Summary
이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
세포 수축력 생성은 거의 모든 세포가 공유하는 근본적인 특성입니다. 이러한 수축력은 적절한 발달에 결정적이며, 세포 및 조직 수준에서 기능하며, 신체의 기계적 시스템을 조절합니다. 수많은 생물학적 과정은 운동성, 접착 및 단일 세포의 분열뿐만 아니라 심장, 방광, 폐, 장 및 자궁과 같은 기관의 수축 및 이완을 포함하여 힘에 의존합니다. 적절한 생리 기능을 유지하는 것이 중요하다는 점을 감안할 때, 세포 수축성은 과장되거나 중단 될 때 질병 과정을 유발할 수 있습니다. 천식, 고혈압, 조산, 섬유성 흉터 및 저활동 방광은 모두 세포 수축력의 적절한 조절로 잠재적으로 완화 될 수있는 기계적으로 구동되는 질병 과정의 예입니다. 여기에서는 형광 표지 엘라스토머 수축성 표면(FLECS)으로 알려진 새로운 마이크로플레이트 기반 수축성 분석 기술을 활용하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시하며, 이는 대규모로 확장된 방식으로 단일 세포 수축성에 대한 단순화되고 직관적인 분석을 제공합니다. 본원에서, 우리는 단지 하나의 FLECS 분석 마이크로플레이트를 이용하는 간단한 절차에서 일차 인간 방광 평활근 세포의 수축에 대한 두 개의 수축 억제제의 효과를 기술하는 두 개의 여섯 점 용량-반응 곡선을 얻기 위한 단계적 프로토콜을 제공하여, 상기 방법의 사용자에게 적절한 기술을 입증한다. FLECS 기술을 사용하여 기본 생물학적 실험실 및 형광 현미경 시스템을 갖춘 모든 연구자는이 근본적이지만 정량화하기 어려운 기능적 세포 표현형을 연구하여 힘 생물학 분야로의 진입 장벽을 효과적으로 낮추고 수축성 세포력의 표현형 스크리닝을 효과적으로 수행 할 수 있습니다.
Introduction
세포 생성 된 기계적 힘은 창자, 방광, 심장 및 기타와 같은 신체 전체의 다양한 기관에서 적절한 기능에 필수적입니다. 이러한 기관은 내부 항상성 상태를 유지하기 위해 세포 수축 및 이완의 안정적인 패턴을 생성해야합니다. 비정상적인 평활근 세포 (SMC) 수축은 예를 들어, 장 평활근 수축의 비정상적인 패턴을 특징으로하는 장 운동 장애1뿐만 아니라 과민성2 또는 저활동 방광3의 비뇨기과 상태를 포함한 다양한 장애의 발병으로 이어질 수 있습니다. 기도 내에서 불규칙한 수축 패턴을 보이는 SMC는 천식 과민 반응을 유발할 수 있으며4 잠재적으로 기도를 조이고 폐로 유입되는 산소의 공기 흐름을 감소시킬 수 있습니다. 또 다른 광범위한 신체 상태 인 고혈압은 혈관 내 평활근 수축의 변동으로 인해 발생합니다5. 분명히 세포와 조직 내의 수축 메커니즘은 치료 옵션이 필요한 질병으로 이어질 수 있습니다. 이러한 조건은 분명히 세포의 기능 장애 수축 행동에서 비롯되기 때문에 잠재적 인 약물 후보를 스크리닝 할 때 세포 수축 기능 자체를 측정하는 것이 논리적이고 필요하게됩니다.
