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Biochemistry

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Describimos un ensayo colorimétrico de alto rendimiento que mide la actividad de la β-galactosidasa en tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas. Este ensayo se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible.

Abstract

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas (ChD), una enfermedad endémica de importancia para la salud pública en América Latina que también afecta a muchos países no endémicos debido al aumento de la migración. Esta enfermedad afecta a casi 8 millones de personas, con nuevos casos estimados en 50.000 por año. En las décadas de 1960 y 70, se introdujeron dos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad coronaria: nifurtimox y benznidazol (BZN). Ambos son efectivos en recién nacidos y durante la fase aguda de la enfermedad, pero no en la fase crónica, y su uso se asocia con importantes efectos secundarios. Estos hechos subrayan la necesidad urgente de intensificar la búsqueda de nuevos medicamentos contra T. cruzi.

T. cruzi se transmite a través de insectos vectores hematófagos de las familias Reduviidae y Hemiptera. Una vez en el huésped mamífero, se multiplica intracelularmente a medida que se forma el amastigota no flagelado y se diferencia en el tripomastigote, la forma infecciosa no replicativa del torrente sanguíneo. Dentro del insecto vector, los tripomastigotes se transforman en la etapa de epimastigote y se multiplican a través de la fisión binaria.

En este trabajo se describe un ensayo basado en la medición de la actividad de la β-galactosidasa citoplasmática liberada en el cultivo debido a la lisis de parásitos mediante el uso del sustrato, clorofenol rojo β-D-galactopiranosido (CPRG). Para ello, la cepa T. cruzi Dm28c fue transfectada con un plásmido sobreexpresante de β-galactosidasa y utilizada para el cribado farmacológico in vitro en estadios de epimastigote, tripomastigote y amastigote. Este artículo también describe cómo medir la actividad enzimática en epimastigotes cultivados, células Vero infectadas con amastigotes y tripomastigotes liberados de las células cultivadas utilizando el fármaco de referencia, benznidazol, como ejemplo. Este ensayo colorimétrico se realiza fácilmente y se puede escalar a un formato de alto rendimiento y aplicarse a otras cepas de T. cruzi .

Introduction

La enfermedad de Chagas (ChD), o tripanosomiasis americana, es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La enfermedad coronaria comienza con una fase aguda asintomática u oligosintomática que generalmente no se diagnostica, seguida de una fase crónica de por vida. En la cronicidad, ~ 30% de los pacientes manifiestan, décadas después de la infección, una variedad de afecciones debilitantes, que incluyen miocardiopatía, síndromes megadigestivos o ambos, con una tasa de mortalidad que oscila entre el 0,2% y el 20%1,2,3. Los pacientes crónicos asintomáticos pueden no tener signos clínicos, pero permanecen seropositivos durante toda su vida.

Las estimaciones sugieren que ~ 7 millones de personas están infectadas en todo el mundo, principalmente de América Latina, donde la enfermedad coronaria es endémica. En estos países, T. cruzi se transmite principalmente a través de insectos triatominos chupadores de sangre infectados (transmisión transmitida por vectores) y con menos frecuencia por transmisión oral a través de la ingestión de alimentos contaminados con heces de triatominos que contienen los parásitos2. Además, el parásito puede transmitirse a través de la placenta de las madres chagásicas a los recién nacidos, a través de transfusiones de sangre o durante el trasplante de órganos. Estas formas independientes del vector de adquirir la infección y la migración humana han contribuido a la propagación mundial de la enfermedad, evidenciada por un número creciente de casos en América del Norte, Europa y algunos países de África, el Mediterráneo oriental y el Pacífico occidental4. La enfermedad coronaria se considera una enfermedad desatendida, ya que la transmisión transmitida por vectores está estrechamente asociada con la pobreza y es un problema de salud pública líder, especialmente en los países latinoamericanos de bajos ingresos. Aunque existen tratamientos disponibles, la mortalidad por ChD en América Latina es la más alta entre las enfermedades parasitarias, incluida la malaria2.

