ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Эта работа описывает простую поведенческую парадигму, которая позволяет анализировать аверсивное ассоциативное обучение у взрослых плодовых мушек. Метод основан на подавлении врожденного негативного поведения геотаксиса из-за ассоциации, образующейся между конкретным экологическим контекстом и поражением электрическим током.
Abstract
Этот протокол описывает новую парадигму анализа аверсивного ассоциативного обучения у взрослых мух (Drosophila melanogaster). Парадигма аналогична пассивному поведению избегания у лабораторных грызунов, в котором животные учатся избегать отсека, где они ранее получили удар электрическим током. Анализ использует отрицательный геотаксис у мух, который проявляется как желание подняться вверх, когда они размещены на вертикальной поверхности. Установка состоит из вертикально ориентированных верхнего и нижнего отсеков. На первом испытании муху помещают в нижний отсек, откуда она обычно выходит в течение 3-15 с, и входят в верхний отсек, где она получает удар электрическим током. Во время второго испытания, спустя 24 часа, задержка значительно увеличивается. При этом количество ударов снижается по сравнению с первым испытанием, что свидетельствует о том, что у мух формируется долговременная память о верхнем отсеке. Запись задержек и количества ударов может быть выполнена с помощью счетчика и секундомера или с помощью простого устройства на основе Arduino. Чтобы проиллюстрировать, как может быть использован анализ, здесь было охарактеризовано пассивное поведение избегания D. melanogaster и D. simulans мужского и женского пола. Сравнение задержек и количества ударов показало, что и D. melanogaster , и D. simulans эффективно научились пассивному поведению избегания. Статистических различий между самцами и самками мух не наблюдалось. Тем не менее, самцы были немного быстрее при входе в верхний отсек в первом испытании, в то время как самки получали немного большее количество ударов в каждом испытании удержания. Западная диета (WD) значительно ухудшала обучение и память у самцов мух, в то время как полетные упражнения уравновешивали этот эффект. Взятые вместе, пассивное поведение избегания у мух предлагает простой и воспроизводимый анализ, который можно использовать для изучения основных механизмов обучения и памяти.
Introduction
Обучение и память — это эволюционно древний механизм адаптации к окружающей среде, сохранившийся от дрозофилы (Д.) до человека1. Плодовая муха является надежным модельным организмом для изучения фундаментальных принципов обучения и памяти, поскольку она предлагает широкий спектр мощных генетических инструментов для препарирования внутренних молекулярных механизмов2. Новаторские генетические скрининговые исследования, которые идентифицировали гены rutabaga3, amnesiac4 и dunce5, критически важные для обучения и памяти2, воспользовались обонятельным обусловливанием, поскольку плодовые мухи полагаются на свое острое обоняние, чтобы найти пищу, потенциальных партнеров и избежать хищников6.
Обонятельное обусловливание стало популярной парадигмой для изучения механизма обучения и памяти, благодаря введению обонятельного Т-лабиринта Талли и Куинна7,8. Впоследствии были предложены другие методы измерения различных типов обучения и памяти, включая визуальное обусловливание9, обусловливание ухаживания10, аверсивный анализ подавления фототаксиса11 и кондиционирование воздействия осы12. Тем не менее, большинство из этих анализов имеют сложную настройку, которая должна быть изготовлена на заказ в университетской мастерской или приобретена через поставщика. Парадигма, описанная здесь, основана на простом поведенческом анализе для изучения аверсивного ассоциативного обучения у мух, которое можно легко собрать с помощью нескольких доступных принадлежностей.
Описанная парадигма эквивалентна пассивному (или тормозящему) поведению избегания у лабораторных мышей и крыс, у которых животные учатся избегать отсека, где они ранее получали удар электрическим током13. У мюридов процедура основана на их врожденном избегании яркого света и предпочтении более темных областей14. На первом испытании животное помещается в светлый отсек, откуда животное быстро выходит, шагая в темный отсек, куда наносится удар электрической ногой. Обычно одного испытания достаточно для формирования твердой долговременной памяти, что приводит к значительному увеличению задержки через 24 часа. Затем латентность используется в качестве индекса способности животного запоминать связь между аверсивным стимулом и конкретной средой15.
