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Recupero avanzato dell'olio utilizzando una combinazione di biotensioattivi

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

Illustriamo i metodi coinvolti nello screening e nell'identificazione dei microbi che producono biotensioattivi. Vengono inoltre presentati metodi per la caratterizzazione cromatografica e l'identificazione chimica dei biotensioattivi, determinando l'applicabilità industriale del biotensioattivo nel migliorare il recupero residuo dell'olio.

Abstract

I biotensioattivi sono composti tensioattivi in grado di ridurre la tensione superficiale tra due fasi di polarità diverse. I biotensioattivi stanno emergendo come alternative promettenti ai tensioattivi chimici a causa della minore tossicità, dell'elevata biodegradabilità, della compatibilità ambientale e della tolleranza a condizioni ambientali estreme. Qui illustriamo i metodi utilizzati per lo screening dei microbi in grado di produrre biotensioattivi. I microbi che producono biotensioattivi sono stati identificati utilizzando il collasso delle gocce, la diffusione dell'olio e i saggi dell'indice di emulsione. La produzione di biotensioattivi è stata convalidata determinando la riduzione della tensione superficiale del mezzo dovuta alla crescita dei membri microbici. Descriviamo anche i metodi coinvolti nella caratterizzazione e identificazione dei biotensioattivi. La cromatografia su strato sottile del biotensioattivo estratto seguita da colorazione differenziale delle piastre è stata eseguita per determinare la natura del biotensioattivo. LCMS, 1H NMR e FT-IR sono stati utilizzati per identificare chimicamente il biotensioattivo. Illustriamo inoltre i metodi per valutare l'applicazione della combinazione di biotensioattivi prodotti per migliorare il recupero dell'olio residuo in una colonna di sabbia simulata.

Introduction

I biotensioattivi sono le molecole anfipatiche tensioattive prodotte da microrganismi che hanno la capacità di ridurre la superficie e la tensione interfacciale tra due fasi1. Un tipico biotensioattivo contiene una parte idrofila che di solito è composta da una porzione di zucchero o una catena peptidica o amminoacido idrofilo e una parte idrofobica costituita da una catena di acidi grassi saturi o insaturi2. A causa della loro natura anfipatica, i biotensioattivi si assemblano all'interfaccia tra le due fasi e riducono la tensione interfacciale al confine, il che facilita la dispersione di una fase nell'altra 1,3. Vari tipi di biotensioattivi che sono stati segnalati finora includono glicolipidi in cui i carboidrati sono legati agli acidi alifatici o idrossi-alifatici a catena lunga tramite legami estere (ad esempio, ramnolipidi, trealolipidi e soforolipidi), lipopeptidi in cui i lipidi sono attaccati a catene polipeptidiche (ad esempio, tensioattivi e lichenisina) e biotensioattivi polimerici che di solito sono composti da complessi polisaccaridici-proteici (ad esempio, emulsan, liposan, alasan e lipomannan)4. Altri tipi di biotensioattivi prodotti dai microrganismi includono acidi grassi, fosfolipidi, lipidi neutri e biotensioattivi particolati5. La classe di biotensioattivi più studiata è quella dei glicolipidi e tra questi la maggior parte degli studi sono stati riportati sui ramnolipidi6. I ramnolipidi contengono una o due molecole di ramnosio (che formano la parte idrofila) legate a una o due molecole di acido grasso a catena lunga (di solito acido idrossi-decanoico). I ramnolipidi sono glicolipidi primari riportati per primi da Pseudomonas aeruginosa7.

I biotensioattivi stanno guadagnando sempre più attenzione rispetto alle loro controparti chimiche a causa di varie proprietà uniche e distintive che offrono8. Questi includono maggiore specificità, minore tossicità, maggiore diversità, facilità di preparazione, maggiore biodegradabilità, migliore formazione di schiuma, compatibilità ambientale e attività in condizioni estreme9. La diversità strutturale dei biotensioattivi (Figura S1) è un altro vantaggio che dà loro un vantaggio rispetto alle controparti chimiche10. Sono generalmente più efficaci ed efficienti a concentrazioni più basse poiché la loro concentrazione critica di micelle (CMC) è di solito parecchie volte inferiore ai tensioattivi chimici11. È stato segnalato che sono altamente termostabili (fino a 100 °C) e possono tollerare pH più elevati (fino a 9) e alte concentrazioni di sale (fino a 50 g/L)12 offrono quindi diversi vantaggi nei processi industriali, che richiedono l'esposizione a condizioni estreme13. La biodegradabilità e la minore tossicità li rendono adatti per applicazioni ambientali come il biorisanamento. A causa dei vantaggi che offrono, hanno ricevuto maggiore attenzione in vari settori come l'industria alimentare, agricola, dei detergenti, cosmetica e petrolifera11. I biotensioattivi hanno anche guadagnato molta attenzione nella bonifica del petrolio per la rimozione di contaminanti petroliferi e inquinanti tossici14.

Qui riportiamo la produzione, la caratterizzazione e l'applicazione di biotensioattivi prodotti da Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108. I passaggi coinvolti nello screening, nella caratterizzazione e nell'applicazione di una combinazione di biotensioattivi per un migliore recupero dell'olio sono descritti nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Un metodo per un migliore recupero dell'olio utilizzando una combinazione di biotensioattivi. Viene mostrato il flusso di lavoro graduale. Il lavoro è stato eseguito in quattro fasi. In primo luogo i ceppi microbici sono stati coltivati e sottoposti a screening per la produzione di biotensioattivi mediante vari saggi, che includevano il saggio di collasso delle gocce, il saggio di diffusione dell'olio, il saggio dell'indice di emulsione e la misurazione della tensione superficiale. Quindi, i biotensioattivi sono stati estratti dal brodo privo di cellule e la loro natura è stata identificata utilizzando la cromatografia a strato sottile e sono stati ulteriormente identificati utilizzando LCMS, NMR e FT-IR. Nella fase successiva, i biotensioattivi estratti sono stati miscelati insieme e il potenziale della miscela risultante per un migliore recupero dell'olio è stato determinato utilizzando la tecnica della colonna di sabbia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo screening di questi ceppi microbici per produrre biotensioattivi è stato effettuato mediante collasso delle gocce, diffusione dell'olio, saggio dell'indice di emulsione e determinazione della riduzione della tensione superficiale del mezzo privo di cellule a causa della crescita dei microbi. I biotensioattivi sono stati estratti, caratterizzati e identificati chimicamente da LCMS, 1H NMR e FT-IR. Infine, è stata preparata una miscela di biotensioattivi prodotti da questi microbi ed è stata utilizzata per recuperare l'olio residuo in una colonna di sabbia simulata.