Hay dos medicamentos registrados para el tratamiento de chD introducidos a fines de la década de 1960 y principios de la década de 1970: nifurtimox y benznidazol5. Ambos medicamentos son efectivos en la fase aguda de la enfermedad en adultos, niños y recién nacidos infectados congénitamente, así como en niños con infección crónica, donde generalmente se logra la curación. Sin embargo, solo unas pocas personas son diagnosticadas lo suficientemente temprano como para ser tratadas a tiempo. Según los últimos ensayos clínicos, ambos fármacos tienen importantes limitaciones en adultos y fueron ineficaces para reducir los síntomas en personas con enfermedades crónicas; por lo tanto, su uso en esta etapa es controvertido. Otros inconvenientes son los períodos de tratamiento prolongados requeridos (60-90 días) y los efectos adversos frecuentes y graves observados, que conducen a la interrupción de la terapia en una proporción de personas infectadas 6,7. Se estima que menos del 10% de las personas con cardiopatía coronaria han sido diagnosticadas, y aún menos tienen acceso al tratamiento, ya que muchas personas afectadas viven en áreas rurales con acceso nulo o escaso a la atención médica8. Estos hechos ponen de relieve la necesidad urgente de encontrar nuevos fármacos contra T. cruzi que permitan tratamientos más eficientes, seguros y aplicables al campo, especialmente para la fase crónica. En este sentido, otro desafío en el desarrollo de compuestos más eficaces es la limitación de los sistemas para evaluar la eficacia de los fármacos in vitro e in vivo9.

Aunque la biología química y los enfoques genómicos para la identificación de posibles objetivos farmacológicos se han utilizado en parásitos cinetoplastidos, las herramientas genómicas disponibles en T. cruzi son limitadas en contraste con T. brucei o Leishmania. Por lo tanto, el cribado de compuestos con actividad tripanocida sigue siendo el enfoque más utilizado en la búsqueda de nuevos candidatos a fármacos quimioterapéuticos contra la Enfermedad Coronaria. Por lo general, el descubrimiento de fármacos en T. cruzi debe comenzar con la prueba de los efectos de un nuevo fármaco en un ensayo in vitro contra la etapa de epimastigote. Durante décadas, la única forma de medir los efectos inhibitorios de los compuestos candidatos en T. cruzi fue el conteo microscópico manual, que es laborioso, lento y dependiente del operador. Además, este enfoque es adecuado para el ensayo de un pequeño número de compuestos, pero es inaceptable para el cribado de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos. Hoy en día, muchas investigaciones comienzan con el análisis de una gran cantidad de compuestos de diferentes orígenes que se ensayan in vitro, probando su capacidad para inhibir el crecimiento de parásitos. Se han desarrollado métodos colorimétricos y fluorométricos para aumentar el rendimiento en estos ensayos, mejorando la objetividad del cribado y haciendo que todo el proceso sea menos tedioso9.

Uno de los métodos colorimétricos más utilizados se basa en la actividad β-galactosidasa de parásitos transfectados descritos por primera vez por Bucknet y colaboradores10. La enzima β-galactosidasa expresada por los parásitos recombinantes hidroliza el sustrato cromogénico, clorofenol rojo β-D-galactopiranosido (CPRG), a rojo clorofenol, que se puede medir fácilmente colorimétricamente utilizando un espectrofotómetro de microplacas. Por lo tanto, el crecimiento del parásito en presencia de una variedad de compuestos se puede evaluar y cuantificar simultáneamente en placas de microtitulación. Este método se ha aplicado para probar fármacos en formas de epimastigote (presentes en el insecto vector), tripomastigotes y amastigotes intracelulares, las etapas mamíferas del parásito. Además, ya están disponibles varias cepas recombinantes de T. cruzi transfectadas con el plásmido pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 para expresar la enzima Escherichia coli β-galactosidasa (y se pueden construir otras nuevas), lo que permite la evaluación de parásitos a partir de diferentes unidades de tipificación discreta (DTU) que pueden no comportarse igualmente hacia los mismos compuestos 10,11,12,13 . Este método ya se ha utilizado con éxito para evaluar la actividad de los compuestos contra T. cruzi en el cribado de bajo y alto rendimiento12,13. Enfoques similares también se han utilizado en otros parásitos protozoarios, incluyendo Toxoplasma gondii y Leishmania mexicana14,15.

Este artículo describe y muestra un método detallado para un cribado de fármacos in vitro contra todas las etapas del ciclo de vida de T. cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa. Los ensayos aquí presentados se han realizado con una línea de T. cruzi que expresa β-galactosidasa obtenida por transfección de la cepa T. cruzi Dm28c de DTU I13 con plásmido pLacZ (Dm28c/pLacZ). Además, el mismo protocolo podría adaptarse fácilmente a otras cepas para comparar el rendimiento entre compuestos y entre cepas de T. cruzi o DTU.

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Protocol

NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de todo el diseño experimental.

