Summary
Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l'influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.
Abstract
La differenziazione cellulare è il processo messo a punto dell'impegno cellulare che porta alla formazione di diversi tipi di cellule specializzate durante la creazione di tessuti e organi in via di sviluppo. Questo processo viene mantenuto attivamente in età adulta. La differenziazione cellulare è un processo continuo durante lo sviluppo e l'omeostasi degli organi. Comprendere le prime fasi della differenziazione cellulare è essenziale per conoscere altri processi complessi come la morfogenesi. Pertanto, gli arti di pollo ricombinanti sono un modello sperimentale che consente lo studio della differenziazione cellulare e della generazione di modelli sotto segnali di pattern embrionali. Questo modello sperimentale imita un ambiente in vivo ; assembla cellule riaggregate in una copertura ectodermica ottenuta da una gemma precoce dell'arto. Successivamente, gli ectodermi vengono trasferiti e impiantati in un recettore dell'embrione di pulcino per consentirne lo sviluppo. Questo test è stato utilizzato principalmente per valutare le cellule delle gemme mesodermiche degli arti; tuttavia, può essere applicato ad altre cellule staminali o progenitrici di altri organismi.
Introduction
L'arto vertebrato è un modello formidabile per studiare la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, la morte cellulare, la formazione di pattern e la morfogenesi 1,2. Durante lo sviluppo, gli arti emergono come rigonfiamenti dalle cellule derivate dal mesoderma1 della piastra laterale. Le gemme degli arti sono costituite da un nucleo centrale di cellule mesodermiche coperte da un ectoderma. Da questa struttura iniziale, emerge un arto intero e ben formato. Dopo che il bocciolo dell'arto si presenta, vengono riconosciuti tre assi: (1) l'asse prossima-distale ([PD] spalla alle dita), (2) l'asse dorso-ventrale ([DV] dal dorso della mano al palmo) e (3) l'anteriore-posteriore ([AP] pollice a dito). L'asse prossimale-distale dipende dalla cresta ectodermica apicale (AER), ectoderma specializzato situato sulla punta distale della gemma dell'arto. L'AER è necessario per la crescita, il mantenimento della sopravvivenza, la proliferazione e lo stato indifferenziato delle cellule che ricevono segnali 2,3. D'altra parte, la zona di attività polarizzante (ZPA) controlla il pattern anteroposteriore4, mentre il pattern dorsale ed ectoderma controlla il pattern dorsoventrale 7,8. L'integrazione della modellazione tridimensionale implica una complessa diafonia tra questi tre assi5. Nonostante la comprensione del percorso molecolare durante lo sviluppo degli arti, le domande aperte sui meccanismi che controllano il pattern e la corretta crescita per formare un intero arto rimangono senza risposta.
Edgar Zwilling sviluppò il sistema degli arti ricombinanti (RL) nel 1964 per studiare le interazioni tra le cellule mesenchimali degli arti e l'ectoderma nello sviluppo degli arti6. Il sistema RL assembla il mesoderma del germoglio dell'arto dissociato-riaggregato nell'ectoderma dell'arto embrionale per innestarlo nella parte dorsale di un embrione di pulcino donatore. I segnali forniti dall'ectoderma inducono l'espressione di geni di differenziazione e geni patterning in modo spazio-temporale, inducendo così la formazione di una struttura simile a un arto in grado di ricapitolare i programmi cellulari che si verificano durante lo sviluppo degli arti 7,8,9.
