Summary
このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。
Abstract
ヒストンタンパク質はDNAと会合して真核生物のクロマチンを形成します。クロマチンの基本単位はヌクレオソームであり、コアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の2つのコピーからなるヒストン八量体で構成され、DNAに包まれています。八量体は、H2A/H2B二量体の2コピーとH3/H4四量体の1コピーからなる。高荷電コアヒストンは、細胞質および核内のいくつかのタンパク質と非特異的相互作用を起こしやすい。ヒストンシャペロンは、ヒストンを細胞質から核にシャトルし、DNAへの沈着を助け、ヌクレオソームの組み立てプロセスを支援する多様なクラスのタンパク質を形成します。一部のヒストンシャペロンは、H2A / H2BまたはH3 / H4のいずれかに特異的であり、一部は両方のシャペロンとして機能します。このプロトコルでは、プルダウンアッセイ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、ヒストンシャペロンアッセイなどの in vitro ラボ技術を組み合わせて使用して、特定のタンパク質がヒストンシャペロンとして機能するかどうかを確認する方法について説明します。
Introduction
DNAとヒストンタンパク質からなるヌクレオソームは、クロマチンの構造単位を形成し、いくつかの重要な細胞イベントを調節します。ヌクレオソームは動的に再配置および再構築され、複製、転写、翻訳などのさまざまなプロセスからDNAにアクセスできるようにします1,2。塩基性の高いヒストンは、細胞環境中の酸性タンパク質と相互作用するか、または凝集を受ける傾向があり、したがって様々な細胞欠陥をもたらす3,4,5。ヒストンシャペロンと呼ばれる専用タンパク質のグループは、細胞質から核へのヒストンの輸送を助け、異常なヒストン-DNA凝集イベントを防ぎます6,7。基本的に、ほとんどのヒストンシャペロンは、生理的イオン強度でヒストンをDNA上に貯蔵および伝達し、それによってヌクレオソームの形成を助けます8,9。一部のヒストンシャペロンは、ヒストンオリゴマーH2A / H2BまたはH3 / H410に対して明確な好みを持っています。
ヒストンシャペロンは、DNA合成に依存しない、または独立にヌクレオソームを組み立てる能力に基づいて特徴付けられる11。例えば、クロマチン集合因子-1(CAF-1)は依存的であるが、ヒストン調節因子A(HIRA)はDNA合成に依存しない12,13。同様に、ヒストンシャペロンのヌクレオプラスミンファミリーは、精子クロマチン脱凝縮およびヌクレオソーム集合に関与している14。ヌクレオソーム集合タンパク質(NAP)ファミリーのメンバーは、in vitroでのヌクレオソーム様構造の形成を促進し、細胞質と核の間のヒストンの往復に関与しています15。ヌクレオプラスミンとNAPファミリータンパク質はどちらも機能的なヒストンシャペロンですが、構造的特徴を共有していません。本質的に、単一の構造的特徴は、タンパク質をヒストンシャペロンとして分類することを可能にしない16。機能的および生物物理学的アッセイの使用と構造研究は、ヒストンシャペロンの特性評価に最適です。
この研究では、タンパク質をヌクレオソームの組み立てを助けるヒストンシャペロンとして特徴付けるための生化学的および生物物理学的方法について説明しています。まず、ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を分析するために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを実施しました。次に、プルダウンアッセイを実施して、ヒストンシャペロン-ヒストン相互作用の駆動力と競合性を決定しました。しかし、これらの相互作用の流体力学的パラメータは、カラム内の移動に影響を与えるタンパク質の形状とその複合体のために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して正確に計算することができませんでした。したがって、正確な分子量、相互作用の化学量論、および生体分子の形状を含む溶液中の高分子特性を提供する分析超遠心分離が使用されました。過去の研究では、yScS11617、DmACF 18、ScRTT106p19、HsNPM120などのヒストンシャペロンを機能的に特徴付けるために、in vitroヒストンシャペロンアッセイが広く使用されています。ヒストンシャペロンアッセイは、タンパク質をヒストンシャペロンとして機能的に特徴付けるためにも使用されました。
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Protocol
1. ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を解明するための分析サイズ排除クロマトグラフィー
- ヒストンシャペロンのオリゴマー状態の解析
- 24 mL 分析サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) カラムを 1.2 カラム容量 (CV)、すなわち 28.8 mL の脱気 SEC バッファー [20 mM の Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 1 mM の β-メルカプトエタノール (β-ME)] で 4 °C で平衡化します (材料の表を参照)。
注:カラムタイプ、バッファー組成、およびバッファーpHは、目的のタンパク質に基づいて選択できます。サンプル注入量は、24 mL カラムで 500 μL を超えてはなりません。また、カラム圧力は5MPa未満に維持する必要があります。 - 高濃度のタンパク質ストック溶液から、脱気したSECバッファー中の0.5 mg/mLタンパク質サンプル500 μLを調製し、500 μLのインジェクションループを使用して事前平衡化カラムに注入します。クロマトグラフィーの実行を、4°CのSECバッファーを使用して0.2〜0.3 mL/minのアイソクラティック流速で進行させます。
- 波長280 nmの吸光度を測定することにより、タンパク質の溶出プロファイルを監視します。芳香族残基を欠くタンパク質を扱う場合は、214 nmの吸光度を測定します。
- タンパク質の溶出量を用いて、標準検量線21を用いてそのおおよその分子量をkDaで算出する。
注:検量線は、分子量既知のタンパク質の保持量をそれらのそれぞれの分子量の対数(log Mr)に対してプロットし、同じカラムを用いて溶出することにより作成される。
- 24 mL 分析サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) カラムを 1.2 カラム容量 (CV)、すなわち 28.8 mL の脱気 SEC バッファー [20 mM の Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 1 mM の β-メルカプトエタノール (β-ME)] で 4 °C で平衡化します (材料の表を参照)。
- ヒストンシャペロンの熱安定性の解析
- 脱気したSECバッファー(1.1.1で使用したものと同じ)で調製した0.5 mg/mLのタンパク質サンプルを個々のマイクロ遠心チューブに500 μL取り、各チューブを20°Cから90°Cの範囲の特定の温度(20°C、40°C、60°C、および90°C)に水浴中で10分間加熱します。
- 続いて、熱処理したサンプルを16,200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を回収し、500 μLの注入ループを使用して各サンプルを個別に分析カラムに注入し、4°CのSECバッファーで事前平衡化しました。
- クロマトグラフィーの実行を、4°CのSECバッファーを使用して0.2〜0.3 mL/minのアイソクラティック流速で進行させます。
- 溶出ピークの位置と高さを観察し、さまざまなサンプルの追加ピークの外観を探します。
- ヒストンシャペロンの化学的安定性の解析
- ヒストンシャペロンの塩安定性を調べるには、トリスバッファー[20 mMのTris-HCl(pH 7.5)、および1 mMのβ-ME]で調製した0.5 mg/mLタンパク質サンプル500 μLを、NaCl(300 mM、600 mM、1 M、1.5 M、および2 M)を別々の微量遠心チューブで4°Cで30分間インキュベートします。 サンプルを16,200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を保持します。
- 次に、4°Cで増加するNaCl濃度を含む各バッファーの1.2 CV(28.8 mL)で事前に平衡化された分析カラムに500 μLの注入ループを使用して、異なるNaCl濃度のタンパク質サンプルを個別にロードします。
- クロマトグラフィーの実行を、4°Cで1 CV(24 mL)の各バッファーを使用して、0.2〜0.3 mL/minのアイソクラティック流速で進行させます。
- 溶出ピークの位置と高さを観察し、さまざまなサンプルの追加ピークの外観を探します。
- 同様に、尿素安定性分析では、トリスバッファー[20 mMのTris-HCl(pH 7.5)、および1 mMのβ-ME]で調製した500 μLの0.5 mg/mLタンパク質サンプルを、尿素濃度の増加(1 M、2 M、3 M、4 M、および5 M)で別々のマイクロ遠心チューブで室温で16時間インキュベートします。サンプルを室温で16,200 x g で10分間遠心分離し、上清を保持します。
