Summary
توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لإلحاق اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) للبالغين Drosophila وفحص التكوين العصبي الناتج.
Abstract
الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تكوين الأعصاب استجابة للمرض أو الإصابة ليست مفهومة جيدا. ومع ذلك ، فإن فهم هذه الآليات أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات العصبية التجديدية. Drosophila melanogaster هو نموذج رائد لدراسات التطور العصبي ولكن تاريخيا لم يتم استغلالها للتحقيق في تجديد الدماغ الكبار. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن الدماغ البالغ يظهر نشاطا متزمنا منخفضا جدا. ومع ذلك، اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) إلى الدماغ المركزي Drosophila الكبار يؤدي إلى توليد خلايا عصبية جديدة وجليا جديدة. الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإصابة بسيطة ولكنها صارمة وصفها هنا الآن جعل الدماغ Drosophila الكبار نموذجا قويا لأبحاث التجديد العصبي. وفيما يلي تعليمات مفصلة عن (1) اختراق إصابات الدماغ المركزي الكبار و (2) تشريح، الكيمياء المناعية، والتصوير بعد الإصابة. هذه البروتوكولات تسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ للغاية، وسوف تسهل دراسات إضافية لتشريح الآليات الكامنة وراء التجديد العصبي.
Introduction
الأضرار التي لحقت الدماغ والجهاز العصبي هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يعاني ما يقرب من 1.5 مليون أمريكي من إصابات الدماغ الرضية (TBI) كل عام1 ، في حين يعاني ما يقدر ب 6 ملايين شخص في الولايات المتحدة وحدها من أمراض تنكسية عصبية ، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر2. يمكن أن يسبب كل من المرض وإصابة الدماغ انحطاطا عصبيا ، مما يؤدي إلى عيوب حسية ومعرفية ومحركات3. كان تطوير استراتيجيات علاجية لإصلاح الدماغ البشري صعبا بسبب فسيولوجيا الدماغ المعقدة. توفر الكائنات الحية النموذجية مثل Drosophila melanogaster نظاما بسيطا لتحديد الآليات الأساسية الكامنة وراء التنكس العصبي والأهداف العلاجية المحتملة4.
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster كان كائنا نموذجيا قويا لأكثر من قرن من الزمان ، والنهوض بمجالات علم الوراثة ، وعلم الأحياء التنموي ، وعلم الأعصاب5،6. الدماغ Drosophila يضم فقط ~ 90،000 neurons7، مليون مرة أقل من متوسط الدماغ البشري8، ولكن لديهم العديد من أوجه التشابه. كل من الإنسان ويطير العقول الاستفادة من الناقلات العصبية GABA, الغلوتامات, أستيل, والأمينات الحيوية الدوبامين والسيروتونين9. يعمل Drosophila والخلايا العصبية البشرية أيضا بشكل مماثل ، مع بنية متشابكة مشتركة وأنواع الخلايا العصبية المماثلة10. حجم الدماغ الأصغر من Drosophila وتوافر تقنيات علم الوراثة المتقدمة ، بالإضافة إلى الحفاظ على الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية بين Drosophila والثدييات ، يسمح للباحثين Drosophila بطرح أسئلة غير عملية أو يصعب الإجابة عليها في نماذج الثدييات.
فهمنا الحالي لنشأة الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا، سواء أثناء الإصابة المنزلية أو بعدها، لا يزال محدودا. يعرف المزيد عن تكوين الأعصاب أثناء النمو الطبيعي. على سبيل المثال، يتم إنشاء الخلايا العصبية وغليا أثناء التنمية من الخلايا السليفة، ودعا neuroblasts10،11. وقد تم تمييز ما لا يقل عن ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الدماغ المركزي. كل من النوع الأول والنوع الثاني النسب neuroblasts الخروج من دورة الخلية ~ 20-30 ساعة بعد تشكيل puparium12. في المقابل، فإن الأروميات العصبية الجسم الفطر هي آخر لإنهاء انقسام الخلية والقيام بذلك عن طريق موت الخلايا المبرمج التي تعتمد على ريبر ~ 85-90 ساعة بعد تشكيل puparium13. بعد انهيار الدماغ ، والدماغ Drosophila الكبار لديها عدد قليل من الخلايا الفاصلة (~ 1 الخلية / الدماغ) ، في الغالب glia14. تمتلك الفصوص البصرية البالغة الأرومات العصبية القادرة على تكوين الأعصاب ببطء15 ، في حين أن الدماغ المركزي البالغ ليس لديه أرومة عصبية معروفة. ندرة السلف العصبية وانتشار الخلايا المحدودة يشبه بقوة الوضع في دماغ الثدييات البالغة ، مما يؤكد على الأهمية المحتملة لآليات تكوين الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا للبشر.
أدى اكتشاف مستويات منخفضة من تكوين الأعصاب للبالغين في الفصوص البصرية Drosophila البالغة بعد الإصابة15 إلى فرضية أن الدماغ المركزي Drosophila البالغ قد يكون قادرا أيضا على تكوين الأعصاب البالغ16. يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج صارم وقابل للاستنساخ لإصابة الدماغ المركزية في Drosophila البالغة التي يمكن استخدامها للتحقيق في تكوين الأعصاب في الدماغ المركزي للبالغين. وبالنظر إلى أوجه التشابه بين بنية الدماغ البشرية وبنية الدماغ الدروزوفيلا ووظيفتها، يمكن أن تؤدي هذه الاكتشافات إلى تحديد أهداف حاسمة لنشأة الأعصاب العلاجية في الأدمغة البشرية المصابة والمرضى.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوان في UW-Madison.