Figure 1
Figura 1: Visión general del ensayo de cribado in vitro de la línea Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilizando CPRG como sustrato para la reacción colorimétrica. El ensayo consiste en sembrar los parásitos (1), incubarlos con BZN (2 y 3), y luego agregar el sustrato colorimétrico (4). Cuando se lisan los parásitos, se libera β-galactosidasa y se escinde CPRG a rojo clorofenol; este cambio de color se puede medir espectrofotométricamente (5). Los datos pueden ser analizados en software de análisis estadístico para obtener la concentración media inhibitoria (IC50) de BZN. Abreviaturas: CPRG = clorofenol rojo β-D-galactopiranosido; BZN = benznidazol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de soluciones de stock

  1. Preparación de medios y soluciones
    1. Solución de hemina (Tabla suplementaria S1)
      1. Agregue todos los componentes a un tubo centrífugo de 50 ml en el orden indicado en la receta y homogeneice por inversión varias veces.
      2. Esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 μm.
      3. Preparar 1 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y mantenerlos a -80 °C hasta su uso.
    2. Prueba de infusión hepática (LIT) media (Tabla suplementaria S1)
      1. Pesar todos los componentes y remover para homogeneizar a temperatura ambiente en un vaso de precipitados de 1 L que contenga al menos 700 ml de agua destilada.
      2. Ajuste el pH a 7.2 y llene el volumen a 900 ml en un cilindro graduado de 1 L con agua destilada; esterilizar por filtración o autoclave (121 °C durante 20 min).
      3. Complemente el medio agregando 100 ml de suero fetal para terneros (FCS), (10% FCS, estéril e inactivado térmicamente a 56 °C durante 45 min), 20 ml de solución de glucosa estéril al 40% (esterilizada por autoclave, 121 °C durante 20 min) y 5 ml de solución de hemina (concentración final de 5 μM) a 900 ml de medio LIT.
    3. Prepare el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco a partir del polvo siguiendo las instrucciones del fabricante.
    4. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Tabla suplementaria S1)
      1. Disuelva todos los componentes sólidos agitando la solución a temperatura ambiente en un vaso de precipitados de 1 L.
      2. Ajuste el pH a 7.2, nivele hasta 1 L en un cilindro graduado de 1 L con agua destilada y esterilice por filtración o autoclave (121 ° C, 20 min).
  2. Soluciones madre de benznidazol (BZN) y diluciones
    NOTA: El rango de concentración de BZN utilizado en este trabajo fue de 2,5 a 80 μM.
    1. Prepare una solución madre de 1 M de BZN disolviendo 13 mg del medicamento en 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). En condiciones asépticas, preparar diluciones seriadas a partir de esta solución madre de BZN de 1 M al doble de la concentración final deseada (2x soluciones) en un volumen final que sea adecuado para el número de pozos a ensayar.
      NOTA: Calcule para 100 μL por pozo con un exceso de 10-20%. La solución madre de BZN y todas las diluciones de BZN deben prepararse inmediatamente antes de su uso en el ensayo debido a la baja solubilidad del medicamento en el medio.
    2. Preparar 2x diluciones de BZN de 160, 80, 40, 20, 10 y 5 μM.
      1. Diluir 1 M de solución madre de BZN a una dilución de 100 veces (10 μL de 1 M de BZN + 990 μL de medio) para obtener una solución de 10 mM en el medio apropiado utilizado para cada etapa del ciclo de vida de T. cruzi. Mezclar continuamente para homogeneizar la suspensión.
      2. Diluir 10 mM de solución de BZN para preparar 320 μM de BZN en el medio apropiado: 32 μL de 10 mM de BZN + 968 μL de medio. Mezclar continuamente para homogeneizar la suspensión.
      3. Diluir 320 μM BZN 2 veces para obtener una concentración de 160 μM (500 μL de 320 μM BZN + 500 μL de medio). Mezclar continuamente para homogeneizar la suspensión. Repita esta dilución de 2 veces con cada solución resultante para obtener soluciones de 80, 40, 20, 10 y 5 μM.
      4. Diluir DMSO 1.000 veces en el medio apropiado para su uso como control no tratado (control de supervivencia al 100%).
        NOTA: Los epimastigotos toleran hasta una dilución de 100 veces de DMSO, mientras que las células Vero toleran solo hasta una dilución de 1,000 veces de DMSO. Si es necesario, se puede incluir un control de la muerte con 50% de DMSO como la condición de supervivencia del 0%.
  3. Solución de sustrato
    1. Disolver CPRG a 1 mM de concentración en agua destilada. Para una placa de 96 pocillos, agregue 2.4 mg de CPRG a 4 ml de agua.
      NOTA: La solución de CPRG debe prepararse inmediatamente antes del ensayo.
  4. Solución de lisis
    1. Preparar una solución al 2,5% v/v de detergente no iónico, no desnaturalizante 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-il)fenoxi]etanol (ver la Tabla de Materiales) en 1x PBS. Prepare 1 ml de la solución por placa de 96 pocillos inmediatamente antes del ensayo.