세포 수축력을 연구하는 도구의 필요성을 인식하여 견인력 현미경 (TFM)6, 마이크로 패턴 TFM7, 플로팅 겔 분석8 및 엘라스토머 마이크로 포스트 분석9을 포함한 여러 정량적 수축 분석 방법이 학술 연구자에 의해 개발되었습니다. 이러한 기술은 수많은 연구에서 단일 접시 형식뿐만 아니라 다중 웰 플레이트 형식으로 활용되었으며 3 차원 힘 측정에도 제안되었습니다10,11,12,13,14. 이러한 기술은 광범위한 세포력 생물학 분야에서 선구적인 연구를 가능하게 했지만, TFM 기질을 제작할 수 있는 능력, TFM 변위 지도를 해결하기 위해 복잡하고 직관적이지 않은 알고리즘을 적절하게 적용할 수 있는 능력, 그리고 스테이지에서 샘플 제거 전후에 촬영한 이미지를 등록할 수 있는 비교적 정밀한 현미경 시스템(세포 해리용)과 같은 특정 기능과 자원을 보유한 실험실로 크게 제한되었습니다. 따라서, 훈련받지 않은 연구자의 경우, 이러한 기술을 적용하기위한 광범위한 요구 사항을 감안할 때 이러한 방법을 사용하는 진입 장벽이 상당히 높을 수 있습니다. 또한 많은 기존 기술(40배 이상의 목표)에 필요한 이미징 해상도는 실험 처리량을 크게 제한할 수 있는 반면, 대량 측정 기술은 이상치 세포의 기여도를 감추고 경미한 수축성 차이의 발견을 방지할 수 있습니다. 참고로, 저자가 알고있는 한, 낮은 처리량 및 반 정량적 부유 겔 분석 접근법 만이 연구자가 사용할 수있을 정도로 충분히 성숙했습니다 (그림 1 참조).
그림 1: FLECS Technology 방법의 전체 개략도 . (A) 세포는 유리에 의해 지지되는 얇은 엘라스토머 층에 공유적으로 매립되는 접착 단백질 마이크로패턴에 부착된다. (B) 다양한 가능한 마이크로패턴 형상의 탑뷰와 'X' 자형 마이크로패턴을 수축시키는 셀의 폭발. (C) 형광 마이크로패턴의 오버레이 및 수축 세포의 위상차 이미지. (D) 단일 계약 셀의 시간 코스 이미지. 스케일 바 = 25 μm. 이 수치는 Pushkarsky et al15의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
최근 마이크로기술의 발전에 따라, 저자들은 FLECS(형광으로 라벨링된 엘라스토머 수축성 표면)라고 불리는 수십만 개의 세포에서 단일 세포 수축을 정량적으로 측정할 수 있는 마이크로플레이트 기반 기술을 개발했다.15,16,17,18,19,20 TFM의 대안으로. 이 접근법에서, 형광 단백질 마이크로패턴은 세포가 직관적이고 측정 가능한 방식으로 그들에게 견인력을 가할 때 변형되고 수축되는 연질 필름에 내장된다. 중요하게도, 단백질 마이크로패턴은 세포 위치, 형상 및 확산 영역을 제한하여 균일한 시험 조건을 유도한다. 이를 통해 치수 변화만을 기반으로 간단한 측정이 가능하며, 이는 4x 배율 이미지에서도 공간적으로 고도로 분해됩니다. 이 방법에는 브라우저 기반 이미지 분석 모듈이 포함되어 있으며 섬세한 취급 절차나 신탁 마커 등록 없이도 수축성 세포력을 간단하게 분석할 수 있으므로 기본 세포 배양 시설과 낮은 배율의 간단한 형광 현미경을 갖춘 모든 연구자가 조작할 수 있어야 합니다(그림 2 ). 선반 준비 및 상용화 된이 기술은 최종 사용자를 염두에두고 설계되었으며 실험실 과학자가 세포 힘 생물학을 연구 할 수있는 진입 장벽을 줄이는 것을 목표로합니다.
도 2: 단일 세포 수축성 검정을 위한 24-웰 플레이트 포맷의 개략도. 이 포맷은 본원에 기술된 실험에 사용되었고, 기사의 비디오 부분에 묘사되었다. 배율 막대 = 25μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 연구에서는 일차 방광 평활근 세포의 세포 수축성에 대한 힘 조절 약물의 영향을 정량화하기 위해 FLECS Technology 플랫폼의 24 웰 플레이트 형식을 적용하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 범용 프로토콜은 다양한 다른 시간 척도, 세포 유형 및 관심있는 치료 조건을 설명하기 위해 필요에 따라 적응 및 수정 될 수 있으며 힘 생물학의 다른 질문에 대답하도록 확장 될 수 있습니다.
Protocol
1. 제1일: 24웰 플레이트의 제조
- 세포 배양 배지 20 mL를 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가하여 절차를 시작한다. 이 실험에서는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 F12 Ham의 기반 배지가 사용됩니다.
- 세포 수축성을 분석하도록 설계된 24웰 플레이트를 얻었다. 피펫을 500 μL로 설정하고 세포 패시징을 위한 세포 스트레이너를 얻었다.
