Summary
Les méthodes décrites ici décrivent une procédure utilisée pour inverser optogénétiquement la plasticité induite par la cocaïne dans un circuit comportementalement pertinent chez le rat. La stimulation optique soutenue à basse fréquence des synapses thalamo-amygdales induit une dépression à long terme (LTD). La DLT optogénétique in vivo induite chez des rats ayant consommé de la cocaïne a entraîné une atténuation subséquente de la recherche de drogue motivée par des signaux.
Abstract
Ce protocole démontre les étapes nécessaires à l’utilisation d’outils optogénétiques pour inverser la plasticité induite par la cocaïne dans les circuits thalamo-amygdale afin de réduire les comportements ultérieurs de recherche de cocaïne chez le rat. Dans nos recherches, nous avions constaté que lorsque des rats s’auto-administrent de la cocaïne par voie intraveineuse associée à un signal audiovisuel, les synapses formées aux entrées du noyau géniculé médian du thalamus (MGN) sur les principaux neurones de l’amygdale latérale (LA) deviennent plus fortes à mesure que l’association signale-cocaïne est apprise. Nous avons émis l’hypothèse que l’inversion de la plasticité induite par la cocaïne au niveau de ces synapses réduirait le comportement de recherche de cocaïne motivé par les signaux. Afin d’accomplir ce type de neuromodulation in vivo, nous voulions induire une dépression synaptique à long terme (LTD), qui diminue la force des synapses MGN-LA. À cette fin, nous avons utilisé l’optogénétique, qui permet la neuromodulation des circuits cérébraux à l’aide de la lumière. L’opsine excitatrice oChiEF a été exprimée sur des terminaux MGN présynaptiques dans l’AL en infusant un AAV contenant oChiEF dans le MGN. Des fibres optiques ont ensuite été implantées dans le LA et une lumière laser de 473 nm a été pulsée à une fréquence de 1 Hz pendant 15 minutes pour induire la LTD et inverser la plasticité induite par la cocaïne. Cette manipulation produit une réduction durable de la capacité des signaux associés à la cocaïne à induire des actions de recherche de drogue.
Introduction
La toxicomanie est un problème de santé publique très grave aux États-Unis et dans le monde. Malgré des décennies de recherches intenses, il existe très peu d’options thérapeutiques efficaces 1,2. Un revers majeur du traitement est le fait que la consommation chronique de drogues génère des souvenirs associatifs à long terme entre les signaux environnementaux et la drogue elle-même. La réexposition à des signaux liés à la drogue entraîne des réponses physiologiques et comportementales qui motivent la consommation continue de drogues et la rechute3. Une nouvelle stratégie thérapeutique consiste à mettre en œuvre des traitements basés sur la mémoire qui visent à manipuler les circuits impliqués dans la régulation des associations médicament-signal. Récemment, il a été observé que les synapses de l’amygdale latérale (LA), en particulier celles provenant du noyau géniculé médian (MGN) du thalamus, sont renforcées par l’auto-administration répétée de cocaïne associée à des signaux, et que cette potentialisation peut soutenir le comportement de recherche de cocaïne 4,5. Par conséquent, il a été proposé que la réintégration induite par les signaux puisse être atténuée en inversant la plasticité au niveau des synapses MGN-LA.
La capacité de cibler précisément la plasticité synaptique d’un circuit cérébral spécifique a été un défi majeur pour le domaine. Les outils pharmacologiques traditionnels ont eu un certain succès dans la diminution des comportements de rechute, mais sont limités par l’incapacité de manipuler les synapses individuelles. Cependant, le développement récent de l’optogénétique in vivo a fourni les outils nécessaires pour surmonter ces limitations et contrôler les voies neuronales avec une précision temporelle et spatiale 6,7,8. En exprimant des opsines sensibles à la lumière dans un circuit cérébral spécifique, la lumière laser peut ensuite être utilisée pour activer ou inhiber le circuit. La stimulation optique dépendante de la fréquence peut être utilisée pour manipuler spécifiquement la plasticité synaptique du circuit chez un animal au comportement.
Ce manuscrit décrit la procédure suivie pour manipuler le circuit MGN-LA pertinent sur le plan comportemental en utilisant l’optogénétique in vivo . Tout d’abord, l’opsine excitatrice oChIEF a été exprimée dans le MGN et des fibres optiques ont été implantées bilatéralement dans le LA. Les animaux ont ensuite été entraînés à s’auto-administrer de la cocaïne d’une manière dépendante des signaux, ce qui potentialise la voie MGN-LA. Ensuite, une stimulation soutenue à basse fréquence avec une lumière laser de 473 nm a été utilisée pour produire une LTD spécifique au circuit. L’inversion de la plasticité induite par la consommation de cocaïne a généré une réduction durable de la capacité des signaux à déclencher des actions associées au comportement de recherche de drogue.
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Protocol
Les expériences décrites dans ce protocole étaient conformes aux lignes directrices établies par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Pittsburgh. Toutes les procédures ont été effectuées sur des rats Sprague-Dawley adultes naïfs qui pesaient de 275 à 325 g à leur arrivée.
1. Construction d’implants en fibre optique et de câbles de raccordement
- Préparer les implants de fibres optiques en suivant les protocoles précédemment publiés9. Les expériences décrites dans ce protocole ont utilisé une fibre de base de 200 μm (0,5 NA) et une virole céramique multimode LC/PC de Ø1,25 mm, taille de trou de Ø230 μm.
- Utilisez un outil Dremel pour marquer le tiers inférieur d’une virole (le plus proche de l’extrémité plate de la virole). La notation des viroles les aide à rester attachés au ciment dentaire, ce qui augmente la probabilité qu’ils restent en sécurité tout au long de l’expérimentation.
- Utilisez des coupe-fil pour couper ~35 mm de fibre. Utilisez un outil de décapage de fibre pour dépouiller ~ 25 mm de fibre, en laissant 10 mm non exposés.
- Préparez de l’époxy thermodurcissable conformément aux instructions du fabricant. Dissoudre 1 g de poudre de résine dans 100 mg de composé durcisseur. Fixez une aiguille émoussée de calibre 25 à une seringue de 1 mL. Remplissez la seringue avec de l’époxy et fixez un embout d’aiguille émoussé de calibre 25.
