Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.
Abstract
קבוצה של 23 קשישים קיבלה ארוחות פונקציונליות (משקה ומאפין) שפותחו במיוחד למניעת סרקופניה (אובדן מסת שריר הקשורה לגיל). דגימות פלזמה נלקחו בתחילת ההתערבות ולאחר 30 ימים של צריכת הארוחות הפונקציונליות. כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב עם ניתוח מסה דו-מושבית (UPLC-MS/MS) בוצעה כדי לזהות תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהן. חלבוני פלזמה היו מזורזים עם אתנול והדגימות היו מרוכזות ו resuspended בשלב הנייד (1:1 acetonitrile: מים) לפני הזרקה למכשיר UPLC-MS / MS. ההפרדה בוצעה עם עמודת שלב הפוך C18 , ותרכובות זוהו באמצעות המסה הניסיונית שלהם, הפצה איזוטופית, ודפוס שבר. תרכובות עניין הושוו לאלה של מאגרי נתונים וספרייה ממוקדת למחצה פנימית. תוצאות ראשוניות הראו כי המטבוליטים העיקריים שזוהו לאחר ההתערבות היו חומצה פנילצטית, גליציטין, 3-הידרוקסיפנילוולרית, וגומיסין M2.
Introduction
סרקופיניה היא הפרעת שלד מתקדמת הקשורה לאובדן מואץ של שרירים באוכלוסייה המבוגרת. מצב זה מגביר את הסיכון לנפילות ומוביל לפעילות מוגבלת של חיי היומיום. סרקופיניה קיימת בכ-5%-10% מהאנשים מעל גיל 65 וכ-50% מבני 80 ומעלה1. לא אושרו תרופות ספציפיות לטיפול בסרקופיניה, ולכן מניעה עם פעילות גופנית ותזונה מאוזנת היטב חשובה 1,2. התערבויות תזונתיות עם מזונות שפותחו במיוחד מועשרים בחלבון חלב וחומצות אמינו חיוניות הראו תוצאות חיוביות במניעת סרקופניה2. במחקרים אחרים, המחברים כללו ויטמינים ונוגדי חמצון, כמו ויטמין E ואיזופלבונים, בתזונה, הגדלת היתרונות לרווח שרירים על המותניים והירכיים3.
ברוסימום עליקסטרום סובה (בספרדית: Brosimum alicastrum Sw. ) הוא עץ הגדל באזורים הטרופיים של מקסיקו. זה כבר נצרך על ידי תרבויות המאיה בשל הערך התזונתי הגבוה שלה4. זהו מקור טוב של חלבון, סיבים, מינרלים, ונוגדי חמצון פנוליים, כגון חומצה כלורוגנית5. מאז זה יכול להיות טחון לאבקה ומשמש במוצרי אפייה או נצרך משקאות, מחקרים אחרונים העריכו את השילוב של קמח זרעי רמון (RSF) לתוך מזונות שונים כדי לשפר את הערך התזונתי שלהם. משקה בטעם קפוצ'ינו בתוספת RSF פותח, שהיה עשיר בסיבים תזונתיים והיה בו יותר מ-6 גרם חלבון למנה, והיה מקובל מאוד על הצרכנים; לכן, זה נחשב חלופה פוטנציאלית לעמידה בדרישות תזונתיות מיוחדות6. במחקר מעקב, RSF שימש גם כדי לנסח מאפין ומשקה חדש עשיר בחלבון, סיבים תזונתיים, micronutrients, ונוגדי חמצון פנוליים. המאפין והמשקה שימשו בהתערבות תזונתית לקשישים, שצרכו את שני המוצרים פעמיים ביום במשך 30 יום. לאחר תקופה זו, המצב התזונתי והסרקופי של המשתתפים השתפר, ואת התוכן הפנולי הכולל של פלזמה גדל7. עם זאת, הקביעה של סך התרכובות פנוליות בפלזמה בוצעה על ידי שיטה ספקטרופוטומטרית, ולכן זיהוי של תרכובות פנוליות בפועל שנקלטו לא היה אפשרי; יתר על כן, שיטה זו אינה ספציפית לחלוטין עבור תרכובות פנוליות, ולכן כמה הערכת יתר עלולה להתרחש8.
זיהוי וכימות של תרכובות פנוליות הנספגות לאחר צריכת מזונות עשירים בנוגדי חמצון אלה היא משימה קשה אך יש צורך להדגים את הפעילות הביולוגית של פיטוכימיקלים אלה. הזמינות הביולוגית של רוב התרכובות הפנוליות נמוכה; פחות מ -5% מהם ניתן למצוא ללא שינוי מבני בפלזמה. תרכובות פנוליות עוברות מספר ביוטרנספורמציות, כגון מתילציה, סולפונציה או גלוקורונידציה, המתבצעות על ידי enterocytes ו hepatocytes9. תרכובות פנוליות הן גם biotransformed על ידי המיקרוביוטה לתוך קטבוליטים חיידקיים שעשויים להפעיל את ההשפעות המועילות שלהם בגוף לאחר נספג לתוך פלזמה10. לדוגמה, חומצה פנילאצטית היא תוצר של טרנספורמציה חיידקית של פלבנואידים ופרואנתוציאנידינים אוליגומריים, אשר יכול לעכב עד 40% של חיידקים (Escherichia coli) הידבקות בדרכי השתן לאחר צריכת חמוציות11.