2. Preparación del cultivo de parásitos

  1. Preparación de epimastigote
    NOTA: T. cruzi Dm28c/pLacZ línea13 se utiliza a lo largo de este informe.
    1. Cultivar los epimastigotes de T. cruzi que expresan β-galactosidasa por vía axénica a 28 °C en matraces de cultivo celular con un área de crecimiento de 25 cm2 (matraces T-25). Mantener los cultivos en fase logarítmica subculturando cada 48-72 h (en 5 mL) en medio LIT suplementado con 10% FCS (Tabla Suplementaria S1) y sulfato de genética (G418) a una concentración final de 200 μg/mL. Cuantificar el crecimiento del parásito mediante el recuento celular en una cámara de Neubauer antes del subcultivo. Cierre bien la tapa y mantenga el matraz de cultivo (sin ventilación) a 28 °C en posición vertical.
      NOTA: G418 garantiza la selección y el mantenimiento del plásmido pLacZ. Los cultivos en fase logarítmica tienen una concentración de epimastigote de 1-5 × 107 parásitos/ml para la línea Dm28c/pLacZ.
    2. Preparar una suspensión de 2 × 105 epimastigotes/ml a partir de un cultivo en fase logarítmica en LIT suplementado con antibiótico G418. Dispensar 100 μL de la suspensión de epimastigote por pocillo (20.000 epimastigotes en 100 μL de LIT) de una microplaca de 96 pocillos y conformar el volumen final a 200 μL por pozo con el medio.
  2. Preparación de amastigote
    1. Utilizar tripomastigotos metacíclicos espontáneos obtenidos de un cultivo de epimastigote envejecido (durante 7 días en este protocolo) para realizar una infección inicial en un matraz T-25 con 2 × 105 células Vero sembradas previamente en DMEM suplementadas con FCS al 2%.
      1. Contar el número de tripomastigotos metacíclicos en una cámara de Neubauer, infectar la monocapa de células Vero con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 en 5 mL de DMEM con 2% FCS, e incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 16 h. Lave los tripomastigotos restantes retirando el medio del matraz con una pipeta estéril de 5 ml, luego agregue 5 ml de 1x PBS y aspire. Finalmente, agregue 5 ml de DMEM con 2% de FCS e incube en las mismas condiciones.
      2. Utilice los tripomastigotes que emergen de la monocapa de células Vero infectada para mantener la infección en matraces T-25 con 2 × 105 células Vero en DMEM con 2% FCS, generando una nueva botella infectada cada semana.
        NOTA: Después de 5-7 días, los tripomastigotes comienzan a emerger y son visibles en el sobrenadante. No agregue G418 a los tripomastigotos utilizados para infectar las células o las células infectadas, ya que la línea celular Vero no es resistente a G418.
    2. Preparar una suspensión de 1 × 105 células Vero/ml en DMEM suplementada con FCS al 2% y sembrar 100 μL de la suspensión por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (10.000 células por pocillo). Incubar durante la noche (12-16 h) a 37 °C y 5% de CO2 para asegurar la adherencia celular al fondo de los pozos.
    3. Después de la incubación durante la noche, enjuague la monocapa de células Vero tres veces con 100 μL de 1x PBS estéril. Añadir tripomastigotes T. cruzi Dm28c/pLacZ (obtenidos de una infección previa en un matraz T-25, paso 2.2.1) a un MOI de 10 en 100 μL de DMEM suplementado con 2% fcS por pocillo (100.000 tripomastigotes por pozo).
    4. Incubar las placas durante 6 h a 37 °C y 5% CO2. Después de este período de incubación, lave las placas dos veces con 1x PBS y agregue 100 μL de DMEM sin rojo fenol suplementado con 2% fcS.
      NOTA: Después de 48 h (2 días después de la infección), los amastigotes intracitoplasmáticos son visibles con un microscopio óptico. El rojo fenol, un indicador de pH en DMEM y otros medios de cultivo celular, podría interferir con la medición de absorbancia de CPRG. Si no se dispone de DMEM sin rojo fenol, consulte las alternativas que se mencionan a continuación en la sección 3.2.1.
  3. Preparación de tripomastigote
    1. Preparar una suspensión de 1 × 106 células Vero/mL en DMEM suplementada con FCS al 2% y sembrar 800.000 células en 5 mL del medio en matraces T-25. Incubar durante la noche (12-16 h) a 37 °C y 5% de CO2 para asegurar la adherencia celular.
      NOTA: Para un matraz T-75, sembra 2 × 106 celdas en un volumen final de 15 mL.
    2. Después de la incubación, enjuague dos veces con 3 ml de 1x PBS estéril. Añadir T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotes a un MOI de 10 en 5 mL de DMEM con 2% fcS (8 × 106 tripomastigotes para un matraz T-25).
      NOTA: Para un matraz T-75, agregue 20 × 106 tripomastigotes en un volumen final de 15 ml de DMEM con 2% fcs.
    3. Incubar durante la noche (12-16 h) a 37 °C y 5% CO2. Lave el matraz dos veces con 3 ml de 1x PBS, y agregue 5 ml de DMEM fresco suplementado con 2% FCS. Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante cuatro días.
    4. Revise el sobrenadante en busca de tripomastigotos bajo un microscopio óptico. Cuantificar los tripomastigotos contándolos en una cámara de Neubauer. Recoger el sobrenadante en un tubo de 15 ml y centrifugar a 7.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspend el pellet para obtener una concentración de 1 × 106 tripomastigotes/mL en DMEM sin rojo fenol suplementado con FCS al 2%. Sembra 100 μL de la suspensión de tripomastigote (100.000 tripomastigotes por pozo) en una placa de 96 pocillos.
      NOTA: Si dmEM sin rojo fenol no está disponible, ver alternativas a continuación en la sección 3.2.1.