- Utilisez un étau ou une pince pour maintenir solidement la virole avec le côté plat vers le haut et le côté convexe vers le bas. Avec la seringue remplie d’époxy, ajoutez une goutte d’époxy sur le côté plat de la virole, en faisant preuve de prudence pour essuyer l’excès d’époxy des côtés de la virole.
- Insérez la partie dénudée de la fibre à travers la virole en laissant 5 mm supplémentaires de fibre dénudée exposée. Dans le cas des implants LA, la fibre sera implantée à 7,9 mm ventrale au bregma, de sorte que la longueur exposée de la fibre non dénudée devrait être de ~ 13 mm.
- Durcissez l’époxy avec un pistolet thermique pendant environ 30-40 s jusqu’à ce qu’il devienne de couleur noire / ambre.
- Marquez la fibre directement à l’interface de l’extrémité convexe de la virole avec un couteau diamant et utilisez un doigt pour tapoter doucement la fibre.
- Polir l’extrémité convexe de la virole en la tenant avec un hémostatique, en veillant à appliquer une pression uniforme et en effectuant 20 rotations circulaires chacune sur une série de papier de polissage (de haute qualité à basse qualité; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Fixez la fibre non dénudée à la table à l’aide de ruban adhésif et de fibre dépouillée, laissant 2 mm supplémentaires au-delà de la coordonnée ventrale (pour les implants LA, la longueur finale de la fibre est de ~10 mm). Utilisez un hémostatique pour tirer sur la virole et casser uniformément la fibre où elle a été marquée. Veillez à ne pas couper complètement la fibre lors du score, sinon le noyau de la fibre sera endommagé.
- Construisez des câbles de raccordement compatibles avec les implants à fibre optique. Des câbles de raccordement conçus sur mesure ont été achetés (voir le tableau des matériaux). Alternativement, les câbles de raccordement peuvent être construits selon les protocoles9 précédemment publiés.
REMARQUE: Le diamètre et le NA de la fibre de virole et de la fibre du câble de raccordement doivent correspondre à la jonction de couplage pour éviter une perte excessive de lumière, ce qui peut entraîner une incapacité à stimuler suffisamment l’activité neuronale. - Mesurez le rendement lumineux à travers le câble de raccordement et les implants de fibre optique en fixant le câble de raccordement / fibre optique à une source de lumière laser appropriée (473 nm, sortie de 1 mW) et en mesurant la sortie avec un capteur de lumière. Une fibre construite avec succès émettra un cercle concentrique de lumière et n’aura pas plus de 30% de perte de lumière.
2. Cathétérisme intraveineux des rongeurs, administration de virus et implantation de fibres optiques
- Préparez l’animal à la chirurgie.
- Anesthésier complètement les rats avec l’anesthésique de votre choix en fonction des lignes directrices de l’établissement. Une option est le chlorhydrate de kétamine (87,5-100 mg/kg, i.m.) et le chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg, i.m.). Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié en vérifiant l’absence d’un réflexe de pincement des orteils.
MISE EN GARDE : La kétamine est une substance contrôlée qui doit être manipulée conformément aux directives institutionnelles.
NOTE: L’injection intramusculaire d’anesthésiques est utilisée dans cette étude car elle a produit une induction d’anesthésie plus rapide et plus fiable que l’injection intrapéritonéale. Surveillez continuellement la respiration et la réactivité du rat et fournissez un soutien thermique tout au long de la chirurgie. - Rasez une grande partie du dos du rat (haut du dos juste au-dessus des omoplates jusqu’au milieu du dos) ainsi que la zone du cou sous le membre antérieur droit et le cuir chevelu.
- Placez le rat dans la zone chirurgicale et appliquez du puralube (larmes artificielles) sur les yeux. Injecter un volume de carprofène (analgésique) en poids corporel par voie sous-cutanée (s.c.) à travers la peau du haut du dos, puis injecter 5 mL de solution de Lactated Ringer s.c. à travers la peau du bas du dos.
- Désinfectez tous les sites chirurgicaux en mouillant un morceau de gaze stérile avec de la bétadine et en l’essuyant dans la zone chirurgicale rasée à l’aide d’un mouvement circulaire. Répétez ensuite le processus avec 70% d’éthanol. Répétez ce cycle alterné trois fois.
- Anesthésier complètement les rats avec l’anesthésique de votre choix en fonction des lignes directrices de l’établissement. Une option est le chlorhydrate de kétamine (87,5-100 mg/kg, i.m.) et le chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg, i.m.). Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié en vérifiant l’absence d’un réflexe de pincement des orteils.
- Effectuer l’implantation d’un cathéter intraveineux selon les protocoles précédemment publiés 4,10.
REMARQUE: Un champ chirurgical n’est pas utilisé pendant cette chirurgie pour éviter l’irritation pendant l’implantation du cathéter. Stériliser tous les instruments et équipements avant utilisation. Utilisez des gants stériles et changez les gants si une surface non stérile est en contact. - Immédiatement après l’implantation du cathéter, fixez le rat dans un cadre stéréotaxique pour effectuer des injections d’AAV.
- Administrer une injection sous-cutanée (s.c) de lidocaïne à 2 % (0,2-0,3 mL) au cuir chevelu comme anesthésique local.
REMARQUE : L’anesthésique local n’est pas utilisé pendant l’implantation du cathéter intraveineux pour éviter toute altération des résultats chirurgicaux. - Connecter une canule d’injection en acier inoxydable de calibre 26 à une seringue Hamilton remplie de 1 μL de solution concentrée d’AAV : AAV5-hSyn-tdTomato ou AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomate
NOTE: oChIEF est une variante de l’opsine channelrhodopsin sensible à la lumière bleue (ChR2), qui peut répondre à une large gamme de fréquences 8,11, et a donc une utilité pour les expériences LTD basse fréquence discutées dans ce protocole, mais aussi pour les expériences LTP à haute fréquence (non discutées ici). La construction oChIEF a été donnée par le Dr Roger Tsien et traitée pour l’emballage et la purification par le Duke Viral Vector Core. Au moins 3-4 semaines sont nécessaires entre le jour de l’injection et le jour de l’induction de la LTD pour permettre une expression optimale du virus dans les terminaux axoniques MGN.