1. توليد Drosophila الكبار لPTBI
- بالنسبة للمتصليب القياسي، ضع 20 عذراء y[1] w[1]؛ UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 الإناث البالغات و 10 y[1] ث [1]17 الذباب الذكور البالغين معا في قوارير (انظر جدول المواد) التي تحتوي على الغذاء. أن يكون عدد كبير من ذرية متزامن، إعداد 10-20 الصلبان في نفس الوقت. الصليب القياسية يؤدي إلى ذرية F1 من النمط الجيني: y[1] ث [1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- ضع القنينات عند 25 درجة مئوية للتزاوج ووضع البيض. لتحقيق أقصى قدر من ذرية، نقل الآباء والأمهات إلى قوارير جديدة كل 2-4 أيام، والحفاظ على قوارير في وقت سابق في 25 درجة مئوية. تجاهل كل قارورة بعد 18 يوما من وضع الوالدين لأول مرة في ذلك لضمان عدم وجود ذرية F2.
ملاحظة: يمكن إنشاء 3 مجموعات من النسل ("broods") من كل مجموعة من الآباء والأمهات. - تحقق بعد ~ 10 أيام ، عندما يبدأ ذرية F1 في eclose.
- ضع القنينات عند 25 درجة مئوية للتزاوج ووضع البيض. لتحقيق أقصى قدر من ذرية، نقل الآباء والأمهات إلى قوارير جديدة كل 2-4 أيام، والحفاظ على قوارير في وقت سابق في 25 درجة مئوية. تجاهل كل قارورة بعد 18 يوما من وضع الوالدين لأول مرة في ذلك لضمان عدم وجود ذرية F2.
- لدراسات النسب، استخدم F1 perma-twin males15 من النمط الجيني: ث؛ FRT40A، UAS-CD2-RFP، UAS-GFP-Mir/FRT40A، UAS-CD8-GFP، UAS-CD2-Mir؛ الحوض-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. للاتساق، قم بهذا عبر في نفس الاتجاه في كل مرة.
- لتوليد الذكور perma التوأم، ضع 20 ث العذراء؛ FRT40A، UAS-CD2-RFP، UAS-GFP-مير؛ الحوض-GAL80ts/TM6B الإناث و 10 ث; FRT40A، UAS-CD8-GFP، UAS-CD2-مير؛ ACT-GAL4 UAS-flp/TM6B15 الذكور البالغين معا في قوارير تحتوي على الغذاء.
- ضع القنينات عند 17 درجة مئوية للتزاوج ووضع البيض. نقل الآباء إلى قوارير من الطعام الجديد كل 7 أيام، والحفاظ على جميع القنينات في 17 درجة مئوية. تجاهل كل قارورة بعد 35 يوما من وضع الوالدين لأول مرة في ذلك لضمان عدم وجود ذرية F2.
- تحقق بعد ~ 21 يوما ، عندما يبدأ ذرية F1 في eclose.
2. اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI; الشكل 1)
- فرز الذباب F1 eclosed حديثا. حدد الذكور الشباب في غضون 6 ساعة بعد الانهيار. ضع هؤلاء الذكور في قوارير نظيفة تحتوي على الطعام ، مع 40 ذبابة أو أقل لكل قارورة.
ملاحظة: يتم إنجاز هذا بسهولة أكبر في منتصف الصباح عن طريق تخدير الذباب على وسادة ثاني أكسيد الكربون وتحديد الذكور البالغين الذين لا يزال لديهم الميكونيوم (مرئية كتقعة خضراء داكنة من خلال جدار البطن) في أحشائهم. - تغذية مسبقة مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) (انظر جدول المواد) لمدة 6 ساعة قبل الإصابة إذا التخطيط لتسمية الخلايا الفاصلة مع EdU. راجع الخطوة 3 للحصول على التفاصيل.
- تعقيم دبابيس مينوتين (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق على الأقل عن طريق وضع دبابيس ~ 100 في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مليئة بالإيثانول بنسبة 70٪.
- تعقيم وسادة ثاني أكسيد الكربون وفرشاة الطلاء عن طريق رش الإيثانول بنسبة 70٪ ومسح الجافة مع الأنسجة النظيفة خالية من الوبر. بمجرد أن تكون الأدوات نظيفة وجافة ، قم بنقل 40 أو أقل من الذكور F1 المفرزة مرة أخرى إلى اللوحة النظيفة.
- فصل الذكور F1 إلى مجموعتين على منصة الطيران. مجموعة واحدة ستكون بمثابة ذباب مسيطر وغير مصاب. وستخضع المجموعة التجريبية الثانية ل PTBI.
- باستخدام ملقط، سحب 4-5 دبابيس مينوتين جديدة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ووضعها بالقرب من حافة لوحة ثاني أكسيد الكربون. تحت نطاق تشريح، واختيار دبوس Minutien على التوالي مع نقطة حادة.
ملاحظة: استخدام دبوس Minutien واحد لتجربة سوف يقلل من التباين. إعادة استخدام دبابيس حادة. ضع دبابيس تالفة أو حادة في أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 مل يحتوي على الإيثانول بنسبة 70٪ للتخلص الآمن. - إذا كنت تعمل مع الذباب من الصليب القياسية، قم بتشغيل مصباح الصمام الثنائي المنبعث للضوء (LED) المجهر ستيريو مجهزة مرشحات الإثارة والانبعاثات المناسبة للبروتين الفلوري الأخضر (GFP). هذا يسمح الإثارة في 440-460 nM ويسمح التصور من 500-560 nM.
ملاحظة: مع هذا المصباح ومجموعة التصفية، فإن أجسام الخلية من الجسم الفطر فلوريس الأخضر من خلال قطع الرأس (الشكل 1C). بالنسبة للذباب التوأم أو الذباب من الأنماط الجينية الأخرى ، يمكن استخدام مضيء ضوء أبيض قياسي للمجهر الاستريو لتصور المعالم على البشرة الرأسية لاستهداف إصابة جسم الفطر (الشكل 1C). - استخدام ملقط لالتقاط وعقد دبوس Minutien المحدد في يد واحدة (للأشخاص اليد اليمنى، وهذا هو عادة اليد اليمنى) وفرشاة الطلاء في اليد الأخرى (اليسار عادة). اختيار ذبابة من المجموعة التجريبية ووضع ذبابة بحيث يكون لديك عرض الظهرية من كبسولة الرأس مع رأس الذبابة إلى اليمين. ضع الفرشاة على الجزء الأمامي من الصدر الظهري وادفع لأسفل بلطف لتثبيت الذبابة.