Il modello RL è prezioso per comprendere le proprietà dei componenti degli arti e l'interazione tra cellule mesodermiche ed ectodermiche6. Una RL può essere definita come una struttura simile a un arto creata dall'assemblaggio sperimentale o dalla ricombinazione di cellule mesodermiche delle gemme degli arti all'interno di una copertura ectodermica6. La morfogenesi della RL dipende dalle caratteristiche delle cellule mesodermiche (o di altri tipi) che risponderanno ai segnali di pattern ectodermico. Uno dei vantaggi di questo sistema sperimentale è la sua versatilità. Questa caratteristica permette la creazione di combinazioni multiple variando la fonte di cellule mesodermiche, come cellule di diversi stadi di sviluppo, da diverse posizioni lungo l'arto, o cellule intere (non dissociate) o riaggregate 7,8,9,10. Un altro esempio è la capacità di ottenere l'ectoderma embrionale da specie diverse dal pollo, ad esempio la tartaruga11, la quaglia o il topo12.
In questo senso, la tecnica RL aiuta a studiare lo sviluppo degli arti e le interazioni tra cellule mesenchimali ed ectodermiche degli arti da un punto di vista evolutivo. Questa tecnica ha anche un grande potenziale per analizzare la capacità di diverse fonti di cellule progenitrici di differenziarsi in una struttura simile a un arto sfruttando i segnali forniti dall'ectoderma embrionale 12,13,14. A differenza delle colture in vitro, la RL consente di valutare la differenziazione e il potenziale morfogenetico di una popolazione cellulare interpretando i segnali embrionali provenienti da un arto in via di sviluppo 9,15.
In questo protocollo, viene fornita una guida passo-passo per eseguire RL di successo con cellule di gemme di arti mesodermici riaggregati, aprendo così la possibilità di adattare questo protocollo con diverse fonti di cellule riaggregate o anche diverse fonti di ectoderma.
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Protocol
Questa ricerca è stata esaminata e approvata dall'Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals dell'Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Città del Messico, Messico). Un diagramma di flusso schematico dei passaggi generali di questo protocollo è mostrato nella Figura 1A.
1. Incubazione embrionale e determinazione della vitalità
- Incubare le uova di gallina fecondate a 38 °C e al 60% di umidità relativa per circa tre giorni e mezzo fino a raggiungere lo stadio 22 HH (secondo Hamilton e Hamburger, 1951)16.
NOTA: Le uova di gallina appena fecondate possono essere conservate a 15 °C per un massimo di una settimana.- Per incubare le uova fecondate, posizionare le uova verticalmente con il lato appuntito verso il basso nell'incubatrice umidificata. Ruotare le uova durante l'incubazione in quanto è necessario per impedire all'embrione in via di sviluppo di aderire alla membrana del guscio.
NOTA: Le uova di gallina fecondate possono essere ottenute da allevamenti locali. Le uova di gallina Livorno bianca fecondate sono generalmente utilizzate per evitare la pigmentazione delle piume negli embrioni tardivi. Considera di incubare abbastanza uova separatamente per ottenere tre strutture: (1) cellule mesodermiche degli arti, (2) ectodermi degli arti e (3) embrioni donatori per innestare la RL.
- Per incubare le uova fecondate, posizionare le uova verticalmente con il lato appuntito verso il basso nell'incubatrice umidificata. Ruotare le uova durante l'incubazione in quanto è necessario per impedire all'embrione in via di sviluppo di aderire alla membrana del guscio.
- Dopo tre giorni e mezzo di incubazione, rimuovere le uova dall'incubatrice, tamponare con etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria.
- Identificare gli embrioni in via di sviluppo che candeggiano l'uovo per osservare i vasi sanguigni e localizzare l'embrione. Scartare le uova che non hanno un embrione.
NOTA: A questo punto, distribuire le uova per ottenere cellule mesodermiche, ectodermi e gli ospiti per la RL.
2. Ottenere cellule mesodermiche degli arti per riempire gli ectodermi
NOTA: Prima di iniziare le manipolazioni, si consiglia vivamente di disinfettare l'area di lavoro, i microscopi e tutto lo strumentale mediante tampone con soluzione di etanolo al 70%.
- Toccare l'estremità smussata del guscio d'uovo con l'estremità di una pinza smussata per aprire una finestra e rimuovere circa 1 cm x 1 cm del guscio usando la pinza.