MISE EN GARDE : En général, l’AAV est considéré comme un organisme de niveau de biosécurité 1 (BSL-1), avec un faible risque d’auto-infection à moins qu’un virus auxiliaire ne soit utilisé dans sa production. Son utilisation nécessite l’approbation de l’IACUC et l’EPI approprié doit être utilisé en tout temps conformément aux directives institutionnelles pour limiter l’exposition inutile. - À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 0,5 mm de l’avant vers l’arrière du crâne et retirez le tissu sus-jacent pour exposer la surface du crâne.
- Nivelez la tête du rat dans l’axe antérieur/postérieur et zéro coordonnée stéréotaxique au bregma.
- Percez trois petits trous dans le crâne à l’aide d’un outil Dremel équipé d’un petit foret. Utilisez un tournevis pour fixer fermement les vis en acier inoxydable (M2x4 965-A2) en place.
REMARQUE: Les vis sont nécessaires pour une bonne fixation du ciment dentaire et la création de casques robustes et durables. La position des vis doit être répartie sur l’axe antéro-postérieur du crâne et loin du site d’injection AAV. - Forer des trous bilatéraux pour l’injection d’AAV en fonction des coordonnées de l’Atlas du cerveau des rats (Watson et Paxinos)12 pour la partie médiale du noyau géniculé médian (MGN); en mm de bregma, AP: -5,4; ML : ±3,0; DV : -6,6. Abaisser lentement les canules d’injection (4 mm/min) jusqu’à ce qu’elles soient positionnées dans le MGN. Injecter une solution concentrée d’AAV à raison de 0,1 μL/min.
- Laissez la canule d’injection en place pendant 5 minutes après la fin des perfusions pour permettre la diffusion loin de la canule, puis retirez lentement la canule du cerveau.
- Administrer une injection sous-cutanée (s.c) de lidocaïne à 2 % (0,2-0,3 mL) au cuir chevelu comme anesthésique local.
- Immédiatement après les injections de virus, continuer à implanter des fibres optiques 4,9 ciblant les terminaux MGN-LA.
- Utiliser un outil Dremel pour percer des trous bilatéraux pour les implants de fibres optiques ciblant l’amygdale latérale (en mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Utilisez des pinces pour saisir la virole de l’implant de fibre optique et la fixer aux adaptateurs stéréotaxiques afin qu’ils soient solidement maintenus en place.
- Abaissez lentement les fibres à un taux de 2 mm / min, jusqu’à ce que l’extrémité de la fibre se trouve dans la partie dorsale du LA (DV: -7,9 mm).
- Fixez d’abord les viroles au crâne à l’aide d’une fine couche d’adhésif instantané Loctite, suivie de ciment dentaire et couvrez les viroles avec des manchons de virole de 1,25 mm de diamètre et des couvercles anti-poussière.
REMARQUE : Le choix de l’adhésif pour fixer les viroles au crâne doit être approuvé par le comité local ou institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. La loctite est utilisée pour cette étude afin de fixer de manière fiable les viroles au crâne après essais et erreurs avec plusieurs adhésifs; Cependant, les alternatives disponibles peuvent être envisagées.
- Après les interventions chirurgicales, logez les rats individuellement et offrez un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Fournir des soins postopératoires conformes aux lignes directrices de l’établissement. Rincer quotidiennement les cathéters avec une solution saline contenant de la gentamicine (5 mg/mL) et de l’héparine (30 USP/mL) pour maintenir la perméabilité. Au moins 5 jours après la chirurgie et 24 heures avant le début des expériences comportementales, la nourriture limite les rats à ~90% de leur poids libre.
3. Auto-administration de cocaïne chez les rongeurs et extinction du levier instrumental
REMARQUE: Toutes les procédures comportementales sont effectuées dans des chambres de conditionnement opérationnelles standard, équipées de deux leviers rétractables sur un mur, d’une lumière de stimulus au-dessus de chaque levier, d’un générateur de tonalité, d’une lumière domestique et d’une pompe à perfusion.
- Soumettre les rats à des séances quotidiennes d’auto-administration de cocaïne de 1 h (2 mg/mL) dans le cadre d’un programme de renforcement FR1.
- Placez les rats dans la chambre d’opération chaque jour et permettez aux rats d’appuyer sur un levier. Une pression sur le « levier actif » désigné (contrebalancé entre les leviers gauche et droit) donne une perfusion de cocaïne (1,0 mg / kg / perfusion) et une présentation de 10 s d’un signal composé de lumière et de tonalité. Une pression sur le « levier inactif » désigné n’a pas d’effets programmés.
- Poursuivre les expériences d’auto-administration pendant au moins 10 jours et jusqu’à ce que les rats réussissent à obtenir au moins 8 perfusions par jour pendant 3 jours consécutifs. Le non-respect des critères d’acquisition au jour 20 entraîne l’exclusion de l’étude.
- Une fois les critères d’acquisition remplis avec succès, soumettre les rats à des séances d’extinction instrumentale de 1 h pendant 6 à 10 jours.
- Placez les rats dans des chambres opérantes et permettez aux rats d’appuyer librement sur levier. Cependant, les réponses sur les leviers actifs et inactifs n’ont pas de conséquences programmées.
- Demandez aux rats de poursuivre l’extinction instrumentale quotidiennement jusqu’à ce qu’une moyenne de < 25 pressions à levier sur deux jours consécutifs se produise.
4. Induction optogénétique in vivo de la LTD
NOTE: Les expériences d’inhibition optogénétique ont lieu 24 heures après le dernier jour de l’extinction instrumentale.
- Connectez les cordons de raccordement à une diode laser bleue de 473 nm via un joint rotatif suspendu au-dessus d’une cage de logement de rongeurs standard propre avec le couvercle retiré. Cette configuration permet aux rongeurs de se déplacer librement autour de la cage pendant la stimulation optogénétique.
- Allumez la diode laser conformément aux instructions d’utilisation et connectez-la à un générateur d’impulsions. Ajustez les paramètres de sorte que, lorsqu’il est allumé, le rat reçoive 900 impulsions lumineuses de 2 ms à 1 Hz.