В этой работе описывается аналогичная процедура с использованием D. в качестве модельной системы, которая предлагает несколько преимуществ по сравнению с моделями грызунов, включая экономическую эффективность, больший размер выборки, отсутствие регулирующего надзора и доступ к мощным генетическим инструментам16,17. Процедура основана на негативном поведении геотаксиса, которое проявляется в желании мух подняться вверх, когда они размещены на вертикальной поверхности18. Установка состоит из двух вертикальных камер. На первом испытании плодовая муха помещается в нижний отсек. Оттуда он обычно выходит в течение 3-15 с, ступая в верхний отсек, где получает удар током. Во время 1-минутного испытания некоторые мухи могут иногда возвращаться в верхний отсек, что приводит к дополнительному поражению электрическим током. На этапе тестирования, спустя 24 часа, задержка значительно увеличивается. При этом количество ударов снижается по сравнению с первым днем, что свидетельствует о том, что у мух формируется аверсивная ассоциативная память о верхнем отсеке. Латентность, количество толчков, а также продолжительность и частота груминговых схваток затем используются для анализа поведения животных и способности формировать и запоминать связь между аверсивным стимулом и конкретной средой. Репрезентативные результаты показывают, что воздействие западной диеты (WD) значительно ухудшает пассивное поведение избегания у самцов мух, предполагая, что WD глубоко влияет на поведение и познание мухи. И наоборот, полетные упражнения смягчили негативное влияние WD, улучшив пассивное поведение избегания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка аппарата пассивного избегания
- Просверлите отверстие диаметром 4 мм, перпендикулярное поверхности стенки 14 мл полипропиленовой культуральной трубки и находящееся на расстоянии 8 мм от дна трубы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электрическую дрель и сверло 5/32 для достижения наилучших результатов. - С помощью стального ножа отрежьте верхнюю часть 14 мл полипропиленовой культуральной трубки, чтобы создать фрагмент дна трубки длиной 45 мм. Нижний фрагмент служит нижним отсеком.
- Отрежьте наконечник синего наконечника пипетки объемом 1000 мкл с помощью лезвия бритвы с одним краем, чтобы сделать отверстие достаточно широким для прохождения одной мухи. Отрежьте сужающуюся часть синего наконечника, чтобы создать фрагмент толщиной 12 мм. Вставьте этот фрагмент плотно в 4-миллиметровое отверстие нижнего отсека. Он используется в качестве погрузочного дока для перевозки мух.
- Вырежьте 15-миллиметровый кусок прозрачной виниловой трубки 5/8" ID (см. Таблицу материалов), чтобы создать муфту. Вставьте верхний и нижний отсек в муфту с противоположных концов, чтобы надежно прикрепить нижний отсек к верхнему отсеку.
- С помощью 2-контактного регулируемого зажима прикрепите узел к вертикальной подставке. Ориентируйте узел вертикально с помощью ударной трубки в качестве верхнего отсека.
- Подключите провода ударной трубки к электростимулятору (см. Таблицу материалов) для нанесения ударов электрическим током. Продолжительность тренировочного периода составляет 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить наблюдение, поместите лист белой бумаги за ударной трубкой, чтобы служить белым фоном аппарата. Поместите лампу с эквивалентной мягкой лампочкой мощностью 75 Вт над ударным отсеком. Поместите регулируемую лампу лупы перед установкой. Представление аппарата пассивного избегания показано на рисунке 1.
2. Подготовка мух к процедуре пассивного избегания
- Обездвиживают 3-4 дневных мух D. melanogaster или D. simulans с помощью ледяной глыбы и переносят их в отдельные флаконы с пищей за 24 ч до начала эксперимента (1 муха на флакон) после процедуры, описанной ранее19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, описанные здесь, сравнивали 3-4 дневных мужчин и. самка летает у D. melanogaster и D. simulans. - Перед поведенческими экспериментами закодируйте все флаконы. Для этого присваивайте каждой группе букву, например, «А», «В», «С» и т.д., и каждой летит цифра. Раскрывайте этот код только после того, как все данные будут записаны и проанализированы. Используйте не менее 20 мух на генотип или лечение, чтобы противостоять индивидуальным вариациям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение экспериментов и анализов «вслепую» позволяет исключить смещение в оценке эффективности полета и анализе данных.
3. Выполнение первой пробной версии
- Используя аспиратор с мухобойным устьем (см. Таблицу материалов), описанный ранее20, осторожно перенесите муху из отдельного флакона в нижний отсек через погрузочный док. Осторожно всасывайте одну муху в рот аспиратора, всасывая воздух. Посадите муху, слегка дуя в погрузочный док.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стресса животного во время ловли и погрузки. - Сразу после того, как муха будет загружена в нижний отсек, запустите 1-минутный таймер и секундомер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Секундомер используется для измерения задержек и счетчика для подсчета количества ударов. - Нажмите секундомер, чтобы записать первую задержку, когда муха входит в ударную трубку, поместив все лапы на сетку. Включите стимулятор, чтобы нанести удар током мухе. Параметры стимуляции: 120 вольт, длительность 1000 мс, 1 импульс/с (PPS), продолжительность поезда 2000 мс.
