Analyse af celledifferentiering, morfogenese og mønster under kyllingembrogenese ved hjælp af det gennemblødte perleassay

Summary

Det gennemblødte perleassay involverer målrettet levering af testreagens på ethvert udviklingstidspunkt for at studere reguleringen af celledifferentiering og morfogenese. En detaljeret protokol, der gælder for enhver forsøgsdyremodel, til fremstilling af tre forskellige typer gennemblødte perler og implantering af disse i et kyllingembryos interdigit præsenteres.

Abstract

En lang række genetiske programmer aktiveres under embryonal udvikling, der orkestrerer celledifferentiering for at generere en forbløffende mangfoldighed af somatiske celler, væv og organer. Den præcise aktivering af disse genetiske programmer reguleres af morfogener, diffusible molekyler, der styrer celleskæbne ved forskellige tærskler. At forstå, hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese, kræver undersøgelse af lokale interaktioner udløst af morfogener under udvikling. Anvendelsen af perler gennemblødt i proteiner eller lægemidler implanteret i forskellige områder af embryoet gør det muligt at studere specifikke molekylers rolle i etableringen af cifre og andre udviklingsprocesser. Denne eksperimentelle teknik giver information om kontrol af celleinduktion, celleskæbne og mønsterdannelse. Således er dette gennemblødte perleassay et ekstremt kraftfuldt og værdifuldt eksperimentelt værktøj, der kan anvendes til andre embryonale modeller.

Introduction

Gennembrud i de molekylære mekanismer, der styrer genekspression under embryonal udvikling, har gjort det muligt for os at forstå, hvordan celleskæbne bestemmes. Forpligtelse til forskellige celleafstamninger opstår, når celler begynder den molekylære ekspression af transkriptionsfaktorer¹. Dette ekspressionsmønster er stærkt koordineret i rum og tid og styrer derved formgivningen, placeringen og mønstret af celler, væv og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induktion er den proces, hvorved celler er forpligtet til specifikke slægter ved at etablere hierarkier, der begrænser cellernes potentiale, som endda inkluderer generering af den grundlæggende kropsplan, som det sker med^{Spemann-organisatoren 6,7}. Blastopore dorsal læbe inducerer en anden embryonal akse i et værtsembryo ^8,9. I dag er det ved hjælp af podning og andre klassiske eksperimenter kombineret med molekylære tilgange kendt, at forskellige transkriptionsfaktorer og vækstfaktorer fungerer til at lede embryonal induktion i^{Spemann-arrangøren 10}. Eksperimentel manipulation er således et vigtigt redskab til at forstå celledifferentiering, morfogenese og mønsterprocesser under embryogenese.

Interessant nok bruges bærere i embryonale systemer, hvor vævstransplantation er vanskelig, eller når induktorerne allerede er velkendte, til at levere molekyler (f.eks. Proteiner, kemikalier, toksiner osv.) for at regulere celledifferentiering, morfogenese og endda mønster. Et sådant bærersystem involverer implantering af perler gennemblødt i et specifikt molekyle i enhver eksperimentel modelorganisme på ethvert udviklingstidspunkt for at bestemme virkningen af det nævnte reagens eller styre differentieringen af den nævnte model. For eksempel ved at implantere retinsyre (RA)-gennemblødte perler i kyllingevingebenknoppen, Cheryl Tickle et al. (1985) demonstrerede, at RA inducerer ekspressionen af sonisk pindsvin i zonen af polariserende aktivitet (ZPA) ^11,12. Den samme eksperimentelle strategi blev brugt til at opdage, at RA styrer asymmetrien af somitter og celledød i lemmernes knopp under cifferudvikling og i andre embryonale lemmer^regioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsagelig proteiner (f.eks. fibroblastvækstfaktorer [FGF], transformerende vækstfaktor-beta [TGF-ß]) er blevet brugt til at inducere lemmer i tidlige embryoners flanker og nye cifre i den interdigitale region, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimenter beviser kraften og nytten af denne teknik til bestemmelse af stadiet af engagement eller kompetence af væv eller grupper af celler udsat for molekylerne.

I denne protokol tjente kyllingelemmet på tidspunktet for cifferdannelse som den eksperimentelle model til at præsentere trin for trin, hvordan man forbereder og implanterer de gennemblødte perler. Dette eksperimentelle værktøj er imidlertid ikke begrænset til denne applikation, men kan udnyttes i enhver eksperimentel dyremodel og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo til at studere induktion, differentiering, celledød og mønster.