- Trasferire le uova in un supporto di plastica o cartone e posizionarle una per una sotto lo stereomicroscopio. Identificare la membrana dell'aria e quindi rimuoverla scegliendo un piccolo foro dove non si trovano vasi. Tirare quest'area con l'aiuto di una pinza chirurgica fine.
NOTA: La membrana dell'aria può essere identificata come la membrana bianca e opaca osservata immediatamente dopo la finestra dell'uovo.- Rimuovere qualsiasi piccolo pezzo di guscio d'uovo che può entrare in contatto con l'embrione.
NOTA: Verificare che gli embrioni siano nello stadio 22 HH prima di iniziare il protocollo. Gli embrioni nelle fasi precedenti possono essere restituiti all'incubatrice dopo aver sigillato la finestra del guscio d'uovo con del nastro.
- Rimuovere qualsiasi piccolo pezzo di guscio d'uovo che può entrare in contatto con l'embrione.
- Aprire completamente il sacco amniotico strappando l'amnione usando la pinza chirurgica fine (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Amnion può essere identificato come una membrana trasparente che copre da vicino l'embrione ed è riempita con liquido amniotico. - Rimuovere con cura l'embrione dall'uovo usando un paio di pinze smussate e quindi trasferirlo in una capsula di Petri sterile contenente soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (1x PBS). Ripeti questo passaggio per le uova rimanenti. Considera che solo ~ 8-10 embrioni sono sufficienti per ottenere le cellule mesodermiche.
- Lavare gli embrioni una volta in PBS 1x ghiacciato e, con l'aiuto di uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali), prelevare le membrane rimanenti. Individua le gemme degli arti posteriori.
NOTA: Le gemme degli arti sono strutture arrotondate situate lungo l'asse anteriore-posteriore dell'embrione come sporgenze dal fianco. Gli arti posteriori si trovano più posteriormente rispetto agli arti anteriori. - Mantenere gli embrioni in PBS 1x pulito e, utilizzando un paio di pinze chirurgiche fini, tagliare longitudinalmente ogni gemma posteriore. Tagliare il bocciolo molto vicino al fianco dell'embrione per sezionare tutte le gemme degli arti posteriori. Ripeti questo passaggio con gli embrioni rimanenti.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le gemme degli arti in un tubo microcentrifuga vuoto da 1,5 ml.
- Utilizzare una punta della pipetta per rimuovere qualsiasi eccesso di 1x PBS e sostituire PBS con 500 μL di soluzione di tripsina allo 0,5% (vedere Tabella dei materiali). Incubare le gemme degli arti in un termoblocco per 7 minuti a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione di tripsina e sostituirla con 500 μL di collagenasi di tipo IV a 2 mg/mL in Hanks Balanced Salt Solution (vedere Tabella dei materiali), quindi incubarla in un termoblocco a 37 °C per 8 minuti.
NOTA: L'incubazione della tripsina stacca leggermente gli ectodermi, mentre la collagenasi disaggrega le cellule mesodermiche. - Dopo l'incubazione, rimuovere quanta più collagenasi possibile e sostituirla con 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) medio integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) per inattivare gli enzimi. Pipettare delicatamente la miscela ~ 10 volte.
- Filtrare la sospensione contenente le cellule con un filtro cellulare di 70 μm per lasciare dietro di sé gli ectodermi.
NOTA: la filtrazione rimuoverà anche eventuali gemme degli arti non digerite, lasciando dietro di sé una sospensione di singole cellule. - Dopo il filtraggio, pipettare nuovamente la sospensione 5-10 volte e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare il surnatante.
- Utilizzare 1 ml di DMEM-HG integrato con il 10% di FBS per lavare la collagenasi in eccesso. Centrifugare la sospensione a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Scartare accuratamente il mezzo mediante pipettaggio e quindi sostituirlo con 1 mL di DMEM-HG fresco integrato con FBS al 10% senza disturbare le cellule sul fondo del tubo.