ATTENTION : Une protection oculaire adéquate doit être utilisée en tout temps pendant l’utilisation du laser. - Mesurez l’intensité lumineuse à travers le cordon de raccordement à l’aide d’un capteur de lumière. Ajustez l’intensité du laser de sorte que le flux lumineux à travers le câble de raccordement soit de ~5-7 mW.
- Placez les rats dans une cage de logement propre. Enlevez les couvercles anti-poussière et les manchons de virole, exposant ainsi les viroles. Connectez les cordons de raccordement bilatéralement aux implants de fibre optique. Laissez les rats explorer l’environnement pendant 3 minutes avant l’induction de la DLT.
- Allumez le générateur d’impulsions pour initier une stimulation optogénétique.
NOTE: Bien que peu probable, si le rat éprouve des réactions indésirables à la stimulation, l’expérience est immédiatement terminée et les rats sont correctement euthanasiés selon les directives de l’établissement. - Après l’induction de l’ILD, gardez les rats dans la cage pendant 3 minutes, puis remettez-les dans leur cage à la maison.
- Pour les expériences de contrôle, utiliser la même procédure de stimulation sur les rats qui expriment le virus de contrôle de la tomate AAV5-td. Pour les expériences fictives, attachez un cordon de raccordement à la fibre optique des rats qui expriment le virus AAV5-oChIEF, mais aucune stimulation n’est délivrée pendant une séance de 15 minutes.
5. Tester l’effet de la stimulation optogénétique sur la recherche de cocaïne induite par les signaux
- 24 h après les stimulations optogénétiques in vivo, replacer les rats dans des chambres de conditionnement opérationnelles. Les rats sont soumis à une séance de réintégration standard de 1 heure induite par des signaux pour évaluer le comportement de recherche de cocaïne.
REMARQUE : Lors de la réintégration induite par un signal, une réponse sur le levier actif donne une présentation de 10 s du signal associé à la cocaïne, mais pas de perfusions de cocaïne. - Effectuer un deuxième test de réintégration au moins 1 semaine après le premier test pour déterminer si l’induction optogénétique de la LTD entraîne une suppression à long terme de la recherche de cocaïne.
6. Coloration, fluorescence et imagerie pour la vérification histologique de l’expression virale et le placement des fibres optiques
- Faire 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4% de paraformaldéhyde (PFA). Conservez les deux solutions sur de la glace. Le volume total dépendra du nombre de rats participant à l’étude (~100 mL de PBS et 200 mL de PFA seront utilisés par rat).
ATTENTION : Le PFA est un produit chimique toxique et cancérogène connu. Prenez soin d’éviter l’inhalation ainsi que le contact avec la peau. Son utilisation et son élimination doivent être conformes aux directives institutionnelles, y compris l’utilisation d’EPI appropriés et d’une hotte chimique. - Installer la pompe péristaltique à un débit de 20 mL/min. Remplissage du tube de la pompe avec 1x PBS. Fixez une aiguille émoussée de calibre 20 à l’extrémité du tube.
- Anesthésier profondément les rats avec du pentobarbital sodique (100 mg/kg, i.p.). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils avant de continuer.
NOTE: Le pentobarbital sodique est utilisé puisque la perfusion est une procédure terminale. - Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale du rat sous le diaphragme. Coupez à travers la cage thoracique rostralement le long des bords latéraux pour exposer le cœur du rat. Utilisez un hémostatique pour serrer la partie rostrale de la cage thoracique loin du cœur. Coupez tout tissu adipeux sus-jacent qui entoure le cœur.
- Insérez l’aiguille émoussée dans le ventricule gauche et dans l’aorte. Percez un petit trou dans l’oreillette droite pour drainer la solution lorsqu’elle retourne au cœur.
- Perfuser chaque rat avec 1x PBS pendant 5 min suivi de 4% PFA, pH 7,4 pendant 10 min.
- Décapitater le rat, extraire le cerveau et le postfixer dans 4% PFA pendant 24 heures. Ensuite, transférez le cerveau à 30% de solution de saccharose pendant 2-3 jours.
- Cerveau de coupe à 50 μm à l’aide d’un cryostat.
- Montez toutes les tranches contenant le LA ou le MGN sur des lames de verre et un couvercle.
- Découpes d’images à l’aide d’un microscope épifluorescent pour vérifier l’expression de la tomate AAV-oChIEF-tdTomate dans le MGN et ses projections à l’AL, ainsi que le placement de la fibre optique au-dessus du LA.
7. Perfusion et préparation aiguë des tranches cérébrales pour les expériences d’électrophysiologie
NOTE: Des expériences électrophysiologiques sont effectuées sur un sous-ensemble d’animaux pour valider le succès de la DLT in vivo .
- Préparer des solutions électrophysiologiques à l’aide des réactifs énumérés dans les tableaux 1 à 3 4,13. Ajuster le pH de toutes les solutions à 7,4 avec HCl et ajuster l’osmolarité à 300-310 mOsm/kgH2O. Préparer des solutions fraîches avant les expériences et conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Saturer toutes les solutions avec du carbogène (95% O 2/5% CO2) à tout moment pendant l’utilisation.
- En utilisant de l’isoflurane conformément aux directives locales ou institutionnelles sur les soins et l’utilisation des animaux, anesthésiez profondément le rat dans une chambre d’euthanasie fermée. Confirmer que l’animal est complètement anesthésié par le réflexe de pincement des orteils.
- Remplissez un petit bécher avec 50 ml de solution de coupe glacée. Remplir le tube de la pompe péristaltique avec une solution et ajuster le débit à 20 mL/min. Fixez une aiguille émoussée de calibre 20 à l’extrémité du tube.
- Ouvrez la cavité abdominale (voir étapes 6.4 et 6.5) et perfuser brièvement le rat avec une solution de coupe (maximum 1-2 min).
- Après perfusion, décapiter immédiatement le rat. Retirez la cervelle et placez-la dans un petit bécher rempli de solution de coupe à 4 °C pendant 30 s-1 min.