- صوب طرف دبوس مينوتين إلى أجسام خلايا جسم الفطر على الجانب الأيمن من الرأس واختراق كبسولة الرأس. إذا كنت تستخدم المعالم، استهدف قطع الرأس الظهرية بين الocelli والحافة الظهرية للعين (الشكل 1).
- بعد الانتهاء من الإصابة، استخدم فرشاة الطلاء لدفع الرأس بلطف من دبوس مينوتين.
- إذا كان استخدام الدماغ لRNA-Seq أو qRT-PCR، وجعل إصابة ثانية على الجانب الأيسر من الرأس.
- كرر الخطوات 2.8-2.10 لإصابة جميع الذباب في المجموعة التجريبية.
- بمجرد إصابة جميع الذباب ، ضع التحكم والذباب المصاب في قارورات منفصلة تحمل علامة تحتوي على الطعام. وضع قوارير أفقيا (أي على الجانبين) في حين أن الذباب يتعافى من التخدير وخلال الشيخوخة اللاحقة لمنع الذباب من الوقوع في الطعام.
- ضع الذباب الصلب القياسي عند 25 درجة مئوية ، ويطير perma-twin عند 30 درجة مئوية إلى العمر.
- بالنسبة للذباب الذي يزيد عمره عن 24 ساعة، ضعه على الطعام النظيف كل يوم إلى يومين.
3. EdU وضع العلامات
- إعداد مخزون من 10 M 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO). ويمكن تخزين هذا في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
- إعداد 200 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إدو في السكروز 10٪. يطير قبل تغذية مع EdU لمدة 6 ساعة قبل PTBI.
- ضع 200 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إدو في 10٪ سكروز على ورقة تصفية مستديرة من الدرجة 3 عيار 23 ملم (انظر جدول المواد) في قارورة فارغة.
- ضع الذباب في القارورة. ثم ختم القارورة مع قابس القطن.
- وضع القارورة أفقيا في حاضنة مرطبة في 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعة.
- نفذ PTBI كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.10.
- ضع الذباب مرة أخرى في القارورة المحتوية على EdU. ختم القارورة مع قابس القطن.
- وضع القارورة أفقيا في حاضنة مرطبة في 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. اتبع إحدى الخطوات الموضحة أدناه (الخطوة 3.8.1-3.8.3).
- تشريح وإصلاح العقول كما هو موضح في الخطوة 4 باستخدام مثبت، وغسل العازلة، ومنع العازلة دون أزيد ومع رد فعل الكشف EdU التي أجريت قبل تلطيخ الأجسام المضادة.
- نقل الذباب إلى قارورة نظيفة تحتوي على ورقة فلتر جديدة و 200 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إدو في السكروز 10٪. وضع القارورة أفقيا في حاضنة 25 درجة مئوية. كرر كل 24 ساعة خلال مدة وضع العلامات. ثم، تشريح وإصلاح العقول كما هو موضح في الخطوة 4 باستخدام المخازن المؤقتة دون azide مع رد فعل الكشف EdU التي أجريت قبل تلطيخ الأجسام المضادة.
- لنبض مطاردة التسمية مع EdU، تغذية EdU لفترة النبض، ونقل الذباب كل 24 ساعة إلى قارورة نظيفة تحتوي على ورقة فلتر جديدة و 200 ميكروغرام من 50 ميكرومتر في السكروز 10٪. بعد فترة النبض (على سبيل المثال، 4 أيام)، نقل الذباب إلى قارورة تحتوي على الغذاء Drosophila القياسية. ضع القارورة على جانبها في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام إضافية. ثم، تشريح وإصلاح العقول كما هو موضح في الخطوة 4 باستخدام المخازن المؤقتة دون azide مع رد فعل الكشف EdU التي أجريت قبل تلطيخ الأجسام المضادة.
4. تشريح، الكيمياء المناعية، وتصاعد
- إعداد أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من المثبت: 4٪ الفورمالديهايد في PEM (100 مللي متر بيبرازين-N، N'bis (2-ethanesulfonic حمض) [PIPES]، 1 M EGTA، 1 mM MgSO4، pH 7.0) (انظر جدول المواد) ومكان على الجليد.
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 20 دماغا من نمط وراثي وحالة واحدة في أنبوب واحد. - إعداد لوحة تشريح مع بركة صغيرة واحدة (~ 100 ميكرولتر) من الإيثانول 70٪ وثلاثة برك صغيرة من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS؛ 100 mM من K2HPO4، 140 mM من NaCl، درجة الحموضة 7.0).
- تخدير ~ 10 التحكم أو الذباب التجريبي على وسادة ثاني أكسيد الكربون التي تم تطهيرها مع الإيثانول 70٪.
- فصل الرأس من جذع كل ذبابة باستخدام مشرط.
- جمع رؤساء مع فرشاة مبللة في الإيثانول 70٪ ووضع رؤساء لمدة 2-5 دقيقة في بركة الإيثانول على لوحة تشريح.
ملاحظة: هذا يجفف قليلا العقول ويجعلها أسهل لتشريح بعيدا عن كتل الرأس. - نقل رؤساء إلى تجمع ~ 100 μL من برنامج تلفزيوني وتشريح العقول ، ونقل كل دماغ إلى تجمع نظيف ~ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تنفيذ هذا باستخدام اثنين من أزواج من ملقط صانعي الساعات لفتح الجزء الخلفي من كشل الرأس وعقد كندل مع زوج واحد من ملقط في حين المتطفلين بلطف الدماغ من كتيكل باستخدام غيض مغلقة من الزوج الثاني من ملقط.
- نقل الأدمغة تشريح إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على 100 ميكرولتر من حل تحديد باستخدام ماسور P200 مجهزة طرف من البلاستيك التي تم قطع و شطب للسماح بدخول العقول.
- إصلاح لمدة 20-25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الإصلاح بعناية مع إما P200 أو ماصة زجاجية.
- غسل العقول الثابتة أربع مرات مع 1 مل من 'PT' (برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ تريتون X-100)، مما يسمح للأدمغة لتسوية لعدة دقائق بين كل غسل.