- Lasciare che le celle formino un pellet compatto (reaggregate) dopo averle incubate per 1-1,5 ore a 37 °C in un termoblocco.
NOTA: Mentre le cellule mesodermiche stanno formando il pellet, è conveniente ottenere gli ectodermi degli arti.
3. Ottenere l'arto ectodermi
- Ripetere i passaggi 1-6 della sezione 2 separatamente con gli altri 22 embrioni di pollo HH scelti per ottenere gli ectodermi.
NOTA: Il numero di embrioni per questo scopo è proporzionale al numero finale della RL desiderata. Un rapporto di 2:1 ectodermi-RL è appropriato. - Dopo aver ottenuto le gemme degli arti posteriori, utilizzare una pipetta di plastica per trasferirle in un tubo microcentrifuga vuoto. Rimuovere qualsiasi PBS 1x in eccesso e sostituirlo con 500 μL di tripsina allo 0,5% in PBS 1x sterile. Incubare la miscela per 30 minuti a 37 °C in un termoblocco.
- Dopo la digestione enzimatica, trasferire la soluzione di tripsina contenente le gemme degli arti in una capsula di Petri sterile.
- Rimuovere il più possibile la tripsina in eccesso usando una micropipetta; inondare la capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato integrato con il 10% di FBS fino a quando tutte le gemme degli arti sono coperte.
NOTA: FBS può essere sostituito con il siero di cavallo. - Identificare le gemme degli arti sotto lo stereomicroscopio; identificare l'ectoderma come una membrana trasparente leggermente staccata dalle cellule mesodermiche dell'arto (Figura 1B).
- Tenere l'estremità più prossimale della gemma dell'arto con l'aiuto di una pinza chirurgica fine mentre si stacca con cura e si separa lo strato ectoderma usando l'altra pinza.
NOTA: Ottenere gli ectodermi potrebbe essere difficile a causa dell'aggregazione delle cellule mesodermiche e dell'attaccamento agli ectodermi, causandone così l'appiccicosità. Si raccomanda di scartare costantemente le cellule mesodermiche per mantenere solo gli ectodermi nella capsula di Petri. - Mantenere gli ectodermi in soluzione FBS 1x PBS-10% ghiacciata.
NOTA: gli ectodermi possono essere conservati a 4 °C nel caso in cui il mesoderma riaggregato non sia pronto. Tuttavia, è preferibile coordinare il tempo di incubazione del pellet con l'ottenimento ectodermico.
4. Assemblaggio di cellule mesodermiche all'interno della copertura ectodermica
NOTA: Per questo, è necessario avere gli ectodermi vuoti in una capsula di Petri con soluzione sterile 1x PBS-10% FBS contenente un pellet formato di cellule mesodermiche.
- Dopo la formazione del pellet (vedere paragrafo 2), scartare ~ 600 μL del mezzo dal tubo mediante pipettaggio.
- Staccare con cura il pellet dal fondo usando una punta di pipetta e senza romperlo o distruggerlo.
- Quando il pellet è completamente staccato dal fondo del tubo, capovolgere il tubo per trasferire il pellet nella capsula di Petri contenente gli ectodermi vuoti (Figura 1C).
- Tagliare un piccolo pezzo del pellet con l'aiuto di un paio di pinze chirurgiche fini e posizionarlo il più vicino possibile all'ectoderma.
- Come se fosse una borsa, aprire l'ectoderma con la pinza chirurgica e posizionare il pezzo di pellet il più strettamente possibile nella copertura ectodermica. Ripetere questo passaggio per tutti gli RL desiderati (Figura 1D).
NOTA: Tagliare i pezzi del pellet uno per uno e riempire gli ectodermi per mantenere pulita la soluzione 1x PBS-10% FBS. La dimensione del pellet deve corrispondere a ciascun ectoderma. - Lasciare che l'ectoderma e il mesoderma guariscano insieme per ~ 30 minuti a temperatura ambiente e poi innestarli nell'ospite dell'embrione. Scartare l'ectoderma e il mesoderma inutilizzati.