3. Ensayo de β-galactosidasa

NOTA: La cuantificación de la actividad de la β-galactosidasa se utiliza como una forma indirecta de determinar el número de parásitos. Se espera que el crecimiento se inhiba en presencia de un compuesto tripanocida, lo que dará lugar a un menor número de parásitos en comparación con el control no tratado, lo que se reflejará en una menor actividad de β-galactosidasa y, por lo tanto, una menor absorbancia.

  1. Incubar los parásitos con BZN.
    1. Agregue 100 μL de la solución correspondiente de 2x BZN por pocillo para alcanzar una concentración final de BZN de 80, 40, 20, 10, 5 y 2.5 μM a 100 μL de suspensión de epimastigote (a partir del paso 2.1), células Vero con amastigotes (2 días después de la infección) (paso 2.2) o tripomastigotes (paso 2.3) en una placa de 96 pocillos.
    2. Incubar los epimastigotes a 28 °C durante 72 h, y los tripomastigotes o células Vero infectadas con amastigotes durante 24 h a 37 °C y 5% CO2.
      NOTA: Cada concentración de fármaco debe evaluarse al menos por triplicado e incluir cultivos de control de epimastigotes, tripomastigotes y células Vero infectadas con DMSO (ver paso 1.2.2.4).
  2. Reacción colorimétrica
    1. Después del período de incubación del tratamiento, si las células Vero infectadas o los tripomastigotes están en DMEM con rojo fenol, reemplace el medio con 100 μL de 1x PBS para evitar interferencias. Realice triplicar pozos en blanco que contengan solo 100 μL del medio correspondiente (o 1x PBS según corresponda).
      NOTA: No es necesario retirar el medio de cultivo para epimastigotes en caso de medio LIT o DMEM sin rojo fenol. DMEM con rojo fenol todavía se puede utilizar; preparar un pozo en blanco con DMEM solo para medir la absorbancia de la base y luego restar este valor durante el análisis de datos (paso 3.3.). El medio insecto de Schneider, que es incoloro, es una alternativa para los epimastigotes.
    2. Añadir 40 μL de solución de sustrato CPRG y 10 μL de la solución detergente a cada pocillo, obteniendo una concentración final de 200 μM CPRG y detergente al 0,1% en un volumen final de 250 μL en cada pocillo.
      NOTA: La solución CPRG y el detergente se pueden agregar juntos en un volumen final de 50 μL por pocillo.
    3. Incubar a 37 °C durante 2 h y medir la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
      NOTA: El cambio de color esperado es de amarillo a marrón rojizo sobre la escisión enzimática de β-galactosidasa (Figura 2A). El tiempo de incubación se puede extender hasta 4 h, y los espectros de absorbancia del rojo clorofenol se pueden leer entre 570 y 595 nm con accesorios de curva similares (Figura suplementaria S1A, B). La incubación de hasta 24 h en presencia de sustrato CPRG ha mostrado ajustes de curva similares (Figura suplementaria S1C).
      1. En un espectrofotómetro de microplacas con un selector monocromador, cree un nuevo protocolo en el software del equipo (Figura suplementaria S2).
      2. Haga clic en Absorbancia como método de detección | Extremo como tipo de lectura | Ok (Figura suplementaria S2A). Agregue un paso de lectura, escriba la longitud de onda seleccionada y haga clic en Aceptar (Figura suplementaria S2B).
      3. En la sección Diseño de placa , marque los pocillos que se van a leer y haga clic en Aceptar (Figura suplementaria S2C). Para leer la placa, insértela en la bandeja y haga clic en Leer placa. Espere a que los valores aparezcan en la pantalla (Figura suplementaria S2D) y expórtelos a una hoja de cálculo para analizar los resultados.