המגוון המבני של תרכובות פנוליות טבעיות, הוסיף למגוון של המטבוליטים שלהם ואת הזמינות הביולוגית הנמוכה שלהם, עושה את הזיהוי שלהם בפלזמה אפילו יותר מאתגר. פרופיל מטבולומי, באמצעות פלטפורמות ניתוח ספקטרוסקופיות כמו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרוסקופיית מסה טנדם (MS/ MS), היא כנראה הגישה הטובה ביותר להשגת מטרה זו; למרבה הצער, הציוד אינו נגיש בקלות, ופיתוח פרוטוקולי ניתוח עדיין מוגבל12. מספר מחקרים דיווחו על טרשת נפוצה /טרשת נפוצה בשילוב עם מערכת הפרדה (כגון כרומטוגרפיה נוזלית) כאסטרטגיה להפחתת המורכבות של ספקטרום המסה במחקרים מטבולומיים. ההקדמה האחרונה של שיטות הפרדה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC) צמצמה את זמן הניתוח והגדילה את הרזולוציה והרגישות בהשוואה לפרוטוקולים נוזליים קונבנציונליים בעלי ביצועים גבוהים, כך שמערכות UPLC-MS/MS התקבלו במהירות באופן נרחב על ידי קהילת חילוף החומרים האנליטית13. בדרך זו, כמה מחקרים חקרו מטבוליטים פנוליים וזיהו נגזרות glucuronidated מחומצה caffeic, קוורצטין, וחומצה פרולית, כמו גם נגזרות sulfonated מחומצה סירינגית וניל בפלזמה של אנשים לאחר צריכת חמוציות14. פרוטוקולים קודמים התכוונו למצוא תרכובות פנוליות ומטבוליטים פנוליים ביופלואידים כגון פלזמה. פרוטוקולים אלה התבססו על זיהוי וכימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) יחד עם גלאי UV-vis15. עם זאת, פרוטוקולים כאלה דורשים שימוש בסטנדרטים אותנטיים כדי להעריך זיהוי מוחלט וכימות מדויק. מגוון רחב של מחקרים זיהו את המטבוליטים הנפוצים ביותר ביופלוידים (צורות זועפות, glucuronidated ומתילציה) על ידי UPLC-MS ו UPLC-MS / MS; עם זאת, חלק גדול של מטבוליטים חיידקיים לא דווח בשל היעדר מסדי נתונים המכילים את המידע המלא שלהם16. זיהוי מטבוליט מסובך על ידי העלות והזמינות המסחרית של תקני מטבוליט. לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר עשויה להיות לא ממוקדת או חצי ממוקדת ניתוח מטבוליטים MS / MS, אשר מסתמך על השימוש במידע תכונה מולקולרית (m / z, מסה מדויקת מונואיסטופית, הפצה איזוטופית, ודפוס פיצול) כדי לקבוע את הזהות הכימית ומשווה אותו עם מסדי נתונים מקוונים זמינים באופן חופשי המכילים מטבוליטים פוליפנול מזוהים ביופלוידים לאחר צריכת פוליפוליפנול-richts12 . מסדי הנתונים החשובים ביותר המשמשים במחקרי UPLC-MS/MS לזיהוי תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהם הם מסד הנתונים של מטבולום אנושי (HMDB), ספריית ליפידבלסט, ספריית METLIN, ומאגרי מידע משלימים אחרים, כגון PubChem, ChemSpider, ו- Phenol Explorer17.
במחקר הנוכחי פותחה שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה לניתוח דגימות הפלזמה של קבוצת הקשישים המעורבים במחקר צריכת המאפינס והמשקאות המכיל RSF7. נתונים ממאגרי מידע מקוונים שונים בחינם של מטבוליטים פלזמה נאספו ושולבו במסד נתונים מיוחד. מסד נתונים זה ניתן לגשת באופן אוטומטי על ידי תוכנת הציוד כדי לזהות את המטבוליטים פוליפנולי בחמש דגימות פלזמה לפני ואחרי ההתערבות התזונתית 30 יום. זה נעשה כדי לזהות את התרכובות הפנוליות העיקריות, או המטבוליטים שלהם, כי הם נספגים מן מזונות פונקציונליים מנוסחים במיוחד שנועדו למניעת סרקופיניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות הפלזמה המשמשות בפרוטוקול זה נאספו במחקר קודם בעקבות כל ההנחיות האתיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה והביואתיקה המוסדית (CIEB-2018-1-37) מאוניברסיטת אוטונומה דה סיודאד חוארז. הפרוטוקול המלא לחילוץ וזיהוי של תרכובות פנוליות ומטבוליטים בפלזמה על ידי UPLC-MS/MS מיוצג באיור 1.
איור 1: ייצוג סכמטי של מיצוי וזיהוי של תרכובות פנוליות ומטבוליטים בפלזמה בשיטת UPLC-MS/MS הממוקדת למחצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
1. הכנה לדוגמה
- לאחסן את דגימות הפלזמה ב -80 °C (80 °F) עד לניתוח.