- Доставьте дополнительные удары, если муха снова войдет в ударную трубку. Запишите количество полученных ударов во время 1-минутного испытания с помощью счетчика или счетчика на основе Arduino (см. Таблицу материалов). Если вы используете счетчик на основе Arduino, выполните следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опциональное устройство на базе Arduino АКМ-007 (см. Таблицу материалов) может использоваться для измерения времени, задержки, количества ударов, а также частоты и продолжительности груминговых схваток для каждого животного путем нажатия и отпускания соответствующих кнопок на устройстве. Кнопки на устройстве предназначены для измерения задержки, администрирования и записи количества ударов, а также измерения частоты и продолжительности груминговых схваток.- Нажмите кнопку Пуск на шаге 3.2., и нажмите кнопку Shock на шаге 3.3.
- Чтобы записать продолжительность грумингового боя, нажмите кнопку Груминг в начале грумингового боя на устройстве и отпустите эту кнопку в конце грумингового боя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Схватки по грумингу измерялись в течение 1 мин испытания. Обширный груминг может свидетельствовать о стрессе животных21,22. Устройство на базе Arduino сохраняет все данные в виде CSV-файла на карту памяти.
- В конце 1-минутного испытания аккуратно перенесите муху обратно в отдельный флакон. Запишите задержку, количество полученных ударов и любые заметные изменения в поведении.
- Очистите нижний и ударный отсек 70% этанолом, протрите безворсовой чистящей салфеткой (см. Таблицу материалов) и высушите феном. Повторите пробную версию со следующей мухой.
- После поведенческих экспериментов очистите нижний отсек водой и моющим средством без запаха. Протрите нижний отсек и амортизатор 70% этанолом и высушите на воздухе ночь.
4. Выполнение второго испытания
- Выполните второе испытание, повторив процедуру, описанную выше (шаг 3) через 24 часа. Протестируйте мух в той же последовательности, что и в предыдущий день.
5. Анализ результатов
- Рассчитайте среднюю латентность, среднее количество ударов и продолжительность груминговых схваток для испытания 1 и испытания 2 для каждой экспериментальной группы животных. Выполните студенческий t-тест для сравнения двух групп или ANOVA для нескольких сравнений с пост-специальным анализом, используя тест Туки23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пассивное избегание изучалось у D. melanogaster (Canton-S) и D. симулянты. В экспериментах сравнивали задержки и количество полученных шоков между последовательными испытаниями. Первоначально эксперименты проводились с 3-4-дневными самцами мух D. melanogaster . Мухи содержались на стандартной диете Bloomington Formulation в климат-контролируемой среде при 24 ° C при 12-часовом цикле света-темноты, влажности 70% и контролируемой плотности популяции. Плотность контролировалась путем поддержания условий размножения постоянными для всех групп. 15 самцов и 15 самок разводили в течение 48 ч в бутылке при 24 °C, влажности 70% и световом цикле 12 часов для получения потомства. Пассивное поведение избегания у плодовой мухи изучалось в четырех 2-минутных испытаниях на расстоянии 24 часов друг от друга. Испытания проводились в одно и то же время суток. Муху осторожно аспирировали из отдельного флакона во время испытания и перекладывали в нижний отсек через погрузочный док (рисунок 1). Эксперименты показали, что D. melanogaster может успешно учиться и запоминать пассивное избегающее поведение. В первом испытании наивная муха входила в верхний отсек в среднем в течение 16 с (16,15±2,64) и часто возвращалась в него, получая в среднем 2 удара (2,18±0,19). Во время последовательных испытаний задержка значительно увеличится, в то время как количество ударов уменьшится, что указывает на то, что мухи узнали связь между верхним отсеком и поражением электрическим током (таблица 1, рисунок 2 A, B). Анализ частотного распределения показал, что отрицательный геотаксис является мощной мотивацией. Во время первого испытания большинство наивных мух входили в верхний отсек в течение 5-15 с (бункер 10, рисунок 2C) и получали 1-3 удара (рисунок 2D). Напротив, большинство мух не войдут в верхний отсек в четвертом испытании и, соответственно, не получат никаких ударов (рисунок 2E, F).