ملاحظة: إذا لم تستقر الأدمغة بسرعة بين الغسيل، فمن المرجح أن يكون جسمها لا يزال سمينا و/أو القصبة الهوائية المرفقة. - كتلة العينات في 1 مل من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ تريتون X-100 و 2٪ ألبوم مصل البقر (PBT) ل ~ 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل حجب والعينات احتضان مع 100 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في PBT. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة هي أرنب المضادة PH3 (1:500) والفأر المضادة Fasiclin الثاني (1:20) (انظر جدول المواد).
- غسل العينات خمس مرات مع 1 مل من PT، مما يسمح للأدمغة لتسوية لعدة دقائق بين كل غسل.
- إزالة غسل النهائي واحتضان في 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا هي مضادة للأرانب 568 (1:400) و Cy5 المضادة للفأرة (1:100) (انظر جدول المواد).
- غسل العينات خمس مرات مع 1 مل من PT، مما يسمح للأدمغة لتسوية لعدة دقائق بين كل غسل. خلال الغسيل النهائي، إضافة 4'،6-Diamidino-2-Phenylindole، ديهيدروكلوريد (DAPI؛ 1:100 من محلول 10 ميكرومتر) لمدة 10 دقائق لتلطيخ النوى. إزالة الغسيل، وترك 50-100 ميكرولتر في كل أنبوب.
- إعداد الشرائح المجهر عن طريق وضع واحد، تسمية تعزيز ذاتية اللصق على منتصف كل شريحة وقطرات 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام المضادة للتلاشي تصاعد في وسط كل تسمية (انظر جدول المواد). تحمل علامة التعزيز الغطاء فوق الشرائح قليلا وتمنع الأدمغة المركبة من أن تصبح مسطحة بشكل مفرط.
- نقل بعناية العقول من كل أنبوب الطرد الدقيق إلى شريحة أعدت مع أقل قدر ممكن من العازلة غسل باستخدام P200 مجهزة قطع ومغلفة طرف من البلاستيك. يمكن تركيب ما يصل إلى 10 أدمغة على شريحة واحدة.
- استخدم ملقط لإعادة وضع الأدمغة برفق قبل وضع غطاء على كل شريحة وختم الشريحة بطلاء الأظافر. توجيه العقول مع الجانب الخلفي إما حتى أو الجانب الأمامي حتى ولكن لا ينبغي أن يكون لمس بعضها البعض.
ملاحظة: نظرا لأنه من الصعب الحصول على صور confocal عالية الجودة من خلال الدماغ بأكمله، يجب تركيب بعض العقول في كل اتجاه. - تخزين الشرائح المعدة مسطحة وفي الظلام عند 4 درجة مئوية حتى التصوير. بالنسبة للتخزين على المدى الطويل (حتى سنة واحدة)، قد يتم تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.
5. التصوير الكونفوجال
ملاحظة: أدمغة الصور باستخدام مجهر كونفوجال ليزر المسح بأشعة الليزر ومكعبات فلتر الانبعاثات المناسبة ل DAPI والأجسام المضادة الثانوية الفلورية (أي 405 نانومتر و488 نانومتر و568 نانومتر، 633 نانومتر، على التوالي).
- قم بتشغيل قوة المجهر وأشعة الليزر ووحدة التحكم والكمبيوتر.
- افتح برنامج الاستحواذ.
- في وضع Acquisition ، حدد ما يصل إلى أربع قنوات وحدد المعلمة للمسح التسلسلي للقنوات المطلوبة. زيادة طاقة الليزر لكل قناة إلى 5-10٪.
- ضع شريحة على المجهر.
- اختر الدماغ الذي سيتم تصويره باستخدام مرفق الفلوروريسينس (انظر جدول المواد).
- في وضع الاقتناء، حدد 1024 × 1024 بكسل كبعد الإطار.
- في وضع Acquisition ، حدد خيار Z-stack ، واذكر أنه يجب أخذ Z-stack في مقاطع 2 ميكرومتر ، والتركيز من خلال العينة ، وتحديد المستويات البؤرية العلوية والسفلية التي سيتم تصويرها.
- جمع صور Z-كومة من العقول بأكملها باستخدام هدف 20x ومناطق الدماغ محددة مثل الجسم الفطر باستخدام هدف 60x.
6. تحليل البيانات
- تحديد الخلايا المتكاثرة وأعداد المستنسخين ثنائيي البروم يدويا و/أو باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد). عند استخدام البرنامج، حدد المناطق ذات الأهمية (ROIs) بمساحات لا تقل عن 10 ميكرومتر.
Representative Results
PTBI يحفز انتشار الخلايا
لتحديد مدى تكوين الأعصاب بعد PTBI الدماغ المركزي، تم قياس الاستجابة التكاثرية في الذكور البالغين الشباب التي تم جمعها والجرحى في غضون 6 ساعة من الانفجار. ولوحظت زيادة كبيرة في الانتشار 24 ساعة بعد الإصابة باستخدام مضاد الفوسفوهيستون 3 (PH3)، وهو علامة للخلايا التي تمر بنشاط الانقسام. ويلاحظ ما يقرب من 3 خلايا PH3 + في السيطرة على العقول المركزية و 11 خلايا PH3 + في الأدمغة المركزية المصابة 24 ساعة بعد PTBI (الشكل 2A-D). وتقع غالبية الخلايا الفاصلة بالقرب من موقع الإصابة. واستخدم اختبار ثان لتقسيم الخلايا لتحديد كمية الانتشار التراكمي للخلايا الناجم عن إصابة واحدة وتقييم مدى نجاة الخلايا المنشأة حديثا. 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) هو التناظرية الثيميدين التي يمكن دمجها في الحمض النووي توليفها حديثا وتسمية الخلايا بشكل دائم التي خضعت لتوليف الحمض النووي. أعطيت الذباب نبضة لمدة 4 أيام من EdU ، تليها مطاردة لمدة 3 أيام. وكشف ذلك أن الخلايا المسماة كانت قابلة للحياة وبقيت على قيد الحياة بعد 3 أيام على الأقل من الانتشار. وبحلول 7 أيام، كان هناك ما متوسطه 2 خلايا EdU+ في الأدمغة المركزية المسيطرة ومتوسط 11 خلية EdU+ في الأدمغة المركزية المصابة، على التوالي (الشكل 2E). وهذا مشابه للنتائج التي تم الحصول عليها بعد الإصابة ب 24 ساعة باستخدام الأجسام المضادة PH3. عندما يتم قياس انتشار الخلايا في 14 يوما، بلغ متوسط الضوابط غير المصابة خلية EdU + لكل دماغ مركزي، في حين بلغ متوسط الأدمغة المصابة 29 خلية EdU + (الشكل 2E)، مما يدل على أن انتشار الخلايا يستمر على الأقل في الأسبوع الثاني بعد PTBI.