- Transférez les cerveaux avec une spatule et fixez-les rapidement dans la chambre d’un vibratome. Retirez l’épaulard à l’aide d’une pince fine. Remplir la chambre avec une solution de coupe à 4 °C et préparer des tranches coronales aiguës (250 μm d’épaisseur) de l’amygdale à une vitesse de 0,37 mm/sec et une fréquence de 70 Hz.
- Au fur et à mesure de l’obtention des tranches, placer chacune d’elles dans une chambre de rétention remplie de solution de coupe et incuber à 37 °C pendant 10-12 min. Environ 5 à 7 tranches contenant le LA peuvent être obtenues par animal.
- Transférer les tranches dans un bécher de solution de maintien à température ambiante (RT) et laisser récupérer pendant >30 minutes avant l’expérimentation.
REMARQUE: Les tranches restent généralement saines lorsqu’elles sont conservées dans une solution de rétention pendant 4 à 6 heures. En raison de la nature fluorescente de l’AAV, les tranches sont conservées dans des conditions de faible luminosité.
8. Enregistrements électrophysiologiques ex vivo
- Préparer des solutions intracellulaires à l’aide des réactifs énumérés dans les tableaux 4 et 5.
NOTE: Les solutions intracellulaires doivent être fabriquées avant les expériences et peuvent être stockées à long terme (3-12 mois) à -80 ° C ou à court terme (1-2 mois) à -20 ° C. Le pH des solutions est ajusté à 7,3 (avec CsOH pour la solution intracellulaire à base de Cs et avec KOH pour la solution intracellulaire à base de K). Ajuster à une osmolarité finale de 290-300 mOsm/kgH2O. - Préparer une solution mère de picrotoxine de 500 mM dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
NOTE: Les stocks de picrotoxines sont aliquotes et stockés à -20 °C. Le jour de l’utilisation, les aliquotes sont décongelées et ajoutées à la solution d’enregistrement jusqu’à une concentration finale de 100 μM.
ATTENTION: La picrotoxine est un antagoniste non compétitif des récepteurs GABAA , de sorte que l’infusion de picrotoxine a un effet stimulant. Il est gravement toxique par ingestion orale ou absorption cutanée. Un EPI approprié doit être utilisé en tout temps lorsque vous travaillez avec de la picrotoxine. - Transférer les tranches dans un microscope droit conçu pour les expériences d’électrophysiologie.
- Pendant les expériences, baigner en continu les tranches perfusées avec une solution d’enregistrement chauffée à 31-33 °C.
- Agrandissez le LA à l’aide d’un objectif 4x. Identifier les principaux neurones par morphologie avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x.
- Utilisez une pipette en verre (3-5 MΩ) remplie d’une solution intracellulaire à base de Cs (pour les expériences de pince de tension) ou d’une solution intracellulaire à base de K (pour les expériences de pince courantes) pour obtenir des enregistrements de pince patch à cellules entières.
- Identifier les projections axonales MGN infectées par AAV sous fluorescence (à l’aide d’un filtre RFP). Stimuler les projections à l’aide d’un laser DPSS à lumière bleue (473 nm) connecté à un générateur d’impulsions.
ATTENTION : Pour limiter l’exposition au laser, la lumière laser collimatée est couplée à un port fluorescent sur le microscope et focalisée sur la tranche à travers l’objectif.
REMARQUE: En mode de serrage de tension, les courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) sont évoqués optiquement à 0,1 Hz. Les neurones recevant des entrées de neurones MGN infectés par AAV présenteront des EPSC fiables. - Pour induire une LTD ex vivo , en mode de pince courante, enregistrer une ligne de base stable des potentiels postsynaptiques excitateurs (EPSP) pendant au moins 10 minutes. Ensuite, délivrez 900 impulsions de 2 ms de lumière de 473 nm à une fréquence de 1 Hz (temps total = 15 min). Ensuite, enregistrez en continu les EPSP à 0,1 Hz pendant ≥60 min.
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Representative Results
Une chronologie décrivant l’ordre des expériences est présentée à la figure 1. Tout au long des expériences comportementales, le nombre de perfusions de cocaïne ainsi que le nombre de réponses apportées sur le levier actif servent de mesure de l’intensité du comportement de recherche de cocaïne. Au cours des premiers jours de l’auto-administration de cocaïne, le nombre de réponses actives devrait augmenter progressivement au cours de chaque jour d’acquisition, avant de se stabiliser au cours de la deuxième semaine. Inversement, les réponses inactives du levier devraient rester faibles tout au long de l’expérience (Figure 2A). Le premier jour de l’extinction instrumentale, il y a généralement une augmentation du nombre de réponses actives par levier, car l’absence inattendue de cocaïne entraîne une escalade du comportement de recherche de cocaïne. Cependant, cette réponse diminuera graduellement avec les séances suivantes à mesure que les rats apprendront la nouvelle contingence, ce qui entraînera un nombre faible et stable de réponses actives du levier dans les 6 à 10 jours (figure 2B). Les rats qui n’atteignent pas les critères d’acquisition spécifiés dans les phases d’auto-administration ou d’extinction instrumentale de l’expérience sont retirés de l’étude et les données ne sont pas incluses dans l’analyse finale.
Après l’extinction instrumentale, la réexposition à des signaux associés à la cocaïne rétablit le comportement de recherche de cocaïne, ce qui entraîne une augmentation du nombre de réponses actives par levier. Cette augmentation est observée dans les deux groupes d’expériences de contrôle : les rats qui ont reçu une injection avec le virus dépourvu d’oChIEF (contrôle AAV) et les rats qui n’ont pas reçu de stimulation laser (contrôle SHAM; Figure 3A) Cependant, la LTD optogénétique invivo des terminaux MGN-LA a entraîné une réduction de la recherche ultérieure de cocaïne induite par des signaux. 24 h après l’induction optogénétique LTD, le nombre de presses à levier actives a été significativement réduit par rapport aux témoins AAV et SHAM (figure 3A). Ce faible niveau de réponse a été maintenu lors d’un test de réintégration subséquent 7 jours plus tard (effectué sur un sous-ensemble de rats) (figure 3B), ce qui indique une réduction persistante de la recherche de cocaïne motivée par des signaux lors de multiples tests de réintégration.