- 次に、室温で異なる尿素濃度を含む対応するバッファーの1.2 CV(28.8 mL)で事前に平衡化された分析カラムに、500 μLの注入ループを使用して尿素処理タンパク質サンプルを個別にロードします。
- クロマトグラフィーの実行を、室温で各バッファー1 CV(24 mL)を使用して、0.2〜0.3 mL / minのアイソクラティック流速で進行させます。
注意: 尿素は結晶化してカラムを損傷する傾向があるため、尿素を含むバッファーを低温で使用して実験を行わないでください。 - 溶出ピークの位置と高さを観察し、さまざまなサンプルの追加ピークの外観を探します。
2. ヒストンオリゴマーとヒストンシャペロンの複合体形成に寄与する相互作用の種類を理解するための塩勾配ベースのプルダウンアッセイ
- プルダウンアッセイの各反応について、40 μLのNi-NTA樹脂をスピンカラムにピペットし、滅菌二重蒸留水で洗浄します。続いて、100 CV(4 mL)の平衡化バッファー[20 mMのトリス塩酸塩(pH 7.5)、300 mMのNaCl、10 mMのイミダゾール、10 μg/mLのBSA、および1 mMのβ-ME]で樹脂を平衡化します(材料の表を参照)。
注:プルダウンは、1.5 mLの微量遠心チューブでも実行できます。 - 5 μMのHisタグ付きヒストンシャペロンを、平衡化バッファー中で20 μMのヒストンH2A/H2B二量体またはH3/H4テトラマーと混合してサンプルを調製します。サンプルを氷上で1時間インキュベートします。
注:H2A/H2BダイマーおよびH3/H4四量体は組換えヒトヒストン21から調製され、分析超遠心(AUC)による推定分子量に基づいてオリゴマーの完全性が確認されます。同じヒストンオリゴマーが、以下に述べる全ての実験に使用されている。 - ステップ2.1のNi-NTA樹脂で事前に平衡化した個別のスピンカラムにサンプルをロードし、それぞれに特定の塩濃度で標識し、カラムを4°Cで30分間保持します。 カラムを1000 x g で1分間遠心分離します。
- 次に、異なる塩濃度(300 mM、500 mM、600 mM、700 mM、800 mM、900 mM、1 M NaCl)を含む100 CV(4 mL)の洗浄バッファー[20 mMのトリス塩酸塩(pH 7.5)、50 mM、Tween-20の0.2%、および1 mMのβ-ME]でカラムを洗浄します。各カラムを特定の塩濃度の緩衝液で洗浄する。
- 塩洗浄ステップの後、100 μLの溶出バッファー[20 mMのTris-HCl(pH 7.5)、300 mMのNaCl、300 mMのイミダゾール、および1 mMのβ-ME]を使用して、異なるカラムからタンパク質を溶出します。
- 続いて、溶出したサンプルを18%SDS-PAGE22 に供し、クマシーブリリアントブルーR250で染色した後のゲルを可視化します( 材料の表を参照)。あるいは、Ni-NTA樹脂から結合タンパク質を溶出する代わりに、樹脂をSDS-PAGEゲルに直接ロードすることもできます。
注:平衡化、洗浄、および溶出バッファー組成物およびpHは、目的のタンパク質に応じて変更され得る。
3. H2A/H2BまたはH3/H4に対するヒストンシャペロンの選好性を特定するための競合プルダウンアッセイ
- 手順 2.1 の説明に従ってスピンカラムを準備します。
- 5 μMのヒストンシャペロンを20 μMのH2A/H2Bダイマーと300 μLの平衡化バッファー(ステップ2.1で調製)中で氷上で30分間インキュベートします。
注:反応中のヒストンオリゴマーとヒストンシャペロンの比率は、既知の結合化学量論データに基づいて選択できます。情報が入手できない場合は、5倍の過剰なヒストンを使用してください。 - ヒストンシャペロン-H2A/H2B複合体を16,200 x g で4°Cで5分間遠心分離し、沈殿物を除去します。次に、平衡化バッファー(ステップ2.1で調製)で予め平衡化したスピンカラムにサンプルをロードし、4°Cで30分間インキュベートします。
- 100 CV(4 mL)の洗浄バッファー[20 mMのトリス塩酸塩(pH 7.5)、300 mMのNaCl、50 mMのイミダゾール、0.2%のTween-20、および1 mMのβ-ME]でカラムを洗浄し、余分なH2A/H2B二量体を除去します。次に、ヒストンシャペロン-H2A/H2B複合体を20-60 μMのH3/H4四量体と混合し、氷上で30分間インキュベートします。
- カラムを100 CV(4 mL)の洗浄バッファー(ステップ3.4で調製)で再洗浄して、結合していないH3/H4四量体を除去し、溶出バッファー(ステップ2.5で調製)を使用してサンプルを溶出します。溶出したサンプルを18%SDS-PAGEに供し、クーマシーブリリアントブルーR250で染色した後に視覚化します。