- להפשיר את דגימות הפלזמה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
הערה: ניתן להניח את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להאיץ את התהליך (5 דקות). - מניחים 200 μL של דגימת פלזמה במיקרוטוב 2 מ"ל ומערבבים עם 1,000 μL של אתנול טהור. מערבולת דגימת הפלזמה עבור 30 s.
הערה: יש להשתמש תמיד בכפפות בעת עבודה עם דגימות פלזמה. - צנטריפוגה המדגם ב 6,580 x g במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant עם micropipette או פיפטה פסטר ומניחים אותו microtube חדש. לאחסן את supernatant ב 4 °C (65 °F).
- מערבבים את הכדור מהשלב הקודם עם 1,000 μL של 100% אתנול, מערבולת עבור 30 s, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6,580 x g במשך 5 דקות.
הערה: הכדור הוא ארוז מאוד צריך להיות resuspended היטב כדי להבטיח מגע בין המדגם ואתנול טהור. מומלץ להשתמש במיקרופיפט כדי לשטוף את הכדור עם אתנול. - לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant ולערבב עם supernatant שהושג בעבר משלב 1.4. במיקרו-טיוב של 2 מ"ל.
- הסר אתנול מן המדגם באמצעות חנקן טהור (99.997%) ב 135 פסאיי. שמור את המחט 1 ס"מ מן החלק העליון של microtube כדי למנוע אובדן מדגם לשטוף עד המדגם יבש. אין צורך בחום כדי לאדות את האתנול.
הערה: זרימת החנקן חייבת להיות נמוכה כדי למנוע אובדן מדגם. לאחר האתנול מיובש, לשמור על זרימת החנקן לפחות 5 דקות כדי להבטיח יובש מדגם. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה; יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 °C (60 °F). הימנע מאחסון הדגימות במשך יותר מ 12 שעות. - Resuspend את הדגימות היבשות ב 100 μL של תערובת של אצטוניטריל: מים בשיעור של 50:50 (v:v).
- לסנן את המדגם דרך קרום מזרק ניילון 0.45 מיקרו מיקרו מיקרו 0.45 מיקרו.
הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בבקבוקון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. אחסן את הדגימות עבור לא יותר מ 8 שעות. מומלץ להזריק את הדגימות למערכת UPLC מיד לאחר הסינון.
2. ניתוח UPLC-MS/MS
- הזרקו 3 μL של דגימה על UPLC המצויד בעמודה דו-פאזית הפוכה C18 (50 מ"מ x 2.1 מ"מ; 1.8 מיקרומטר). הגדר את טמפרטורת הדגימה האוטומטית ב 20 °C (50 °F) ואת התרמוסטט עמודה ב 25 °C (60 °F). הזרקו כל דגימה בשלושה עותקים.
- השתמש 0.1% (v:v) חומצה פורמית במים כמו ממס A, ו 100% אצטוניטריל כמו ממס B. הגדר את קצב הזרימה ב 0.4 mL / min ותוכנית הדרגתית כדלקמן: 0-1 דקות 10% B, 1-4 דקות 30% B, 4-6 דקות 38% B, 6-8 דקות 60% B, 8-8.5 דקות 60% B, 8.5-9 דקות 10% B (טבלה 1).
- הגדר את ספקטרומטר המסה ליינון מצב שלילי. השתמש חנקן כגז ייבוש ב 340 °C (50 °F) וקצב זרימה של 13 L/ min. הגדר את לחץ nebulizer ב 60 פסאיי. הגדר את מתח הנימים ב- 4,000 V, את מתח הפיצול על 175 V ואת מתח הרחפן ב- 65 V. השתמש באנרגיית התנגשות ב- 20 V (טבלה 2).
- סרוק את המסות בין יחס טעינה של 100-1100 מסה לטעינה (m/z) ועבור MS/MS, סרוק מסות בין 50-1000 מ'/ז ' (טבלה 2). הגדר רכישת נתונים למצב MS/MS אוטומטי. השתמש במסת הייחוס הבאה: 119.036 ו- 966.0007.
| זמן (דקה) | ממס A (0.1 % חומצה פורמית במי HPLC) | ממס B (100 % אצטוניטריל) |
| 0 ל-1 | 90 | 10 |
| 1 עד 4 | 70 | 30 |
| 4 עד 6 | 62 | 38 |
| 6 עד 8 | 40 | 60 |
| 8 עד 8.5 | 40 | 60 |
| 8.5 עד 9 | 90 | 10 |
טבלה 1: שיפוע פאזה נייד המשמש להפרדה של תרכובות פנוליות על ידי UPLC.
| מצב יינון | שלילי |
| גז ייבוש | חנקן בטמפרטורה של 340 °C (65 °F), קצב זרימה 13 L/min |
| לחץ נבולייזר | 60 פסאיי |
| מתח נימי | 175 V |
| מסות סריקת טרשת נפוצה | 100-1100 מ'/ז' |
| מסות סריקה של MS/MS | 50-1000 מטר/z |
טבלה 2: פרמטרי יינון עבור ניתוח MS/MS.