انتشار الخلايا يعتمد على العمر
ولوحظت أكبر استجابة تكاثرية في الدماغ المركزي خلال أول 24 ساعة بعد الانفجار (الشكل 3). بحلول 7 أيام بعد الانهيار ، لا تزال الإصابة المخترقة تسبب زيادة كبيرة في الانتشار ، بمتوسط 6 خلايا PH3 + لكل دماغ مركزي. ومع ذلك ، من قبل 14 يوما بعد الانهيار ، والقدرة على تقسيم الخلايا بعد PTBI يقلل بشكل كبير إلى خلية واحدة تقسيم ، على غرار ذلك من العقول السيطرة (الشكل 3). وبالتالي، فإن احتمال انتشار الخلايا بعد PTBI يعتمد على العمر.
يمكن للخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثا المشروع لتصحيح المناطق المستهدفة
لتقييم التجديد العصبي بعد PTBI ، تم استخدام نظام وضع العلامات perma-twin15. نسب بيرما التوأم تتبع التسميات بشكل دائم تقسيم الخلايا وذرية مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP)15. وقد اكتشف عدد أكبر من المستنسخين من التوأمين في عينات مصابة، في غضون يومين و أسبوعين، مما كان عليه في الضوابط (الشكل 4A-E). وتجدر الإشارة إلى أن هناك خلايا عصبية جديدة الجسم الفطر في ~ 50٪ من العقول PTBI 2 أسابيع بعد الإصابة (الشكل 4N). هذه الخلايا العصبية الجديدة المتوقعة dendrites بشكل مناسب للكاليك الجسم الفطر والم محاور عصبية بشكل مناسب لفص الجسم الفطر (الشكل 4D، F، G). وهذا يشير إلى أن الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا قد تكون الخلايا العصبية الوظيفية المشاركة في إصلاح أجسام الفطر التالفة. وتشمل المناطق الأخرى من الدماغ التي يبدو أنها تتجدد الجسم الإهليلجي (EB) (الشكل 4H، I)، فصوص الهوائيات (AL) (الشكل 4J، K)، والقرن الجانبي (LH) (الشكل 4L، M) التي تمتلك استنساخات كبيرة حوالي 26٪، 26٪، و 20٪ من الوقت، على التوالي (الشكل 4N). وتؤكد هذه النتائج فائدة هذا النظام للتحقيق في تكوين الأعصاب للبالغين. يظهر نموذج مقترح لتسلسل الأحداث التالية PTBI ويؤدي إلى توليد خلايا عصبية جديدة في الشكل 5.
الشكل 1: اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) إلى الدماغ المركزي Drosophila الكبار. (أ) التخطيطي من الخارج من رأس ذبابة الكبار. هذا هو وجهة نظر الجبهة. وهكذا، فإن الجانب الأيمن من الحيوان هو إلى يسار المشاهد. (ب) تخطيطي من الداخل من رئيس Drosophila الكبار مع مسار الإصابة المشار إليها باللون الرمادي. هذا هو عرض الخلفي. وهكذا، في هذه الصورة والأرقام اللاحقة، الجانب الأيمن من الدماغ هو إلى اليمين. يؤثر PTBI الدماغ المركزي هياكل الدماغ متعددة, بما في ذلك الجسم الفطر (الأخضر) والأنسجة خارج الدماغ, بما في ذلك الجسم الدهني (الأزرق) وخلايا الدم البيضاء (الأحمر). CB = منطقة الدماغ المركزية. OL = منطقة الفص البصري. (ج) منظر دورسال لرأس بالغ حي يتم فيه تسمية أجسام الفطر (رؤوس الأسهم) ببروتين فلوري أخضر (GFP). هذا هو "النمط الجيني القياسي" (انظر النص للحصول على التفاصيل). ينتج بروتوكول PTBI بشكل مستنسخ إصابة أجسام الفطر. تم اقتباس هذا الرقم من Reference16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يحفز PTBI انتشار الخلايا. مخططات التحكم غير المصاب (A) وPTBI (B). تشير المربعات الزرقاء في الزوايا اليمنى العليا إلى مناطق الدماغ الموضحة في التكبير الأعلى في الألواح (C) و (D). (C, D) PH3 الأجسام المضادة (الأحمر) كان يستخدم لارساء انتشار الخلايا 24 ساعة بعد الاصابة. في السيطرة على العقول (C) ، وهناك عدد قليل من خلايا PH3 + وليس بالقرب من MB. ومع ذلك، في أدمغة PTBI (D)، هناك خلايا PH3+ بالقرب من MB. (ه) تحديد كمية الخلايا المنتشرة. تعكس الأرقام الخلايا المنتشرة في جميع أنحاء الأدمغة بأكملها ، ليس فقط بالقرب من جسم الفطر. في 24 ساعة، وكان العقول السيطرة غير مصاب في المتوسط 3 خلايا PH3 + / الدماغ (ن = 11 العقول، 28 الخلايا)، في حين 24 ساعة بعد PTBI، وكان العقول في المتوسط 11 خلايا PH3 + / الدماغ (ن = 17 العقول، 181 الخلايا). في 7 أيام، والضوابط غير المصابين لديها عدد قليل من خلايا EdU + ، مع متوسط 2 EdU + الخلايا / الدماغ (ن = 15 العقول ، 24 خلية) ، في حين أن 7 أيام بعد PTBI العقول كان متوسط 11 EdU + الخلايا / الدماغ (ن = 22 العقول ، 238 خلية). في 14 يوما، والضوابط غير المصابين لديها في المتوسط 1 EdU + الخلية / الدماغ (ن = 8 العقول،11 الخلايا)، في حين أن 14 يوما بعد PTBI العقول لديها في المتوسط 29 خلايا EdU + / الدماغ (ن = 14 العقول، 400 الخلايا). لهذه المجموعة من التجارب، تم استخدام الذكور البالغين الشباب داخل 6 ساعة من eclosion. الاختبارات t غير المدفوعة لعينات التحكم وPTBI عند قيم العائد