  3. Análisis de datos y cálculo de la concentración de inhibidores de medios (IC50)
    1. Reste el valor medido en blanco, correspondiente solo al medio LIT, 1x PBS o DMEM con o sin rojo fenol más la solución de detergente CPRG. Al probar la actividad tripanocida de compuestos coloreados, mida la absorbancia de controles en blanco adicionales con LIT o DMEM con cada concentración de fármaco utilizado y luego reste esos valores de los valores de absorbancia obtenidos con los parásitos en cada concentración.
      NOTA: La Tabla suplementaria S2 muestra los valores típicos obtenidos en este ensayo con estos medios sin parásitos más solución de detergente CPRG. Las diferencias antes y después de agregar CPRG son significativas, pero no interfieren con el ensayo con parásitos (Tabla suplementaria S2).
    2. En el software de análisis estadístico, grafique la concentración de BZN (en μM) versus la absorbancia a 595 nm en una tabla xy. Transforme las concentraciones de BZN en valores logarítmicos haciendo clic en el botón Analizar, seleccionando la opción Transformar | transformar los valores x usando x=log(x) y haciendo clic en el botón Aceptar.
    3. Obtenga los valores de IC50 del software de análisis estadístico.
      NOTA: El IC50 se define como la concentración del fármaco que reduce el crecimiento del parásito en un 50% en comparación con el control no tratado y se calcula como el punto de inflexión de la función sigmoidal que se ajusta a la curva.
      1. En el software de análisis estadístico, haga clic en el botón Analizar , seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva) en la lista de análisis xy y haga clic en Aceptar.
      2. En la pestaña modelo de la ventana Parámetros , en el grupo dosis-respuesta - inhibición de ecuaciones integradas, seleccione la opción método dosis-respuesta: log(inhibidor) vs. respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros). Deje todas las demás pestañas en los valores predeterminados; haga clic en Aceptar.
      3. Haga clic en la sección de resultados del software de análisis estadístico para encontrar el valor de IC50, la SD y la bondad del ajuste.
      4. Haga clic en la sección de gráficos para encontrar el gráfico xy de la concentración logarítmica del fármaco frente a los valores de absorbancia . Busque que el ajuste de la curva también se grafique en un color diferente.
        NOTA: Una herramienta de cálculo IC50 en línea gratuita se puede encontrar en https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se incubaron epimastigotes Dm28c que expresan β-galactosidasa con 6 concentraciones de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (o compuestos de interés) durante 72 h. Después de este período, se agregó reactivo CPRG junto con detergente, que lisa las células y libera β-galactosidasa. CPRG es escindido por la β-galactosidasa para producir rojo clorofenol, lo que lleva a un cambio en el color de amarillo a rojizo (Figura 2A). El rojo clorofenol se midió leyendo la absorbancia a 595 nm en un lector de microplacas después de 2 h. Se trazó una tabla XY con las concentraciones logarítmicas de BZN versus la absorbancia a 595 nm. La gráfica se ajustó mediante regresión no lineal (Figura 2B). En este experimento en particular, el CI50 obtenido para epimastigotes fue de 20,59 ± 1,075 μM, similar al obtenido de la literatura (Tabla I)16,17. Anteriormente se han descrito resultados representativos utilizando este método para tripomastigotes y amastigotes13.

