Summary
Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.
Abstract
Trypanosoma cruzi , Latin Amerika'da halk sağlığı açısından önem taşıyan endemik bir hastalık olan Chagas hastalığının (ChD) etken maddesidir ve göçün artması nedeniyle endemik olmayan birçok ülkeyi de etkilemektedir. Bu hastalık yaklaşık 8 milyon insanı etkilemektedir ve yeni vakaların yılda 50.000 olduğu tahmin edilmektedir. 1960'larda ve 70'lerde, ChD tedavisi için iki ilaç tanıtıldı: nifurtimox ve benznidazol (BZN). Her ikisi de yenidoğanlarda ve hastalığın akut fazında etkilidir, ancak kronik fazda değildir ve kullanımları önemli yan etkilerle ilişkilidir. Bu gerçekler, T. cruzi'ye karşı yeni ilaç arayışını yoğunlaştırmanın acil ihtiyacının altını çizmektedir.
T. cruzi , Reduviidae ve Hemiptera familyalarının hematofajöz böcek vektörleri yoluyla bulaşır. Memeli konağına girdikten sonra, kamçılanmamış amastigot formu olarak hücre içi olarak çoğalır ve kan dolaşımı replikatif olmayan enfektif form olan tripomastigote farklılaşır. Böcek vektörünün içinde, tripomastigotlar epimastigot aşamasına dönüşür ve ikili fisyon yoluyla çoğalır.
Bu yazıda, substrat, klorofenol kırmızısı β-D-galaktopiranosid (CPRG) kullanılarak parazit lizisi nedeniyle kültüre salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin ölçülmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Bunun için, T. cruzi Dm28c suşu β-galaktosidaz aşırı eksprese eden plazmid ile transfekte edildi ve epimastigote, tripomastigote ve amastigot aşamalarında in vitro farmakolojik tarama için kullanıldı. Bu yazıda ayrıca, kültürlenmiş epimastigotlarda, amastigotlarla enfekte Vero hücrelerinde ve referans ilaç benznidazol kullanılarak kültürlenmiş hücrelerden salınan tripomastigotlarda enzimatik aktivitenin nasıl ölçüleceği açıklanmaktadır. Bu kolorimetrik analiz kolayca gerçekleştirilir ve yüksek verimli bir formata ölçeklendirilebilir ve diğer T. cruzi suşlarına uygulanabilir.
Introduction
Chagas hastalığı (ChD) veya Amerikan tripanosomiasis, kamçılı protozoan Trypanosoma cruzi'nin (T. cruzi) neden olduğu paraziter bir hastalıktır. ChD, genellikle teşhis edilmeyen asemptomatik veya oligosemptomatik akut faz ile başlar, bunu yaşam boyu süren kronik bir faz izler. Kroniklikte, hastaların ~% 30'u enfeksiyondan on yıllar sonra ortaya çıkar - miyokardiopati, mega-sindirim sendromları veya her ikisi de dahil olmak üzere çeşitli zayıflatıcı koşullar,% 0.2 ila% 20 arasında değişen bir ölüm oranı1,2,3. Asemptomatik kronik hastaların klinik bulguları olmayabilir, ancak yaşamları boyunca seropozitif kalırlar.
Tahminler, dünya çapında ~ 7 milyon insanın, çoğunlukla ChD'nin endemik olduğu Latin Amerika'dan enfekte olduğunu göstermektedir. Bu ülkelerde, T. cruzi esas olarak enfekte kan emici triatomin böcekleri (vektör kaynaklı bulaşma) yoluyla ve daha az sıklıkla parazitleri içeren triatomin dışkısı ile kontamine olmuş gıdaların yutulması yoluyla oral yolla bulaşır. Ek olarak, parazit plasenta yoluyla chagasic annelerden yenidoğanlara, kan nakli yoluyla veya organ nakli sırasında bulaşabilir. Enfeksiyonu ve insan göçünü elde etmenin bu vektörden bağımsız yolları, Kuzey Amerika, Avrupa ve bazı Afrika, Doğu Akdeniz ve Batı Pasifik ülkelerinde artan sayıda vaka ile kanıtlanan hastalığın dünya çapında yayılmasına katkıda bulunmuştur4. ChD, vektör kaynaklı bulaşma yoksullukla yakından ilişkili olduğu ve özellikle Latin Amerika düşük gelirli ülkelerinde önde gelen bir halk sağlığı sorunu olduğu için ihmal edilmiş bir hastalık olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler olmasına rağmen, Latin Amerika'da ChD'ye bağlı mortalite, sıtma2 de dahil olmak üzere paraziter hastalıklar arasında en yüksektir.