Чтобы убедиться, что пассивный анализ избегания работает у других видов плодовых мух, эксперименты были повторены на D.simulans самцов и самок мух, содержащихся в тех же условиях содержания, что и меланогастерные мухи, описанные выше. Продолжительность испытания была сокращена до 1 мин. Частотное распределение по задержкам ясно показало, что если муха не входит в верхний отсек в течение 60 с в первом испытании, она обычно не входит вообще (рисунок 3C). Число испытаний было сокращено до трех, поскольку вышеописанные эксперименты достоверно продемонстрировали, что даже одного испытания было достаточно для того, чтобы муха сформировала аверсивные ассоциации. D. simulans самцы и самки мух были эффективны в изучении пассивного избегающего поведения, как видно из данных на графиках и таблицах (рисунок 3, рисунок 4; и таблица 2, таблица 3).
Сравнение задержек и числа шоков между мужчинами и женщинами не выявило каких-либо статистически значимых различий (рисунок 5 А, В). Тем не менее, самцы мух немного быстрее входили в верхний отсек в первом испытании, в то время как самки получали немного большее количество ударов в каждом испытании (рисунок 4A, B). Разница была особенно очевидна на графиках, иллюстрирующих частотные распределения (рисунок 4C-F). Частотное распределение задержек в третьем испытании показало, что большинство мух проникали в верхний отсек в течение 7,5-12,5 с (рисунок 4E). Распределение частоты для числа толчков в третьем испытании показывает, что самки мух получали в среднем 1-2 удара в последнем испытании (рисунок 4F).
Общая продолжительность грумингового поведения также была зафиксирована во время испытаний. Поведение мухи состоит из повторяющихся скоординированных движений передних и задних ног, проносящихся над крыльями, головой и телом24. Самоподготовка, также известная как автохуминг, ранее была связана с поведенческим стрессом у мух24, лабораторных грызунов25 и людей22. Таким образом, исследования самоухоженного поведения могут дать представление о поведении, связанном с тревогой26. Анализ общей продолжительности груминговых схваток во время испытаний пассивного избегания показал, что самоподготовка была значительно увеличена у самок мух во втором и третьем испытаниях (рисунок 5C, таблица 4).
Растущие данные свидетельствуют о связи между высококалорийным WD и нарушением когнитивных функций27. Экспериментально WD оказывает неблагоприятное воздействие на функцию митохондриального мозга, нейрогенез и синаптическую пластичность28,29,30. Недавнее исследование показало, что WD увеличивает триглицериды и сокращает продолжительность жизни в D., в то время как полетные упражнения уравновешивают пагубный эффект WD31. Чтобы начать изучать влияние WD и полетных упражнений на пассивное поведение избегания, самцы мух D. simulans подвергались 5-дневному WD, полетному упражнению или комбинации WD и полетных упражнений в соответствии с протоколами, описанными ранее31. WD, содержащий 15% Nutiva USDA Certified Organic, не содержащий ГМО, красное пальмовое масло, 15% сахарозы и 0,1 млн NaCl, был подготовлен в том виде, в котором он был опубликован в другом месте31. Летное упражнение выполнялось на группах из шестидесяти самцов мух, размещенных в 1-галлонных прозрачных пластиковых барабанах, привязанных к горизонтальной платформе, прикрепленной к электродвигателю и управляемой таймером. Упражнение выполнялось ежедневно в течение 7 ч в течение 5 дней, как было опубликовано ранее31. В конце 5-дневной диеты и режима физических упражнений мухи были отсортированы на отдельные флаконы под холодной анестезией и подвергнуты двум испытаниям пассивного избегающего поведения. Эксперименты показали, что WD увеличивает количество шоков, полученных в первом и втором испытаниях, и уменьшает латентность во втором испытании, что указывает на то, что WD значительно ухудшает аверсивное ассоциативное обучение у мух (рисунок 6, таблица 5). Наблюдалась также тенденция к снижению числа шоков во втором испытании в группе с комбинацией WD и упражнений, предполагая, что физические упражнения могут смягчить влияние перегрузки калорий.