Protocol

Denne forskning blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Board for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico).

1. Æginkubation og embryo iscenesættelse

BEMÆRK: Befrugtede høneæg kan fås fra lokale gårde. Befrugtede hvide leghorn kyllingæg er mest almindeligt anvendt. Opbevar de friskgødede kyllingæg ved 15 °C i op til 1 uge før inkubation.

1. Inkuber de befrugtede kyllingæg lodret med den spidse side nedad i en befugtet inkubator ved 38 ° C og 70% relativ luftfugtighed, indtil de når 28 HH-stadiet (ca. 5,5 dage ifølge Hamilton og Hamburger, 1951)²². Drej æggene under inkubationen for at forhindre embryoet i at klæbe til skalmembranen.
   BEMÆRK: Valget af udviklingsstadiet er informeret af de eksperimentelle mål. I dette tilfælde er 28 HH-stadiet optimalt til intercifret perleimplantation for at fremkalde et ektopisk ciffer eller fremme celledød.
2. Fjern æggene fra inkubatoren, vatpind dem med 70% ethanol, og lad dem lufttørre. Desinficer arbejdsområdet, mikroskoper og instrumenter med 70% ethanol.
3. Stearinlys ægget for at identificere blodkar og lokalisere embryoet. Kassér æg, der ikke har et embryo.
4. Brug enden af ikke-tandede tang til at åbne et vindue i omkring fem æg ved at trykke på den stumpe ende af et æg og fjerne en 1 cm² sektion af skallen med tangen.
5. Overfør ægget til en karton- eller plastholder, og læg det under stereomikroskopet. Fjern luftmembranen ved at punktere og trække den ud med fine kirurgiske tang. Fjern ethvert lille stykke æggeskal, der kan komme i kontakt med embryoet.
   BEMÆRK: Luftmembranen er den hvide, uigennemsigtige membran, der observeres umiddelbart efter vinduesudset af ægget.
6. Overhold under mikroskopet, mens du åbner fostersækken lidt, rive den ved hjælp af de fine kirurgiske tang. Pas på ikke at beskadige vaskulaturen af den chorioallantoiske membran.
   BEMÆRK: Amnionen er den gennemsigtige membran, der tæt omgiver embryoet, der indkapsler det i fostervand.
7. Trin embryonerne i ovo for at afgøre, om de er i det ønskede stadium. Embryoner i tidligere stadier kan returneres til inkubatoren efter forsegling af æggeskalsvinduet med tape.

2. Perleforberedelse

BEMÆRK: Afhængigt af det pågældende eksperimentelle mål og den pågældende behandling kan alternative perletyper (f.eks. Affi-Gel, AG1-X2, heparin) være mere egnede. Affi-Gel perler er optimale til proteiner (f.eks. TGF-ß1), mens heparinperler er ideelle til vækstfaktorer (f.eks. FGF'er, WNT) og AG1-X2-perler til kemikalier opløselige i organiske opløsningsmidler (f.eks. DMSO).