참고 : 플레이트는 요청시 저자가 구할 수 있습니다. - 한 손으로 플레이트를 들어올려 잡고 플레이트 상단에서 플라스틱 필름을 부드럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 조심스럽게 플레이트를 다시 내려 놓으십시오.
- 진공 흡입기를 켜고 유출을 방지하기 위해 웰에서 인산염 완충 식염수 (PBS)의 최상층을 흡인하십시오. PBS를 한 번에 한 행씩 제거합니다. 웰이 더 이상 완전히 채워지지 않으면 한 손으로 플레이트를 잡고 조심스럽게 PBS의 나머지 부분을 웰에서 제거하십시오. 500 μL의 세포 배양 배지로 신속하게 채운다. 흡입기와 우물 바닥 사이의 접촉을 피하기 위해주의하십시오.
- 플레이트를 부드럽게 흔들고 측면을 탭하여 우물의 바닥 전체가 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 모든 웰이 매체로 채워지면 플레이트를 옆으로 두십시오.
2. 1 일째 : 세포 파종
- 배양 플라스크를 계대 7 이하인 일차 인간 방광 평활근(BSM) 세포와 함께 37°C 인큐베이터로부터 회수한다. 현미경으로 세포 형태를 확인하고 세포가 적어도 90 % 컨플루언시로 성장했지만 100 % 컨플루언시 미만으로 성장했는지 확인하십시오.
- 세포 해리 프로토콜을 수행하십시오. 멸균 생물안전 캐비닛 내에서 세포가 분리될 때까지 세포를 2.5분 동안 트립신화한 후 혈청이 보충된 배지(10% FBS)로 담금질합니다.
- 세포가 해리되면 혈구세포계를 사용하여 세포를 계수하고 세포 현탁액을 혈청이 보충 된 배지에서 약 50,000 cells / mL로 희석하십시오. 중요하게도, 세포는 마이크로패턴에 부착하기 위해 적어도 2% 혈청을 필요로 한다.
- 시딩하기 전에, 세포 현탁액을 40 또는 100 μm 세포 스트레이너를 통해 혈청학적 피펫이 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 넣어 신속하게 변형시켜 세포 덩어리를 단일 세포로 분해한다.
- P1000 피펫을 사용하여 플레이트의 24개 웰 각각에 500μL의 50,000 cells/mL 세포 현탁액을 조심스럽게 첨가하여 용액을 웰의 다른 위치에 적하하여 분배합니다.
- 세포 시딩 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 앉히면 증발에 의해 생성된 미세전류에 의해 영향을 받지 않고 세포가 마이크로패턴 상에 직접 침전되게 한다. 1시간 후, 플레이트를 37°C 인큐베이터에 밤새 놓는다. 세포는이 시간 동안 접착 미세 패턴에 걸쳐 자체 조립되고 확산되어 기저 수축 수준을 발휘하기 시작합니다.
3. 2 일째 : 시험약 첨가
참고: 부착된 세포를 포함하는 웰에서 디메틸설폭사이드(DMSO)의 최종 농도는 1%를 초과할 수 없으며 약물/DMSO는 세포에 직접 첨가할 수 없지만 먼저 희석하여 세포 배지의 중간 용액으로 혼합해야 합니다.
- 30 μL의 스톡 약물을 연속 210 μL 부피의 DMSO로 옮기고 각 전달 단계 사이에 완전히 혼합함으로써 여섯 단계, 여덟 배 약물 희석 시리즈를 생성한다. 이 작업에서, 블레비스타틴의 여섯 단계, 여덟 배 희석 계열은 DMSO에서 40 μM 내지 1 nM 범위의 용량으로 제조된다.
- 각 원약 용액 (단계 3.1로부터)에 대해 30 μL의 약물을 470 μL의 세포 배양 배지에 섞는다. 중간 용액은 DMSO의 16.7배 희석액을 산출한다.
- 각 중간 용액 200 μL를 24 웰 플레이트 상의 적절한 웰로 옮긴다(이는 이미 각 웰에 100 μL의 배지를 함유함). 이것은 DMSO의 추가적인 여섯 배 희석을 산출한다.
- 단계 3.2 및 3.3은 웰 내의 DMSO의 최종 농도 1%를 집합적으로 수득한다.