Des enregistrements électrophysiologiques ex vivo sur des animaux exposés à la stimulation optique ont confirmé que l’atténuation lors de la réintégration était effectivement due au moins en partie à une modulation de la plasticité synaptique du MGN-LA. Cela a été mis en évidence par une diminution de l’amplitude EPSC évoquée optiquement dans les neurones LA après exposition à la LTD optique (Figure 4A). Cette atténuation de l’amplitude EPSC était spécifique aux neurones qui recevaient une stimulation optique, car l’amplitude EPSC restait inchangée dans les contrôles SHAM. De plus, la DLT n’a pas pu être générée en tranches de rats ayant déjà reçu une stimulation optique in vivo, mais elle a été évoquée de manière fiable dans les neurones de rats ayant subi une stimulation SHAM, comme en témoigne une réduction soutenue de la pente ascendante de l’EPSP (figure 4B). Ainsi, la stimulation optique in vivo semble obstruer l’induction ultérieure de la LTD dans la tranche. Pendant l’enregistrement, il est important de mesurer la résistance en série pendant toute la durée de l’enregistrement pour assurer le maintien de la santé du patch. Les cellules présentant un changement de résistance en série supérieur à 20% ne sont pas acceptées pour l’analyse des données. Ceci est particulièrement important pour les expériences LTD qui durent >60 minutes, car les changements de résistance en série peuvent influencer la dynamique des récepteurs et des canaux. Pour s’assurer que les afférences stimulées lors des enregistrements électrophysiologiques proviennent du MGN, il est important de recueillir des tranches à travers l’étendue du thalamus. Cela sert de validation que les corps cellulaires du MGN expriment effectivement l’AAV par fluorescence. En plus de la confirmation visuelle, une validation fonctionnelle est également nécessaire. Dans des conditions de pince de courant, les neurones MGN infectés par AAV-oChIEF déclenchent des potentiels d’action en réponse aux hautes et basses fréquences de la stimulation lumineuse de 473 nm (Figure 4C).
Tous les résultats comportementaux ont été considérés comme provisoires jusqu’à ce que l’expression virale et les implants de fibres optiques soient vérifiés histologiquement et que le placement approprié soit confirmé (Figure 5). L’absence d’expression d’AAV dans le MGN ou l’AL et/ou ceux dans lesquels les fibres optiques n’étaient pas correctement positionnées dans l’AL dorsale ont été exclus de l’analyse expérimentale, mais dans certains cas peuvent être inclus comme un témoin anatomique négatif.
Figure 1 : Chronologie de la procédure expérimentale. Un aperçu des étapes critiques du protocole, y compris le déroulement séquentiel et la durée de chaque phase expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Acquisition et extinction de l’auto-administration de cocaïne. (A) Les animaux présentent un nombre croissant de perfusions de cocaïne et de réponses actives du levier tout au long de l’acquisition, ainsi qu’un faible niveau de réponses inactives du levier. (B) Après une augmentation initiale de la pression sur les leviers au jour 1 de l’extinction, les animaux diminuent en répondant sur les leviers actifs et inactifs à un niveau bas et stable. Barres d’erreur, moyenne ±SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de Rich et al. 20194. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La LTD optogénétique in vivo atténue la réintégration induite par les signaux. (A) La DLT optique entraîne une réduction significative des presses à levier actives pendant la remise en état par rapport aux animaux qui ont reçu une stimulation de contrôle du virus témoin ou de la MASH. ANOVA bidirectionnelle, effet principal de l’interaction de groupe (F(2,27) = 7,04, P = 0,004) et d’une interaction jour x groupe (F(2,27) = 8,08, P = 0,002); Analyse post hoc de Bonferroni : ***p < .001. (B) 7 jours plus tard, les rats ont subi un deuxième test de rétablissement, révélant une réduction significative du pressage actif du levier chez les animaux qui avaient déjà subi MGN-LA LTD par rapport aux témoins SHAM. ANOVA bidirectionnelle, effet principal du groupe (F(1,32) = 5,04, P = 0,032), interaction significative (F(1,32) = 7,69, P = 0,009); Analyse post hoc de Bonferroni, **p < .01. Barres d’erreur, moyenne ±SEM, n en barres, nombre de rats. Ce chiffre a été modifié à partir de Rich et al. 20194. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Validation fonctionnelle de la stimulation optogénétique in vivo à basse fréquence (A) La LTD in vivo à double hémisphère des synapses MGN-LA atténue l’amplitude EPSC par rapport aux témoins SHAM (test t non apparié, t(10) = 2,73, *P = 0,021). Encart : Traces EPSC moyennes de l’échantillon évoquées à Erev-70 mV. Barres d’échelle: 50 ms, 200 pA, n en barres, nombre de rats (neurones). (B) L’induction optique in vivo de la LTD occlut ex vivo. 24 h après l’induction in vivo de la LTD, des tranches d’amygdale ont été préparées et le même protocole de stimulation a été appliqué. La pente ascendante de l’EPSP aux terminaux MGN-LA a été réduite par stimulation optique ex vivo dans les neurones d’animaux ayant reçu une stimulation SHAM in vivo, mais pas dans les neurones d’animaux ayant reçu une LTD optique in vivo. n en italique, nombre de neurones. (C) Échantillonner les enregistrements de pince de courant des neurones MGN infectés par AAV-oChIEF. Les potentiels d’action ont été induits par la stimulation de la lumière bleue (5-100 Hz). Barres d’échelle : 100 ms, 40 mV. Barres d’erreur, moyenne ±SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de Rich et al. 20194. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Vérification histologique de l’expression virale et de la mise en place des fibres optiques. (A) Images microscopiques représentatives montrant l’expression DAPI et AAV-oChIEF-tdTomate en LA (à gauche) et MGN (à droite). Barre d’échelle: 2 mm. (B) Schéma montrant l’injection de AAV-oChIEF-tdTomate et dans toute l’étendue antérieure-postérieure du LA (gauche) et du MGN (droite), et les emplacements des fibres optiques dans le LA. L’ombrage rouge foncé montre la représentation de la plus petite propagation acceptable du virus, et l’ombrage rose clair montre la représentation de la plus grande propagation acceptable. Les cercles bleus correspondent à un placement réussi de la fibre optique dans les deux hémisphères. Les cercles noirs correspondent à un placement réussi de la fibre optique dans un seul hémisphère. Le noir « X » correspond à un placement infructueux de la fibre. Pour être inclus dans l’analyse finale, les rats avaient besoin d’une expression virale à double hémisphère dans l’AL ainsi que d’un placement réussi des fibres. Les coordonnées sont en mm, postérieures à partir de bregma. Ce chiffre a été modifié à partir de Rich et al. 20194. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Chimique | mm | MW | g/1000 mL |
| N-méthyl-D-glucamine | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Chlorure de potassium | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Phosphate de sodium monobasique | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodium Bicarbonate | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Sodium Ascorbate | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourée | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Sodium Pyruvate | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfate de magnésium | 10 | Utilisez 5,0 mL de 2,0 m de bouillon | |
| Chlorure de calcium | 0.5 | Utiliser 250 μL de 2,0 m de stock | |
| 1. Pour 1 L de solution, ajouter les sels dans l’ordre indiqué à 850 mL deddH2O | |||
| 2. pH avec HCl concentré à 7,3-7,4 (NMDG fait une solution basique) | |||
| 3. Oxygéner pendant 5-10 min puis ajouter MgSO4 et CaCl2 | |||
| 4. Porter la volutme finale à 1 L avec ddH2O et vérifier le pH final | |||
| 5. Vérifiez l’osmolarité avec l’osmomètre et ajustez-la à 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tableau 1 : Liste des ingrédients pour la solution de coupe extracellulaire. Ingrédients et instructions utilisés pour la préparation de la solution de coupe extracellulaire à base de NMDG.