Il presente studio illustra solo i metodi coinvolti nello screening, nell'identificazione, nella caratterizzazione strutturale e nell'applicazione della combinazione di biotensioattivi per migliorare il recupero dell'olio residuo. Non fornisce una caratterizzazione funzionale dettagliata dei biotensioattivi prodotti dai ceppi microbici15,16. Vari esperimenti come la determinazione critica delle micelle, l'analisi termogravimetrica, la bagnabilità superficiale e la biodegradabilità vengono eseguiti per la caratterizzazione funzionale dettagliata di qualsiasi biotensioattivo. Ma poiché questo documento è un documento di metodi, l'attenzione si concentra sullo screening, l'identificazione, la caratterizzazione strutturale e l'applicazione della combinazione di biotensioattivi per migliorare il recupero dell'olio residuo; questi esperimenti non sono stati inclusi in questo studio.

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Protocol

1. Crescita di ceppi microbici

  1. Pesare 2 g di Luria Brodo in polvere e aggiungere a 50 ml di acqua distillata in un matraccio conico da 250 ml. Mescolare il contenuto fino a quando la polvere si dissolve completamente e portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata.
  2. Allo stesso modo, preparare altri due palloni da 100 ml di brodo di Luria e posizionare tappi di cotone sul collo dei palloni.
  3. Coprire i tappi di cotone con un foglio di alluminio e autoclave i palloni per 15 minuti a 121 °C e 15 psi per sterilizzare il supporto.
  4. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il fluido a temperatura ambiente.
  5. Per la preparazione della coltura primaria di un ceppo, prelevare una singola colonia da una piastra laica utilizzando un ciclo di inoculazione e inoculare in una provetta contenente 5 ml di brodo di Luria sterile.
  6. Incubare la provetta durante la notte a 30 °C a 180 giri/min.
  7. Inoculare i palloni contenenti 100 mL di brodo di Luria autoclavato aggiungendo 1 mL di colture di semi coltivate durante la notte ai palloni all'interno dell'armadio a flusso d'aria laminare.
  8. Incubare i palloni in un incubatore rotativo a 30 °C e 180 giri/min per 7 giorni.
  9. Dopo il completamento del periodo di incubazione, raccogliere i palloni e trasferire il brodo di coltura nei tubi della centrifuga. Centrifugare la coltura a 4.500 x g per 20 min in una centrifuga refrigerata a 4 °C.
  10. Versare delicatamente il surnatante privo di cellule in un becher fresco e utilizzarlo nei saggi di screening per la produzione di biotensioattivi.

2. Saggi di screening per la produzione di biotensioattivi

NOTA: Nelle sezioni seguenti, il tensioattivo commerciale (Saponina) è stato utilizzato come controllo positivo mentre l'acqua e i mezzi non vaccinati sono stati utilizzati come controllo negativo.

  1. Analisi di compressione delle gocce
    1. Prendere un vetrino pulito e rivestire la superficie del vetrino con 200 μL di olio.
    2. Aggiungere 20 μL del surnatante libero da cellule al centro dell'olio e lasciarlo indisturbato per 2-3 minuti.
      NOTA: se la goccia collassa, segnare il surnatante positivo per la presenza di biotensioattivo.
  2. Saggio di diffusione dell'olio
    1. Prendere 20 ml di acqua doppia distillata in una piastra di Petri (diametro 75 mm) e aggiungere 200 μL di petrolio greggio alla superficie dell'acqua.
    2. Aggiungere 20 μL di surnatante libero da cellule al centro dell'olio e lasciarlo indisturbato per 1 minuto.
      NOTA: se si forma una zona di compensazione a causa dello spostamento dell'olio, assegnare un punteggio positivo al surnatante per la presenza del biotensioattivo.
  3. Saggio dell'indice di emulsione (saggio E24 )
    1. Aggiungere 4 ml di benzina (benzina) e surnatante senza celle ciascuno in una provetta di vetro pulita.
    2. Ruotare vigorosamente la miscela per 3 minuti e lasciarla indisturbata per le successive 24 ore.
    3. Dopo 24 ore, determinare l'indice E24 in percentuale dell'altezza dello strato emulsionato (cm) rispetto all'altezza dell'intera colonna liquida (cm).
      Equation 1
      NOTA: Se si osserva un'emulsione (olio in acqua o acqua in olio) dopo 24 ore, è probabile che il surnatante contenga il biotensioattivo.
  4. Misurazione della tensione superficiale
    NOTA: La tensione superficiale è stata misurata utilizzando il metodo dell'anello du Noüy17. Lo strumento utilizzato in questo esperimento (vedi Tabella dei materiali) è molto sensibile, quindi garantire una corretta pulizia del recipiente di vetro e della sonda.
    1. Accendere il sistema e fare doppio clic sul software associato per aprirlo.
    2. Pulire il recipiente di vetro con il liquido la cui tensione superficiale deve essere determinata.
    3. Aggiungere il liquido (40 ml) nel recipiente e montare il recipiente sul portasciuga.
    4. Sblocca il supporto della sonda e monta la sonda su di esso. Ora blocca il supporto della sonda premendo il pulsante Di blocco sul controller manuale.
    5. Utilizzando il controller manuale, regolare l'altezza della piattaforma in modo che la sonda sia a circa 2-3 mm di distanza dalla superficie del liquido.
    6. Ora usa il software per misurare la tensione superficiale. Fai clic su File situato nel pannello in alto a sinistra dello schermo. Fare clic su Apri area di lavoro. Apparirà una finestra pop-up.
    7. Scorrere verso il basso e fare doppio clic sull'icona K100: Superficie e tensione interfacciale .
    8. Ora, fai clic sull'icona File situata nell'angolo in alto a sinistra dello schermo. Fare clic su Nuovo database. Immettere il nome per il salvataggio dei dati e fare clic su OK.
    9. Ancora una volta, fare clic su File > nuova misurazione > anello di > SFT. Immettere il nome della misurazione. Assicurarsi che il modello di configurazione mostri l'anello SFT.
    10. Inserire i dettagli nella finestra Configurazione misurazione selezionando la sonda e il recipiente utilizzato per la misurazione. Inoltre, inserisci i dettagli del liquido e della fase gassosa.
      NOTA: La fase liquida sarà acqua, mentre la fase gassosa sarà aria. La densità della fase liquida è la densità del surnatante libero da cellule. Questo può essere determinato prendendo il peso di 50 ml del liquido e calcolando la densità come Kg/m3.
    11. Ora fai clic sulla scheda Procedura e inserisci i seguenti dettagli: Velocità di rilevamento: 6 mm / min, Sensibilità di rilevamento: 0,005 g, Velocità di ricerca: 6 mm / min, Sensibilità di ricerca: 0,005 g, Velocità di misurazione: 3 mm / min, Sensibilità di misurazione: 0,001 g, Profondità di immersione: 3 mm, Distanza di ritorno: 10%, correzione: Harkins & Jordan, valori massimi: 5. Fare clic su OK.
    12. Nella finestra pop-up, selezionare il database in cui memorizzare i dati e fare clic su OK.
      NOTA: è possibile creare un nuovo database qui o aggiungere nuove misurazioni ai dati esistenti.
    13. Ora fai clic sul pulsante Riproduci situato nella parte superiore centrale dello schermo. Il sistema inizierà a eseguire lo script. Dopo che il sistema si è stabilizzato, rileverà la superficie. Immergere la sonda nel liquido, spostare la sonda avanti e indietro e rilevare la tensione nella lamella formata.
    14. Per ottenere i risultati, fare clic sull'icona Misurazione nella parte centrale sinistra dello schermo. Fare clic su Dati e annotare la tensione superficiale determinata.
    15. Dopo aver completato la misurazione, abbassare l'altezza della piattaforma e sbloccare e smontare la sonda e la nave dallo strumento.
      NOTA: per determinare la diminuzione della tensione superficiale dovuta alla produzione di biotensioattivi, il LB non inoculato deve essere utilizzato come controllo.