5. Trapianto dell'ectoderma riempito in un embrione ospite
NOTA: Prima di trapiantare gli ectodermi, disporre due stereomicroscopi uno accanto all'altro su un banco, uno per la manipolazione degli embrioni e l'innesto di RL. L'altro è per mantenere gli ectodermi pieni pronti per il trasferimento nell'embrione.
- Seleziona il numero di uova desiderate per innestare gli ectodermi riempiti.
- Usando l'estremità di una pinza smussata, tocca il guscio d'uovo dei 22 embrioni ospiti HH per aprire una finestra. Identificare la membrana dell'aria e, utilizzando un paio di pinze chirurgiche fini, rimuoverla completamente.
- Aprire il sacco amniotico vicino all'arto anteriore per esporre il fianco destro dell'embrione. Aprire solo l'importo necessario per eseguire la procedura.
- Guidato dalla posizione dell'arto anteriore, eseguire graffi della ferita con un ago di tungsteno (vedi Tabella dei materiali) per la lunghezza di 2-3 somiti, danneggiando leggermente il mesoderma fino a quando non sanguina.
- Trasferire individualmente un ectoderma riempito (RL) nell'embrione di pulcino e posizionare la base dell'arto ricombinante sopra la ferita del somite.
NOTA: il trasferimento RL può essere effettuato con una pipetta di plastica o con un coltello a fessura angolata. - Fissare correttamente l'RL con due pezzi di filo di palladio di 0,025 mm di diametro e 0,5-1 mm di lunghezza (vedi Tabella dei materiali). Allineare la base della RL con la ferita per assicurarsi che sia attaccata al fianco dell'embrione ospite e vascolarizzata (Figura 1E).
- Sigillare la finestra con del nastro adesivo e restituire l'uovo all'incubatrice. Raccogliere gli embrioni nei punti temporali desiderati per l'analisi.
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Representative Results
Riconoscere un arto ricombinante ben eseguito
Dopo l'innesto, gli embrioni manipolati sono stati restituiti all'incubatrice per consentire allo sviluppo della RL. Il tempo di incubazione è correlato ai requisiti dell'esperimento. Tuttavia, l'RL può essere facilmente distinto dopo 12 ore dall'impianto. Per determinare se l'impianto fosse adeguato, la RL è stata osservata come una protuberanza che era saldamente attaccata alla parete mesodermica dell'embrione donatore (Figura 2A). Al contrario, sia che la vitalità cellulare e/o l'innesto fallissero, l'RL era staccato dalla parete mesodermica o presentava una morfologia approssimativa (Figura 2B).
Esame morfologico e di pattern degli arti ricombinanti
Per l'esame morfologico, RL è stato colorato con il blu di Alcian17 per osservare la formazione di elementi scheletrici e il loro pattern. Si raccomanda di macchiare l'intero tronco dell'embrione donatore per evitare di perdere la RL durante la procedura (Figura 3A). In alternativa, prima di cancellare l'RL, sono state ottenute immagini in soluzione di etanolo per osservare la morfologia dell'RL o eseguire misurazioni quantitative (Figura 3B). La RL macchiata o non macchiata è stata affettata per osservare la struttura del tessuto o identificare il tipo di cellula (Figura 3C).