Figure 2
Figura 2: Cálculo del valor IC50 de benznidazol para la forma de epimastigote Dm28c. (A) Una placa de 96 pocillos con epimastigotes tratados con diferentes concentraciones de BZN (2.5, 5, 10, 20, 40 y 80 μM) antes de agregar CPRG (1), después de la adición inicial de CPRG y detergente (2), y después de la incubación con CPRG y detergente que muestre el cambio de color (3). (B) Diagrama XY de las concentraciones logarítmicas de BZN versus absorbancia (OD) a 595 nm para epimastigotes Dm28c/pLacZ. La gráfica se ajustó mediante regresión no lineal para estimar el valor de IC50 . Cada valor representa la media y la desviación estándar (barras de error) de 6 réplicas biológicas independientes. La línea azul continua representa el ajuste de la curva. Abreviaturas: CPRG = clorofenol rojo β-D-galactopiranosido; BZN = benznidazol; OD = densidad óptica; C = control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

BZN IC50 (μM) calculado utilizando Dm28c que expresa β-galactosidasa BZN IC50 (μM) reportado en la literatura
Epimastigotes 17,08 a 20.59 De 11 a 18,72
Amastigotes 2.31 a 3.92 1,66 a 4,39
Tripomastigotes 27,07 a 44,74 24,68 a 50,72

Tabla 1: Rango de valores de IC50 obtenidos para epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes utilizando este protocolo en comparación con IC50 reportado en la literatura17,18.

Figura suplementaria S1: Configuración del software lector de microplacas para la absorbancia de lectura. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Mediciones de la actividad de la β-galactosidasa (densidad óptica a 570 a 595 nm) utilizando epimastigotes de la línea Dm28c/pLacZ de Trypanosoma cruzi después de la incubación con CPRG en diferentes puntos temporales. Los valores se expresan como media y desviación estándar de tres réplicas independientes. Las líneas continuas de colores representan el ajuste de la curva. (A) Incubación con 200 μM CPRG durante 2 h. (B) Incubación con 200 μM CPRG durante 4 h. (C) Representación de la actividad de la β-galactosidasa (densidad óptica a 570 nm) en diferentes puntos temporales (2, 4 y 24 h). Abreviatura: CPRG = clorofenol rojo β-D-galactopiranosido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Composición y preparación del medio LIT, hemina y PBS. Abreviaturas: LIT = Triptosa de infusión hepática; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S2: Lecturas de absorbancia para medios LIT y DMEM sin parásitos. Los valores se expresan como triplicados de cada medio; la fila de medios contiene el valor medio de las tres réplicas; y la fila SD contiene los valores de desviación estándar de las réplicas. Abreviaturas: SD = Desviación estándar; LIT = Triptosa de infusión hepática; DMEM = Medio Águila Modificada de Dulbecco. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Este trabajo describe un ensayo basado en la determinación de la actividad citoplasmática β-galactosidasa liberada debido a la lisis de membrana de los epimastigotes de T. cruzi, tripomastigotes o células infectadas con amastigotes en presencia del sustrato CPRG. Utilizamos parásitos T. cruzi Dm28c/pLacZ, una cepa parásita estable obtenida después de la transfección con un plásmido portador de β-galactosidasa construido por Buckner y coautores10. Este ensayo se ha utilizado para buscar compuestos antitripanocidas 12,19,20,21. Se utilizó la cepa T. cruzi Dm28c/pLacZ para optimizar el protocolo de cribado. Como se resume en la Figura 1, este protocolo tiene cuatro puntos principales; el primero es la siembra de parásitos en placas de 96 pocillos. Los epimastigotes y tripomastigotos se cuentan y siembran a partir de una suspensión. En el caso de los amastigotes, primero sembran las células Vero para formar una monocapa adherente y luego infectar con tripomastigotes. Los amastigotes están presentes dentro de las células después de 48 h. En segundo lugar, prepare las diluciones del medicamento para ser probado en las concentraciones deseadas e incube con los parásitos. Finalmente, el tercer paso consiste en agregar CPRG y detergente para lisar las células. CpRG se escinde al β-galactosidasa liberación del citoplasma del parásito, y el rojo clorofenol se genera y se mide espectrofotométricamente. El cuarto paso crítico implica el análisis de datos, la construcción de gráficos x-y y el ajuste de la curva obtenida para calcular los valores de IC50 de los medicamentos de interés.