3. Estrazione di biotensioattivi

  1. Regolare il pH del surnatante libero da cellule a 2 utilizzando 2 N HCl. Conservare la miscela a 4 °C durante la notte.
  2. Aggiungere lo stesso volume della miscela cloroformio-metanolo (2:1) al surnatante e mescolare vigorosamente per 20 minuti.
  3. Lasciare la miscela indisturbata affinché si verifichi la separazione di fase.
  4. Rimuovere la fase superiore contenente acqua e metanolo e lasciare evaporare la fase inferiore contenente il biotensioattivo in una cappa aspirante.
  5. Dopo l'evaporazione della fase organica, ridistribuire il biotensioattivo grezzo color miele in 3 ml di cloroformio e utilizzare questa miscela per un'ulteriore identificazione e caratterizzazione del biotensioattivo.

4. Studi di stabilità delle emulsioni

  1. Stabilità dell'emulsione a diverse temperature
    1. Prendi 5 ml di supernatanti privi di cellule in diverse provette.
    2. Aggiungere 5 ml di benzina a ciascuna provetta e mescolare vigorosamente vorticosamente per 3 minuti.
    3. Incubare le provette durante la notte in diversi bagni d'acqua a diverse temperature (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C e 70 °C).
    4. Dopo 24 ore, stimare gli indici di emulsione come menzionato in precedenza.
  2. Stabilità dell'emulsione a diversi valori di pH
    1. Prendere 5 ml di surnatante libero da cellule in provette pulite.
    2. Regolare il pH dei supernatanti liberi da cellule (2, 4, 6, 8 e 10) utilizzando 1 N HCl e 1 N NaOH.
    3. Aggiungere una quantità uguale di benzina alle provette e mescolare vigorosamente ruotando per 3 minuti.
    4. Lasciare le provette indisturbate a temperatura ambiente per 24 ore.
    5. Stimare l'indice di emulsione come accennato in precedenza.
  3. Stabilità dell'emulsione a diverse concentrazioni saline
    1. Prendere 5 ml di surnatante libero da cellule in provette pulite.
    2. Aggiungere diverse quantità di sale (NaCl) ai supernatanti (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L e 80 g/L).
    3. Sciogliere i sali nei supernatanti liberi da cellule vorticosamente per 3 minuti.
    4. Aggiungere una quantità uguale di benzina alle provette e mescolare vigorosamente ruotando per 3 minuti.
    5. Lasciare le provette indisturbate a temperatura ambiente per 24 ore.
    6. Stimare l'indice di emulsione dopo 24 ore.

5. Determinazione della natura del biotensioattivo

  1. TLC del biotensioattivo estratto
    1. Spot 20 μL dei biotensioattivi su piastre TLC. Spot 2 μL contemporaneamente.
    2. Individua i biotensioattivi su tre diverse piastre TLC.
    3. Preparare una miscela da 100 ml dell'eluente contenente cloroformio:metanolo (2:1) e aggiungere l'eluente alla camera TLC. Chiudere il coperchio della camera e lasciarlo saturare per 20 minuti.
    4. Dopo aver asciugato le piastre, posizionare le piastre TLC all'interno della camera sature di una miscela di metanolo cloroformio ed eseguire la TLC.
    5. Dopo che l'eluente ha raggiunto la parte superiore della piastra TLC (1 cm di distanza dalla parte superiore), estrarre le piastre e lasciarle asciugare all'aria.
  2. Colorazione per il rilevamento dei lipidi
    1. Prendi una camera TLC pulita e aggiungi alcuni (5-10) granuli di iodio nella camera fresca e satura la camera per 5-10 minuti.
    2. Posizionare la piastra TLC all'interno della camera e osservare lo sviluppo delle macchie gialle. Se compaiono le macchie, segnare il biotensioattivo positivo per la presenza della componente lipidica.
  3. Colorazione per il rilevamento di peptidi o amminoacidi
    1. Preparare una soluzione di ninidrina sciogliendo 0,4 g di ninidrina in 20 ml di butanolo. Aggiungere 0,6 ml di acido acetico glaciale al 100% alla miscela.
    2. Spruzzare la piastra TLC con soluzione di ninidrina e lasciarla asciugare all'aria per 2 minuti. Riscaldare la piastra a 110 °C e osservare lo sviluppo del colore.
      NOTA: Se compaiono le macchie blu, assegnare un punteggio positivo al biotensioattivo per la presenza di qualsiasi catena peptidica o amminoacido.
  4. Colorazione per il rilevamento dei carboidrati
    1. Preparare una soluzione di p-anisaldeide aggiungendo 2 ml di p-anisaldeide a 48 ml di acido acetico glaciale contenente 1 mL di H2SO4. Aggiungere 0,6 ml di acido acetico alla miscela.
    2. Spruzzare uniformemente la miscela su una piastra TLC e lasciarla asciugare all'aria per 2 minuti.
    3. Incubare la piastra a 110 °C e monitorare lo sviluppo delle macchie.
      NOTA: Se compaiono le macchie verdi o marroni, segnare il biotensioattivo positivo per la presenza di eventuali carboidrati.