- 처리된 플레이트를 적절한 기간 동안 37°C 인큐베이터에 넣는다. 이 실험을 위해, 30분 인큐베이션이 사용된다.
- 이미징 직전에 Hoechst 33342 살아있는 핵 염색 용액을 각 웰에 첨가하십시오 (1:10,000 최종 희석). 세포 핵을 표지하기 위해 추가로 15분 동안 인큐베이션하도록 허용한다.
4. 2 일째 : 웰 플레이트 이미징
- 세포 핵 (DAPI)과 마이크로 패턴 (TRITC) 모두에 대한 채널을 이미지화하기 위해 장착 된 현미경에 액세스하십시오.
- 먼저 DMSO로만 셀을 이미지화합니다.
- 그런 다음 단일 세포를 식별하고 두 채널이 완벽하게 정렬되어 자동 이미지 분석이 가능하도록 미세 패턴과 표지 된 세포 핵에 초점을 맞추고 이미지화하십시오.
- 플레이트의 각 24개 웰의 여러 위치에서 반복합니다. 이미지들은 4x 목표물(또는 선택적으로 이미징을 가속화하고 이미지당 최대 데이터 포인트들을 획득하기 위해 더 높음)으로 촬영될 수 있다.
- 이미지를 TIF 파일로 내보내고 ImageJ가 있는 웹에 연결된 컴퓨터에서 열어 데이터를 분석합니다.
5. 실험 후 : 이미지 분석
참고: 이미지 분석은 포털 및 이미징 소프트웨어 Biodock.ai 사용하여 수행되었습니다.
- 획득한 이미지를 컴퓨터에 업로드합니다.
- 해당 쌍의 마이크로패턴과 핵 이미지의 이름이 올바르게 지정되었는지 확인하십시오.
- 마이크로 패턴 이미지 이름이 모두 "sharedCoreName_pt.tif" 형식을 사용하는지 확인합니다.
- 핵 이미지 이름이 모두 "sharedCoreName_dapi.tif" 형식을 사용하는지 확인합니다.
- ImageJ를 사용하여 TIF에서 PNG로 이미지를 변환합니다.
- ImageJ가 열리면 한 번에 하나의 채널에로드하십시오. 이 실험에서는 먼저 마이크로 패턴 이미지를 ImageJ에 스택으로 로드합니다.
- 이미지 > 사용하여 > 밝기/대비 조정, 이미지 밝기를 조정하여 마이크로 패턴을 강조하고 배경을 검은색으로 줄입니다. 이 외에도 이미지를 부드럽게하십시오.
- 이미지 > 8 비트> 유형 유형을 사용하여 이미지를 8비트로 변환합니다.
- 그런 다음 이미지를 PNG 유형으로 내보내고 상자 슬라이스 수준을 파일 이름으로 선택합니다. 이제 새 폴더 PNG를 만들고 같은 이름의 PNG 파일을 저장하십시오.
- 핵 이미지에 대해이 과정을 반복하십시오.
- 분석을 위해 PNG 이미지 쌍을 이미지 처리 소프트웨어에 업로드합니다.
- 계정을 만들고 유효성을 검사합니다. 저자는 학술 사용자에 대한 공개 액세스를 가능하게하는 계정을 가지고 있습니다.
- 작성자에게 연락하여 계정의 유효성을 검사합니다.
- 소프트웨어에 로그인합니다.
- 왼쪽의 데이터 탭에서 일괄 업로드 업로드를 클릭합니다.
- 이미지 쌍을 팝업 창으로 끌어다 놓아 이미지를 가져오고 배치의 이름을 지정합니다. 확인을 클릭합니다.
- 배치 이름 옆의 확인란을 선택하고 분석을 클릭합니다.
- 다음 화면에서 아래로 스크롤하여 수축성 분석 옆의 확인란을 선택하고 선택을 클릭합니다. 페이지 아래쪽에서 드롭다운 메뉴에서 이미징에 사용된 배율로 10x를 선택합니다.
- 제출을 클릭합니다. 데이터 분석이 완료됨으로 표시되면 배치 이름을 클릭합니다. 다음 화면에서 페이지 오른쪽에 있는 데이터 다운로드를 클릭합니다.