3. בניית מסד נתונים
- חפש תרכובות פנוליות, מטבוליטים פנוליים, או תרכובות אחרות של עניין בספרות המדעית.
- פתח את תוכנת ניהול מסדי הנתונים הכלולה במערכת UPLC. בחר | קובץ ספריית מתחם מסד נתונים אישי חדש (PCDL) | צור PCDL חדש. בחר את סוג ה- PCDL: מטבולומיקה של LC/ MS. הגדר שם עבור ה- PCDL. לאחר מכן בחר צור.
- בסרגל הכלים, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה . לאחר מכן לחץ על לחצן חפש תרכובות .
הערה: מכיוון שמדובר ב- PCDL חדש, תוצאות הטבלה יהיו ריקות. פעולה זו תשתנה לאחר הוספת תרכובות חדשות ל- PCDL.- הוסף תרכובות לספריית מתחם מסד הנתונים האישי המיוחד על-ידי העתקתן מהספרייה הכללית של המכשיר. פתח את מסד הנתונים הקיים של המכשיר הכלול בתוכנת ניהול מסדי הנתונים. לחץ על הלחצן חפש תרכובות. באפשרות חיפוש יחיד , הזן את קריטריוני החיפוש המורכבים כדי למצוא את דריבית הריבית.
הערה: ניתן למצוא תרכובות לפי שם, נוסחה מולקולרית, מסה מדויקת וזמן שמירה. - בטבלת התוצאות המורכבות, בחר את דריבית הריבית. כדי לבחור יותר ממתחם אחד, לחץ על המתחם הראשון, החזק את מקש CTRL לחוץ ולאחר מכן לחץ על כל דריבית עניין. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל התרכובות המסומנות ובחר צרף ל- PCDL.
- בחלון החדש, חפש ובחר את קובץ מסד הנתונים האישי המיוחד. סמן את התיבות כלול ספקטרום עבור תרכובות אם קיים ולכלול מידע ניידות יון עבור תרכובות אם קיים. לחץ על לחצן צרף . בתיבת הדו-שיח החדשה, בחר כן כדי לבדוק את התרכובות החדשות שנוספו. בחר לא כדי להמשיך לחפש תרכובות עניין נוספות.
- הוסף תרכובות לספריית מתחם מסד הנתונים האישי המיוחד על-ידי העתקתן מהספרייה הכללית של המכשיר. פתח את מסד הנתונים הקיים של המכשיר הכלול בתוכנת ניהול מסדי הנתונים. לחץ על הלחצן חפש תרכובות. באפשרות חיפוש יחיד , הזן את קריטריוני החיפוש המורכבים כדי למצוא את דריבית הריבית.
- אם תרכובות העניין אינן זמינות בספריה הכללית של המכשיר, הוסף תרכובות חדשות באופן ידני.
- פתח את מסד הנתונים האישי המיוחד. לאחר הפתיחה, בצע את שלב 3.3. בחרו באפשרות 'עריכת תרכובות '. לחץ על לחצן הוסף חדש .
- בחלק העליון של החלון, השלם את המידע עבור המתחם החדש. מלא את הנוסחה, השם, שם IUPAC, מספר CAS, מזהה Chemspider ומזהים אחרים.
- השתמש במידע הזמין בספריות המקוונות החינמיות (Chemspider, PubChem ו- Phenol Explorer) כדי למלא את המידע עבור דריבית העניין החדשה. לאחר שתסיים, לחץ על הלחצן שמור כחדש כדי לשמור את המידע המורכב החדש במסד הנתונים האישי המיוחד.
הערה: בעת הוספת מידע מספריות בחינם, הקפד לכלול את המידע המורכב ללא נוכחות של כלוריד או יוני יודיד. זה עשוי לשנות את המסה המדויקת ואת הנוסחה המולקולרית של מתחם העניין.
- חזור על התהליך עם כל תרכובות העניין כדי להשלים את מסד הנתונים האישי המיוחד.
4. ניתוח נתונים
- השתמש בתוכנת המנהל האיכותי של המכשיר כדי לזהות את התרכובות הפנוליות והמטבוליטים הפנוליים הקיימים בדגימות.
- פתח את הקובץ לדוגמה. בחלונית Chromatogram, בחר הגדר כרומטוגרמה וחלץ את כרומטוגרמה היון הכוללת (TIC), את כרומטוגרמה היון המופקת של MS (EIC) ואת ה- EIC של MS/ MS. בחר באפשרות שילוב הכרומטוגרמה.
- בחלונית 'חיפוש תרכובות ', בחרו 'חפש לפי אפשרויות נוסחה'. בחלון החדש, בחר מקור נוסחה ולאחר מכן באפשרות מסד נתונים/ספריה . מצא את מסד הנתונים האישי שנוצר בעבר ולחץ על פתח.
- בחר באפשרות התאמת נוסחאות והגדר עמידות להתאמת מסה של 5 חלקים למיליון (ppm).