6. Identificazione chimica del biotensioattivo

  1. LCMS del biotensioattivo
    1. Sciogliere 25 mg del biotensioattivo estratto in 1 mL di cloroformio.
    2. Eseguire LCMS (in una configurazione di blocco spray con una frequenza di scansione di riferimento di 10 s) utilizzando una colonna C18.
    3. Utilizzare cloroformio:metanolo (1:1) come fase mobile e iniettare 2 μL del campione nella colonna ad una portata di 0,1 ml/min.
    4. Impostare i parametri sperimentali su: polarità: ES positivo, tensione capillare: 3 kV, temperatura sorgente: 80 °C, temperatura di desolvazione: 300 °C, portata gas di desolvazione: 7.000 L/h e portata gas trappola: 0,40 ml/min.
    5. Scansiona gli intervalli da 100 a 1.200 Da durante un tempo di rilevamento di 20 minuti e osserva gli ioni in modalità ES positiva.
    6. Analizza i valori m/z utilizzando qualsiasi software quantitativo di spettrometria di massa.
    7. Per l'analisi, accedere al software.
    8. Clicca su Batch Search ed entra nell'elenco delle masse ottenute. Esamina i risultati in una modalità di carica positiva e usa M + H e M + Na come addotti. Mantenere la precisione a 10 PPM e spuntare su Struttura di visualizzazione.
    9. Clicca su Cerca e dall'elenco dei composti, seleziona quello con il livello PPM più basso.
  2. 1 H NMR del biotensioattivo
    NOTA: 1H NMR del biotensioattivo è stato eseguito utilizzando uno spettrometro NMR a 400 MHz (vedi Tabella dei materiali).
    1. Sciogliere 5 mg del biotensioattivo in 1 mL di cloroformio deuterato (CdCl3).
    2. Trasferire la miscela in un tubo NMR. Tappare correttamente il tubo e inserire il tubo nella chiave inglese. Regolare l'altezza del tubo utilizzando il tubo regolatore.
    3. Posizionare il tubo insieme alla chiave nella macchina NMR e seguire i passaggi indicati di seguito per ottenere uno spettro NMR.
    4. Per selezionare il tipo di provetta campione: sx N, dove N è la posizione in cui è stato posizionato il tubo (ad esempio, sx 13, se il tubo è stato posizionato nella13a posizione) nel software associato.
    5. Digitare edc e premere Invio per creare una nuova cartella in cui è possibile archiviare i dati.
    6. Apparirà un pop-up. Selezionare il solvente cliccando su CdCl 3 nell'elenco e inserire il nome del campione.
    7. Per avviare il protocollo, digitare "getprosol"; per bloccare il solvente, digitare "lock cdcl3".
    8. Digitare "topshim" per eseguire lo shim del campione e infine digitare "rga;zgefp" per acquisire i dati. Questo avvierà il protocollo.
    9. Dopo aver ottenuto gli spettri, digitare "apk;abs n" e premere invio per la correzione di fase e di base.
    10. Per selezionare i picchi primari, digitare "pp" e premere Invio. Per selezionare solo picchi intensi, inserisci "mi" e digita l'intensità sopra la quale devono essere selezionati i picchi. Il valore predefinito sarà 0.2.
    11. Per integrare i picchi, fare clic su Integra e posizionare il cursore sul lato sinistro del picco da integrare e tenendo premuto il cursore fare clic e trascinare il cursore attorno al picco.
    12. Salva i dati facendo clic su File nell'angolo in alto a sinistra, quindi fai clic su Salva.
    13. Il campione può essere espulso dalla macchina digitando "sx ej".
    14. Analizzare i picchi e determinare l'ambiente degli atomi H.
  3. Spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier del biotensioattivo
    NOTA: FT-IR del biotensioattivo estratto è stato eseguito utilizzando uno spettrofotometro disponibile in commercio in modalità ATR (vedi Tabella dei materiali).
    1. Accendere lo spettrofotometro e controllare lo spurgo, l'essiccante e il rilevatore.
    2. Per raccogliere uno spettro, prima raccogli lo spettro di fondo senza un campione in posizione.
    3. Prendere il biotensioattivo estratto e asciugarlo completamente. Posizionare il biotensioattivo essiccato direttamente sul cristallo diamantato, esercitare pressione e premere il punto di contatto ATR.
    4. Nel software, selezionare il numero delle scansioni (inserire 30) e scansionare lo spettro da 400 cm-1 a 4.000 cm-1.
    5. Fare clic su OK per aggiungere lo spettro del campione alla finestra spettrale.
    6. Fare clic su File > Salva > Salva con nome e immettere il nome del file seguito dall'estensione .spa e fare clic su OK.

7. Applicazione di biotensioattivi (recupero avanzato dell'olio)

NOTA: In questo esperimento, l'acqua a doppia distillazione è stata utilizzata come controllo negativo e il 10% di SDS, il 10% di Tween 80 e il 10% di saponina commerciale sono stati utilizzati come controlli positivi.

  1. Prendi il vetro e sigilla l'uscita inferiore con lana di vetro e perline di vetro.
  2. Imballare la colonna con terreno sabbioso in modo tale che un po 'di liquido possa essere aggiunto nella parte superiore del terreno e il flusso attraverso possa essere raccolto nella parte inferiore. Montare la colonna sul supporto e aggiungere alcune perle di vetro sulla parte superiore del terreno.
  3. Inondare la colonna con 50 ml di soluzione di salamoia e raccogliere il flusso per determinare il volume dei pori.
    volume dei pori = volume di salamoia aggiunto sulla parte superiore - volume di flusso attraverso raccolto.
  4. Rimuovere la salamoia dalla colonna costringendo il petrolio greggio a passarci attraverso di essa dopo averla aggiunta dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il volume della salamoia e dell'olio che escono dalla colonna per determinare il volume iniziale di saturazione dell'olio. Il volume della salamoia rilasciato dalla colonna sarà il volume iniziale di saturazione dell'olio o l'olio originale in posizione.
  5. Lasciare la colonna indisturbata per 24 ore.
  6. Dopo 24 ore, inondare la colonna con 10 volumi di pori di salamoia e raccogliere l'olio che esce dalla colonna per stimare il recupero secondario dell'olio. L'olio lasciato nella colonna dopo il recupero secondario dell'olio corrisponde all'olio residuo.
  7. Preparare una miscela di biotensioattivi aggiungendo volumi uguali del biotensioattivo estratto (estratto dopo la fase 3.5) al becher di vetro. Aggiungere i biotensioattivi nella parte superiore della colonna e incubare la colonna per 24 ore.
  8. Dopo 24 ore, misurare la quantità di olio e acqua per determinare un recupero dell'olio aggiuntivo o migliorato. Il volume dell'olio rilasciato dalla colonna corrisponderà all'olio residuo recuperato.
  9. Stimare il recupero dell'olio migliorato con la seguente equazione:
    Equation 2