참고: 다운로드한 파일에는 분석된 이미지, 각 이미지의 평균 수축을 보고하는 요약 결과, 모든 이미지에서 감지된 모든 마이크로 패턴에 대한 자세한 분석, 크기, 위치, 부착된 셀 수 및 수축을 보고하는 내용이 포함됩니다. - 약물 농도에 대한 수축 값을 플롯하여 농도-반응 곡선을 생성하고 다른 치료의 상대적 효능을 결정합니다.
- 제출을 클릭합니다. 데이터 분석이 완료됨으로 표시되면 배치 이름을 클릭합니다. 다음 화면에서 페이지 오른쪽에 있는 데이터 다운로드를 클릭합니다.
Representative Results
DMSO로만 처리된 웰로부터 획득한 이미지 영역과 40 μM 블레비스타틴으로 처리된 이미지들의 영역이 도 3에 나란히 도시되어 있다. DMSO 전용 처리된 세포는 방광 평활근 세포(BSMCs)에 의해 부착되는 마이크로패턴의 매우 두드러진 변형에 기초하여 상당한 수준의 수축을 나타낸다는 것을 명확하게 관찰할 수 있다. 반대로, 40 μM 블레비스타틴으로 잘 처리된 이미지의 이미지에서, BSMCs에 의해 부착되는 마이크로패턴이 세포에 의해 부착되지 않은 마이크로패턴과 크기가 거의 구별되지 않기 때문에7 유의한 세포 이완이 관찰되고7 , 이는 최소한의 수축을 나타낸다. 이들 이미지는 형광 마이크로패터닝 방법에 의해 제공되는 단일 세포 수축성의 직관적이고 명확한 시각적 표현을 보여준다. 조밀한 세포 단층 아래에 무작위로 분포된 수많은 형광 입자의 전방향 이동이 상대적 수축력을 전달하기 위한 TFM 기반 방법과는 달리, 여기서 마이크로패턴의 균일하고 현저한 수축된 기하학은 개별 세포의 수축에 대한 즉각적이고 쉽게 해석할 수 있는 질적 정보를 제공한다. 이는 이미지에 표준 이진 개체 연산을 적용하여 직접 정량화할 수 있습니다.
그림 3: 1% DMSO 처리만 함유한 웰(왼쪽) 또는 40μM의 블레비스타틴을 함유하는 웰(오른쪽)에서 촬영한 이미지를 나란히 비교한 결과입니다. 블레비스타틴을 사용한 처리는 더 크고 수축되지 않은 마이크로패턴에 의해 지시되는 바와 같이 단일 세포의 수축성을 상당히 감소시킨다는 것을 명확하게 관찰할 수 있다. 청색 핵은 어떤 미세패턴이 세포에 의해 결합되는지를 나타낸다. 배율 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
브라우저 기반 분석 모듈을 적용하여 마이크로패턴과 세포핵의 획득된 이미지 쌍을 분석함으로써, 도 4에 도시된 바와 같이 각 집단에 대한 단일 세포 수축성 분포가 얻어진다. FLECS 방법론15에 대한 선행 보고서에서 자세히 설명하면, 분석은 각 "X" 형상 마이크로패턴의 위치와 방향을 찾고, 각 마이크로패턴의 중심에 직접 부착된 핵의 수를 계산하고, 각 마이크로패턴의 평균 길이를 계산하고, 빈 마이크로패턴의 평균 길이에 대하여 각 마이크로패턴의 수축의 픽셀 거리를 계산함으로써 작동한다(제로 수축 참조). 따라서, 빈 마이크로패턴은 수축 데이터를 정규화하기 위한 중요한 목적을 제공한다. 중요하게도, 마이크로패턴에 결합하지 않는 세포는 이미지 분석에 영향을 미치지 않는 미세전류로 인해 우물 경계에 축적될 것이다. 이 플롯에서 볼 수 있듯이, DMSO 대조군으로만 처리된 세포 집단의 교란되지 않은 수축성은 20픽셀만큼 높은 범위에 걸쳐 있으며, 중심은 약 10픽셀에서 발견된다. 한편, 블레비스타틴으로 처리된 세포는 상당히 적게 수축하고 그들의 분포는 단지 6 픽셀이 넘는 중심까지 밀려난다. 중요하게도, 이미지에 발견된 모든 단일 마이크로패턴이 셀에 정확하게 결합한다는 것은 이러한 분포에서 표현된다는 것이다. 이것은 약물 치료에 대한 차별적 인 세포 반응을 전달하는 방법의 능력을 보여줍니다.