1960'ların sonlarında ve 1970'lerin başında ChD tedavisi için iki kayıtlı ilaç vardır: nifurtimox ve benznidazol5. Her iki ilaç da yetişkinlerde, çocuklarda ve doğuştan enfekte olmuş yenidoğanlarda ve ayrıca kronik enfeksiyonu olan çocuklarda hastalığın akut fazında etkilidir. Bununla birlikte, sadece birkaç kişiye zamanında tedavi edilecek kadar erken teşhis konur. Son klinik çalışmalara göre, her iki ilacın da yetişkinlerde önemli sınırlamaları vardır ve kronik hastalığı olan kişilerde semptomları azaltmada etkisizdir; Bu nedenle, bu aşamada kullanımları tartışmalıdır. Diğer dezavantajlar, gerekli olan uzun tedavi süreleri (60-90 gün) ve gözlenen sık, ciddi yan etkilerdir ve bu da enfekte kişilerin bir oranında tedavinin kesilmesine yol açmaktadır 6,7. ChD'li kişilerin% 10'undan daha azının teşhis edildiği ve hatta daha azının tedaviye erişimi olduğu tahmin edilmektedir, çünkü etkilenen birçok birey sağlık hizmetlerine erişimi olmayan veya az olan kırsal alanlarda yaşamaktadır8. Bu gerçekler, özellikle kronik faz için daha verimli, güvenli ve sahaya uygulanabilir tedavilere izin vermek için T. cruzi'ye karşı yeni ilaçların acilen bulunması gerektiğini vurgulamaktadır. Bu bağlamda, daha etkili bileşiklerin geliştirilmesindeki bir diğer zorluk, in vitro ve in vivo9 ilaç etkinliğini değerlendirmek için sistemlerin sınırlandırılmasıdır.
Kinetoplastid parazitlerde potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesi için kimyasal biyoloji ve genomik yaklaşımlar kullanılmasına rağmen, T. cruzi'deki mevcut genomik araçlar T. brucei veya Leishmania'nın aksine sınırlıdır. Bu nedenle, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin taranması, ChD'ye karşı yeni kemoterapötik ilaç adaylarının araştırılmasında hala en çok kullanılan yaklaşımdır. genellikle, T. cruzi'deki ilaç keşfi, yeni bir ilacın in vitro testinde epimastigot aşamasına karşı etkilerini test etmekle başlamalıdır. On yıllar boyunca, aday bileşiklerin T. cruzi üzerindeki inhibitör etkilerini ölçmenin tek yolu, zahmetli, zaman alıcı ve operatöre bağımlı olan manuel mikroskobik sayımdı. Dahası, bu yaklaşım az sayıda bileşiğin tahlili için uygundur, ancak büyük bileşik kütüphanelerinin yüksek verimli taranması için kabul edilemez. Günümüzde, birçok araştırma, in vitro olarak test edilen ve parazit büyümesini inhibe etme kapasitelerini test eden farklı kökenlerden çok sayıda bileşiğin analizi ile başlamaktadır. Bu tahlillerde verimi artırmak, taramanın nesnelliğini geliştirmek ve tüm süreci daha az sıkıcı hale getirmek için hem kolorimetrik hem de florometrik yöntemler geliştirilmiştir9.
En yaygın kullanılan kolorimetrik yöntemlerden biri, ilk olarak Bucknet ve işbirlikçileri10 tarafından tanımlanan transfekte parazitlerin β-galaktosidaz aktivitesine dayanmaktadır. Rekombinant parazitler tarafından eksprese edilen β-galaktosidaz enzimi, kromojenik substratı, klorofenol kırmızısını β-D-galaktopiranosid (CPRG), bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak kolorimetrik olarak kolayca ölçülebilen klorofenol kırmızısına hidrolize eder. Böylece, çeşitli bileşiklerin varlığında parazit büyümesi, mikrotitre plakalarında aynı anda değerlendirilebilir ve ölçülebilir. Bu yöntem, epimastigot formlarındaki (böcek vektöründe bulunur), tripomastigotlar ve hücre içi amastigotlar, parazitin memeli evreleri olan ilaçları test etmek için uygulanmıştır. Ayrıca, Escherichia coli β-galaktosidaz enzimini eksprese etmek için pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plazmid (pLacZ)10 ile transfekte edilen birkaç rekombinant T. cruzi suşu zaten mevcuttur (ve yenileri inşa edilebilir), bu da aynı bileşiklere karşı eşit davranmayabilecek farklı ayrık tipleme birimlerinden (DTU'lar) parazitlerin değerlendirilmesine izin verir10,11,12,13 . Bu yöntem, düşük ve yüksek verimli tarama12,13'te T. cruzi'ye karşı aktivite için bileşikleri değerlendirmek için zaten başarıyla kullanılmıştır. Benzer yaklaşımlar, Toxoplasma gondii ve Leishmania mexicana14,15 dahil olmak üzere diğer protozoan parazitlerde de kullanılmıştır.
Bu yazıda, β-galaktosidaz eksprese eden parazitler kullanılarak T. cruzi'nin tüm yaşam döngüsü aşamalarına karşı in vitro ilaç taraması için ayrıntılı bir yöntem açıklanmakta ve gösterilmektedir. Burada sunulan tahliller, DTU I13'ten T. cruzi Dm28c suşunun pLacZ plazmidi (Dm28c/pLacZ) ile transfeksiyonu ile elde edilen β-galaktosidaz eksprese eden T. cruzi hattı ile gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, aynı protokol, bileşikler arasındaki ve T. cruzi suşları veya DTU'lar arasındaki performansı karşılaştırmak için diğer suşlara kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm deneysel tasarıma genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Kolorimetrik reaksiyon için bir substrat olarak CPRG kullanan Trypanosoma cruzi Dm28c / pLacZ hattının in vitro tarama testine genel bakış. Tahlil, parazitlerin (1) tohumlanmasından, BZN (2 ve 3) ile inkübe edilmesinden ve daha sonra kolorimetrik substratın (4) eklenmesinden oluşur. Parazitler lize edildiğinde, β-galaktosidaz salınır ve CPRG'yi klorofenol kırmızısına ayırır; renkteki bu değişim spektrofotometrik olarak ölçülebilir (5). Veriler, BZN'nin yarı inhibitör konsantrasyonunu (IC50) elde etmek için istatistiksel analiz yazılımında analiz edilebilir. Kısaltmalar: CPRG = klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid; BZN = benznidazol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Stok çözeltilerinin hazırlanması
- Medya ve çözeltilerin hazırlanması
- Hemin çözeltisi (Ek Tablo S1)
- Tüm bileşenleri tarifte verilen sırayla 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve birkaç kez ters çevirerek homojenize edin.