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Representative Results

Tre ceppi batterici (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108) sono stati sottoposti a screening per la produzione di biotensioattivi mediante vari saggi, tra cui il test di collasso delle gocce, il saggio di spostamento dell'olio, il saggio dell'indice di emulsione e la riduzione della tensione superficiale. I supernatanti privi di cellule di tutti e tre i ceppi batterici e una soluzione di tensioattivo chimico hanno provocato un collasso delle gocce e, pertanto, sono stati valutati positivi per la presenza dei biotensioattivi (Figura 4a). D'altra parte, la goccia d'acqua non è collassata ed è stata quindi valutata negativa per la presenza del biotensioattivo. Anche i tensioattivi commerciali e i supernatanti privi di cellule delle tre colture batteriche sono riusciti a spostare lo strato di olio nel test di diffusione dell'olio e, pertanto, sono stati valutati positivi per la presenza di biotensioattivi (Figura 4b). L'acqua, d'altra parte, non poteva spostare alcun petrolio e, quindi, è stata valutata negativa. Nei saggi dell'indice di emulsione, è stata osservata un'emulsione stabile in provette contenenti tensioattivi commerciali e i supernatanti dei tre ceppi microbici. Tuttavia, non è stata osservata alcuna emulsione nella provetta contenente terreno di coltura non inoculato (Figura 4c). Ciò ha nuovamente suggerito che Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108 producono biotensioattivi. La conferma della produzione di biotensioattivi è stata ottenuta misurando la tensione superficiale del brodo privo di cellule e confrontandola con il controllo non inoculato. I biotensioattivi di Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108 sono stati trovati per ridurre la tensione superficiale del mezzo da 58,89 mN / m a 45,41 mN / m, 45,82 mN / m e 28,43 mN / m, rispettivamente (Figura 5).

Le misurazioni IFT sono state eseguite utilizzando il metodo di trazione dell'anello. I biotensioattivi di tutti e tre i ceppi sono stati in grado di ridurre significativamente le tensioni interfacciali tra varie fasi acquose e organiche (Tabella S1). Le misurazioni della tensione superficiale e della tensione interfacciale confermano che tutti e tre i ceppi producono biotensioattivi.

L'estrazione con solvente di biotensioattivi dalle colture cellulari libere di Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108 ha determinato concentrazioni di biotensioattivi di 820 mg / L, 560 mg / L e 480 mg / L, rispettivamente.

Come osservato nella Figura 4C, l'emulsione formata dal biotensoattivo era la microemulsione dell'acqua in olio. I saggi di stabilità dell'emulsione hanno mostrato che i biotensioattivi hanno mostrato una buona stabilità in diverse condizioni ambientali (Figura 6). Le emulsioni prodotte erano molto stabili a diverse temperature (Figura 6a), valori di pH (Figura 6b) e concentrazioni di sale (Figura 6c) testate.

La cromatografia a strato sottile è stata eseguita per determinare la natura dei biotensioattivi. La colorazione delle piastre con vapore di iodio ha comportato lo sviluppo di macchie gialle in tutti i biotensioattivi e il controllo (Biosurfactant from Bacillus sp. IITD 106 (Figura 7a). Ciò indicava che i biotensioattivi contenevano una porzione lipidica. Nessuna macchia di colore blu è stata ottenuta in nessuna delle piastre TLC dopo la colorazione con ninidrina (Figura 7b). Ciò ha dimostrato che i biotensioattivi non contenevano alcuna porzione peptidica. Macchie blu e verdi sono state osservate in tutte le piastre TLC, quando colorate con macchia di anisaldeide (Figura 7c). Ciò ha dimostrato che i biotensioattivi contenevano una porzione di carboidrati. Dai risultati di TLC, si è concluso che tutti i biotensioattivi erano glicolipidi.

L'identificazione chimica dei biotensioattivi utilizzando LCMS ha rivelato che il Rhodococcus sp. IITD102 e il Lysinibacillus sp. IITD104 producono lo stesso tipo di biotensioattivo, che è stato identificato come acido idrossidecanoico diramipanosico con una massa di 480,25 Da. La struttura del biotensioattivo è stata supportata da dati NMRe FT-IR 1 H (Figura 8).

Nello spettro NMR 1H, gli spostamenti chimici ottenuti a 7,2 rappresentavano i protoni dei gruppi carbossilici. Gli spostamenti chimici corrispondenti ai protoni del gruppo metilico sono stati ottenuti nell'intervallo 1-2 ppm. Gli spostamenti corrispondenti ai protoni attaccati ai gruppi alchilici sono stati ottenuti a 2,3 ppm. Gli spettri FT-IR dei biotensioattivi estratti da Rhodococcus sp. IITD102 e Lysinibacillus sp. IITD104 hanno mostrato la presenza di picchi forti al numero d'onda 3.290 cm-1, che conferma la presenza del gruppo funzionale OH. Un piccolo picco al numero d'onda 2.951 cm-1 corrisponde allo stiramento CH. Un forte picco a 1.620 cm-1 rappresentava la presenza di gruppo carbossilico nei biotensioattivi. Altri picchi ottenuti a 1.530, 1.410, 1.200 e 1.060 hanno confermato la presenza di gruppi funzionali alchil, CH3, C-O-C e C-CH3, rispettivamente. Sia i dati NMR che FT-IR hanno supportato la struttura del biotensioattivo determinato dagli studi LCMS. IITD108 (Figura 9) ha dimostrato che produce un ramnolipide contenente tre catene lipidiche che formano il nucleo idrofobico di massa del biotensioattivo. Il biotensioattivo è stato identificato come acido 2decanoil)-αL rhamnopiranosil-3-idrossidecanoico con una massa di 802 Da. I risultati di LCMS sono stati supportati da dati 1H NMR e FT-IR.

La configurazione per un migliore recupero dell'olio è illustrata nella Figura 2.