注:アッセイを逆にして、最初にH3 / H4四量体をシャペロンと混合し、複合体をNi-NTAビーズに結合させ、次に複合体をさまざまな濃度のH2A / H2B二量体とインキュベートすることができます。
4. ヒストンシャペロンとヒストンの結合化学量論を解析するための分析的超遠心-沈降速度(AUC-SV)実験
- AUCのサンプル調製
- 再構成されたヒストンH2A/H2B二量体、H3/H4四量体、およびヒストンシャペロンを別々に、7 kDaカットオフ透析チューブ23を介して、透析バッファー[20 mMのトリス(pH 7.5)、300 mMのNaCl、および1 mMのβ-ME]に対して透析します( 材料の表を参照)。バッファーの不一致によるバックグラウンドエラーを最小限に抑えるために、透析バッファーに対して広範囲に透析を、好ましくは24時間かけて3回行います。
注:タンパク質サンプルの初期OD 280は、0.3〜0.5の最終OD280を達成するために、2〜3倍高い値を持つ必要があります。これは本質的に希釈の効果を無効にするために行われます。 - 分析サイズ排除クロマトグラフィー(ステップ1で説明)を使用して、H2A/H2B二量体、H3/H4四量体、およびヒストンシャペロンを透析バッファーで個別に精製します。ランのバッファーを保存して、後でさらに希釈を準備し、AUC セルで参照として使用します。
- 再構成されたヒストンH2A/H2B二量体、H3/H4四量体、およびヒストンシャペロンを別々に、7 kDaカットオフ透析チューブ23を介して、透析バッファー[20 mMのトリス(pH 7.5)、300 mMのNaCl、および1 mMのβ-ME]に対して透析します( 材料の表を参照)。バッファーの不一致によるバックグラウンドエラーを最小限に抑えるために、透析バッファーに対して広範囲に透析を、好ましくは24時間かけて3回行います。
- AUC のサンプルローディング
- ステップ4.1.1の透析バッファーを使用して精製タンパク質を最終容量450 μLで混合し、0.3〜0.6のOD280 に到達します。ヒストンシャペロンをH2A/H2B二量体またはH3/H4四量体と混合して、別々の反応管で複合体を形成します。タンパク質混合物を2〜3時間インキュベートします。
注:あるいは、沈降データは、分析用超遠心分離機の干渉光学スキャンシステムを使用して取得できます。別に、精製タンパク質を混合するために、ヒストンシャペロン濃度を固定し、ヒストンオリゴマーの濃度を上げてインキュベートして、正確な化学量論を取得します。 - 前述したように、分析用超遠心分離機の吸光度検出器を使用したAUC-SV実験用の二重セクターセンターピースと石英窓でセルを組み立てます24。
- 400 μLのサンプル溶液と420 μLの透析バッファーをセルの2つのセクター(それぞれサンプルセクターとリファレンスセクター)に充填します。
注:参照セクタでは、参照メニスカスをサンプルのメニスカスより上に維持するために、大量のバッファーが使用されます。ただし、光干渉システムを使用している間は、2つのセクターを同じ体積で埋めます。 - セルの重量を量り、正確にバランスを取り、4か所のチタンローターにロードします( 材料表を参照)。セルとローターの下部にあるマークを使用してセルの位置を合わせます。ローターを遠心分離機に入れ、蓋を閉めて、圧力が15ミクロン未満のHgに低下し、ローターの温度が20°Cに安定するまで真空を発生させます(通常2〜2.5時間かかります)。
注意: AUCの動作パラメータには、実験温度、ローター速度、スキャンの間隔、および収集するスキャンの数が含まれます。SV実験の場合、スキャン間隔はタンパク質の分子量に応じて与えられます。タンパク質が小さいほど、スキャン間の時間間隔が長くなります。ローター速度もタンパク質の予想される分子量に応じて設定され、実験は20°Cで行われます。 吸光度データは280 nmでモニターされます。 - 正確な化学量論を得るには、ヒストンシャペロン濃度を一定に保ち、ヒストンオリゴマーの濃度を上げてインキュベートして飽和させます。
- ステップ4.1.1の透析バッファーを使用して精製タンパク質を最終容量450 μLで混合し、0.3〜0.6のOD280 に到達します。ヒストンシャペロンをH2A/H2B二量体またはH3/H4四量体と混合して、別々の反応管で複合体を形成します。タンパク質混合物を2〜3時間インキュベートします。
- AUCデータ分析
- 前述のようにデータ解析を行う25。簡単に言うと、プログラムSEDNTERP26 を使用してバッファー成分の密度と粘度を計算します( 材料表を参照)。同様に、同じくSEDNTERPを用いて、そのアミノ酸組成に基づいてタンパク質の部分比容積を計算する。