1. Affi-Gel og heparin perle forberedelse
   1. Skær en firkant parafilm, så den passer til en 45 mm petriskål. Placer parafilmen over bunden af petriskålen for at dække den og fastgør den til bunden af petriskålen ved at skubbe hvert toppunkt ved hjælp af enden af ikke-tandede tang. Afsat.
   2. Brug en pipette eller spatel til at overføre perlerne til et mikrocentrifugerør og vaske dem to gange i 1x PBS ved bundfældning og pipettering.
   3. Overfør ~ 40-50 perler med en mikropipette til midten af den parafilmede petriskål fra trin 1.
   4. Brug mikroskopet til at vælge ~ 30 Affi-Gel eller heparin perler ~ 100 μm i diameter til brug. Brug et mikroskop okular retikel til at dimensionere perlerne eller brug den tredje interdigit af et HH 28 embryo som reference; bønnen skal være mindre end interdigit.
   5. Fjern forsigtigt så meget af den overskydende PBS, der omgiver perlerne, som muligt, og blød dem i 2-5 μL af behandlingsopløsningen. Sørg for, at opløsningen helt dækker perler.
   6. Parallelt hermed fremstilles kontrolperler ved at lægge dem i blød i en opløsning, der indeholder den samme mængde køretøj som anvendt i den eksperimentelle behandlingsopløsning.
      BEMÆRK: Koncentrationer skal beregnes for hver behandling i henhold til forsøget. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af potentielt skadelige reagenser.
   7. Inkuber perlerne i opløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur. For at forhindre perlerne i at tørre ud under inkubationen pipetteres et par dråber 1x PBS eller vand omkring perlerne for at befugte den lokale atmosfære og dække fadet med parafilm for at bremse fordampningen.
   8. Læg petriskålen på is og implanter perlerne inden for samme dag.
2. AG 1-X2 perleforberedelse
   1. Skær en firkant parafilm, så den passer til en 45 mm petriskål. Dæk bunden af petriskålen med parafilm og anbring ved at skubbe hvert toppunkt ved hjælp af enden af ikke-tandede tang. Afsat.
   2. Brug en spatel til at overføre AG 1-X2-perlerne til et mikrocentrifugerør. Der tilsættes 30-50 μL af behandlingsopløsningen ved den ønskede endelige koncentration.
   3. Parallelt inkuberes kontrolperlerne i en opløsning med køretøjet alene, fremstillet uden det eksperimentelle kemikalie eller protein af interesse.
   4. Inkuber perlerne i 20 minutter, mens du langsomt ryster ved stuetemperatur. Pak mikrocentrifugerørene ind med folie for at beskytte mod lys under al inkubation, da mange af disse molekyler er lysfølsomme
   5. Fjern så meget af opløsningen som muligt ved hjælp af en pipette og plet med 2% phenolrød opløst i vand ved stuetemperatur i 2 minutter med mild omrøring i en hvirvel.
      BEMÆRK: Farvning af de gennemsigtige AG 1-X2 perler letter deres implantation i embryoet.
   6. Fjern 2% phenol rød og vask perlerne to gange i 1x PBS for at fjerne overskydende farvestof.
   7. Med en mikropipettespids overføres ~ 40-50 AG 1-X2 perler til midten af den parafilmdækkede petriskål tilberedt i trin 1 og blød disse i blød i 5 μL 1x PBS. Under mikroskopet skal du vælge omkring 30 perler, der er ~ 100 μm diameter i størrelse. Kassér de ubrugte perler.
   8. Perler er klar til implantering. Sørg for, at perlerne er nedsænket i PBS under hele implantationen ved at pipettere et par dråber 1x PBS eller vand omkring perlerne for at befugte den lokale atmosfære og / eller dække skålen med parafilm for at bremse fordampningen.

3. Embryomanipulation og interdigitimplantation

1. Før du manipulerer embryonerne, skal du arrangere to stereomikroskoper ved siden af hinanden på en bordplade. Den ene er til embryomanipulation og perleimplantation, og den anden er til at opretholde de behandlede perler klar til at implantere i embryoet.
2. Brug ikke-tandede tang til at oprette et vindue i de resterende æg som beskrevet i æginkubations- og embryoiscenesættelsesafsnittet.
3. Under mikroskopet skal du åbne fostersækken ved at rive fosterhinden med fine kirurgiske tang nær højre bagben kun med den mængde, der er nødvendig for at udføre proceduren (dvs. så lidt som muligt).
4. Brug fine tang til at holde embryoet ved fosterhinden for at udsætte højre bagben. Brug en fin wolframnål til at lave et hul centreret i det distale meste af den tredje interdigit af bagbenet.
5. Uden at frigive embryoet og den udsatte bagben, skal du tage en behandlet perle fra det andet mikroskop ved hjælp af en af spidserne af tangen. Tangen skal være i åben position, for at en perle kan klæbe til tangspidsen.
6. Overfør prikken til kyllingembryoet nær bagbenet og placer det oven på det intercifrede hul.
7. Luk tangen for at lægge pres på perlerne, indtil den kommer ind i hullet.
8. Slip embryoet og forsegl æggeskalsvinduet med tape.
9. Returner æggene til inkubatoren, indtil de har nået det krævede stadium. Gentag proceduren, indtil det krævede antal manipulerede embryoner er nået. Det er bydende nødvendigt at sikre, at perlerne ikke tørrer ud på noget tidspunkt.
   BEMÆRK: For at observere en komplet ektopisk finger skal du inkubere i ~ 72 timer efter perleimplantation. I modsætning hertil udtrykkes tidlige differentieringsgener (f.eks. Sox9) ~ 30 minutter efter implantationen af en TGF-ß1-gennemblødt perle.