- 0,22 μm'lik bir filtreden filtreleme ile sterilize edin.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL alikot hazırlayın ve kullanıma kadar -80 °C'de tutun.
- Karaciğer İnfüzyon Triptoz (LIT) Ortamı (Ek Tablo S1)
- Tüm bileşenleri tartın ve oda sıcaklığında homojenize etmek için en az 700 mL damıtılmış su içeren 1 L'lik bir beherde karıştırın.
- PH'ı 7,2'ye ayarlayın ve damıtılmış su ile 1 L dereceli bir silindirde hacmi 900 mL'ye yükseltin; filtrasyon veya otoklavlama ile sterilize edin (20 dakika boyunca 121 °C).
- 100 mL fetal buzağı serumu (FCS), (% 10 FCS, 45 dakika boyunca 56 ° C'de steril ve ısıl olarak inaktive edilmiş), 20 mL% 40 steril glikoz çözeltisi (otoklavlama ile sterilize edilmiş, 20 dakika boyunca 121 °C) ve 900 mL LIT ortamına 5 mL hemin çözeltisi (nihai konsantrasyon 5 μM) ekleyerek ortamı destekleyin.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) üreticinin talimatlarını izleyerek tozdan hazırlayın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) (Ek Tablo S1)
- Çözeltiyi oda sıcaklığında 1 L'lik bir beherde karıştırarak tüm katı bileşenleri çözün.
- PH'ı 7,2'ye ayarlayın, damıtılmış su ile 1 L dereceli bir silindirde 1 L'ye kadar seviye atın ve filtreleme veya otoklavlama (121 ° C, 20 dakika) ile sterilize edin.
- Hemin çözeltisi (Ek Tablo S1)
- Benznidazol (BZN) stok çözeltileri ve seyreltmeleri
NOT: Bu çalışmada kullanılan BZN konsantrasyonu aralığı 2,5 ila 80 μM idi.- 13 mg ilacı 50 μL dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözerek 1 M BZN'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Aseptik koşullar altında, bu 1 M BZN stok çözeltisinden, test edilecek kuyu sayısı için yeterli olan son hacimde, istenen nihai konsantrasyonun (2x çözeltiler) iki katı kadar seri seyreltmeler hazırlayın.
NOT: Kuyu başına %10-20'den fazla olan 100 μL için hesaplayın. BZN stok çözeltisi ve tüm BZN seyreltmeleri, ilacın ortamdaki düşük çözünürlüğü nedeniyle tahlilde kullanılmadan hemen önce hazırlanmalıdır. - 160, 80, 40, 20, 10 ve 5 μM'lik 2x BZN seyreltmeleri hazırlayın.
- T. cruzi'nin her yaşam döngüsü aşaması için kullanılan uygun ortamda 10 mM'lik bir çözelti elde etmek için 1 M BZN stok çözeltisini 100 kat seyreltmede (1 M BZN + 990 μL ortamın 10 μL'si) seyreltin. Süspansiyonu homojenize etmek için sürekli karıştırın.
- Uygun ortamda 320 μM BZN hazırlamak için 10 mM BZN çözeltisini seyreltin: 32 μL 10 mM BZN + 968 μL ortam. Süspansiyonu homojenize etmek için sürekli karıştırın.
- 160 μM konsantrasyon elde etmek için 320 μM BZN'yi 2 kat seyreltin (500 μL 320 μM BZN + 500 μL ortam). Süspansiyonu homojenize etmek için sürekli karıştırın. 80, 40, 20, 10 ve 5 μM çözeltileri elde etmek için elde edilen her çözelti ile bu 2 katlı seyreltmeyi tekrarlayın.
- DMSO'yu tedavi edilmemiş kontrol olarak kullanılmak üzere uygun ortamda 1.000 kat seyreltin (%100 sağkalım kontrolü).
NOT: Epimastigotlar DMSO'nun 100 kata kadar seyreltilmesini tolere ederken, Vero hücreleri DMSO'nun sadece 1000 kat seyreltilmesini tolere eder. Gerekirse,% 50 DMSO'lu bir ölüm kontrolü% 0 sağkalım koşulu olarak dahil edilebilir.
- 13 mg ilacı 50 μL dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözerek 1 M BZN'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Aseptik koşullar altında, bu 1 M BZN stok çözeltisinden, test edilecek kuyu sayısı için yeterli olan son hacimde, istenen nihai konsantrasyonun (2x çözeltiler) iki katı kadar seri seyreltmeler hazırlayın.
- Substrat çözeltisi
- CPRG'yi damıtılmış suda 1 mM konsantrasyonda çözün. 96 kuyucuklu bir plaka için, 4 mL suya 2.4 mg CPRG ekleyin.
NOT: CPRG çözeltisi tahlilden hemen önce hazırlanmalıdır.
- CPRG'yi damıtılmış suda 1 mM konsantrasyonda çözün. 96 kuyucuklu bir plaka için, 4 mL suya 2.4 mg CPRG ekleyin.