Figura 1: Rappresentazione schematica del disegno sperimentale degli arti ricombinanti (RL). (A) L'RL è stata eseguita assemblando il mesoderma delle gemme degli arti da un embrione di pulcino HH di un donatore di 22 HH all'interno di una copertura ectodermica ottenuta da un altro donatore di embrioni di pulcino 22 HH. Gli ectodermi erano strettamente imbottiti di cellule mesodermiche. Dopo l'assemblaggio, gli ectodermi imbottiti venivano trasferiti e fissati con fili di palladio sopra la ferita di un somite precedente. (B) Una gemma dell'arto con ectoderma staccata dopo il trattamento con tripsina. (C) Il pellet è stato ottenuto dopo la sua formazione in prossimità degli ectodermi vuoti, pronto per essere riempito. (D) Viene mostrata una copertura ectodermica piena di cellule mesodermiche. (E) Fissare l'RL nell'embrione ospite con fili di palladio. Si prega di notare che la RL è stata posizionata sul fianco destro dell'embrione vicino alla gemma dell'arto anteriore; p: pellet. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Arti ricombinanti pollo-pollo appena ottenuti. (A) Viene mostrato un RL di 24 ore attaccato alla parete del mesoderma. (B) Viene mostrato un RL di 24 ore non riuscito. Si prega di notare che il filo di palladio non sta fissando l'RL; di conseguenza, la RL si staccò dalla parete mesodermica e presentò una morfologia ruvida. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi morfologica degli arti ricombinanti. (A) Colorazione blu alciana per dimostrare elementi scheletrici in una RL pollo-pollo di 6 giorni. (B) Lo stesso RL è stato mostrato in (A) prima di cancellare il blu alciano. (C) Fetta sagittale di una RL colorata con colorazione blu alciana e con ematossilina ed eosina. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In generale, il protocollo RL può essere suddiviso in cinque fasi: (1) incubazione embrionale, (2) ottenimento di cellule mesodermiche degli arti per riempire gli ectodermi, (3) ottenimento degli ectodermi, (4) assemblaggio di cellule mesodermiche all'interno delle coperture ectodermiche e (5) trapianto degli ectodermi riempiti negli embrioni ospiti. Il principale limite della tecnica RL è il protocollo lungo e dettagliato, che ha molti punti critici che richiedono pazienza per essere eseguiti in modo appropriato. Per completare con successo il protocollo, è necessario identificare i momenti critici. Durante l'approvvigionamento delle cellule mesodermiche, l'integrità e la vitalità delle cellule sono essenziali. La morte cellulare impedirà il corretto sviluppo della RL. Allo stesso modo, è necessaria una corretta manipolazione dell'ectoderma per garantire l'interazione tra cellule mesodermiche ed ectodermiche. Quando gli ectodermi sono imbottiti, le cellule mesodermiche devono essere il più vicino possibile all'ectoderma distale sotto l'AER. Sia per l'approvvigionamento mesodermico che ectodermico, anche lo stadio di sviluppo degli embrioni donatori è fondamentale. Va considerato che le cellule mesodermiche risponderanno in modo differenziale in base al loro stadio di sviluppo. Tuttavia, la fase di sviluppo può essere liberamente selezionata in base alle esigenze sperimentali. Tuttavia, lo stadio 22 HH deve essere mantenuto per facilitare l'ottenimento di ectodermi, mantenendo così l'integrità cellulare e la segnalazione. Infine, un buon innesto e fissaggio sono essenziali per garantire una corretta integrazione della RL nella parete dell'embrione e il suo sviluppo.