Representative Results

Brug af gennemblødte perler til at evaluere celleadfærd i det embryonale kyllingelem
For at sikre effektiviteten af dette assay skal adlen placeres konsekvent og præcist på det rigtige sted; i dette tilfælde den distale-most af den tredje interdigit under den apikale ektodermale højderyg AER (figur 1A). Denne positionering gør det muligt for det pågældende molekyle at sprede sig ligeligt gennem det interdigitale væv. Desuden indeholder zonen under AER udifferentierede celler, der let reagerer på behandling. For at evaluere virkningerne på celledifferentiering kan embryonerne farves med Alcian blå og Alizarin rød for at bevise dannelsen af skeletelementer (figur 1B). Det gennemblødte perleassay er også velegnet til evaluering af celledød med neutral rød (figur 1C) og genregulering ved in situ-hybridisering (figur 1D). Skalastangen er sat til 250 μm.

Figur 1: Perleimplantation i det interdigitale væv i kyllingelemmet.( A) Den korrekte placering af den gennemblødte perle under AER i en 28 HH bagben. (B) Alcian blå og Alizarin rød skeletfarvning beviser dannelsen af et ektopisk ciffer induceret 4 dage efter implantation af en TGF-ß1-gennemblødt perle. (C) Neutral rød farvning markerer celledødsinduktion (pilespids) 24 timer efter implantering af en RA-gennemblødt perle i det interdigitale væv på 28 HH-stadiet. (D) Sox9 in situ-hybridisering 4 timer efter implantation af en TGF-ß1-gennemblødt perle. Skalastangen er sat til 250 μm. Billederne vist i B og C er taget fra Díaz-Hernández et ^al.23,24. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den største fordel ved det eksperimentelle værktøj, der er beskrevet i denne protokol, er at være i stand til at kontrollere tid og sted for eksponeringen for perler gennemblødt i et givet eksperimentelt molekyle. Kombinationen af den korrekte positionering med præcis udviklingstid giver enorme muligheder for at studere celledifferentieringsprocesser. Udførelse af disse eksperimenter i udifferentieret væv gør det muligt at undersøge de første afgørende begivenheder i cellulær afstamning. For eksempel resulterer placering af en TGFß-gennemblødt perle i det interdigitale væv i embryonale lemmer 28 HH i dannelsen af et ektopisk ciffer, hvor en molekylær kaskade udløses, der inducerer den genetiske ekspression af mastergen Sox9²⁵. Bemærkelsesværdigt nok organiserer det inducerede bruskvæv sig også i et ciffer med falanksdannelse.

Interessant nok udløser RA celledød i samme interdigitale region ved at regulere genekspressionen af knoglemorfogenetiske proteiner, der styrer celleskæbne for udifferentierede celler mod celledød¹⁰. Derfor kan celledifferentiering, celledød, morfogenese og mønstering samtidig undersøges i samme region af et embryo og skræddersys til enhver region og genetisk vej af interesse ^8,9.

De elementer, der er afgørende for succesen med denne protokol, inkluderer aldrig at lade de gennemblødte perler tørre ud (dvs. de skal altid forblive våde). Det er også vigtigt at vælge de passende perler: Affi-Gel og heparinperler er til proteiner, mens AG1-X2 er til kemikalier opløst i organiske opløsningsmidler. Et andet kritisk punkt er koncentrationen af molekylet indeholdt i opløsningen, der anvendes til at suge perlerne, som normalt er 1000 gange mere koncentreret, end det ville blive brugt til in vitro-undersøgelser . Ikke desto mindre er en ulempe ved denne metode, at den endelige koncentration af molekyler frigivet fra de gennemblødte perler er ukendt, såvel som frigivelseshastigheden. I protokollen nævnes, at perler-100 μm diameter er mere praktisk til brug. Overvej dette, når lemmer manipuleres. Vigtigst er det, at perlernes diameter skal vælges i henhold til implantationszonen og konsekvent opretholdes i hvert embryo. En lille variation i perlestørrelsen mellem eksperimenterne vil dog sandsynligvis ikke påvirke resultaterne.

Afslutningsvis afhænger potentialet i det gennemblødte perleassay, der er skitseret her, kun af forskerens fantasi. Denne protokol kan anvendes på enhver eksperimentel dyre-, cellekultur- eller organotypisk kulturmodel, herunder organoider. Desuden er denne protokol et nyttigt, ligetil uddannelsesværktøj til at undervise eleverne i grundlæggende udviklingsbiologiske begreber og tekniske færdigheder ved at øve denne eksperimentelle manipulation i udviklingsbiologiklasser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01