- Lizis çözeltisi
- 1x PBS'de% 2.5 v / v noniyonik, denatüre olmayan deterjan 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi] etanol ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Tahlilden hemen önce 96 delikli plaka başına 1 mL çözelti hazırlayın.
2. Parazit kültürü hazırlığı
- Epimastigot preparatı
NOT: Bu rapor boyunca T. cruzi Dm28c/pLacZ satır13 kullanılmıştır.- β-galaktosidaz eksprese eden T. cruzi epimastigotları, 25 cm2'lik bir büyüme alanına sahip hücre kültürü şişelerinde 28 ° C'de eksenel olarak büyütün (T-25 şişeleri). Her 48-72 saatte bir (5 mL'de) LIT ortamında% 10 FCS (Ek Tablo S1) ve genetikin sülfat (G418) ile desteklenmiş 200 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda alt kültüre alarak kültürleri log fazında tutun. Alt kültürlemeden önce bir Neubauer odasında hücre sayımı yaparak parazit büyümesini ölçün. Kapağı güvenli bir şekilde kapatın ve kültür şişesini (havalandırılmamış) 28 ° C'de dikey konumda tutun.
NOT: G418, pLacZ plazmid seçimini ve bakımını sağlar. Log faz kültürleri, Dm28c/pLacZ hattı için 1-5 × 107 parazit/mL epimastigot konsantrasyonuna sahiptir. - G418 antibiyotik ile desteklenmiş LIT'teki bir log faz kültüründen 2 × 105 epimastigot / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın. 96 kuyucuklu bir mikroplakanın kuyu başına 100 μL epimastigot süspansiyonunu (100 μL LIT'de 20.000 epimastigot) dağıtın ve ortamla kuyu başına 200 μL'ye kadar son hacmi oluşturun.
- β-galaktosidaz eksprese eden T. cruzi epimastigotları, 25 cm2'lik bir büyüme alanına sahip hücre kültürü şişelerinde 28 ° C'de eksenel olarak büyütün (T-25 şişeleri). Her 48-72 saatte bir (5 mL'de) LIT ortamında% 10 FCS (Ek Tablo S1) ve genetikin sülfat (G418) ile desteklenmiş 200 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda alt kültüre alarak kültürleri log fazında tutun. Alt kültürlemeden önce bir Neubauer odasında hücre sayımı yaparak parazit büyümesini ölçün. Kapağı güvenli bir şekilde kapatın ve kültür şişesini (havalandırılmamış) 28 ° C'de dikey konumda tutun.
- Amastigat preparatı
- Daha önce DMEM'de tohumlanmış% 2 FCS ile desteklenmiş 2 × 10 5 Vero hücresi içeren birT-25 şişesinde ilk enfeksiyonu gerçekleştirmek için yaşlı bir epimastigot kültüründen elde edilen spontan metasiklik tripomastigotları (bu protokolde 7 gün boyunca) kullanın.
- Bir Neubauer odasındaki metasiklik tripomastigotların sayısını sayın, Vero hücresi tek katmanını% 2 FCS ile 5 mL'lik DMEM'de 10'luk bir enfeksiyon çokluğu (MOI) ile enfekte edin ve 16 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Kalan tripomastigotları, besini şişeden 5 mL steril pipetle çıkararak yıkayın, ardından 5 mL 1x PBS ekleyin ve aspirat edin. Son olarak,% 2 FCS ile 5 mL DMEM ekleyin ve aynı koşullar altında inkübe edin.
- Enfekte Vero hücresi monokatmanından çıkan tripomastigotları, DMEM'de% 2 FCS ile 2 × 105 Vero hücresi ile T-25 şişelerinde enfeksiyonu korumak için kullanın ve her hafta yeni bir enfekte şişe oluşturun.
NOT: 5-7 gün sonra, tripomastigotlar ortaya çıkmaya başlar ve süpernatanda görülür. Vero hücre hattı G418'e dirençli olmadığından, hücreleri veya enfekte olmuş hücreleri enfekte etmek için kullanılan tripomastigotlara G418 eklemeyin.
- DMEM'de 1 × 105 Vero hücresi / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın,% 2 FCS ile desteklenmiş ve 96 kuyucuklu doku kültürü plakalarında kuyu başına süspansiyonun 100 μL'sini tohumlayın (kuyu başına 10.000 hücre). Kuyucukların dibine hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca (12-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, Vero hücresi tek katmanını 100 μL steril 1x PBS ile üç kez durulayın. T. cruzi Dm28c / pLacZ tripomastigotları (bir T-25 şişesindeki önceki bir enfeksiyondan elde edilen, adım 2.2.1), kuyu başına% 2 FCS (kuyu başına 100.000 tripomastigot) ile desteklenmiş 100 μL'lik DMEM'de 10'luk bir MOI'ye ekleyin.
- Plakaları 37 °C'de 6 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu kuluçka süresinden sonra, plakaları 1x PBS ile iki kez yıkayın ve% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan 100 μL DMEM ekleyin.
NOT: 48 saat sonra (enfeksiyondan 2 gün sonra), intrasitoplazmik amastigotlar optik mikroskopla görülebilir. DMEM ve diğer hücre kültürü ortamlarında bir pH göstergesi olan fenol kırmızısı, CPRG'nin absorbans ölçümüne müdahale edebilir. Fenol kırmızısı içermeyen DMEM mevcut değilse, aşağıda bölüm 3.2.1'de belirtilen alternatiflere bakın.