النقاط 3 مرات p<0.0001 و p<0.0001 و p<0.0002 على التوالي. تعكس أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). تم اقتباس هذا الرقم من Reference16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقل الاستجابة التكاثرية ل PTBI مع التقدم في العمر. لاستكشاف ما إذا كان العمر يؤثر على كمية انتشار الخلايا التي تحدث بعد الإصابة ، تمت مقارنة الذكور البالغين الممنوعين حديثا بالحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين 7 أيام و 14 يوما و 28 يوما قبل PTBI ، باستخدام ANTI-PH3 لتقصي انتشار الخلايا بعد 24 ساعة من الإصابة. الذباب المصاب في غضون 6 ساعة من الانفجار كان متوسط 11 خلايا PH3 + / الدماغ (ن = 17 العقول، 182 الخلايا) مقارنة بمتوسط 3 خلايا PH3 + / الدماغ في الضوابط المتطابقة مع العمر (ن = 11 العقول، 28 خلية). الذباب الذين تتراوح أعمارهم بين 7 أيام، ثم تعرض لPTBI، وكان في المتوسط 6 خلايا PH3 + / الدماغ (ن = 11 العقول، 65 خلية) بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة مع العمر مع متوسط 2 خلايا PH3 + / الدماغ (ن = 5 العقول، 12 خلية). عندما كان الذباب تتراوح أعمارهم بين 14 يوما قبل PTBI و المقايسة 24 ساعة في وقت لاحق، كان هناك في المتوسط 1 PH3 + الخلية / الدماغ (ن = 8 العقول، 11 خلية) مماثلة للضوابط المتطابقة مع العمر، والتي بلغ متوسطها أيضا 1 PH3 + الخلية / الدماغ (ن = 4 أدمغة، 2 الخلايا). 28 يوما السيطرة غير مصاب (ن = 4، 1 خلية) وPTBI (ن = 3، 1 خلية) الذباب على حد سواء في المتوسط 0 PH3 + الخلايا / الدماغ. اختبارات t غير المدفوعة ل PTBI للتحكم في المقارنات في هذه النقاط 4 مرات هي p<0.0001 و p<0.04 و p<0.07 و p<0.84 على التوالي. تم اقتباس هذا الرقم من Reference16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يظهر تتبع النسب التوأم Perma تجديد الدماغ والاستهداف المناسب للم محاور المحاور التالية ل PTBI. تم استخدام نظام تتبع النسب التوأم perma15 لتحليل تكوين الأعصاب بعد PTBI. يقوم هذا النظام بتصنيف الخلايا المقسمة والذرية بشكل دائم مع بروتين فلوري أخضر (GFP) أو بروتين فلوري أحمر (RFP). تمت تربية الذباب عند 17 درجة مئوية للحفاظ على النظام خارج أثناء التطوير. تم جمع ذكور F1 الذين يحملون متحولين ثنائيين عند الانفجار ، ثم أصيبوا ووضعوا عند 30 درجة مئوية للتعافي لمدة يومين أو 14 يوما. (أ) في الضوابط غير المصابة لمدة يومين ، هناك بعض خلايا GFP + المنتشرة في جميع أنحاء الدماغ. (ب) في 14 يوما، وهناك عدد قليل نسبيا من الخلايا GFP + موجودة في الدماغ المركزي السيطرة. (ج) بالمقارنة، الأدمغة المصابة لمدة يومين لديها خلايا GFP+ أكثر تميل إلى التجمع بالقرب من الإصابة (رأس السهم). (د) في 14 يوما بعد الإصابة، هناك استنساخ كبير بالقرب من موقع الإصابة. بعض هذه المستنسخات لديها محاور المحاور التي المشروع على طول مساحات الجسم الفطر (رأس السهم). يتم عرض قناة GFP فقط هنا؛ كانت هناك مماثلة RFP + استنساخ في عينات PTBI. (ه) يزيد عدد المستنسخين بمرور الوقت في الأدمغة غير المصابة بعد PTBI.Control (ن = 13) بمعدل 10 مستنسخين في يومين، في حين أن أدمغة PTBI لمدة يومين (ن = 20) لديها ما متوسطه 23 استنساخا (p<0.00002). في 7 أيام، كان متوسط أدمغة التحكم 9 استنساخ لكل دماغ (ن = 18)، في حين أن أدمغة PTBI لمدة 7 أيام كان متوسطها 39 استنساخ لكل دماغ (ن = 16) (p-value<0.000000002). وهذا أكثر بكثير من عدد المستنسخين الذين شوهدوا في اليومين التاليين للإصابة (p-value<0.0009). في أدمغة التحكم لمدة 14 يوما ، هناك ما متوسطه 10 استنساخ لكل دماغ ، وهو ما لا يختلف كثيرا عن عناصر التحكم لمدة يومين و7 أيام. ومع ذلك ، في 14 يوما بعد PTBI ، هناك ما متوسطه 66 استنساخ GFP + ، وهو أكثر بكثير من أي من الضوابط المتطابقة مع العمر (p<0.0000003) أو 2-يوم بعد PTBI العقول (ع القيمة <0.0001). تعكس أشرطة الخطأ SD. (F-M) PTBI يحفز تشكيل استنساخ في مناطق متعددة في الدماغ. لوحات على الجانب الأيسر هي مخططات مناطق الدماغ حيث تم العثور على استنساخ كبيرة 14 يوما بعد PTBI (A، H، J، L). لوحات على اليمين تظهر تكبيرات عالية من العقول التمثيلية (G، I، K، M). وكان لدى العديد من الأدمغة التي استمرت 14 يوما استنساخات توقعت مناطق مستهدفة معينة. وشملت هذه الجسم الفطر (MB) (F, G), الجسم بيضاوي الشكل (EB) (H, I), الفص الهوائي (AL) (J, K), والقرن الجانبي (LH) (L, M). (ن) كل من عدد استنساخ واستنساخ حجم الزيادة مع الوقت بعد PTBI.The نسب مناطق الدماغ مع استنساخ كبيرة حسبت في 2 و 7 و 14 يوما