- AUC マシンからプログラム SEDFIT27 にデータをロードし、メニスカス (赤い線)、セルの下部 (青い線)、およびデータ分析の境界 (緑の線) を定義します。モデルとして連続C(秒)分布を選択します。
- 次に、最大解像度を100に設定します。沈降係数(s)、最小:0、最大:10-15を設定します。最初に摩擦比を1.2に設定し、データから比を導き出すために浮動小数点を選択します。信頼水準(F比;正則化の大きさを決定する)を1シグマ正則化の0.68に設定します。SEDNTERPから取得した部分比容量、バッファー密度、およびバッファー粘度の値を設定します。
- RUNを押して、ソフトウェアがラム方程式27を解くようにします。重大なデータの不一致がある場合は、パラメーターを調整します。パラメータを調整した後、FITを押してすべてのパラメータを絞り込みます。0.01信号単位未満である必要がある二乗平均平方根偏差(RMSD)値に基づいて適合品質を評価します。
- オプションを選択してピークの分子量を推定します:メインツールバーの表示機能にピーク「Mw in c(s)」を表示し、分子/複合体の「s」に関する情報を提供します。
5. ヒストンシャペロン機能を確認するためのプラスミドスーパーコイルアッセイ
- ヌクレオソーム集合反応
- 2 μMのH3/H4四量体と4 μMのH2A/H2B二量体を、アセンブリバッファー[20 mMのトリス塩酸塩(pH 7.5)、1 mMのDTT、1 mMのMgCl2、0.1 mg/mLのBSA、および100 mMのNaCl]でヒストンシャペロンの濃度を上げて混合し、最終容量50 μLにします。 混合物を4°Cで30分間インキュベートします。
- 同時に、別の反応で、負にスーパーコイルされたpUC19プラスミド500 ngを1 μgのトポイソメラーゼI酵素( 材料表を参照)で最終容量50 μLのアセンブリバッファーで前処理し、30°Cで30分間インキュベートします。
注:トポイソメラーゼIは、一本鎖ニックを生成することにより、スーパーコイル二本鎖プラスミドDNAを緩和します。市販の小麦胚芽トポイソメラーゼIまたは組換え発現ショウ ジョウバエメラノガスター トポイソメラーゼIなどの真核生物起源のトポイソメラーゼI酵素を使用することができる。 - 次に、H3/H4四量体、H2A/H2B二量体、ヒストンシャペロン混合物(ステップ5.1.1から)、弛緩プラスミドDNA反応混合物(ステップ5.1.2から)を組み合わせ、さらに30°Cで90分間インキュベートします。
注:アッセイ用に2つの制御反応を設定します。1つはヒストンシャペロンと緩和プラスミドDNA(ヒストンではない)を持ち、もう1つはヒストンオリゴマーとリラックスプラスミドDNA(ヒストンシャペロンではない)を持っています。 - 100 μLの2xストップバッファー(40 mMのEDTA、2%のSDS、および0.4 mg/mLのプロテイナーゼK)を加えてアセンブリ反応を停止し、37°Cで30分間インキュベートします。
注:ストップバッファーは、結合したヒストンの変性とタンパク質分解によりプラスミドDNAを脱タンパクします。
- フェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿
- ステップ5.1.4の反応混合物を含むチューブに等量のトリス飽和フェノールを加えてよく混合した後、室温で16,200 x g で10分間遠心分離します。
- プラスミドDNAを有する上水相をマイクロピペットで穏やかに回収し、等量のクロロホルムと混合する。混合物をボルテックスし、室温で16,200 x g で10分間遠心分離します。
注:イソアミルアルコールをこのステップに含めることで、水相と有機相の間の界面がファジーになるのを防ぐことができます。 - 次に、上部水相を収集し、1/10容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.5)と2.5容量の氷冷エタノールを加え ます(材料の表を参照)。チューブを3〜4回反転させて溶液をよく混合し、プラスミドDNAを完全に沈殿させるために混合物を-20°Cの冷凍庫に30分間保持します。
- ステップ5.2.3のサンプルを16200 x g で10分間遠心分離し、上清を静かに廃棄します。微量のエタノールが蒸発するまでチューブを開いたままにし、沈殿したプラスミドDNAをチューブ内に残します。
- アガロースゲル電気泳動を行い、プラスミドのスーパーコイル効果を観察した。
- ステップ5.2.4で沈殿したプラスミドDNAを滅菌二重蒸留水に溶解します。
- 1 x トリス酢酸 EDTA (TAE) バッファー (40 mM のトリス、20 mM の酢酸、および 1 mM の EDTA) 中の 1% アガロースゲル上のサンプルを分離します (材料の表を参照)。