- Daha önce DMEM'de tohumlanmış% 2 FCS ile desteklenmiş 2 × 10 5 Vero hücresi içeren birT-25 şişesinde ilk enfeksiyonu gerçekleştirmek için yaşlı bir epimastigot kültüründen elde edilen spontan metasiklik tripomastigotları (bu protokolde 7 gün boyunca) kullanın.
- Tripomastigot preparatı
- DMEM'de 1 × 106 Vero hücresi / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın,% 2 FCS ile desteklenmiş ve T-25 şişelerinde ortamın 5 mL'sinde 800.000 hücreyi tohumlayın. Hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca (12-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: Bir T-75 şişesi için, tohum 2, 15 mL'lik son hacimde 106 hücre ×. - Kuluçkadan sonra, 3 mL steril 1x PBS ile iki kez durulayın. %2 FCS ile 5 mL'lik DMEM'de 10'luk bir MOI'ye T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotları ekleyin (T-25 şişesi için 8 × 106 tripomastigot).
NOT: Bir T-75 şişesi için,% 2 FCS ile 15 mL'lik DMEM'in son hacmine 20 × 106 tripomastigot ekleyin. - Gece boyunca (12-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Şişeyi 3 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve% 2 FCS ile desteklenmiş 5 mL taze DMEM ekleyin. Dört gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Optik mikroskop altında tripomastigotlar için süpernatantı kontrol edin. Tripomastigotları bir Neubauer odasında sayarak sayın. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan DMEM'de 1 × 106 tripomastigot / mL konsantrasyonu elde etmek için peleti yeniden askıya alın. 96 kuyucuklu bir plakada tripomastigot süspansiyonunun 100 μL'sini (kuyu başına 100.000 tripomastigot) tohumlayın.
NOT: Fenol kırmızısı içermeyen DMEM mevcut değilse, bölüm 3.2.1'de aşağıdaki alternatiflere bakın.
- DMEM'de 1 × 106 Vero hücresi / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın,% 2 FCS ile desteklenmiş ve T-25 şişelerinde ortamın 5 mL'sinde 800.000 hücreyi tohumlayın. Hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca (12-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
3. β-galaktosidaz testi
NOT: β-galaktosidaz aktivitesinin kantitasyonu, parazitlerin sayısını belirlemenin dolaylı bir yolu olarak kullanılır. Tripanosidal bir bileşiğin varlığında büyümenin inhibe edilmesi ve tedavi edilmeyen kontrole kıyasla daha düşük sayıda parazite yol açması beklenmektedir, bu da daha düşük bir β-galaktosidaz aktivitesine ve dolayısıyla daha düşük absorbansa yansıyacaktır.
- Parazitleri BZN ile inkübe edin.
- 96 kuyucuklu bir plakada 80, 40, 20, 10, 5 ve 2.5 μM ila 100 μL epimastigot süspansiyonu (adım 2.1'den), amastigotlu Vero hücrelerine (enfeksiyondan 2 gün sonra) (adım 2.2) veya tripomastigotların (adım 2.3) nihai BZN konsantrasyonuna ulaşmak için kuyu başına 100 μL karşılık gelen 2x BZN çözeltisi ekleyin.
- Epimastigotları 72 saat boyunca 28 ° C'de ve tripomastigotları veya enfekte Vero hücrelerini 37 ° C'de 24 saat boyunca amastigotlarla ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: Her ilaç konsantrasyonu en az üçlü olarak değerlendirilmeli ve epimastigotların, tripomastigotların ve DMSO ile enfekte Vero hücrelerinin kontrol kültürlerini içermelidir (bkz. adım 1.2.2.4).
- Kolorimetrik reaksiyon
- Tedavi inkübasyon süresinden sonra, enfekte Vero hücreleri veya tripomastigotlar fenol kırmızısı ile DMEM'deyse, paraziti önlemek için ortamı 100 μL 1x PBS ile değiştirin. Sadece 100 μL karşılık gelen ortam (veya uygun şekilde 1x PBS) içeren üçlü boş kuyucuklar gerçekleştirin.
NOT: Fenol kırmızısı olmadan LIT ortamı veya DMEM durumunda epimastigotlar için kültür ortamının çıkarılması gerekli değildir. Fenol kırmızısı ile DMEM hala kullanılabilir; baz absorbansını ölçmek için yalnızca DMEM ile boş bir kuyu hazırlayın ve ardından veri analizi sırasında bu değeri çıkarın (adım 3.3.). Schneider'in renksiz olan böcek ortamı, epimastigotlar için bir alternatiftir. - Her bir kuyucuğa 40 μL CPRG substrat çözeltisi ve 10 μL deterjan çözeltisi ekleyin, her bir kuyucukta 250 μL'lik bir son hacimde 200 μM CPRG ve% 0.1'lik bir deterjan konsantrasyonu elde edin.
NOT: CPRG çözeltisi ve deterjan, kuyu başına 50 μL'lik son bir hacimde bir araya getirilebilir. - 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve bir mikroplaka spektrofotometresinde 595 nm'de absorbansı ölçün.