في الضوابط والأدمغة المصابة. في 2 أيام، وأظهرت ~ 8٪ من العقول السيطرة (ن = 13) استنساخ AL، في حين لم تكن هناك استنساخ AL في العقول المصابة لمدة يومين (ن = 20). في 7 أيام السيطرة على العقول (ن = 18) ، وكان 6 ٪ AL و 6 ٪ استنساخ EB. في 7 أيام بعد PTBI (ن = 16) ، وكان 6 ٪ من العقول أيضا استنساخ AL ، وكان 6 ٪ استنساخ EB ، و 19 ٪ كان استنساخ ميغابايت كبيرة. في 14 يوما، والسيطرة على العقول (ن = 9) لم تظهر أي مناطق محددة مع استنساخ، في حين أن 47٪ من العقول PTBI (ن = 15) كان استنساخ MB، 20٪ من العقول PTBI كان استنساخ AL، و 27٪ من العقول PTBI كان استنساخ EB، و 27٪ كان استنساخ LH. تم اقتباس هذا الرقم من Reference16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نموذج موجز للتجديد بعد اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI). في الشباب البالغين Drosophila، هناك خلايا هادئة تشبه الأرومية العصبية داخل الدماغ المركزي التي تفتقر إلى التعبير عن الجينات الأرومية العصبية الكنسية. بحلول 24 ساعة بعد PTBI ، يتم تنشيط الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية الهادئة ، والتعبير عن جينات الأرومة العصبية ، وبدأت في الانتشار. في كل من 4 ساعة و 24 ساعة بعد PTBI ، هناك موجة من موت الخلية16. في 7 أيام، ومعدل الانتشار لا يزال مرتفعا، والعديد من الخلايا الجديدة قد اعتمدت هويات الخلايا الناضجة، لتصبح الخلايا العصبية أو غليا. في 14 يوما بعد PTBI، استنساخ كبيرة من الخلايا العصبية الجديدة مع محاور عصبية وdendrites إسقاط بشكل صحيح إلى المناطق المستهدفة الخاصة بهم. كما يتم استعادة العيوب الحركية من قبل 14 يوما، مما يشير إلى أن Drosophila الكبار يمكن تجديد وظيفيا وهيكليا. تم اقتباس هذا الرقم من Reference16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
على الرغم من أن الإصابات المخترقة لدماغ دروسوفيلا البالغ قد وصفت سابقا15,17,18، ركزت هذه الإصابات على الفصوص البصرية وليس الدماغ المركزي. وعلاوة على ذلك، لا توجد حتى الآن تعليمات مفصلة عن كيفية تنفيذ الإصابات. يصف هذا البروتوكول نموذجا لاختراق إصابة الدماغ المركزي Drosophila البالغ الذي يستنسخ أدلة ذات دلالة إحصائية لنشأة الأعصاب للبالغين بعد PTBI.
ويرجع استنساخ هذا البروتوكول PTBI، جزئيا، إلى الجسم الفطر كمنطقة الهدف الإصابة. جسم الفطر كبير ، ويتألف من ~ 2200 خلية عصبية مع التشعب المعقد و أربور المحور في صفائف كبيرة ونمطية للغاية18. تقع أجسام خلايا الخلايا العصبية لجسم الفطر بالقرب من سطح الدماغ ويمكن تصورها من خلال قطع الرأس باستخدام تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (الشكل 1C). سلائف الجسم الفطر هي الخلايا الجذعية العصبية الماضي للخضوع ل موت الخلايا المبرمج خلال development13,12,19. وهكذا، العديد من الخلايا العصبية الجسم الفطر هي صغيرة جدا في وقت الانفجار. وأدى ذلك إلى فرضية أن جسم الفطر قد يكون أكثر إمكانات ميتوتيك من مناطق الدماغ الأخرى16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جسم الفطر أمر بالغ الأهمية للتعلم والذاكرة18. وهذا يسمح للمرء أن يسأل ما إذا كان تكوين الأعصاب PTBI الناجمة يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي.
وتشمل العوامل الأخرى التي تسهم في إعادة إنتاج النتائج استخدام الذباب المتقاطع من الأنماط الجينية المتسقة، وأداء الصلبان في نفس الاتجاه في كل مرة، والتحكم بدقة في درجات الحرارة التنشئة والشيخوخة، وتحليل الذكور والإناث على حدة. استخدام الذباب F1 من خارج يقلل من احتمال تحليل العقول homozygous للطفرات العفوية. الصليب القياسي ل y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 الإناث الكبار إلى y[1] ث [1] الذكور البالغين الذباب النتائج في ذرية F1 من النمط الجيني y[1] ث [1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. يتم التعبير عن OK107-GAL4 في جميع الخلايا العصبية الجوهرية للجسم الفطر ويدفع التعبير عن مراسل غشاء ملزمة UAS-mCD8-GFP السماح التصور من أجسام الفطر وتوقعاتها. بالنسبة للمتصاليب perma-twin، يجب أن تظل الصلبان عند 17 درجة مئوية في جميع الأوقات للحفاظ على نظام تتبع النسب مغلقا. وهذا يضمن أنه لا توجد خلايا مقسمة وصفت أثناء التنمية وأن يتم تسمية الخلايا العصبية فقط الكبار المولد وغليا. وتحقيقا لهذه الغاية، يمكن أيضا الحفاظ على غرفة الطيران عند 17 درجة مئوية. على الرغم من أن الوصف الأولي للنظام perma-twin15 أوصى الذباب تربية في 18 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات الخلفية كبيرة.