- 0.2〜0.5 μg/mL濃度の臭化エチジウムでゲルを染色し、UV下で観察してゲル上のDNAバンドを可視化します。
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Representative Results
シロイヌナズナ由来のタンパク質FKBP53の組換えN末端ヌクレオプラスミンドメインをSECの分析に供した。溶出ピーク体積を標準曲線に対してプロットし、そのオリゴマー状態を同定した。SECの分析結果から、ドメインは溶液中に五量体として存在し、分子量は約58 kDaであることが明らかになりました(図1A、B)。さらに、ヌクレオプラスミンドメインを分析SECと併せて熱的および化学的安定性について分析した。90°Cまでの熱処理を行ったヌクレオプラスミン試料は、20°Cに維持した試料と比較して溶出量とピーク高さに明らかな変化を示さず、ドメインが耐熱性が高いことが示唆されました(図1C)。同様に、ヌクレオプラスミンドメインは、最大2 MのNaClの塩安定性(図1D)および最大4 Mの尿素安定性(図1E)を示しました。しかし、ヌクレオプラスミン五量体は、より高い尿素濃度で解離し始めました。
ヒストンシャペロン(AtFKBP53のヌクレオプラスミンドメイン)とヒストンオリゴマーH2A/H2B二量体およびH3/H4四量体との間の複合体形成に寄与する相互作用の種類を決定するために、グラジエントソルトウォッシュを使用してプルダウンアッセイを実施しました。ヌクレオプラスミンドメインとH2A/H2B二量体の相互作用は、塩濃度0.4 M NaClまで安定していました(図2A)。比較すると、H3/H4との関連は0.7 M NaClまでかなり安定していました(図2B)。シャペロン-ヒストン錯体が高塩濃度に耐える能力は、錯体の安定化における疎水性相互作用の役割を示唆しています。H3/H4とのシャペロン複合体は、高塩濃度でも安定であり、錯体形成における疎水性相互作用の主な役割を示唆しています。高塩濃度でのH2A/H2B-シャペロン複合体の安定性が低いことは、錯体形成における静電相互作用の重要な役割を明らかにしています。別の実験では、プルダウンアッセイを使用して、シャペロンがH2A / H2B二量体またはH3 / H4四量体のいずれかを好むかどうかを調べました。その結果、シャペロンはH2A/H2B二量体とH3/H4四量体に同時に結合し、シャペロンに付加する順序に関係なく結合することが明らかになりました(図2C、D)。これは、シャペロンがヒストンオリゴマーとの相互作用のために別々の部位を有することを示した。
AUC-SV実験(図3)は、ヒストンオリゴマーとシャペロンの間の相互作用の化学量論を研究するために実施されました。AUC-SVデータ解析では、H2A/H2Bと複合体のAtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインについて、分子量104 kDaに相当する沈降係数(s)値が5.40 Sであった。ヌクレオプラスミンドメインとH3/H4の複合体は、129 kDaに相当する7.35 Sの沈降係数値を与えた。複合体の推定分子量は、五量体ヌクレオプラスミンが1:1の化学量論でH2A/H2B二量体およびH3/H4四量体の両方と複合体を形成することを明らかにした。
タンパク質がヒストンシャペロンであることを確認するために、タンパク質がヒストンオリゴマーをDNAに沈着させることができることを示すことが不可欠です。この目的のために、プラスミドスーパーコイルアッセイが採用されました(図4)。弛緩した環状プラスミドを、ヒストンオリゴマーH2A/H2BおよびH3/H4とNAPファミリーの組換え植物ヒストンシャペロン(AtNRP1およびAtNRP2)とともにインキュベートしました28。シャペロンの存在はスーパーコイルプラスミドの量を増加させ、ヒストンをDNA上に沈着させてヌクレオソームを形成し、DNAスーパーコイルを引き起こす可能性があることを示唆しています。
図1:AtFBP53のヌクレオプラスミンドメインのオリゴマー状態と安定性。 (A)AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインの分析サイズ排除クロマトグラフィープロファイル。(b)分子量既知の球状タンパク質を用いて得られた検量線。青い点は既知のタンパク質の分子量を表し、赤い点はAtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインを表します。(440 kDa-フェリチン、158 kDa-アルドラーゼ、75 kDa-コンアルブミン、44 kDa-オボアルブミン、6.5 kDa-アプロチニン)。(C)異なる温度で熱処理を行った0.5 mg/mL AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインの500 μLの分析サイズ排除クロマトグラム:20°C(緑)、40°C(オレンジ)、60°C(黒)、90°C(水色)。