NOT: Beklenen renk değişimi, β-galaktosidaz enzimatik bölünmesi üzerine sarıdan kırmızımsı-kahverengiye kadardır (Şekil 2A). Kuluçka süresi 4 saate kadar uzatılabilir ve klorofenol kırmızısının absorbans spektrumları benzer eğri bağlantı parçaları ile 570 ila 595 nm arasında okunabilir (Ek Şekil S1A, B). CPRG substratı varlığında 24 saate kadar inkübasyon, benzer eğri bağlantı parçaları göstermiştir (Ek Şekil S1C).- Tek renkli seçicili bir mikroplaka spektrofotometrede, ekipman yazılımında yeni bir protokol oluşturun (Ek Şekil S2).
- Algılama yöntemi olarak Absorbans'a tıklayın | Okuma türü olarak uç nokta | Tamam (Ek Şekil S2A). Bir Okuma Adımı ekleyin, seçilen dalga boyunu yazın ve Tamam'ı tıklatın (Ek Şekil S2B).
- Plaka Düzeni bölümünde, okunacak kuyucukları işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın (Ek Şekil S2C). Plakayı okumak için, tepsiye yerleştirin ve Plakayı Oku'ya tıklayın. Değerlerin ekranda görünmesini bekleyin (Ek Şekil S2D) ve sonuçları analiz etmek için bunları bir elektronik tabloya aktarın.
- Tedavi inkübasyon süresinden sonra, enfekte Vero hücreleri veya tripomastigotlar fenol kırmızısı ile DMEM'deyse, paraziti önlemek için ortamı 100 μL 1x PBS ile değiştirin. Sadece 100 μL karşılık gelen ortam (veya uygun şekilde 1x PBS) içeren üçlü boş kuyucuklar gerçekleştirin.
- Veri analizi ve ortam inhibitörü konsantrasyonu (IC50) hesaplaması
- Sadece LIT ortamına, fenol kırmızısı olan veya olmayan DMEM'e ve ayrıca CPRG-deterjan çözeltisine karşılık gelen boş ölçülen değeri çıkarın. Renkli bileşiklerin tripanosidal aktivitesini test ederken, kullanılan her ilaç konsantrasyonu ile LIT veya DMEM ile ek boş kontrollerin emilimini ölçün ve daha sonra bu değerleri her konsantrasyonda parazitlerle elde edilen absorbans değerlerinden çıkarın.
NOT: Ek Tablo S2, bu testte parazitler ve CPRG-deterjan çözeltisi olmadan bu ortamlarla elde edilen tipik değerleri göstermektedir. CPRG eklenmeden önce ve sonra farklılıklar önemlidir, ancak parazitlerle yapılan tahlili engellemez (Ek Tablo S2). - İstatistiksel analiz yazılımında, bir xy tablosunda 595 nm'deki absorbansa karşı BZN konsantrasyonunu (μM cinsinden) çizin. Analiz Et düğmesine tıklayarak, x=log(x) seçeneğini kullanarak x-değerlerini dönüştürmek | Dönüştür seçeneğini belirleyerek ve Tamam düğmesine tıklayarak BZN konsantrasyonlarını logaritmik değerlere dönüştürün.
- IC50 değerlerini istatistiksel analiz yazılımından elde edin.
NOT: IC 50, parazit büyümesini tedavi edilmemiş kontrole kıyasla%50 azaltan ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır ve eğriye uyan sigmoidal fonksiyonun bükülme noktası olarak hesaplanır.- İstatistiksel analiz yazılımında, Analiz Et düğmesine tıklayın, xy analiz listesinde doğrusal olmayan regresyon (eğri sığdırma) seçeneğini seçin ve Tamam'a tıklayın.
- Parametreler penceresinin model sekmesinde, yerleşik denklemlerin doz-yanıt - inhibisyon grubunda, seçenek doz-yanıt yöntemini seçin: log(inhibitör) ve yanıt - Değişken Eğim (dört parametre). Diğer tüm sekmeleri varsayılan değerlerde bırakın; Tamam'ı tıklatın.
- IC50 değerini, SD'yi ve uygunluğun iyiliğini bulmak için istatistiksel analiz yazılımının sonuçlar bölümüne tıklayın.
- İlacın logaritmik konsantrasyonunun absorbans değerlerine karşı xy grafiğini bulmak için grafik bölümüne tıklayın. Eğri uyumunun da farklı bir renkte grafiklendirilip çizilmediğine bakın.
NOT: Ücretsiz bir çevrimiçi IC50 hesaplama aracı https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator bulunabilir.
- Sadece LIT ortamına, fenol kırmızısı olan veya olmayan DMEM'e ve ayrıca CPRG-deterjan çözeltisine karşılık gelen boş ölçülen değeri çıkarın. Renkli bileşiklerin tripanosidal aktivitesini test ederken, kullanılan her ilaç konsantrasyonu ile LIT veya DMEM ile ek boş kontrollerin emilimini ölçün ve daha sonra bu değerleri her konsantrasyonda parazitlerle elde edilen absorbans değerlerinden çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü takiben, β-galaktosidaz eksprese eden Dm28c epimastigotları, 72 saat boyunca 6 konsantrasyon BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (veya ilgili bileşikler) ile inkübe edildi. Bu süreden sonra, hücreleri lize eden ve β-galaktosidaz salgılayan deterjanla birlikte CPRG reaktifi eklendi. CPRG, klorofenol kırmızısı üretmek için β-galaktosidaz tarafından yarılır ve rengin sarıdan kırmızımsıya değişmesine neden olur (Şekil 2A). Klorofenol kırmızısı, 2 saat sonra bir mikroplaka okuyucuda 595 nm'deki absorbans okunarak ölçüldü. BZN'nin logaritmik konsantrasyonları ile 595 nm'deki absorbansa karşı bir XY tablosu çizildi. Grafik, doğrusal olmayan regresyon kullanılarak yerleştirilmiştir (Şekil 2B). Bu özel deneyde, epimastigotlar için elde edilen IC 50, literatürden elde edilene benzer şekilde20.59 ± 1.075 μM idi (Tablo I)16,17. Tripomastigotlar ve amastigotlar için bu yöntemi kullanan temsili sonuçlar daha önce13 olarak tanımlanmıştır.