Figure 2
Figura 2: Configurazione sperimentale per un migliore recupero dell'olio utilizzando la tecnica della colonna di sabbia. La colonna piena di terra è stata montata sul supporto. L'uscita inferiore era sigillata con lana di vetro e perle di vetro. Dopo il recupero secondario, l'olio residuo all'interno della colonna è stato sottoposto a un maggiore recupero dell'olio mediante l'aggiunta della miscela di biotensioattivi ad essa. Il tubo posto nella parte inferiore della colonna è stato utilizzato per raccogliere la frazione eluita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nell'esperimento simulato di recupero avanzato dell'olio, su 50 mL di salamoia aggiunti alla parte superiore della colonna, sono stati raccolti 12 mL nel flowthrough e, pertanto, il volume dei pori è stato stimato in 38 mL. Quando l'olio è stato forzato attraverso la colonna, 33 ml di salamoia sono stati rilasciati dalla colonna. Questo rappresentava il volume iniziale di saturazione dell'olio. Il recupero secondario utilizzando 10 volumi di pori di salamoia ha portato all'eluizione di 10 ml di olio. L'olio residuo rimasto nella colonna era di 23 ml. L'acqua contenente la miscela di biotensioattivi è stata in grado di recuperare 13 ml di olio dalla colonna (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: Recupero dell'olio avanzato simulato utilizzando una colonna di sabbia. Il volume iniziale di saturazione dell'olio sia della colonna di controllo che di quella di prova era di circa 33 ml. Durante il recupero secondario dell'olio, circa 10 ml di olio sono stati recuperati sia dalle colonne di controllo che da quelle di prova. Le differenze nei profili di recupero della prova e delle colonne di controllo sono state osservate solo durante il recupero dell'olio residuo lasciato nella colonna. La miscela di biotensioattivi ha portato a un ulteriore recupero di 13 mL dell'olio residuo rimasto dalla colonna di prova, mentre nella colonna di controllo sono stati recuperati solo 1,03 mL di olio in questa fase. Ciò dimostra che la miscela di biotensioattivi ha un grande potenziale nel migliorare il recupero dell'olio residuo dai serbatoi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ciò ha rappresentato un maggiore recupero dell'olio. Pertanto, l'acqua contenente la miscela di biotensioattivi era in grado di recuperare il 56,52% dell'olio residuo dalla colonna (Tabella 1). D'altra parte, le soluzioni di 10% SDS, 10% Tween 80 e 10% saponina sono state in grado di recuperare l'85%, il 68% e il 73% di olio residuo dalla colonna.

Parametri Controllare le inondazioni Inondazioni combinate di biotensioattivi 10 % SDS 10 % Interpolazione 10 % Saponina
PV (mL) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (mL) 33 33 33 29 33
POS (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (mL) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (mL) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (mL) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

dove PV = volume dei pori determinato dopo la saturazione iniziale della colonna con salamoia, OOIP = olio originale in posizione, IOSV = volume iniziale di saturazione dell'olio, POS = saturazione percentuale dell'olio, Sv = volume di salamoia aggiunto per il recupero secondario, SOR = olio secondario recuperato dopo inondazione della salamoia, ROC = olio residuo in colonna dopo il recupero secondario, ROS = saturazione residua dell'olio, ROR = olio residuo recuperato dopo l'allagamento del biotensioattivo, AOR = olio aggiuntivo recuperato

Tabella 1: Recupero dell'olio migliorato simulato in una colonna di sabbia.

Figure 4
Figura 4: Saggi di screening per la produzione di biotensioattivi (a) Saggio di collasso delle gocce: la goccia d'acqua non è collassata dopo essere stata aggiunta alla superficie rivestita di olio, mentre il tensioattivo chimico e i supernatanti privi di cellule dei tre ceppi batterici hanno provocato il collasso della goccia. (b) Saggio di spostamento dell'olio: la goccia d'acqua non ha provocato lo spostamento dell'olio mentre il tensioattivo chimico e i supernatanti privi di cellule dei tre ceppi batterici hanno spostato gli strati di olio (c) Saggio dell'indice di emulsione: i supernatanti privi di cellule e la soluzione di tensioattivo commerciale hanno tutti portato alla formazione di un indice di emulsione stabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Riduzione della tensione superficiale dovuta alla produzione di biotensioattivi. La determinazione della riduzione della tensione superficiale del mezzo dovuta alla crescita microbica ha confermato la produzione di biotensioattivi da parte dei membri microbici. A causa della crescita di Rhodococcus sp. IITD 102 e Lysinibacillus sp. IITD 104, la tensione superficiale del mezzo si è ridotta da 59 mN/m a 45 mN/m. A causa della crescita di Paenibacillus sp. IITD 108, la tensione superficiale del mezzo si è ridotta da 59 mN/m a 28 mN/m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Stabilità dell'emulsione a varie (a) temperature, (b) valori di pH e (c) concentrazioni di sale. Tutte le emulsioni generate utilizzando i supernatanti dei tre ceppi microbici e la miscela di tensioattivi commerciali mostrano una grande stabilità in diverse condizioni ambientali. All'interno degli intervalli di temperatura, pH e concentrazione salina testati, gli indici di emulsione determinati erano simili e non è stata osservata alcuna riduzione significativa dell'EI a valori più elevati dei vari fattori che implicano che il biotensioattivo può essere utilizzato in condizioni ambientali estreme. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Caratterizzazione TLC di biotensioattivi (a) Piastre macchiate con vapore di iodio: Varie macchie sviluppate sulla piastra TLC mostrano che i biotensioattivi estratti sono una miscela di vari composti contenenti un gruppo lipidico. Le macchie contrassegnate con freccia blu rappresentano i biotensioattivi, che si sono macchiati positivi per la presenza di frazioni lipidiche. Le altre macchie rappresentano il resto dei composti presenti nella miscela del biotensioattivo grezzo. b) Piastre macchiate di ninidrina: non sono apparse macchie viola quando le piastre sono state macchiate con ninidrina. Ciò ha rappresentato l'assenza di amminoacidi nella miscela di biotensioattivi e (c) Piastre colorate con anisaldeide: macchie verde chiaro e gialle sono apparse sulla piastra TLC e queste rappresentano i composti contenenti zuccheri. Le macchie contrassegnate da frecce nere rappresentano i biotensioattivi che si sono macchiati positivi per la presenza della porzione di carboidrati. Le macchie che si sono macchiate sia con iodio che con anisaldeide rappresentano composti contenenti sia lipidi che porzioni di carboidrati e potrebbero essere un biotensioattivo glicolipidico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Caratterizzazione chimica del biotensioattivo estratto da Rhodococcus sp. IITD 102 e Lysinibacillus sp. IITD 104. a) rappresenta gli spettri FT-IR dei biotensioattivi estratti da Rhodococcus sp. IITD 102 e Lysinibacillus sp. IITD 104, b) rappresenta gli spettri H1 NMR dei biotensioattivi estratti da Rhodococcus sp. IITD 102 e Lysinibacillus sp. IITD 104 e (c) mostra la struttura dei biotensioattivi grezzi estratti da Rhodococcus sp. IITD 102 e Lysinibacillus sp. IITD 104. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Caratterizzazione chimica del biotensioattivo estratto da Paenibacillus sp. IITD 108. a) rappresenta gli spettri FT-IR dei biotensioattivi estratti da Paenibacillus sp. IITD 108, b) rappresenta gli spettri NMR 1H dei biotensioattivi estratti da Paenibacillus sp. IITD 108 e c) mostra la struttura dei biotensioattivi grezzi estratti da Paenibacillus sp. IITD 108. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Struttura di diversi tipi di biotensioattivi. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella S1: Effetto dei biotensioattivi sulla tensione interfacciale (IFT) tra acqua e idrocarburi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