(D)異なるNaCl濃度を含むバッファー中の0.5 mg/mL AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメイン500 μLの分析サイズ排除クロマトグラム:0.3 M(紫)、0.6 M(赤)、1.0 M(水色)、1.5 M(緑)、2.0 M(黒)。(E)異なる尿素濃度のバッファー中のAtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインの分析サイズ排除クロマトグラム:0 M(コントロール;ライトブルー)、1.0 M(ピンク)、2.0 M(ブラック)、3.0 M(ダークブルー)、4.0 M(グリーン)、5.0 M(ブラウン)。ヌクレオプラスミン五量体は、熱的および化学的ストレス条件に対して高い安定性を示します。図は参考文献21から適応されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:AtFKBP53のヌクレオプラスミンドメインとヒストンオリゴマーとの相互作用に関するプルダウンアッセイ。 アッセイからの溶出画分の18%SDS-PAGE画像を以下に示します。 ここでは、(A) 20 μM H2A/H2B二量体および (B) 5 μM AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインを有する20 μM H3/H4四量体のプルダウンアッセイを、0.3 M、0.5 M、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、および1.0 Mの範囲で増加させた5 μM AtFKBP53 FKBDを陰性対照として使用しました。競合結合実験のために、 (C) 5 μM AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインと20 μM H3/H4四量体の混合物を20〜60 μM H2A/H2B二量体の範囲でインキュベートし、 (D) 5 μM AtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインと20 μM H2A/H2B二量体の混合物を20〜60 μM H3/H4四量体の範囲でインキュベートしたもの。標識AtFKBP53は、AtFKBP53のヌクレオプラスミンドメインに対応する。溶出画分は、両方のヒストンオリゴマーのヌクレオプラスミンへの同時結合を示す。図は参考文献21から適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒストンオリゴマー、AtFKBP53のヌクレオプラスミンドメイン、およびそれらの複合体の分析的超遠心-沈降速度(AUC-SV)実験。 AUC 距離分布 対沈降係数(S)プロット。得られた沈降係数(複数可)値および分子量も提供される。標識AtFKBP53は、AtFKBP53のヌクレオプラスミンドメインに対応する。推定分子量は、ヒストンオリゴマーH2A/H2B二量体およびH3/H4四量体を有するAtFKBP53ヌクレオプラスミンドメインの1:1化学量論を明らかにした。0.3〜0.5のOD280 を有する全タンパク質サンプルの450μLをAUC-SV実験に使用した。図は参考文献21から適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:プラスミドスーパーコイルアッセイ。 ヒストンシャペロンAtNRP1およびAtNRP2のプラスミドスーパーコイルアッセイ。実験のために、500 ngのpUC19プラスミドDNAを1 μgのトポイソメラーゼIで前処理しました。4 μM AtNRP1、4 μM AtNRP2、および4 μM H2A/H2B二量体と2 μM H3/H4四量体の混合物は、前処理されたpUC19 DNAとインキュベートしてもスーパーコイル活性を示さない対照として使用されました。4 μM H2A/H2Bの二量体と2 μM H3/H4の四量体、およびAtNRP1とAtNRP2のそれぞれ4 μMの混合物を含むレーンは、前処理されたpUC19 DNAとのインキュベーション時にスーパーコイルDNAの形成を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、推定ヒストンシャペロンの生化学的および生物物理学的特性評価のための包括的なプロトコルセットを実証および検証します。本明細書では、組換え発現および精製されたNAPファミリータンパク質、AtNRP1およびAtNRP2、ならびにAtFKBP53のN末端ヌクレオプラスミンドメインを用いて、プロトコルを実証した。同じ一連の実験は、これまで特徴付けられていなかったあらゆる生物からのヒストンシャペロンの機能的属性を描写するために非常によく使用できます。