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая анализ пассивного избегания. Размеры нижнего отсека составляют 45 мм в длину и 17 мм в наружный диаметр. Размеры верхнего отсека составляют 80 мм в длину и 18 мм в наружный диаметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пассивное избегающее поведение у самцов D. melanogaster . (A) Средняя задержка (ы) на испытание. График показывает, что задержки значительно увеличиваются с количеством испытаний. Количество мух указано на каждом баре. B) среднее число полученных шоков за одно испытание. График показывает, что количество шоков значительно уменьшается с количеством испытаний. (C) Частотное распределение, показывающее количество мух в корзине задержек в первом испытании. Числа на оси X являются центрами бункера. Бункеры представляют собой интервалы (0-5 с, 5-15 с, 15-25 с и т.д.). График показывает, что большинство мух попадают в верхний отсек в течение 5-15 с. (D) Распределение частот, отображающее количество мух в бункере ударов в первом испытании. Числа на оси X являются центрами бункера. График показывает, что большинство мух получают 1-3 удара в первом испытании. Немногие мухи не вошли в ударный отсек на первом испытании и получили ноль ударов. Они были исключены из последующих судебных процессов. (E) Частотное распределение, показывающее количество мух в корзине задержек в четвертом испытании. График показывает, что большинство мух не попадают в верхний отсек. (F) Частотное распределение, показывающее количество мух в бункере ударов в четвертом испытании. График показывает, что большинство мух получают 0 ударов в последнем испытании. Сокращения: ns- незначимый, *- P<0.05, **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пассивное избегающее поведение у самцов D. simulans . (A) Средняя задержка (ы) на испытание. График показывает, что задержки значительно увеличиваются с количеством испытаний. B) среднее число полученных шоков за одно испытание. График показывает, что количество шоков значительно уменьшается с количеством испытаний. (C) Частотное распределение, показывающее количество мух в корзине задержек в первом испытании. На графике видно, что большинство мух проникают в верхний отсек в течение 2,5-12,5 с. Числа на оси X являются центрами бункера. (D) Частотное распределение, показывающее количество мух в бункере ударов в первом испытании. График показывает, что большинство мух получают 1-3 удара в первом испытании. (E) Распределение частот, показывающее количество мух в корзине задержек в третьем испытании. График показывает, что большинство мух не попадают в верхний отсек. (F) Частотное распределение, показывающее количество мух в бункере ударов в третьем испытании. График показывает, что большинство мух получают 0 ударов в последнем испытании. Сокращения: *- П<0.05, ****- П<0.0001. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пассивное избегающее поведение у женщин D. simulans . (A) Средняя задержка (ы) на испытание. График показывает, что задержки значительно увеличиваются с количеством испытаний. B) среднее число полученных шоков за одно испытание. График показывает, что количество шоков значительно уменьшается с количеством испытаний. (C) Частотное распределение, показывающее количество мух в корзине задержек в первом испытании. На графике видно, что большинство мух проникают в верхний отсек в течение 2,5-12,5 с. Числа на оси X являются центрами бункера. (D) Частотное распределение, показывающее количество мух в бункере ударов в первом испытании. График показывает, что большинство мух получают 2 удара в первом испытании. (E) Распределение частот, показывающее количество мух в корзине задержек в третьем испытании. График показывает, что большинство мух входят в верхний отсек в течение 7,5-12,5 с. (F) Распределение частот, отображающее количество мух в бункере ударов в третьем испытании. График показывает, что большинство самок мух получили 1-2 удара в последнем испытании. Сокращения: **- П<0.01, ***-П<0.001, ****- П<0.0001. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение пассивного избегания и грумингового поведения у самцов и самок D. simulans . (A) Средняя задержка (ы) на испытание. График не показывает статистически значимых различий между мужчинами и женщинами в латентности. B) среднее число полученных шоков за одно испытание. На графике не показано статистически значимых различий между мужчинами и женщинами в количестве полученных шоков. (C) Общая продолжительность груминговых схваток в испытаниях 1-3. Хотя не было статистически значимых различий между самцами и самками, самки мух показали значительное снижение грумингового поведения во время испытаний 2 и 3 по сравнению с испытанием 1. Сокращения: *- П<0.05. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Влияние WD на пассивное избегающее поведение самцов D. simulans . (A) Средняя задержка (ы) на испытание. На графике показано, что WD значительно увеличил задержку в группах WD и WDE. B) среднее число полученных шоков за одно испытание. График показывает статистически значимое увеличение числа ударов, полученных мухами на WD в испытаниях 1 и 2. Интересно, что летные упражнения значительно свели на нет эффект WD согласно Т-тесту Student. Сокращения: CD-контрольная диета, CDE-контрольная диета с физическими упражнениями, WD- западная диета, WDE- западная диета с физическими упражнениями. *- П<0,05, **- П<0,01. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Tukey. #- P<0.05, Студенческий t-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Испытания | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 | Пробная версия 3 | Пробная версия 4 |
| Задержка (ы) | 16.15±2.64 | 49.08±6.2 | 64.72±6.8 | 102.1±12.1 |
| Потрясений | 2.18±0.19 | 1.41±0.29 | 0.76±0.25 | 0.33±0.22 |
| Множественные сравнения Latency Tukey между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | ||
| 1 против 2 | **** | <0.0001 | ||
| 1 против 3 | **** | <0.0001 | ||
| 1 против 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 против 3 | нс | 0.2043 | ||
| 2 против 4 | **** | <0.0001 | ||
| 3 против 4 | ** | 0.0099 | ||
| Шокирует многочисленные сравнения Туки между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | ||
| 1 против 2 | нс | 0.0646 | ||
| 1 против 3 | *** | 0.0004 | ||
| 1 против 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 против 3 | нс | 0.2569 | ||
| 2 против 4 | * | 0.0253 | ||
| 3 против 4 | нс | 0.694 | ||
Таблица 1: Влияние тренировок на предотвращение поражения электрическим током у самцов D. melanogaster. Данные о задержках и полученных ударах представлены в виде средств ± SEM. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки.
