Summary
Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Histon proteinleri, ökaryotik kromatini oluşturmak için DNA ile birleşir. Kromatinin temel birimi, DNA tarafından sarılmış çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4'ün iki kopyasından oluşan bir histon oktamerden oluşan bir nükleozomdur. Oktamer, bir H2A / H2B dimerinin iki kopyasından ve bir H3 / H4 tetramerinin tek bir kopyasından oluşur. Yüksek yüklü çekirdek histonları, hücresel sitoplazma ve çekirdekteki çeşitli proteinlerle spesifik olmayan etkileşimlere eğilimlidir. Histon şaperonları, histonlardan çekirdeğe histonları taşıyan ve DNA üzerinde birikmelerine yardımcı olan, böylece nükleozom montaj sürecine yardımcı olan çeşitli bir protein sınıfı oluşturur. Bazı histon şaperonları H2A / H2B veya H3 / H4 için spesifiktir ve bazıları her ikisi için de şaperon olarak işlev görür. Bu protokol, pull-down testleri, analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi in vitro laboratuvar tekniklerinin, belirli bir proteinin histon şaperonu olarak işlevsel olup olmadığını doğrulamak için birlikte nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.
Introduction
DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA'yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri 1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar 3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler 6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur 8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H410 için kesin bir tercihi vardır.
Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir11. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi 12,13'ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı14'te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek15 arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon16 olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.
Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini aydınlatmak için analitik boyut dışlama kromatografisi
- Histon şaperonların oligomerik durumunun analizi
- 24 mL'lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C'de dengeleyin (bkz.
NOT: Sütun tipi, tampon bileşimi ve tampon pH'ı, ilgili proteine göre seçilebilir. Numune enjeksiyon hacmi, 24 mL'lik bir sütun için 500 μL'yi geçmemelidir. Ayrıca, kolon basıncının 5 MPa'nın altında tutulması gerekir. - Daha yüksek konsantrasyonlu bir protein stok çözeltisinden, gazdan arındırılmış SEC tamponunda 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesi hazırlayın ve 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak önceden dengelenmiş kolona enjekte edin. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
- 280 nm dalga boyunda absorbansı ölçerek proteinin elüsyon profilini izleyin. Aromatik kalıntıları olmayan proteinlerle uğraşırken, absorbansı 214 nm'de ölçün.
- Standart kalibrasyon eğrisi21'i kullanarak kDa cinsinden yaklaşık moleküler ağırlığını hesaplamak için proteinin elüsyon hacmini kullanın.
NOT: Kalibrasyon eğrisi, bilinen moleküler ağırlıklı proteinlerin tutma hacminin, aynı sütun kullanılarak salınan ilgili moleküler ağırlıklarının kütüğüne (log Mr) karşı çizilmesiyle hazırlanır.
- 24 mL'lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C'de dengeleyin (bkz.
- Histon şaperonların termal stabilitesinin analizi
- Gazdan arındırılmış SEC tamponunda (1.1.1'de kullanılanla aynı) hazırlanan protein örneğinin 500 μL'sini ayrı ayrı mikrosantrifüj tüplerinde alın ve her tüpü bir su banyosunda 10 dakika boyunca 20 °C ile 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C ve 90 °C) arasında değişen belirli bir sıcaklığa ısıtın.
- Daha sonra, ısıl işlem görmüş numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin, süpernatantı bir mikropipetle toplayın ve 4 ° C'de SEC tamponu ile önceden dengelenmiş analitik kolona 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak her numuneyi ayrı ayrı enjekte edin.
- Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
- Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
- Histon şaperonların kimyasal stabilitesinin analizi
- Histon şaperonların tuz stabilitesini incelemek için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, 4 ° C'de 30 dakika boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan NaCl konsantrasyonları (300 mM, 600 mM, 1 M, 1.5 M ve 2 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı koruyun.
- Daha sonra, protein numunelerini farklı NaCl konsantrasyonlarında ayrı ayrı yükleyin, 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsünü kullanarak, 4 ° C'de artan NaCl konsantrasyonlarını içeren ilgili tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik kolona yerleştirin.
- Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak'lık izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
- Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
- Benzer şekilde, üre stabilite analizi için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, oda sıcaklığında 16 saat boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan üre konsantrasyonları (1 M, 2 M, 3 M, 4 M ve 5 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı saklayın.
- Daha sonra, üre ile muamele edilmiş protein numunelerini, oda sıcaklığında farklı üre konsantrasyonları içeren karşılık gelen tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik sütuna 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak ayrı ayrı yükleyin.
- Kromatografi çalışmasının, oda sıcaklığında ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
DİKKAT: Üre kristalleşme ve kolona zarar verme eğiliminde olduğundan üre içeren tampon ile deneyleri daha düşük bir sıcaklıkta yapmayın. - Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
2. Histon oligomerleri ve histon şaperon arasındaki karmaşık formasyona katkıda bulunan etkileşimlerin türünü anlamak için tuz gradyanı tabanlı pull-down testleri
- Pull-down testinin her reaksiyonu için, 40 μL Ni-NTA reçinesini bir spin kolonuna pipet edin ve steril çift damıtılmış su ile yıkayın. Daha sonra, reçineyi 100 CV (4 mL) denge tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10 μg / mL BSA ve 1 mM β-ME] ile dengeleyin (bkz.