| Chimique | mm | MW | g/1000 mL |
| N-méthyl-D-glucamine | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Chlorure de potassium | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Phosphate de sodium monobasique | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodium Bicarbonate | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Sodium Ascorbate | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourée | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Sodium Pyruvate | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfate de magnésium | 1 | Utiliser 500 μL de 2,0 m de stock | |
| Chlorure de calcium | 2 | Utilisez 1000 μL de 2,0 m de stock | |
| 1. Pour 1 L de solution, ajouter les sels dans l’ordre indiqué à 850 mL deddH2O | |||
| 2. pH avec 1 N HCl ou KOH à 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygéner pendant 5-10 min puis ajouter MgSO4 et CaCl2 | |||
| 4. Porter la volutme finale à 1 L avec ddH2O et vérifier le pH final | |||
| 5. Vérifiez l’osmolarité avec l’osmomètre et ajustez-la à 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tableau 2 : Liste des ingrédients pour la solution de rétention extracellulaire. Ingrédients et instructions utilisés pour la préparation de la solution de maintien extracellulaire.
| Chimique | mm | MW | g/1000 mL |
| N-méthyl-D-glucamine | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Chlorure de potassium | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Phosphate de sodium monobasique | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Sodium Bicarbonate | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glucose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Sulfate de magnésium | 1 | Utiliser 500 μL de 2,0 m de stock | |
| Chlorure de calcium | 2 | Utilisez 1000 μL de 2,0 m de stock | |
| 1. Pour 1 L de solution, ajouter les sels dans l’ordre indiqué à 850 mL deddH2O | |||
| 2. pH avec 1 N HCl ou KOH à 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygéner pendant 5-10 min puis ajouter MgSO4 et CaCl2 | |||
| 4. Porter la volutme finale à 1 L avec ddH2O et vérifier le pH final | |||
| 5. Vérifiez l’osmolarité avec l’osmomètre et ajustez-la à 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tableau 3 : Liste des ingrédients de la solution d’enregistrement extracellulaire. Ingrédients et instructions utilisés pour la préparation de la solution d’enregistrement extracellulaire.
| Chimique | mm | MW | mg/50 mL |
| Méthanesulfonate de césium | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Chlorure de césium | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Césium-EGTA | 0.4 | Ajouter 80 μL de 250 mM de Cs-EGTA | |
| THÉ-Chlorure | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Phosphocréatine de sodium | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Commencez avec 40-45 ml de qualité CLHP H2O | |||
| 2. Gardez la phosphocréatine, l’ATP et le GTP sur la glace en tout temps. | |||
| 3. Ajoutez les ingrédients dans l’ordre indiqué dans le tableau | |||
| 4. pH à 7,3 avec CsOH (environ 200 μL de 2 M CsOH) | |||
| 5. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité. | |||
| 6. Ajouter H2O de qualité CLHP à une osmolarité finale d’environ 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Préparer des aliquotes de 500 à 1000 μL et conserver à -80 °C ou -20 °C | |||
Tableau 4 : Liste des ingrédients de la solution intracellulaire d’électrophysiologie du méthanesulfonate de césium. Ingrédients et instructions utilisés pour la préparation de la solution intracellulaire de méthanesulfonate de césium.
| Chimique | mm | MW | mg/50 mL |
| Potassium Gluconate | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Chlorure de potassium | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Chlorure de sodium | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Ajouter 80 μL de K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Phosphocréatine de sodium | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Commencez avec 40-45 ml de qualité CLHP H2O | |||
| 2. Gardez la phosphocréatine, l’ATP et le GTP sur la glace en tout temps. | |||
| 3. Ajoutez les ingrédients dans l’ordre indiqué dans le tableau | |||
| 4. pH à 7,3 avec KOH (environ 200 μL de 2 M KOH) | |||
| 5. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité. | |||
| 6. Ajouter H2O de qualité CLHP à une osmolarité finale d’environ 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Préparer des aliquotes de 500 à 1000 μL et conserver à -80 °C ou -20 °C | |||
Tableau 5 : Liste des ingrédients de la solution intracellulaire d’électrophysiologie du gluconate de potassium. Ingrédients et instructions utilisés pour la préparation de la solution intracellulaire de gluconate de potassium.