הערה: ניתן להגדיר עמידות התאמה שונה של מסות במהירות של 10 עמודים לדקה; הבדל זה תלוי בספקטרומטר המסה המשמש. - בחר באפשרות יונים שליליים ובחר בתיבת הדו-שיח -H בלבד. באפשרות 'תוצאות ', סמנו את תיבות הדו-שיח 'חלץ EIC', 'חלץ ספקטרום נקי', 'חלץ ספקטרום גולמי' וכלול תיבות הדו-שיח 'מבנה '.
- בחרו באפשרות 'מסנני תוצאות '. מארק להזהיר אם הציון הוא ולהגדיר את משחק הניקוד ב 80.00%. מארק אל תתאים אם התוצאה היא וקבע את הציון על 75.00%.
הערה: ניתן לשנות את ציוני ההתאמה/לא תואמים לערכים נמוכים יותר במידת הצורך. פעולה זו תפחית את דיוק הזיהוי. - לחץ על מצא תרכובות על ידי נוסחה כדי לזהות תרכובות של עניין במדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך שלב אחר שלב לזיהוי מטבוליטים פנוליים באמצעות ניתוח UPLC-MS/MS הממוקד למחצה, במצב שלילי, של דגימות פלזמה מתואר באיור 2. ראשית, הכרומטוגרמה הכוללת של היון (TIC) מתמצית פנוליקים פלזמה (המתקבלת לאחר משקעי חלבון של דגימת הפלזמה הכוללת) הושגה באמצעות התוכנה האיכותית של המכשיר. לאחר מכן, נעשה שימוש בכרומטוגרמת היון שחולצה, והמסה המדויקת ותבנית הפיצול (ניתוח MS/MS) של כל אות (או תכונה מולקולרית) הושוו לאלה של מסד נתונים אישי מסוים שנוצר גם בתוכנת המכשיר. אותות עם התאמה המונית של פחות מ 5 עמודים לדקה הוקצו נוסחה מולקולרית ממסד הנתונים. לבסוף, ההתפלגות האיזוטופית של כל אות הושוותה לזו של הנוסחה המולקולרית שהוקצתה כדי להשיג את הזיהוי הסופי הסופי. תרכובות ש-א) זוהו רק בשכפול אחד או ב) שהוצגו בשטח הנמוך מ-10,000 טופלו כזיהויים כוזבים. מניתוח זה זוהו בסך הכל 25 תרכובות פנוליות ומטבוליטים בדגימות הפלזמה (טבלה 3). ברשימה זו, הן תרכובות פנוליות ואת המטבוליטים שלהם, כגון 3-hidroxyphenylvaleric חומצה ואיזופרופיל 3-(3,4-דיהידרוקסיפניל)-2-hydroxypropanoate, נמצאו. מאז מצב יינון שלילי מתאים ביותר עבור כל המחלקות של תרכובות פנוליות, למעט אנתוציאנינים, תרכובות אלה לא ניתן לזהות עם השיטה הנוכחית. אם אנתוציאנינים הם מרכיבים חשובים של מטריצת המזון, יש להשתמש גם במצב החיובי.
| מטבוליטים פנוליים | ר.ט. (דקה) | נוסחה | קודמן | מסה ניסיונית | מסה תיאורטית | הפרש (ppm) | |
| 2,3-חומצה דיהידרוקסיבנזואית | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-חומצה הידרוקסיהיפורית | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-דיהידרוקסיטולון | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-חומצה הידרוקסיפנילוולרית | 6.717 | C11H144O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-דיהידרוקסיפניל)-חומצה ולרית | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-הידרוקסיאנטרודיול | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| אג'וגול | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| חומצה בנזואית | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| חומצה קרנוזית | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| קרנוסול | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| קטכול | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| גליציטין | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| הספרטין | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| חומצה היפופורית | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| חומצה הומובנילית | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| איזופרופיל 3-(3,4-דיהידרוקסיפניל)-2-הידרוקסיפרופנואט | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| חומצה פנילאצטית | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| חומצה פלורטית | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protocatechuic aldehyde | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| סקואיסולריקירסינול | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| ונילין | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| אפיקאצ'ין 3'-או-גלוקורוניד | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| גומיסין M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| איריזולדון | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| אורוליטין C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
טבלה 3: זיהוי לא סופי של תרכובות פנוליות ומטבוליטים בדגימות פלזמה על ידי שיטת UPLC-MS/MS הממוקדת למחצה.
כדי להעריך את האפקטיביות של השיטה המיועדת לזיהוי התרכובות הפנוליות העיקריות, או המטבוליטים שלהם, שנקלטו מהמאפין והמשקאות המכילים RSF, נותחו חמש דגימות אלטוריות של משתתפי המחקר, שהושגו לפני ואחרי ההתערבות בת 30 הימים. השפע היחסי של כל תרכובת חושב על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה (AUC) לאחר טיפול על ידי AUC לפני הטיפול. מניתוח זה, ניתן היה לראות כי כמה תרכובות הופיעו רק בדגימות שהושגו לפני הטיפול, אחרים נותרו ללא שינוי, בעוד חלקם גדלו לאחר צריכת המזונות הפונקציונליים. טבלה 4 מציגה את הרשימה של 12 תרכובות פנוליות שהראו עלייה בפלזמה לאחר צריכת 30 יום של מזונות המכילים RSF. חומצה פנילאצטית הייתה המטבוליט היחיד שנמצא באופן עקבי בריכוזים גבוהים יותר לאחר הטיפול. גליציטין, איזופלבון גליקוסילציה, וחומצה הידרוקסיפניאלוולרית 3(מטבוליט פנולי) גדלו בשלוש מתוך חמש הדגימות אך ירדו בשתיים האחרות. Gomisin M2, ליגנן, זוהה בשלוש מתוך חמש דגימות רק לאחר ההתערבות התזונתית. תרכובות פנוליות אחרות (כגון הספרטין, secoisolariciresinol, ונילין) ומטבוליטים (כגון 2-hydroxyhippuric חומצה) נמצאו רק במדגם אחד ורק לאחר הטיפול.