도 4: 1% DMSO만(파란색) 또는 40μM 블레비스타틴을 함유하는 웰에서 촬영한 이미지의 분석으로부터 얻어진 단일 세포 수축성 데이터를 묘사하는 히스토그램. DMSO 처리된 세포의 분포는 광범위하고 블레비스타틴 처리 분포보다 훨씬 더 큰 수축 값(~10 픽셀)으로 중심을 이루며, 블레비스타틴으로 세포를 처리하는 정량적 효과를 입증한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단일 24-웰 플레이트 상의 모든 웰을 활용하고 웰당 적어도 3개의 부위를 이미징함으로써, 두 개의 약물 화합물에 대해 6-포인트 용량-반응 곡선이 동시에 생성된다. 도 5는 동일한 범위의 투여량인 블레비스타틴 또는 시토칼라신 D(둘 다 공지된 수축성 억제제)로 처리된 BSMCs에 대한 농도-반응 데이터를 도시한다. 농도-반응 프로파일로부터 명백한 바와 같이, 시토칼라신 D는 이들 세포에서 강장 수축의 보다 강력한 억제제이다. 시그모이드 곡선을 데이터 포인트에 피팅함으로써 각 약물에 대해 IC50 값을 계산할 수 있습니다. 우리의 실험은 IC50이 약물에 대한 노출의 ~ 30 분 후에 블레비스타틴 및 시토칼라신 D에 대해 각각 7.9 μM 및 100 nM임을 나타냅니다. 중요하게도, 전반적으로, 이들 값은 이전 보고서와 일치하며, 수축 억제제7,21의 효능을 결정하는 방법의 정량적 정확성을 검증한다.
도 5: 단일 세포에서 세포 수축성에 대한 블레비스타틴 및 시토칼라신 D의 효과를 묘사하는 농도-반응 곡선. 각 데이터 요소는 해당 조건에 대한 세 개의 이미지로 구성됩니다. 시그모이드 곡선을 각 데이터 세트에 적합시켰다. 결과는 시토칼라신 D가 더 강력하고, 더 낮은 IC50 값을 갖는다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 단일 24웰 FLECS 플레이트에서 수집할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
다양한 처리 조건 하에서 한 번에 수십만 개의 세포에서 수축을 정량적으로 측정하고 표준 현미경 기기 만 사용하는이 단순화 된 방법은 연구자가 세포 힘 생물학을 연구 할 수있는 전통적인 TFM에 대한 접근 가능한 대안을 제공합니다. 제시된 기술은 규칙적으로 형상화된 형광 마이크로패턴의 변화를 분석함으로써 세포 수축의 시각적 표시를 제공하기 때문에, 임의의 주어진 세포에 의해 생성된 수축의 크기는 직관적으로 이해된다 - 마이크로패턴이 작을수록, 세포에 의해 가해지는 수축력이 클수록.
특히, 마이크로패턴(세포 수축성을 조절하는 것으로 알려진 모든 인자22,23,24)을 포함하는 형태, 확산 면적 및 부착 분자와 같은 인자들에 대한 제어를 제공함으로써, 제시된 기술은 세포 수축 연구의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 추가적인 변수들을 체계적으로 제거한다.
이 실험에서는 10 kPa 강성을 겔에 사용하고 70 μm (대각선 길이) 마이크로 패턴을 사용하여 IV 형 콜라겐으로 구성했습니다. 이들 파라미터 외에, 접착 분자는 다양한 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴 및 다른 세포외 매트릭스 (ECM)로 대체될 수 있다. 젤의 강성은 0.1kPa까지 그리고 MPa 범위까지 조정할 수 있습니다. 마이크로 패턴 지오메트리는 ~ 5 μm의 최소 피쳐 크기로 모든 형상으로 de novo를 설계 할 수 있습니다. 이들 파라미터는 분리되고, 특정 생물학적 맥락에 대해 독립적으로 최적화될 수 있다.