| Испытания | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 | Пробная версия 3 |
| Задержка (ы) | 10.16±0.78 г. | 22.64±2.1 | 30.63±2.69 г. |
| Потрясений | 2.36±0.13 | 1.84±0.17 | 1.24±0.14 |
| Множественные сравнения Latency Tukey между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 против 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 против 3 | * | 0.0229 | |
| Шокирует многочисленные сравнения Туки между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | * | 0.0166 | |
| 1 против 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 против 3 | * | 0.0172 | |
Таблица 2: Влияние тренировок на предотвращение поражения электрическим током у самцов D. simulans . Данные о задержках и полученных ударах представлены в виде средств ± SEM. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки.
| Испытания | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 | Пробная версия 3 |
| Задержка (ы) | 12.07±0.89 | 20.98±2.63 | 23.20±2.16 г. |
| Потрясений | 2.65±0.12 | 1.98±0.12 | 1.49±0.11 |
| Множественные сравнения Latency Tukey между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | ** | 0.0023 | |
| 1 против 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 против 3 | ** | 0.0028 | |
| Шокирует многочисленные сравнения Туки между испытаниями | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 против 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 против 3 | *** | 0.0003 | |
Таблица 3: Влияние тренировок на предотвращение поражения электрическим током у женщин D. simulans. Данные о задержках и полученных ударах представлены в виде средств ± SEM. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки.
| Испытания | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 | Пробная версия 3 |
| Мужской груминг (ы) | 14.42±1.02 г. | 18.47±2.82 г. | 18.23±2.75 |
| Женский уход (ы) | 9.15±1.39 | 14.03±2.26 г. | 15.50±2.38 г. |
| Многочисленные сравнения Туки между испытаниями самцов | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | нс | 0.4384 | |
| 1 против 3 | нс | 0.4873 | |
| 2 против 3 | нс | 0.9971 | |
| Многочисленные сравнения Туки между испытаниями самок | Сводка | Скорректированное значение P | |
| 1 против 2 | * | 0.0299 | |
| 1 против 3 | * | 0.0426 | |
| 2 против.3 | нс | 0.8481 | |
Таблица 4: Влияние пассивного избегания на поведение D. simulans при груминге. Данные представлены в виде средств ± SEM. Односторонняя ANOVA с многочисленными сравнительными тестами Tukey.