NOT: Pull-down, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde de gerçekleştirilebilir. - His etiketli histon şaperonun 5 μM'sini denge tamponunda 20 μM histon H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırarak numuneyi hazırlayın. Numuneyi 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
NOT: H2A/H2B dimer ve H3/H4 tetramer, rekombinant insan histonları21'den hazırlanır ve oligomerlerin bütünlüğü, analitik ultrasantrifüjleme (AUC) ile tahmini moleküler kütlelere dayanarak doğrulanır. Aşağıda belirtilen tüm deneyler için aynı histon oligomerler kullanılmıştır. - Numuneleri, her biri belirli bir tuz konsantrasyonu için etiketlenmiş adım 2.1'den itibaren Ni-NTA reçinesi ile ayrı önceden dengelenmiş spin kolonlarına yükleyin ve sütunları 4 ° C'de 30 dakika boyunca saklayın. Kolonları 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın.
- Daha sonra, sütunları farklı tuz konsantrasyonları (yani, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 M NaCl) içeren 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM, 500 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Her sütunu belirli bir tuz konsantrasyonuna sahip bir tamponla yıkayın.
- Tuz yıkama adımından sonra, 100 μL elüsyon tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol ve 1 mM β-ME] kullanarak proteini farklı sütunlardan süzün.
- Daha sonra, salınan numuneleri %18 SDS-PAGE22'ye tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra jeli görselleştirin (bkz. Alternatif olarak, bağlı proteini Ni-NTA reçinesinden salmak yerine reçineyi doğrudan SDS-PAGE jeline yükleyebilirsiniz.
NOT: Dengeleme, yıkama ve elüsyon tampon bileşimleri ve pH, ilgilenilen proteine bağlı olarak değiştirilebilir.
3. H2A/H2B veya H3/H4 için histon şaperon tercihini belirlemek için rekabetçi pull-down testi
- Döndürme sütununu adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlama
- Histon şaperonun 5 μM'sini, buz üzerinde 30 dakika boyunca 300 μL denge tamponunda (adım 2.1'de hazırlanan) 20 μM H2A/H2B dimer ile inkübe edin.
NOT: Reaksiyondaki histon oligomerin histon şaperona oranı, bilinen bağlayıcı stokiyometri verilerine dayanarak seçilebilir; bilgi yoksa beş kat fazla histon kullanın. - Herhangi bir çökeltiyi gidermek için histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 16.200 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra, numuneyi denge tamponu (adım 2.1'de hazırlanan) ile önceden dengelenmiş spin kolonuna yükleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Fazla H2A/H2B dimerini gidermek için kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, %0.2 Tween-20 ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Daha sonra, histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 20-60 μM H3 / H4 tetramer ile karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu (adım 3.4'te hazırlanmış) ile yeniden yıkayarak bağlanmamış H3/H4 tetramerini çıkarın ve numuneyi elüsyon tamponu (adım 2.5'te hazırlanmış) kullanarak süzün. Salınan numuneleri %18 SDS-PAGE'e tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra görselleştirin.
NOT: Tahlil tersine çevrilebilir, burada ilk önce H3 / H4 tetrameri şaperon ile karıştırılabilir, kompleks Ni-NTA boncuklarına bağlanmasına izin verilir ve kompleks daha sonra değişen konsantrasyonlarda H2A / H2B dimer ile inkübe edilebilir.
4. Histon şaperonlar ve histonlar arasındaki bağlanma stokiyometrisini analiz etmek için analitik ultrasantrifüjleme - sedimantasyon hızı (AUC-SV) deneyleri
- AUC için numune hazırlama
- Yeniden yapılandırılmış histon H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu ayrı ayrı 7 kDa kesilmiş diyaliz tüpü23 aracılığıyla, diyaliz tamponuna [20 mM Tris (pH 7.5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-ME] karşı diyaliz edin (bkz. Arabellek uyuşmazlığından kaynaklanan arka plan hatasını en aza indirmek için, diyaliz tamponuna karşı, tercihen 24 saatlik bir süre boyunca üç kez diyalizi kapsamlı bir şekilde gerçekleştirin.
NOT: Protein örneklerinin ilk OD 280'i, 0.3-0.5'lik son OD280'i elde etmek için iki ila üç kat daha yüksek bir değere sahip olmalıdır. Bu aslında seyreltmenin etkilerini geçersiz kılmak için yapılır. - H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu diyaliz tamponu ile ayrı ayrı saflaştırın, analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak (1. adımda belirtildiği gibi). Daha sonra daha fazla seyreltme hazırlamak ve AUC hücresinde referans olarak kullanmak için arabelleği çalıştırmadan kaydedin.