Edgar Zwilling riportò per la prima volta il sistema RL nel 19646, dopo di che molti gruppi di ricerca lo implementarono per rispondere a diverse interessanti domande biologiche. Il protocollo della RL è stato precedentemente descritto in lunghezza da Marian Ros et al. come metodo standard per manipolare la gemma dell'arto del pulcino in via di sviluppo18, che spiega altri modi per finestrare le uova ed eseguire RL con ala intera o gamba e per eseguire RL con mesoderma riaggregato. Tuttavia, alcune variazioni tra i Ros. et al. protocollo e il presente protocollo descritto qui possono essere trovati. Nel loro protocollo, le gemme degli arti degli embrioni come donatori di ectoderma vengono incubate con tripsina in PBS ghiacciato per ~ 2 ore. Dopo aver iniziato l'incubazione dell'ectoderma, hanno immediatamente ottenuto le gemme degli arti dagli embrioni come donatori di mesoderma, quindi hanno frammentato le gemme degli arti, le hanno digerite e rimosso manualmente l'ectoderma per formare il pellet mesodermico dopo l'incubazione per 30 minuti. Qui, in primo luogo, le gemme degli arti sono state ottenute da embrioni da utilizzare come donatori mesodermici, dopo di che l'intero germoglio dell'arto viene digerito mediante incubazione con tripsina e collagenasi. Gli ectodermi vengono quindi rimossi mediante filtrazione e il pellet viene incubato tra 1-1,5 ore. Il vantaggio di questo metodo per ottenere il pellet mesodermico è che il trattamento con tripsina stacca gli ectodermi intatti dal mesoderma mentre il trattamento con collagenasi digerisce le cellule mesodermiche. Pertanto, è possibile filtrare il tessuto ectodermico e scartarlo. D'altra parte, più tempo di incubazione del pellet gli consente di compattarsi meglio, il che aiuta quando gli ectodermi si riempiono. Un'altra differenza tra i due protocolli è che Ros et al. hanno staccato gli ectodermi uno per uno e li hanno trasferiti nella capsula di Petri contenente il pellet. Al contrario, tutti gli ectodermi sono sezionati e raccolti in una capsula di Petri nel presente protocollo. Il pellet viene trasferito alla capsula di Petri per riempire gli ectodermi. Seguendo questo metodo, gli ectodermi possono essere preparati contemporaneamente all'innesto. Come con molti altri protocolli, il modo in cui vengono eseguiti i RL può variare; tuttavia, i passaggi in entrambi i protocolli descrivono adeguatamente le fasi critiche della tecnica per produrre una manipolazione di successo.
Lavori precedenti hanno dimostrato che le cellule dissociate della zona polarizzante inibiscono la morfogenesi quando disperse casualmente tra i mesodermi in RL 7,10. Pertanto, è facoltativo eliminare le cellule dalla ZPA prima di formare il pellet mesodermico. Successivamente, le cellule ZPA (o perle soniche incorporate nel riccio) possono essere utilizzate per indurre l'RL a sviluppare la polarità A-P 8,9,19.
Il modello sperimentale RL è adattabile a una varietà di scenari. La ricombinazione può essere implementata con cellule degli arti di diversi stadi di sviluppo o maturi (fore- o hindlimb), altre posizioni lungo i tre assi degli arti e con cellule dissociate-riaggregate o mesoderma non dissociato-frammentato15. È interessante notare che studi precedenti hanno riportato l'utilizzo del modello RL per studiare il comportamento di diverse combinazioni di mesoderma mutante e wild-type ed ectodermi 13,14,20,21 o utilizzando celle elettroporate22.
Considerando che lo sviluppo degli arti è un processo evolutivamente conservato, le fonti ectodermiche possono anche variare dagli ectodermi di pollo, quaglia, anatra, topo o ratto che possono essere ottenuti seguendo lo stesso protocollo descritto. Un'altra possibilità è cambiare il mesodermico o anche altri tipi di cellule o fonti per produrre RL interspecie.
In conclusione, RL è un modello fenomenale per studiare la morfogenesi, il patterning, le interazioni cellula-cellula, la migrazione cellulare e la differenziazione cellulare a livello cellulare e molecolare. Poiché la procedura di RL consente molteplici variazioni, consente potenziali applicazioni su numerose questioni biologiche senza essere limitata alla biologia dello sviluppo degli arti di pollo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Estefania Garay-Pacheco per le immagini in Figura 2 e Maria Valeria Chimal-Montes de Oca per l'opera d'arte. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [numeri di sovvenzione IN211117 e IN213314] e dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [numero di sovvenzione 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] assegnato a JC-M. JC M-L ha ricevuto una borsa di studio post-dottorato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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