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Discussion
Comme décrit ci-dessus, plusieurs étapes critiques sont importantes pour obtenir les résultats expérimentaux appropriés. Le protocole ne sera probablement efficace que chez les animaux qui acquièrent correctement l’auto-administration de cocaïne et, à ce jour, il n’a été testé qu’à l’aide des paramètres décrits ci-dessus. Il est possible que la dose de cocaïne, le calendrier de renforcement et les paramètres de signal puissent être modifiés avec probablement peu d’effet sur les résultats comportementaux, à l’exception du fait qu’un calendrier de renforcement de deuxième ordre peut conduire à une recherche de cocaïne indépendante de l’amygdale qui pourrait réduire l’efficacité de la procédure, bien que cela n’ait pas été directement testé14 . Il y a plusieurs points tout au long du protocole où la validation de la construction et du bon fonctionnement des fibres optiques aidera à assurer une stimulation optique réussie. Il est nécessaire de noter correctement les viroles pour éviter la perte de l’embout et polir les fibres optiques, et de tester que la perte de rendement lumineux à travers les implants ne dépasse pas 30%9. De plus, les paramètres de stimulation laser sont des considérations importantes. Le laser doit fonctionner à une puissance relativement faible (5-7 mW). La stimulation soutenue à basse fréquence est utilisée pour induire la LTD, ce qui peut être validé fonctionnellement en mesurant la force synaptique MGN-LA avec des enregistrements électrophysiologiques. Enfin, les résultats ont indiqué une réduction significative de la réintégration induite par les signaux avec un n final de 10 animaux par groupe, cependant, les expérimentateurs devraient s’attendre à commencer avec un n plus grand, car il est probable que certains animaux devront être exclus de l’analyse finale. Il est crucial de vérifier le placement anatomique et l’expression appropriés du virus et des fibres optiques, et de n’utiliser que les données provenant d’animaux chez lesquels l’histologie a été vérifiée.
Malgré l’effet comportemental robuste sur la recherche de cocaïne observé avec ce protocole, plusieurs limites doivent être prises en compte. D’une part, la méthode n’a été testée que chez des rats qui ont été entraînés avec un seul signal audiovisuel associé à de la cocaïne. Il n’est pas clair ce qui se passerait dans un scénario où plusieurs indices différents seraient conditionnés, ce qui serait une représentation plus précise de la dépendance humaine, où de multiples stimuli environnementaux deviennent fortement associés à la consommation de drogues15,16,17. Les preuves de notre laboratoire indiquent que la capacité de la LTD optogénétique à réduire la recherche de médicaments est due à une diminution de la force synaptique qui affaiblit les souvenirs associés aux signaux médicamenteux. Cependant, il n’est pas clair dans quelle mesure les souvenirs neutres ou non associés à l’auto-administration de cocaïne pourraient être affectés par ce protocole. En outre, bien que la méthode n’affecte la force synaptique que sur un circuit, d’autres circuits peuvent également être importants pour coder la mémoire et / ou conduire le comportement de recherche de cocaïne18,19,20. Enfin, il convient de noter que la DLT ne peut être induite qu’au niveau des synapses où le virus est suffisamment exprimé, laissant probablement certaines connexions synaptiques non affectées par le protocole de stimulation, ce qui limite potentiellement l’impact comportemental. De plus, les preuves suggèrent que seuls de petits ensembles de neurones et de synapses sont impliqués dans l’encodage d’un souvenir particulier, ce qui accrédite l’idée que l’induction de la LTD dans une région entière du cerveau n’est pas la meilleure stratégie pour effectuer un changement de comportement, alors que d’autres approches existent pour cibler spécifiquement les populations de neurones actives ou contextuellementactives 21, 22. Malgré cela, le protocole est efficace pour atténuer la recherche de drogue motivée par les signaux, probablement parce que la stimulation optique à basse fréquence limite l’induction de la LTD aux synapses qui ont déjà été potentialisées par des appariements répétés cocaïne-signal4.
Ce protocole fournit une avancée significative aux études comportementales optogénétiques plus couramment utilisées où l’activité des neurones est activée ou inhibée pendant que l’animal effectue le comportement en temps réel19,23. Au lieu de cela, l’optogénétique est utilisée ici comme un outil neuromodulateur pour inverser la plasticité induite par la cocaïne. Un avantage de cette méthode est que la manipulation optogénétique est indépendante du test comportemental, de sorte que les effets confusionnels potentiels de l’optogénétique (par exemple, les effets de circuit local, la période réfractaire après la stimulation lumineuse, les effets de stimulation antidromique, etc. 24 ne devrait pas affecter les résultats, augmentant ainsi la confiance que le mécanisme neuronal hypothétique médie les changements de comportement. Cette méthode peut donc être utilisée dans un certain nombre d’applications étudiant comment la plasticité synaptique, en particulier une augmentation de la force synaptique comme cela se produit avec LTP, se rapporte aux changements de comportement. Des approches similaires pourraient également être pertinentes pour l’application clinique des technologies de stimulation neuronale où les connexions anormales dans le cerveau entraînant un comportement dysfonctionnel peuvent être régulées à la baisse. De même, étant donné que la construction virale oChIEF répond à la fois aux stimulations à basse et à haute fréquence, il existe des applications potentielles à ces méthodes au-delà de la portée des expériences décrites. Par exemple, la LTP induite optogénétiquement peut être bénéfique pour inverser les déficits de plasticité observés dans un large éventail de troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux25. En outre, la plasticité bidirectionnelle au niveau des synapses MGN-LA a également été directement liée à la régulation des comportements liés aux troubles associés à la peur8.
La modulation des circuits neuronaux spécifiques qui soutiennent les comportements motivés par la drogue est essentielle pour établir l’abstinence à long terme de la consommation de drogues. Ce protocole utilise de nouvelles avancées en optogénétique in vivo pour inverser la plasticité d’un circuit neuronal précis qui est renforcé par l’auto-administration répétée de cocaïne en présence de signaux environnementaux. Le résultat de cette neuromodulation spécifique est une probabilité réduite que les réexpositions subséquentes déclenchent une réponse de recherche de cocaïne, ce qui peut avoir des implications importantes pour le développement de thérapies futures pour les troubles liés à l’utilisation de substances.
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Disclosures
Rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier les subventions de l’USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) et le ministère de la Santé de Pennsylvanie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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