Un ensayo in vitro para todas las etapas del ciclo de vida de T. cruzi es el paso inicial en el estudio de los efectos de un nuevo fármaco potencial. En estos ensayos, los efectos se evalúan mediante un conteo microscópico, un procedimiento subjetivo y costoso de tiempo que es difícil de automatizar. La sustitución de esta técnica por un ensayo colorimétrico puede mejorar la objetividad del cribado, haciéndolo también menos lento. La lectura colorimétrica de la placa toma solo unos minutos, a diferencia de las horas requeridas para el conteo microscópico manual intensivo en mano de obra, y facilita la detección de grandes bibliotecas de nuevos compuestos con valor terapéutico potencial. En cuanto a la similitud general de los parásitos que expresan β-galactosidasa (Dm28c/pLacZ) en comparación con la cepa Dm28c de tipo silvestre, determinamos que los parásitos eran morfológicamente normales, con tasas de crecimiento similares y diferenciados por igual dentro de las formas del ciclo de vida. Además, los resultados de las pruebas de drogas obtenidas comparando la línea Dm28c de tipo salvaje y la línea Dm28c/pLacZ cuantificada mediante conteo microscópico no mostraron diferencias significativas13.

Una limitación de este protocolo es que los medios de cultivo coloreados podrían interferir con la absorbancia medida. DmEM (o RPMI) sin rojo fenol se recomienda para superar esta limitación. Un pozo en blanco con DMEM se utilizó con éxito como valor de absorbancia basal en este protocolo. Otra limitación es la supuesta interferencia al usar medicamentos de color, que podría superarse utilizando medios con el compuesto en blanco o seleccionando la longitud de onda de absorbancia entre 570 y 595 nm para dar la interferencia más baja. CpRG no se altera por la presencia de un fármaco dado (coloreado o no), lo que hace que este ensayo sea bastante robusto. Cuando se utilizan medios con medicamentos de color rojo fenol o de color, es fundamental realizar controles en blanco para cada condición y luego restar el valor de absorbancia obtenido de las mediciones con parásitos para evitar cualquier interferencia.

La concentración de solución cpRG reportada para T. cruzi tripomastigotes y Toxoplasma gondii es de 100 μM10,15. Sin embargo, la concentración óptima reportada para epimastigotes es de 200 μM11. En esta línea Dm28c/pLacZ, se utilizó una solución CPRG de 200 μM para epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes con resultados confiables. En cuanto a los tiempos de incubación de CPRG, el mejor ajuste de la curva se logró cuando los epimastigotes se incubaron con la solución de sustrato durante 2 h (R2 = 0,9995). Sin embargo, la R2 fue muy similar (R2 = 0,9994), y la actividad de la β-galactosidasa fue lineal en el rango de 6.250-200.000 epimastigotes por pozo (es decir, 62.500-2.000.000 de epimastigotes/ml) a las 4 h (Figura suplementaria S2). Se notificó un rango lineal de 3.150-100.000 tripomastigotes por pozo (es decir, 31.500-1.000.000 de tripomastigotes/ml) para los tripomastigotes13. Para evitar observar grandes desviaciones estándar, es importante sembrar la cantidad correcta de parásitos en cada pozo. Como los volúmenes son pequeños, es importante ser consistente al contar los parásitos antes de la siembra. Además, se podrían medir más de tres réplicas para cada condición experimental si fuera necesario.

A diferencia de otros ensayos de cribado colorimétrico22, los pasos de manipulación posteriores no son necesarios aquí, lo que aumenta la reproducibilidad y fiabilidad del ensayo, así como la velocidad de recopilación de datos. Este es un ensayo fácil, rápido y confiable adecuado para la detección de fármacos de alto rendimiento de compuestos candidatos para el tratamiento de ChD y se puede aplicar a otras cepas de T. cruzi . El plásmido pLacZ está disponible a petición del laboratorio Bucker y podría usarse para transfectar cepas resistentes de, por ejemplo, líneas eliminatorias para evaluar la sensibilidad de la línea a diferentes medicamentos en diferentes fondos genéticos. El único punto crítico a tener en cuenta es que los plásmidos knockout deben tener un marcador de resistencia a los antibióticos diferente al de pLacZ.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Buckner por proporcionar amablemente el plásmido pLacZ. Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, el Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva de Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) y el Consejo de Investigación del Reino Unido [MR/P027989/1]. Servier Medical Art se utilizó para producir la Figura 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

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References

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Bioquímica Número 177
<em>In vitro</em> Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de <em>Trypanosoma cruzi</em> utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa
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Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

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