I biotensioattivi sono uno dei gruppi più versatili di componenti biologicamente attivi che stanno diventando alternative interessanti ai tensioattivi chimici. Hanno una vasta gamma di applicazioni in numerosi settori come detergenti, vernici, cosmetici, alimenti, prodotti farmaceutici, agricoltura, petrolio e trattamento delle acque grazie alla loro migliore bagnabilità, CMC inferiore, struttura diversificata e compatibilità ambientale18. Ciò ha portato a un maggiore interesse per la scoperta di più ceppi microbici in grado di produrre biotensioattivi. Qui illustriamo i metodi per lo screening, l'identificazione e l'applicazione di una miscela di biotensioattivi prodotti da Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 e Paenibacillus sp. IITD 108, per un migliore recupero dell'olio. La produzione di biotensioattivi è stata sottoposta a screening mediante collasso delle gocce, diffusione dell'olio, saggio dell'indice di emulsione e confermata misurando la riduzione della tensione superficiale del mezzo dovuta alla crescita microbica. Vari rapporti sulla produzione di biotensioattivi glicolipidi (ramnolipidi e trealolipidi) da Rhodococcus sono disponibili in letteratura 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. hanno riportato la produzione e l'ottimizzazione di un biotensioattivo lipopeptide da Paenibacillus sp. alvei ARN6325. Bezza et al. hanno riportato la biodegradazione del pirene da parte di un biotensioattivo lipopeptide prodotto da Paenibacillus dendritiformis CN526. La produzione di biotensioattivi (lipopeptidi e glicolipidi) è stata riportata anche da altri ceppi di Paenibacillus 27,28,29,30,31. Varie specie di Lysinibacillus sono state segnalate per produrre biotensioattivi 32,33,34. Lysinibacillus sphaericus è stato segnalato per produrre rhamnolipid in grado di solubilizzare i pesticidi idrofobici35.

Uno dei vantaggi che i biotensioattivi offrono rispetto alle loro controparti chimiche è la loro stabilità in condizioni ambientali estreme. I biotensioattivi prodotti da Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 e Paenibacillus sp. IITD 108 sono stati analizzati per la loro stabilità in diversi intervalli di temperatura, pH e concentrazioni di sale e sono risultati stabili sotto valori estremi di questi parametri. In precedenza, Habib et al. hanno riportato un lipopeptide prodotto da idrocarburi che degradano Rhodococcus sp. che ha mostrato stabilità in diversi intervalli di temperature, valori di pH e concentrazioni di sale36. È stato riportato un aumento della concentrazione di sali inorganici per aumentare la stabilità dell'emulsione37. La tendenza dei colloidi ad agglomerare o separarsi è una funzione delle forze attrattive (forze di Van der Walls) e repulsive (forze elettrostatiche) che sono coinvolte durante l'interazione delle particelle38. I cristalli di sale che si dissolvono in acqua stabiliscono le proprie cariche elettriche e gli ioni rilasciati assorbono sulle goccioline dell'emulsione. Aumentando la concentrazione salina, l'espansione e la repulsione del secondo strato si riducono. Inoltre, maggiore è la densità di carica di uno ione, minore è la lunghezza dello strato elettrico. Pertanto, i cationi bivalenti come Na2+ provocano la formazione di emulsioni più stabili rispetto ai cationi monovalenti39.

Un altro vantaggio che i biotensioattivi hanno rispetto ai tensioattivi chimici è che sono biodegradabili40. Zeng et al. hanno confrontato le capacità di degradazione del tensioattivo sintetico Triton X 100, degli alchilbenzene solfonati lineari (LAS) e dei rhamnolipidi e hanno scoperto che il biotensioattivo rhamnolipid era completamente degradato mentre LAS e Triton X 100 erano solo parzialmente degradati41. Liu et al. riportano anche che, a differenza dei tensioattivi sintetici CTAB, Triton X 100 e SDS, i ramnolipidi non mostrano tossicità e potrebbero essere facilmente degradati da B. subtilis e altri microrganismi del compost42.

I biotensioattivi prodotti da tutti e tre i ceppi microbici sono risultati essere glicolipidi. Il rodococco è stato precedentemente segnalato per produrre glicolipidi da vari gruppi di ricerca 20,21,23. Rapporti simili sulla produzione di biotensioattivi glicolipidi da parte di Lysinibacillus e Paenibacillus sono disponibili anche nella letteratura 31,32,35,43,44. L'identificazione chimica dei biotensioattivi ha rivelato che si tratta di rhamnolipidi. I ramnolipidi sono la classe di biotensioattivi glicolipidi che contengono una o due unità di ramnosio collegate a una catena lipidica45. Sono il tipo di biotensioattivi più studiato. Vari ceppi microbici sono stati segnalati per produrre rhamnolipidi 7,46,47,48,49. Rhamnolipids è stato segnalato per mostrare un alto potenziale per migliorare il recupero di olio residuo 50,51,52,53. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che la miscela di biotensioattivi prodotti da Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 e Paenibacillus sp. IITD 108 ha recuperato con successo circa il 56,52% dell'olio residuo in un test simulato della colonna di sabbia. Ciò ha dimostrato che la miscela di biotensioattivi può essere utilizzata per il recupero dell'olio residuo dai serbatoi di terra. In un test simile del pacco di sabbia, Sun et al. hanno riferito che il biotensioattivo è riuscito a recuperare il 50% dell'olio residuo54. I biotensioattivi contenenti brodo privo di cellule di Bacillus subtilis sono stati anche segnalati per essere efficaci nel recupero del 33% dell'olio residuo55. Il recupero residuo di olio del 27% e del 26% -36% è stato riportato anche da Darvishi et al. e Wahabi et al.56,57.