للاتساق، فمن المستحسن أيضا للحفاظ على السيطرة الذباب غير مصاب على لوحة ثاني أكسيد الكربون كما ينفذ واحد PTBI. وهذا يضمن أن كلا المجموعتين من الذباب لديها التعرض مخدر متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن أن تخترق القابلية للاستنساخ الرأس تماما. ومع ذلك ، يجب الحرص على عدم ثني طرف الدبوس ضد الوسادة ، مما يجعلها غير صالحة للاستخدام للإصابات المستقبلية. بالنسبة للممارسين المهرة ، لا يوجد ضرر غير مقصود يذكر لذباب PTBI. ومع ذلك ، فإن الضغط بشدة على الصدر لتثبيت الذبابة أثناء الإصابة يمكن أن يكون قاتلا. إحدى الطرق لتقييم مدى الإصابة غير المقصودة هي تحديد معدل وفيات ذباب PTBI بعد الإصابة ب 24 ساعة. بالنسبة للذباب المصاب من جانب واحد ، يمكن أن يكون هذا 50٪ أو أعلى للمبتدئين. لذلك ، لضمان أن النتائج الملاحظة ترجع إلى PTBI وليس إلى إصابة غير مقصودة ، ينصح بأن يمارس المبتدئون إدارة PTBI على ~ 20 يطير يوميا على مدى عدة أسابيع ولا يحللون الأدمغة الناتجة حتى يتم <10٪ باستمرار معدل الوفيات 24 ساعة.
لتحديد كمية الانتشار التي يحفزها PTBI الدماغ المركزي، يمكن استخدام كل من مكافحة الفوسفوهيستون H3 (PH3) مناعة و5-إيثينيل-2'-deoxyuridine (EdU) التأسيس. مكافحة PH3 تسميات الخلايا قبل وطوال مرحلة ما بعد الطور، والحد من الكشف عن سوى جزء صغير من الخلايا تقسيم بنشاط. وهكذا، تلطيخ المضادة PH3 يوفر لمحة جزئية فقط من الانتشار. EdU هو التناظرية الثيميدين التي يمكن دمجها في الحمض النووي توليفها حديثا. عن طريق تغذية الذباب EdU قبل وبعد الإصابة، فمن الممكن الحصول على صورة أكثر اكتمالا من الخلايا التي هي إما تقسيم أو قد انقسمت بعد الإصابة. حقيقة أن أي خلايا تنقسم يتم وضع علامة دائمة مفيدة على حد سواء لتحديد الخلايا ركوب الدراجات ببطء و المقايسة بقاء الخلايا بعد الانتشار الأولي. لأسباب غير واضحة، ولكن ربما بسبب نفاذية محدودة من حاجز الدم في الدماغ، ووضع العلامات EdU غير فعالة والتقارير الناقصة انتشار الخلايا في الدماغ الكبار. ويتضح ذلك من الأعداد المماثلة من خلايا PH3+ و EdU+ في كل من العقول التحكمية والتجريبية عند 24 ساعة بعد PTBI ومن خلال ملاحظة أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا الجديدة في المستنسخين التوأمين بيرما تتضمن EdU16. لوضع العلامات القصوى ، من الضروري إطعام الذباب مسبقا باستخدام EdU لأن الذباب المصاب لا يستأنف التغذية لعدة ساعات بعد PTBI. تم تقييم التغذية عن طريق إضافة تلوين الطعام إلى محلول EdU ومراقبة كمية الصبغة في الأمعاء من خلال قطع البطن16.
وتجدر الإشارة إلى أنه في حين قدمنا بروتوكول تشريح الدماغ في الخطوة 4، يمكن استخدام تقنيات بديلة. العديد من هذه متوفرة في بروتوكولات المنشورة سابقا20,21,22. Drosophila melanogaster يقدم نموذجا منخفض التكلفة مع أدوات وراثية جزيئية قوية التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الكامنة وراء تجديد أنسجة متعددة، بما في ذلك القناة الهضمية ومكونات الجهاز العصبي. ويرد هنا نموذج جديد للإصابات قابل للاستنساخ يمكن استخدامه لدراسة الاستجابة لإصابة الدماغ. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه البروتوكولات تدعم فكرة أن الدماغ المركزي Drosophila الكبار يحتفظ القدرة على الانتشار، وتوليد خلايا عصبية جديدة ردا على الإصابة. هذه الملاحظات تبرر إجراء مزيد من التحقيق في كل من مدى تكوين الأعصاب الكبار وآلياته الجزيئية الكامنة. بمجرد تحديد المكونات المشاركة في التجديد العصبي في هذا النظام ، يمكننا تحويل معرفتنا بالنشأة العصبية الدروزوفيليا البالغة إلى البشر.
Disclosures
ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لستايسي ريمكوس وبيكي كاتزنبرغر للمساعدة التقنية وإدواردو مورينو لتقاسم أسهم بيرما التوأم. ونود أن نشكر باري غانيتزكي وديفيد واسارمان على المناقشات الحيوية التي حسنت بلا شك العلم وكينت موك وكايلا غيرا وبيلي شبيجلبرغ على مساهماتهم في المختبر. تم تطوير الأجسام المضادة FasII من قبل كوري غودمان وتم الحصول عليها من بنك Hybridoma للدراسات التنموية ، الذي أنشأه NICHD في المعاهد القومية للصحة وحافظ عليه في جامعة أيوا ، قسم البيولوجيا ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم الحصول على معظم سلالات دروسوفيلا المستخدمة في هذه الدراسة من مركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (BDSC; المعاهد القومية للصحة P40OD018537). وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة T32 GM007133 (KLC)؛ المعاهد القومية للصحة NS090190 (GBF)؛ المعاهد القومية للصحة NS102698 (GBF)؛ كلية الدراسات العليا بجامعة ويسكونسن (GBF)؛ ومعهد القيادة النسائية في العلوم والهندسة (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
- NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A.
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E.
- Crocker, K. L., et al.
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