| Задержки | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 |
| КОМПАКТ-ДИСК | 16.26±2.28 | 45.85±4.09 г. |
| КДЭ | 15.28±2.75 г. | 33.59±5.19 |
| WD | 13.49±1.58 г. | 28.33±3.7 |
| ВДЭ | 13.00±1.95 | 30.23±3.79 г. |
| Множественные сравнения задержки Tukey между группами Trial 1 | Сводка | Скорректированное значение P |
| CD против CDE | нс | 0.9916 |
| CD против WD | нс | 0.7369 |
| CD против WDE | нс | 0.6475 |
| CDE против WD | нс | 0.9523 |
| CDE против WDE | нс | 0.9122 |
| WD vs. WDE | нс | 0.9981 |
| Множественные сравнения задержки Tukey между группами Trial 2 | Сводка | Скорректированное значение P |
| CD против CDE | нс | 0.2785 |
| CD против WD | ** | 0.0082 |
| CD против WDE | * | 0.0283 |
| CDE против WD | нс | 0.8578 |
| CDE против WDE | нс | 0.9594 |
| WD vs. WDE | нс | 0.9844 |
| Потрясений | Пробная версия 1 | Пробная версия 2 |
| КОМПАКТ-ДИСК | 1.95±0.21 | 0,94±0,4 |
| КДЭ | 2.0±0.28 | 1.0±0.23 |
| WD | 3.05±0.26 | 2.36±0.41 |
| ВДЭ | 2.49±0.24 | 1.36±0.23 |
| Шокирует многочисленные сравнения Туки между группами Испытание 1 | Сводка | Скорректированное значение P |
| CD против CDE | нс | 0.9992 |
| CD против WD | ** | 0.005 |
| CD против WDE | нс | 0.3765 |
| CDE против WD | нс | 0.0523 |
| CDE против WDE | нс | 0.6446 |
| WD vs. WDE | нс | 0.3268 |
| Шокирует многочисленные сравнения Туки между группами Trial 2 | Сводка | Скорректированное значение P |
| CD против CDE | нс | 0.9996 |
| CD против WD | * | 0.0194 |
| CD против WDE | нс | 0.8246 |
| CDE против WD | * | 0.0122 |
| CDE против WDE | нс | 0.9306 |
| WD vs. WDE | нс | 0.1508 |
Таблица 5: Влияние WD и физических упражнений на предотвращение поражения электрическим током у мужчин D. simulans. Данные о задержках и полученных ударах представлены в виде средств ± SEM. Односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки. Сокращения: CD-контрольная диета, CDE-контрольная диета с физическими упражнениями, WD- западная диета, WDE- западная диета с физическими упражнениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Избегание угрожающих раздражителей является важнейшей характеристикой адаптивного поведения у различных видов от C. elegance до human32. Процедуры обучения избеганию, которые обычно влекут за собой побег от аверсивного события, обычно используются поведенческими задачами для исследования процессов обучения и памяти у лабораторных грызунов13 с 1970-х годов32 года. В активных процедурах избегания за индифферентным стимулом или условным сигналом (CS) следует аверсивное событие или безусловный сигнал (US), которого животные учатся избегать, выполняя определенную поведенческую задачу. В процедурах пассивного избегания животное должно избегать отвратительных США, связывая ранее наказанное поведение с конкретным экологическим контекстом33. Более длительные задержки теста на удержание, указывающие на лучшую память, свидетельствуют о том, что животное разработало подробное представление об опыте дрессировки13. Обучение пассивному избеганию состоит из одного испытания; однако механизмы мозга, лежащие в основе приобретения этой задачи, сложны, поскольку животное учится связывать различные фрагменты информации, включая экологические, пространственно-позиционные и аверсивные стимулы13. Изменение этих стимулов позволяет изучать эпизодические и контекстуальные типы памяти13.
Парадигма, описанная здесь, приняла пассивное избегающее поведение у грызунов для взрослой мухи в качестве модельной системы. Хотя было разработано несколько процедур для изучения обучения и памяти у мух, включая обоняние7,8, визуальное 9 и кондиционирование ухаживания10, эти анализы довольно трудоемки и требуют сложной настройки. Протокол, описанный здесь, представляет собой простой поведенческий анализ для изучения ассоциативного аверсивного обучения у мух, который состоит из 1 мин испытаний и может быть легко настроен с несколькими доступными запасами. Протокол потенциально позволяет дополнительно манипулировать сигналами окружающей среды с добавлением обонятельных, визуальных и других контекстуальных стимулов, изменяя цвета или геометрические узоры для нижнего отсека или добавляя обонятельные сигналы в крышку верхней камеры. Кроме того, этот анализ может быть легко адаптирован для изучения кратковременной памяти, среднесрочной памяти и резистентной к анестезии памяти путем манипулирования интервалами между испытаниями и подвергая мух анестезии.
Анализ одинаково хорошо работал у D. melanogaster и D. simulans мужских и женских мух, демонстрируя, что парадигма может быть адаптирована к различным видам D. Изменения в поведении мух, характеризующиеся увеличением задержек и уменьшением числа шоков, были статистически значимыми во втором испытании и усиливались в последующих испытаниях. Интересно, что если бы наивные мухи привыкли к аппарату без поражения электрическим током, они бы вошли в верхний отсек немного быстрее на втором и третьем испытаниях. Однако снижение латентности не было статистически значимым (данные не показаны). Статистически значимых различий между полами не наблюдалось, хотя самки мух имели несколько более длительные задержки и получали немного больше шоков. Эта разница может быть связана с сочетанием факторов, включая неспособность самок связать шок с верхним отсеком, более сильный геотаксис или, возможно, потому, что самки немного больше и медленнее, чем самцы. Общая продолжительность ухаживания была значительно ниже во втором и третьем испытаниях на самках мух, что проводит параллель между D. и тревожным поведением грызунов26.