Şekil 2: Epimastigot formu Dm28c için benznidazolün IC50 değerinin hesaplanması. (A) CPRG (1) eklenmeden önce, CPRG ve deterjanın ilk eklenmesinden sonra (2) ve renk değişimini gösteren CPRG ve deterjan ile inkübasyondan sonra farklı BZN konsantrasyonları (2.5, 5, 10, 20, 40 ve 80 μM) ile muamele edilmiş epimastigotlara sahip 96 delikli bir plaka (3). (B) Dm28c/pLacZ epimastigotları için 595 nm'de absorbansa (OD) karşı BZN'nin logaritmik konsantrasyonlarının XY-grafiği. Grafik, IC50 değerini tahmin etmek için doğrusal olmayan regresyon kullanılarak yerleştirildi. Her değer, 6 bağımsız biyolojik kopyanın ortalamasını ve standart sapmasını (hata çubukları) temsil eder. Sürekli mavi çizgi, eğri uyumunu temsil eder. Kısaltmalar: CPRG = klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid; BZN = benznidazol; OD = optik yoğunluk; C = kontrol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| BZN IC50 (μM), β-galaktosidaz eksprese eden Dm28c kullanılarak hesaplanmıştır | Literatürde bildirilen BZN IC50 (μM) | |
| Epimastigotlar | 17.08 ile 20.59 arası | 11 ile 18,72 arası |
| Amastigotlar | 2,31 ila 3,92 | 1,66 ila 4,39 |
| Tripomastigotlar | 27.07 ile 44.74 arası | 24,68 ila 50,72 |
Tablo 1: Bu protokol kullanılarak epimastigotlar, tripomastigotlar ve amastigotlar için elde edilen IC 50 değerlerinin aralığı, literatürde bildirilen IC 50 ile karşılaştırıldığında 17,18'dir.
Ek Şekil S1: Okuma absorbansı için mikroplaka okuyucu yazılımının kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Farklı zaman noktalarında CPRG ile inkübasyondan sonra Trypanosoma cruzi'nin Dm28c / pLacZ hattından epimastigotlar kullanılarak β-galaktosidaz aktivite ölçümleri (570 ila 595 nm'de optik yoğunluk). Değerler, üç bağımsız kopyanın ortalama ve standart sapması olarak ifade edilir. Renkli sürekli çizgiler eğriye uyumu temsil eder. (A) 2 saat için 200 μM CPRG ile inkübasyon (B) 4 saat için 200 μM CPRG ile inkübasyon. (C) β-galaktosidaz aktivitesinin (570 nm'de optik yoğunluk) farklı zaman noktalarında (2, 4 ve 24 saat) temsili. Kısaltma: CPRG = klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S1: LIT ortamı, hemin ve PBS'nin bileşimi ve hazırlanması. Kısaltmalar: LIT = Karaciğer infüzyonu triptoz; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S2: Parazitsiz LIT ve DMEM ortamı için absorbans okumaları. Değerler her ortamın üçlüsü olarak ifade edilir; medya satırı üç çoğaltmanın ortalama değerini içerir; ve SD satırı çoğaltmaların standart sapma değerlerini içerir. Kısaltmalar: SD = Standart Sapma; LIT = Karaciğer İnfüzyon Triptoz; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, substrat CPRG varlığında T. cruzi epimastigotların, tripomastigotların veya amastigotlarla enfekte olmuş hücrelerin membran lizisine bağlı olarak salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin belirlenmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Buckner ve ortak yazarlar10 tarafından inşa edilen β-galaktosidaz taşıyan plazmid ile transfeksiyondan sonra elde edilen kararlı bir parazit suşu olan T. cruzi Dm28c / pLacZ parazitlerini kullandık. Bu tahlil, antitripanosidal bileşikleri araştırmak için kullanılmıştır 12,19,20,21. T. cruzi Dm28c/pLacZ suşu tarama protokolünü optimize etmek için kullanıldı. Şekil 1'de özetlendiği gibi, bu protokolün dört ana noktası vardır; birincisi, 96 kuyucuklu plakalarda parazit tohumlamasıdır. Epimastigotlar ve tripomastigotlar sayılır ve bir süspansiyondan tohumlanır. Amastigatlar durumunda, önce Vero hücrelerini yapışkan bir tek tabaka oluşturmak için tohumlayın ve daha sonra tripomastigotlarla enfekte edin. Amastigotlar 48 saat sonra hücrelerin içinde bulunur. İkincisi, istenen konsantrasyonlarda test edilecek ilacın seyreltmelerini hazırlayın ve parazitlerle inkübe edin. Son olarak, üçüncü adım, hücreleri lize etmek için CPRG ve deterjan eklemeyi içerir. CPRG, parazit sitoplazmasından β-galaktosidaz salınımı üzerine bölünür ve klorofenol kırmızısı üretilir ve spektrofotometrik olarak ölçülür. Dördüncü kritik adım, veri analizini, x-y grafiklerinin oluşturulmasını ve ilgilenilen ilaçların IC50 değerlerini hesaplamak için elde edilen eğrinin uymasını içerir.