| דגימה (AUC לאחר טיפול/AUC לפני הטיפול) | |||||||
| תרכובת | נוסחה | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-חומצה הידרוקסיהיפורית | C18H33NO4 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 3-חומצה הידרוקסיפנילוולרית | C11H144O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-הידרוקסיאנטרודיול | C18H22O5 | nd | nd | T | nd | nd | |
| גליציטין | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| הספרטין | C16H14O6 | T | nd | nd | nd | nd | |
| חומצה פנילאצטית | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| חומצה פלורטית | C9H10O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| Protocatechuic aldehyde | C7H6O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| סקואיסולריקירסינול | C20H26O6 | T | nd | nd | nd | nd | |
| ונילין | C8H8O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| גומיסין M2 | C22H26O6 | nd | T | T | T | nd | |
טבלה 4: רשימה של תרכובות פנוליות שגדלו בפלזמה של קשישים לאחר צריכה של 30 יום של מזונות המכילים RSF. הנתונים הם היחסים של השפע (AUC) של כל תרכובת לאחר הטיפול לעומת השפע שלהם לפני הטיפול. T מציין כי המתחם זוהה רק במדגם לאחר הטיפול. Nd: לא זוהה.
איור 2: פרוטוקול לזיהוי מטבוליטים מורכבים פנוליים על ידי UPLC-MS/MS ממוקד למחצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי וכימות של פיטוכימיקלים ביואקטיביים הנספגים לאחר צריכת תוסף מזון או מזון חיוניים להדגמה והבנה של היתרונות הבריאותיים של תרכובות אלה ואת המזונות המכילים אותם. בעבודה הנוכחית פותחה שיטת UPLC-MS/MS, שמטרתה רק זיהוי של התרכובות הפנוליות העיקריות והמטבוליטים שלהן שהגדילו את הריכוז בפלזמה לאחר התערבות תזונתית של 30 יום עם שני מוצרי מזון שגובשו במיוחד עבור קשישים. ההנחה הייתה כי, אם תרכובת אחת גדלה או הופיעה בפלזמה רק לאחר תקופת ההתערבות, תרכובת זו נספגה ו/או biotransformed מן המזונות המשמשים בהתערבות.
UPLC-MS /MS היא אחת הטכנולוגיות המועדפות למחקרים מטבולומיים שבהם תרכובות משקל מולקולרי נמוך רבות מנותחות בו זמנית בדגימות מורכבות כדי להעריך את ההשפעה של טיפול כלשהו או שינוי סביבתי13. ניתן לעשות זאת באמצעות שיטות ממוקדות ולא ממוקדות (או כלליות). ניתוחים ממוקדים מתמקדים במספר קטן וידוע של מטבוליטים מעניינים. הם האפשרות הטובה ביותר לכימות תרכובות עם סטנדרטים זמינים, מתן הספציפיות הטובה ביותר ורגישות; עם זאת, שיטות אלה חייבות להיות ממוטבות ביסודיות עבור המטבוליטים שנבחרו ואינן מסוגלות לזהות תרכובות בלתי צפויות בדגימות12. במחקרים אחרים, HPLC בשילוב עם גלאי UV-vis שימש לזיהוי חומצות פנוליות ומטבוליטים בפלזמה, אבל סוג זה של מחקר השתמש בסטנדרטים אנליטיים כדי לזהות ולכמת את מתחם העניין15. במחקר אחר הוצעה תוספת של תקן פנימי18; עם זאת, רק חומצות פרוליות וקפאיות והמטבוליטים שלהם נותחו בעבודה זו. מצד שני, הסינתזה של סטנדרטים פנימיים של מטבוליטים פנוליים הוצעה כחלופה להיעדר סטנדרטים אנליטיים מסחריים19. עם זאת, הסינתזה של מגוון גדול של תרכובות פנוליות קשה, זמן רב, ויקר. שיטות לא ממוקדות מנסות לזהות ולזהות כמה שיותר תרכובות מולקולריות והן בעיקר יוצרות השערות12. הם יכולים לזהות כמה מאות תרכובות במדגם אחד על ידי הקצאת נוסחאות לאותות כרומטוגרפיים הניתנים לזיהוי עם תכונות אופייניות, כגון m / z או מסה מדויקת נמדדת, זמן שימור כרומטוגרפי, טביעת אצבע איזוטופית וכו ', כך שהנתונים שנוצרו על ידי ניתוחים אלה נפוצים מאוד ויכולים להיות קשים לפענוח200 . מכיוון שמטרת השיטה הנוכחית לא הייתה להשיג פרופיל מטבולי מלא של דגימות הפלזמה (אשר תהיה גישה לא ממוקדת) אלא לזהות את התרכובות הפנוליות העיקריות ואת המטבוליטים הפנוליים (שלא היו ידועים קודם לכן) בהם, תוכננה גישה ממוקדת למחצה. לשם כך, כל האותות המזוהים חולצו באופן אוטומטי עם התוכנה של המכשיר ולאחר מכן בהשוואה למסד נתונים שנוצר על ידי עצמו שהכיל 645 תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהם, אשר התקבלו ממסדי נתונים מקוונים בחינם. מסד הנתונים כלל תבניות פיצול MS/MS של התרכובות ששימשו להקצאת השם והנוסחה המורכבים, המאפשר זיהוי מדויק יותר של תרכובות בדגימה12.