Интересно, что, как показано на рисунках 3E и 4E, задержки в третьем испытании были разделены на две крайности (менее 30 с и 60 с). Эти различия, однако, не наблюдались в 4-м испытании, указывая на то, что большинство мух в конечном итоге приобрели задачу (рисунок 2E). Хотя точные причины индивидуальных различий в развитии пассивных задач избегания неясны, естественные популяции могут содержать полиморфизм и мутации, влияющие на обучение и память3,5,34,35. Недавнее исследование показало, что полиморфизм в локусе кормления (for), кодирующем cGMP-зависимую протеинкиназу (PKG), может опосредуть альтернативные стратегии в обучении поведению кормов34. Мухи с аллелем «ровер» и более высокой активностью имеют лучшую кратковременную память, в то время как мухи с аллелем «няни» и сидячим поведением демонстрируют лучшую долговременную память34.
Анализ показал, что WD значительно ухудшал обучение и память у мух, что было очевидно по более коротким задержкам и получению большего количества ударов во втором испытании. Более высокое количество ударов в первом испытании после WD может указывать на дефицит кратковременной памяти и неспособность установить связь между конкретным экологическим контекстом и поражением электрическим током. Интересно, что летные упражнения частично смягчили негативный эффект WD, поскольку мухи WDE получили значительно меньше ударов во втором испытании. Это говорит о том, что полетные упражнения могут обратить вспять влияние метаболической перегрузки и улучшить когнитивные функции. Эти данные подтверждаются нашими предыдущими наблюдениями о благотворном влиянии полетных упражнений на физиологию полета, размножение и поведение31.
Одним из критических шагов в описанном протоколе является перенос мух из отдельного флакона в нижнюю камеру. Стрессовые мухи либо войдут в верхний отсек слишком быстро, либо не войдут вообще. Мухи, которые не вошли в верхний отсек на первом испытании, все еще могли войти в верхний отсек после того, как их перенесли обратно в отдельный флакон и дали 5-минутный перерыв. Однако лучше исключить этих мух из эксперимента. Возраст мух является еще одним решающим фактором, так как отрицательный геотаксис стал значительно слабее у 30-дневных мух (данные не показаны). Таким образом, больше мух не войдут в верхнюю камеру на первом испытании и будут исключены из эксперимента.
Преимущество описанного анализа заключается в том, что это простая поведенческая задача, которая производит воспроизводимые данные как у D. melanogaster , так и у D. simulans самцов и самок мух. Анализ может помочь в изучении основных механизмов, лежащих в основе нарушений обучения и памяти в результате различных генетических, фармакологических и диетических манипуляций. Более того, поскольку испытания на удержание могут проводиться в разное время после первоначального обучения, кратковременная, промежуточная и долгосрочная память могут быть потенциально опрошены отдельно.
Существуют также потенциальные ограничения с этой задачей с одним испытанием, включая межсубъектную изменчивость и возрастные различия (обсуждалось выше). На обучение и память также могут влиять различные факторы, включая поведенческое состояние во время обучения, экспериментальные манипуляции и реакции на стресс36. Поскольку США даны в отсеке с медной сеткой, вход животных иногда трудно оценить, если только фотолучи и инфракрасные камеры не могут быть установлены для отслеживания видео в будущем.
Взятый вместе, анализ, представленный здесь, является простой, надежной и воспроизводимой процедурой, которая позволяет изучать механизмы памяти. Это потенциально может открыть новые возможности для подробного анализа консолидации памяти у мух, включая генно-лекарственные взаимодействия, как в контекстуальных, так и в эпизодических аспектах памяти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L.
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (9), Pt A 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T.
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , Oxford University Press. (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing' rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O. Encyclopedia of Psychopharmacology. Stolerman, I. P. , Springer Berlin Heidelberg. 960-967 (2010).
Tags
Поведение Проблема 176 Пассивное избегание аверсивное обучение ассоциативное обучение память дрозофила западная диета полетные упражненияErratum
Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.
In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
to:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
In the Discussion, the third paragraph was updated from:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
to:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