이 기술은 다양한 평활근 세포 유형 (일차 인간 방광, 장, 기관지, 기관지, 자궁, 대동맥 및 동맥), 중간엽 줄기 세포 및 그 분화 된 자손, 다양한 섬유 아세포 (폐, 진피 및 심장), 근섬유아세포 및 내피 세포를 포함한 중간엽 표현형의 고접착성 및 수축성 세포 유형과 호환되도록 광범위하게 입증되었습니다. 또한, 단핵구 유래 대식세포는 또한 마이크로패턴, 특히 마이크로패턴이 공지된 옵소닌으로 구성되는 경우 마이크로패턴에 대해 큰 측정가능한 식작용을 생성할 것이다. 다양한 암 라인이 또한 상기 방법을 사용하여 검정될 수 있다.
이 방법은 T 세포 및 호중구와 같이 상대적으로 작은 세포 또는 주로 상피 표현형을 갖는 세포 유형과 함께 사용하기 위해 몇 가지 도전을 제기 할 수 있습니다. 이것의 주된 이유는이 방법이 측정 가능한 수축 신호를 생성하기 위해 마이크로 패턴을 통한 세포의 강한 접착력과 완전한 확산에 의존하기 때문입니다. 약하게 결합하거나, 서로 결합하거나, 완전히 퍼지지 않는 세포는 측정 가능한 수축 신호를 생성하지 않습니다. 비교적 드문 이러한 거동은 마이크로패턴 크기를 더 작게 조정하거나, 마이크로패턴 내에서 대체 접착 분자를 사용하여 이들 세포에서의 부착 및 확산을 더 잘 촉진함으로써 완화될 수 있다.
이 기술의 사용자는 상이한 성분, 성장 인자, 혈청 수준 및 pH 민감성이 상이한 세포에서 가변 거동을 유도할 수 있기 때문에, 관심있는 그들의 특정 세포 유형에 대해 상이한 가능한 세포 배양 배지 제형을 신중하게 평가해야 한다. 프로토콜의 최적화는 실험 워크플로의 크기 조정보다 선행되어야 하며, 미디어 구성 요소는 항상 신선하고 멸균되며 이전 배치와 일치해야 합니다.
궁극적으로, 단일 세포 분해능이 사용자의 목표에 필요하지 않거나 표적 세포 유형이 최소한의 확산 용량을 갖는 경우, 전통적인 TFM은 그러한 실험에 동등하거나 더 적합할 수 있다. 저자의 목표와 희망은이 도구가 세포 생물 학자들이 특히 자동화 된 고 처리량 표현형 약물 스크린의 맥락에서 세포 수축을 연구 할 수있는 추가 방법을 제공한다는 것입니다.
약물 스크린에서의 장래의 용도에 특정하여, 384-웰 FLECS 플레이트와 같은 더 높은 처리량 플레이트가 사용될 수 있다. 이러한 플레이트에서 많은 현미경의 4x 목표는 시야에서 단일 우물 전체를 포착하여 모든 세포 수축 반응을 포착 할 수 있습니다. 고처리량 이미징 시스템을 사용하면 약 5분 내에 전체 384웰 플레이트를 이미징할 수 있으므로 이 시스템은 다른 옵션보다 훨씬 빨라지므로 고처리량 표현형 약물 발견에 적합합니다. 실제로 저자는 자동화를 사용하여 ~ 50 개의 384 웰 플레이트 (총 19,000 웰 이상)에서 매주 약물 검사를 정기적으로 운영합니다.
Disclosures
I.P.는 FLECS 기술의 방법과 시스템을 보호하는 특허 계열의 발명가입니다. I.P., Y.W., J.Z., E..C 및 R.H.는 모두 Forcyte Biotechnologies, Inc.의 직원입니다. R.D.는 UCLA의 교수이며 Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z.의 공동 설립자이며 R.D.는 상기 특허의 독점 라이센스 사용자이며 FLECS Technology를 상용화하고 있는 Forcyte Biotechnologies, Inc.에 재정적 이익을 보유하고 있습니다.
Acknowledgments
실험실 작업은 Forcyte가 연구 활동을 후원하는 UCLA 분자 공유 스크리닝 리소스 (MSSR)와 Forcyte Biotechnologies, Inc.가 상주 회사 인 California NanoSystems Institute (CNSI)의 Magnify Incubator의 지원으로 수행되었습니다. 저자는 요청시 모든 학술 연구원에게 Biodock.ai FLECS 분석 모듈에 대한 액세스 권한을 부여합니다. L.H.와 I.P.는이 일에 똑같이 기여했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
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