La valutazione economica dei biotensioattivi per il recupero dell'olio residuo dai giacimenti mostra che l'utilizzo di biotensioattivi nell'EOR è un'opzione economicamente praticabile. Moutinho et al. hanno riferito che il costo tipico di un biotensioattivo commerciale (rhamnolipidi) è di circa 59,6 USD per kg58. In un altro studio, è stato anche riportato che la concentrazione di biotensioattivi di 28 mg / L di biotensioattivo ha migliorato il recupero dell'olio residuo e ha portato alla produzione di 52,5 m3 di olio aggiuntivo59. Gli studi hanno dimostrato che la concentrazione di biotensioattivi di 10 mg / L era sufficiente per mobilitare il recupero dell'olio. Secondo i dati riportati, la quantità di biotensioattivo necessaria per produrre 52,5 m3 di olio aggiuntivo è di circa 0,525 kg. Il costo complessivo di produzione di 52,5 m3 di petrolio è di circa US $ 21463 di cui solo US $ 30 è il costo di produzione del biotensioattivo. I dati mostrano che il costo percentuale del biotensioattivo nella produzione di petrolio per barile è solo dello 0,0000139%.

I nostri risultati suggeriscono che la combinazione dei biotensioattivi può essere utilizzata in modo efficiente per recuperare l'olio residuo dai serbatoi. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima relazione sul miglioramento del recupero dell'olio residuo dal serbatoio utilizzando una miscela di biotensioattivi prodotti da diversi ceppi microbici. Sebbene il nostro studio descriva chiaramente i metodi coinvolti nello screening, nella caratterizzazione strutturale e nell'applicazione di biotensioattivi nel recupero avanzato dell'olio, lo studio non fornisce una caratterizzazione funzionale dettagliata dei biotensioattivi, che influiscono sulla loro efficienza in varie applicazioni. La concentrazione critica di micella, che è la misura dell'efficienza di qualsiasi tensioattivo nella formazione delle micelle e specifica la concentrazione limite del tensioattivo per il suo uso significativo, non è stata determinata nel presente studio60. Allo stesso modo, anche la stabilità termica del biotensioattivo, che ne determina l'applicabilità alle condizioni del serbatoio per eOR, non è stata descritta61. I biotensioattivi in alcune applicazioni sono anche usati come agenti antibiofilm. La loro bagnabilità superficiale gioca un ruolo importante nel determinare la loro natura antibiofilm. Anche gli studi di bagnabilità superficiale non sono stati effettuati nel presente lavoro62. Altre caratteristiche funzionali importanti in varie applicazioni dei biotensioattivi, che includono la loro biodegradabilità e la natura antimicrobica, non sono state determinate in questo studio63,64. Pertanto, ci siamo concentrati sulla caratterizzazione strutturale dei biotensioattivi. A seconda dell'applicazione target, è possibile eseguire una caratterizzazione funzionale come stabilità, biodegradabilità e attività antimicrobica.

Nel test di collasso della goccia e nel test di diffusione dell'olio, per aumentare la visibilità, è meglio usare un olio che abbia un certo colore. Nel test di diffusione dell'olio, l'emulsione deve essere osservata dopo 24 ore. Schiume leggere, se formate, si disintegrano in 24 ore. I tensiometri sono strumenti molto sensibili pertanto durante le misurazioni della tensione superficiale, il recipiente e la sonda devono essere puliti correttamente prima di ogni misurazione per evitare eventuali errori dovuti al riporto delle ultime misurazioni. L'estrazione del biotensioattivo comporta l'aggiunta di una miscela di metanolo cloroformio al surnatante privo di cellule. Il passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante o il pallone deve essere coperto con un foglio di alluminio immediatamente dopo il trasferimento della miscela di estrazione. Durante il recupero secondario in un esperimento EOR, la soluzione di salamoia deve essere aggiunta in eccesso fino a quando nessun altro olio esce dalla colonna.

Il metodo discute la portata della miscela di biotensioattivi nel recupero dell'olio residuo dalle colonne. Il processo dipende da molti fattori. La fase di crescita dei microbi in cui vengono raccolte le colture iniziali. Alcuni biotensioattivi sono stati segnalati per essere prodotti nella fase di log, mentre altri sono stati segnalati per essere prodotti in fase stazionaria. Le colture dovrebbero essere raccolte di conseguenza nella fase particolare in cui la produzione di biotensioattivi ha raggiunto il suo massimo. I saggi di screening dei biotensioattivi sono meno sensibili, pertanto tutti i saggi devono essere eseguiti prima di raggiungere una conclusione sulla capacità di produzione di biotensioattivi di un particolare ceppo. La purificazione del biotensioattivo deve essere eseguita prima della caratterizzazione chimica del biotensioattivo se la concentrazione di biotensioattivo è bassa nel biotensioattivo grezzo. Gli esperimenti avanzati di recupero dell'olio dipendono fortemente dal tipo di terreno utilizzato per l'imballaggio della colonna. Il terreno deve essere completamente asciutto e deve essere setacciato per rimuovere granuli più grandi e altri contaminanti solidi. Una miscela di terreno sabbioso e terreno da giardino asciutto (in proporzione uguale) dovrebbe essere preferita per imballare la colonna. L'uscita della colonna deve essere sigillata correttamente con lana di vetro e perle di vetro per evitare perdite di terreno dalla colonna durante il corso dell'esperimento.

Il metodo descritto è utile per determinare il significato dei biotensioattivi prodotti e delle loro miscele nel recupero di olio aggiuntivo in un esperimento simulato di colonna di sabbia. Diversi biotensioattivi hanno specificità diverse perché contengono diversi gruppi funzionali65. Una combinazione di biotensioattivi consentirà la solubilizzazione di diversi idrocarburi e quindi aumenterà il recupero di olio residuo dai serbatoi. Il metodo descritto aiuterà a determinare il potenziale delle miscele di biotensioattivi in applicazioni sul campo come il recupero avanzato del petrolio dai pozzi petroliferi.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India, per il sostegno finanziario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

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Scienze ambientali numero 184
Recupero avanzato dell'olio utilizzando una combinazione di biotensioattivi
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Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

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