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול היו 1) טיפול מקדים מדגם (מיצוי וריכוז של תרכובות פנוליות ומטבוליטים מדגימות פלזמה); 2) בניית מסד נתונים שלם וספציפי לניתוח ממוקד למחצה של הדגימות וזיהוי כל התרכובות האפשריות השייכות למחלקה מורכבת ספציפית; ו-3) בחירת הפרמטרים המשמשים את התוכנה האיכותית של המכשיר (סובלנות התאמה המונית ppm, וציון%) כדי לזהות במדויק את התרכובות במדגם. בטיפול מקדים מדגם, יש לנקוט זהירות כדי למנוע אובדן של תרכובות עניין, לשחזר אותם בריכוז סופי גבוה, ולהיות מסוגל לחסל תרכובות מפריעות. ביצירת מסד הנתונים הספציפי, חשוב לערוך חיפוש ספרותי יסודי ולאחר מכן להשתמש במסדי נתונים מקוונים בחינם כדי לקבל נתונים כימיים ספציפיים שישמשו לזיהוי מורכב במדגם. הבחירה של הערכים הטובים ביותר עבור התאמה המונית וציון נדרש אימות קודם של השיטה האנליטית באמצעות תקנים ודגימות ידועות21,22.
לאחר יישום הפרוטוקול, הבעיות הנפוצות והפתרונות המומלצים שלהם היו כדלקמן: 1) לא זוהו תרכובות בדגימות. זה היה בגלל הריכוז הנמוך של התרכובות, ניתן לפתור על ידי ייבוש המדגם מחדש המסה אותו בנפח קטן יותר. 2) אותות הופיעו ב- TIC, אך תרכובות לא זוהו. זה יכול להיות בגלל כישלון בכיול המוני, כך ההבדל בין מסות ניסיוניות ותיאורטיות היה גבוה. במקרה זה, הכיול ההמוני של המכשיר צריך להתבצע על פי היצרן והדגם של הציוד. סיבה שנייה יכולה להיות מסד נתונים אישי לא שלם, ולכן זה קריטי כדי לבדוק כל הזמן ולתחזק את מסד הנתונים. המוני תרכובות החשודות כבעלות עניין ניתן לבדוק ולהשוות אותן למאגרי מידע מקוונים הזמינים באופן חופשי או לספרות מדעית חדשה. 3) אותות הופיעו בריצות ריקות. זה מצביע על זיהום וניתן לפתור אותו על ידי ניקוי המחט והעמודה של הדגימה האוטומטית. פרוטוקול הניקוי הסטנדרטי הוא לבצע כמה ריצות באמצעות מתנול, אז isopropanol, ולבסוף acetonitrile כמו השלב הנייד. לאחר מכן העמודה משודכת מחדש, ומפעילה את השלב הנייד למשך 30 דקות לפחות.
הקשיים העיקריים בפיתוח של סוג זה של שיטה הם 1) הזמינות הביולוגית הנמוכה, באופן כללי, של כל פיטוכימיקלים, כולל תרכובות פנוליות, אשר מתרגם ריכוזי פלזמה נמוכים מאוד16; 2) המגוון הגבוה של תרכובות פנוליות הקיימות במזונות, אשר גדל על ידי חילוף החומרים שלהם biotransformation המתרחשים enterocytes אנושיים hepatocytes ואת microbiota23 המעי הגס; 3) היעדר תקנים (כמה תקנים קיימים אך קשה מאוד להשיג) עבור תרכובות רבות, במיוחד עבור מטבוליטים, ואת קיומו של כמה תרכובות לא ידועות או לא אופייניות23; ו 4) תגובות משתנות בקרב אנשים, הן בספיגה והן בחילוף החומרים של פיטוכימיקלים14. כדי להתגבר על הבעיה של ריכוזי פלזמה נמוכים של מטבוליטים פנוליים, הם צריכים להיות מופקים ומרוכזים. זה יכול להיות מושגת על ידי מיצוי מיקרו מוצק פאזה14 או, כמו בעבודה הנוכחית, על ידי תוספת של ממיסים כי לזרז חלבונים להמיס תרכובות פנוליות מטבוליטים, ואחריו אידוי ממס resuspension בנפח קטן יותר19. טכניקה זו היא פשוטה, כלכלית, ומתאים עבור מספר קטן של דגימות. עם זאת, ההתאוששות של תרכובות עניין ניתן לשפר בקלות באמצעות נפחי פלזמה גדולים יותר, כך הריכוז הסופי של כל התרכובות יהיה גבוה יותר. המגוון הגבוה של מטבוליטים פנוליים וחוסר סטנדרטים היא הסיבה מדוע גישה ממוקדת למחצה שימשה לזיהוי התרכובות שהוגברו על ידי ההתערבות לפני שניסה לכמת אותם. על ידי שימוש במסד נתונים שנוצר במיוחד במקום ניתוח לא ממוקד לחלוטין, ניתן היה להתעלם מהמטבוליטים העיקריים הרבים בפלזמה, תוך התמקדות רק בתרכובות הפנוליות והמטבוליטים שלהם. מגבלה חשובה של מסד נתונים זה, ספציפי עבור תרכובות פנוליות ואת המטבוליטים האנושיים שלהם, היה חוסר מידע ספקטרלי המוני עבור תרכובות רבות ואת המטבוליטים שלהם, אשר מפחית את הדיוק של זיהוי המתחם.