T. cruzi'nin tüm yaşam döngüsü aşamaları için in vitro bir tahlil, potansiyel yeni bir ilacın etkilerini incelemenin ilk adımıdır. Bu tahlillerde, etkiler, otomatikleştirilmesi zor olan zaman pahalı ve öznel bir prosedür olan mikroskobik sayım ile değerlendirilir. Bu tekniğin kolorimetrik bir tahlille değiştirilmesi, taramanın nesnelliğini artırabilir ve aynı zamanda daha az zaman alıcı hale getirebilir. Kolorimetrik plaka okuma, emek yoğun manuel mikroskobik sayım için gereken saatlerin aksine sadece birkaç dakika sürer ve potansiyel terapötik değeri olan yeni bileşiklerin büyük kütüphanelerinin taranmasını kolaylaştırır. β-galaktosidaz eksprese eden parazitlerin (Dm28c / pLacZ) vahşi tip Dm28c suşuna kıyasla genel benzerliği ile ilgili olarak, parazitlerin morfolojik olarak normal olduğunu, benzer büyüme oranlarına sahip olduğunu ve yaşam döngüsü formları içinde eşit olarak farklılaştığını belirledik. Ayrıca, mikroskobik sayımla ölçülen vahşi tip Dm28c ve Dm28c/pLacZ hattını karşılaştırarak elde edilen ilaç testi sonuçları anlamlı bir fark göstermemiştir13.
Bu protokolün bir sınırlaması, renkli kültür ortamının ölçülen emilime müdahale edebilmesidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için fenol kırmızısı içermeyen DMEM (veya RPMI) önerilir. DMEM'li boş bir kuyu bu protokolde bazal absorbans değeri olarak başarıyla kullanılmıştır. Diğer bir sınırlama, renkli ilaçlar kullanıldığında, bileşikle birlikte boş olarak veya en düşük paraziti vermek için 570 ila 595 nm arasındaki absorbans dalga boyunu seçerek üstesinden gelinebilecek varsayılan girişimdir. CPRG, belirli bir ilacın varlığı (renkli olsun ya da olmasın) ile değiştirilmez, bu da bu tahlili oldukça sağlam hale getirir. Fenol kırmızısı veya renkli ilaçlarla ortam kullanırken, her durum için boş kontroller yapmak ve daha sonra herhangi bir paraziti önlemek için parazitlerle yapılan ölçümlerden elde edilen absorbans değerini çıkarmak çok önemlidir.
T. cruzi trypomastigotes ve Toxoplasma gondii için bildirilen CPRG çözeltisinin konsantrasyonu 100 μM 10,15'tir. Bununla birlikte, epimastigotlar için bildirilen optimal konsantrasyon 200 μM11'dir. Bu Dm28c/pLacZ hattında, epimastigotlar, tripomastigotlar ve amastigotlar için güvenilir sonuçlar veren 200 μM CPRG çözeltisi kullanılmıştır. CPRG inkübasyon süreleri ile ilgili olarak, en iyi eğri uyumu, epimastigotlar 2 saat boyunca substrat çözeltisi ile inkübe edildiğinde elde edildi (R2 = 0.9995). Bununla birlikte, R 2 çok benzerdi (R2 = 0.9994) ve β-galaktosidaz aktivitesi, kuyu başına 6.250-200.000 epimastigot (yani, 62.500-2.000.000 epimastigot / mL) aralığında 4 saatte lineerdi (Ek Şekil S2). Tripomastigotlar 13 için kuyu başına 3.150-100.000 tripomastigot (yani, 31.500-1.000.000 tripomastigot / mL) doğrusal bir aralık bildirilmiştir. Büyük standart sapmaları gözlemlemekten kaçınmak için, her bir kuyucukta doğru miktarda parazit tohumlamak önemlidir. Hacimler küçük olduğundan, tohumlamadan önce parazitleri sayarken tutarlı olmak önemlidir. Ayrıca, gerekirse her deneysel koşul için üçten fazla replikasyon ölçülebilir.
Diğer kolorimetrik tarama tahlilleri22'den farklı olarak, burada sonraki manipülasyon adımları gerekli değildir, bu da tahlilin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini ve veri toplama hızını arttırır. Bu, ChD tedavisi için aday bileşiklerin yüksek verimli ilaç taraması için uygun, kolay, hızlı ve güvenilir bir tahlildir ve diğer T. cruzi suşlarına uygulanabilir. pLacZ plazmid, Bucker laboratuvarından talep üzerine temin edilebilir ve hattın farklı genetik arka planlardaki farklı ilaçlara duyarlılığını değerlendirmek için örneğin nakavt hatlarının dirençli suşlarını transfekte etmek için kullanılabilir. Akılda tutulması gereken tek kritik nokta, nakavt plazmidlerinin pLacZ'den farklı bir antibiyotik direnç belirtecine sahip olması gerektiğidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Dr. Buckner'a pLacZ plazmidini nazik bir şekilde sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Arjantin'den Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) ve Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] tarafından desteklenmiştir. Servier Medical Art, Şekil 1'i (https://smart.servier.com) üretmek için kullanılmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I.
- World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D.
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C.
- Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