プロトコルセクションの最初の部分では、ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を調査します。いくつかの報告は、ヒストンシャペロンがオリゴマー状態でかなりの多様性を示すことを示しています。例えば、ヒトCAF-1はモノマー29として存在する。NAPファミリーメンバーは、二量体または四量体29、30、31として存在する。ヌクレオプラスミンは五量体およびしばしばデカマーオリゴマー状態を明らかにする32,33。分析SEC実験はヒストンシャペロンのオリゴマー状態を決定することができ、AUC-SV実験は同じことを確認することができます。ヒストンシャペロンのいくつかは、様々な熱的および化学的ストレス条件下で非常に安定であることが知られている33,34。ヒストンシャペロンの熱的および化学的安定性の特徴は、分析SECと組み合わせて調査することもできます。さらに、円二色性分光法は、化学物質の温度上昇または高濃度にさらされた場合のシャペロンの二次構造の変化の詳細な分析に効果的に使用できます。
プロトコルセクションの第2部では、塩勾配アプローチと競合プルダウンアッセイを使用してシャペロンのヒストンオリゴマーの好みを特定することにより、ヒストンオリゴマーとシャペロンとの関連を助ける基本的な相互作用を調べることができるプルダウンアッセイについて説明します。塩濃度のわずかな増加で複合体が崩壊する場合、それは複合体の安定化における静電相互作用の大きな寄与を示唆している。高塩中の無傷の複合体は、複合体35の安定化における疎水性に対する重要な役割を示唆するであろう。競合プルダウンアッセイは、特定のヒストンオリゴマークラスに対するヒストンシャペロンの特異性または選好性を決定するために容易に使用できます。ヒストンシャペロンは、ヒストンオリゴマーに対する好みに基づいて、H2A / H2Bシャペロン、H3 / H4シャペロン、およびH2A / H2B-H3 / H4シャペロン10,36などの3つのカテゴリに分類できます。さらに、必要に応じて、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、特定のシャペロンのヒストンオリゴマー特異性およびそれらの相互作用の熱力学的特性を理解することができます。
プロトコルセクションの第3部では、ヒストンシャペロンとヒストンオリゴマーの間の相互作用化学量論の調査について説明します。一般に、ヒストンシャペロンの異なるファミリーは、H2A / H2Bまたは/およびH3 / H4 21,28,37,38との関連の濃度測定についてかなり異なります。AUC-SV実験は、タンパク質またはその複合体の沈降係数と分子量を得るのに役立ち、複合体形成における化学量論を正確に推定するのに非常に役立ちます。あるいは、ITCを使用して化学量論を調べることもできます。
プロトコルセクションの第4部は、ヒストンシャペロンのヌクレオソームアセンブリ機能の調査に焦点を当てています。ヒストンシャペロンは、複製、転写、DNA修復などの重要な細胞プロセスを調節するヌクレオソームアセンブリにおいて重要な役割を果たします39。ヒストンシャペロンのヒストンシャペロン活性の in vitro 評価に典型的に使用されるプラスミドスーパーコイルアッセイは、このセクションで詳述される。
すべてのヒストンシャペロンが完全に構造化されているわけではないことに注意してください。天然変性領域を有することが知られているものはほとんどない40,41。したがって、熱的および化学的安定性アッセイは、そのようなタンパク質には適さない可能性がある。さらに、異なる生物由来のヒストンシャペロンは、異なるオリゴマー状態およびヒストンに結合する能力が異なる。したがって、このプロトコルは良い出発点かもしれませんが、必要に応じて変更が必要になります。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
インド政府科学技術研究委員会[CRG/2018/000695/PS]およびインド政府科学技術省バイオテクノロジー省[BT/INF/22/SP33046/2019]からのディリープ・ヴァスデヴァンへの学外助成金、およびブバネシュワール生命科学研究所からの壁内支援は大いに認められています。ヒストン調製にご協力いただいたスデシュナ・センさんとアンナプルナ・サフーさんに感謝します。同僚のチンマイ・モハパトラ博士、マナス・クマール・ジャグデフ氏、シェイク・ナウサド・ホセイン博士との議論も認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
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