שונות גדולה בקרב אנשים נצפתה באופן קבוע במחקרים הערכת ספיגה וחילוף חומרים של תרכובות פנוליות, הן כמותית והן איכותית. בתוצאות הנוכחיות, אדם אחד הציג 18 תרכובות בדגימת הפלזמה שנלקחה לאחר ההתערבות, בעוד האחרים הראו רק 9 או 10. יתר על כן, תרכובות פנוליות רבות ומטבוליטים נמצאו רק בדגימות הבסיסיות (לפני ההתערבות), והם גם השתנו בקרב אנשים. בסך הכל, יותר ממחצית התרכובות שזוהו הראו ריכוזים גבוהים יותר (AUC) לפני מאשר לאחר ההתערבות או נמצאו רק בדגימות טרום התערבות. לכן, היה צורך להשוות דגימות בודדות שנלקחו לפני ואחרי ההתערבות כדי להבין אילו תרכובות היו למעשה גדלו על ידי זה. המטבוליט היחיד שגדל בעקביות לאחר הטיפול היה חומצה פנילאצטית, קטבוליט מיקרוביאלי של flavan-3-ols24 שנמצא בפלזמה של אנשים במחקרים חריפים של צריכת מזונות עשירים פנוליים14,25. רוב המחקרים שזיהו וכימתו מטבוליטים פנוליים בפלזמה היו מחקרים חריפים, שבהם ריכוזי המתחם היו במעקב במהלך 24 שעות לאחר צריכת הארוחה העשירה פנולית, וציין כי לאחר 24 שעות, הריכוזים שלהם היו ליד הערך הבסיסי19,25. לכן, זה מובן כי הדגימות שניתחו בעבודה הנוכחית הראו מספרים נמוכים וריכוזים של מטבוליטים פנוליים. לאחרונה, ג'אנג ואח ' 25 העריך את הצריכה של פטל אדום, הן במחקרים חריפים ולאחר 4 שבועות של תוספי. הם הבחינו כי הן התערבויות חריפות וכרוניות הגדילו תרכובות פנוליות ואת המטבוליטים שלהם, בעוד שלאחר תוספי 4 שבועות, ריכוז הפלזמה הבסיסית של כמה מטבוליטים גדל (urolithins, cinnamic, פנילפרופיוני, וחומצות hippuric) ואחרים ירד (נגזרות אנתוציאנין מצומדות).
בחינה סופית של השיטה שפותחה בעיתון הנוכחי מראה כי ברוב החלקים, היא התאימה היטב למטרה שלשמה היא נוצרה. הטיפול המקדים במדגם היה פשוט ויעיל, והושגו הפרדת UPLC וזיהוי MS/MS ממוקד למחצה של מטבוליטים פנוליים. שיטה ממוקדת למחצה זו יכולה להיות שימושית כגישת סינון ראשונה לזיהוי תרכובות פנוליות שניתן לספוג מטריצות מזון שונות, כמו גם את המטבוליטים הפנוליים הקיימים בפלזמה אנושית. יתר על כן, הפרוטוקול שימושי כי זה מאפשר זיהוי כאשר אין סטנדרטים מתרכובות פנוליות או מטבוליטים זמינים. לבסוף, השיטה משתמשת בכמות פלזמה קטנה, שהיא קריטית ברוב מחקרי vivo שבהם דגימות פלזמה הן נדירות. עם זאת, מומלץ כי, עבור מחקרים עתידיים, מחקר חריף צריך להתבצע לפני ההתערבות הכרונית כדי לזהות טוב יותר את התרכובות הפנוליות העיקריות מטבוליטים נספגו מן המזונות מנוסחים במיוחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה על התמיכה הכספית של CONACYT, מקסיקו (CB- 2016-01-286449), ו- UACJ-PIVA (פרויקטים 313-17-16 ו 335-18-13). OAMB רוצה להודות CONACYT למלגת הדוקטורט שלו. תמיכה טכנית ממשרד ייצור המולטימדיה של UACJ מוכרת בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