- Yeniden yapılandırılmış histon H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu ayrı ayrı 7 kDa kesilmiş diyaliz tüpü23 aracılığıyla, diyaliz tamponuna [20 mM Tris (pH 7.5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-ME] karşı diyaliz edin (bkz. Arabellek uyuşmazlığından kaynaklanan arka plan hatasını en aza indirmek için, diyaliz tamponuna karşı, tercihen 24 saatlik bir süre boyunca üç kez diyalizi kapsamlı bir şekilde gerçekleştirin.
- AUC için örnek yükleme
- Saflaştırılmış proteinleri, 0.3-0.6'lık bir OD280'e ulaşmak için adım 4.1.1'den diyaliz tamponunu kullanarak 450 μL'lik son bir hacimde karıştırın. Ayrı reaksiyon tüplerinde kompleks oluşum için histon şaperonu H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırın. Protein karışımlarını 2-3 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Alternatif olarak, çökeltme verileri analitik ultrasantrifüjdeki parazitli optik tarama sistemi ile elde edilebilir. Ayrı olarak, saflaştırılmış proteinleri karıştırmak için, histon şaperon konsantrasyonunu sabitleyin ve tam stokiyometriyi elde etmek için histon oligomerlerinin artan konsantrasyonlarıyla inkübe edin. - AUC-SV deneyi için hücreyi, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analitik ultrasantrifüjün bir absorbans dedektörünü kullanarak çift sektörlü bir merkez parçası ve kuvars pencerelerle birleştirin24.
- 400 μL numune çözeltisini ve 420 μL diyaliz tamponunu hücrenin iki sektörüne (sırasıyla numune ve referans sektörleri) doldurun.
NOT: Referans menisküsünü numunenin menisküsünün üzerinde tutmak için referans sektöründe daha büyük hacimli tampon kullanılır. Bununla birlikte, bir optik girişim sistemi kullanırken, iki sektörü eşit hacimle doldurun. - Hücreleri tartın ve doğru bir şekilde dengeleyin ve dört yerli titanyum rotora yükleyin ( bkz. Hücrelerin ve rotorun altında verilen işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Rotoru santrifüje yükleyin, kapağı kapatın ve basınç 15 mikrondan daha az Hg'ye düşene ve rotor sıcaklığı 20 ° C'ye sabitlenene kadar (genellikle 2-2,5 saat sürer) bir vakum gelişmesine izin verin.
NOT: AUC çalışma parametreleri deneysel sıcaklığı, rotor hızını, taramalar arasındaki aralığı ve toplanacak tarama sayısını içerir. SV deneylerinde, tarama aralığı proteinin moleküler kütlesine göre verilir; daha küçük proteinler, taramalar arasında daha büyük zaman aralıkları gerektirir. Rotor hızı da proteinin beklenen moleküler kütlesine göre ayarlanır ve deney 20 ° C'de gerçekleştirilir. Absorbans verileri 280 nm'de izlenir. - Tam stokiyometriyi elde etmek için, histon şaperon konsantrasyonunu sabit tutun ve doygunluğa ulaşmak için artan histon oligomer konsantrasyonları ile inkübe edin.
- Saflaştırılmış proteinleri, 0.3-0.6'lık bir OD280'e ulaşmak için adım 4.1.1'den diyaliz tamponunu kullanarak 450 μL'lik son bir hacimde karıştırın. Ayrı reaksiyon tüplerinde kompleks oluşum için histon şaperonu H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırın. Protein karışımlarını 2-3 saat boyunca inkübe edin.
- AUC veri analizi
- Veri analizini daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin25. Kısaca, SEDNTERP26 programını kullanarak tampon bileşenlerinin yoğunluğunu ve viskozitesini hesaplayın (bkz. Benzer şekilde, SEDNTERP kullanarak amino asit bileşimine dayanarak proteinin kısmi spesifik hacmini hesaplayın.
- AUC makinesindeki verileri SEDFIT27 programına yükleyin ve menisküs (kırmızı çizgi), hücre alt kısmı (mavi çizgi) ve veri analizi sınırlarını (yeşil çizgiler) tanımlayın. Model olarak sürekli C(s) dağılımını seçin.
- Ardından, çözünürlüğü maksimum 100'e kadar ayarlayın; set çökeltme katsayısı (lar), s min: 0 ve s max: 10-15; sürtünme oranını başlangıçta 1,2 olarak ayarlayın ve oranın verilerden türetilmesi için yüzmeyi tercih edin; 1 sigma düzenlileştirme için güven seviyesini (F-oranı; düzenlileştirmenin büyüklüğünü belirleyen) 0,68'e ayarlayın; SEDNTERP'den elde edilen kısmi spesifik hacim, tampon yoğunluğu ve tampon viskozite değerlerini ayarlayın.
- Yazılımın Lamm denklemi27'yi çözmesine izin vermek için RUN tuşuna basın. Önemli bir veri uyuşmazlığı varsa parametreleri ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra, tüm parametreleri hassaslaştırmak için FIT tuşuna basın. Uyum kalitesini, 0,01 sinyal biriminden az olması gereken kök-ortalama-kare sapma (RMSD) değerine göre değerlendirin.
- Seçeneği seçerek zirvelerin moleküler kütlelerini tahmin edin: molekülün / kompleksin 's'si hakkında bilgi sağlayacak olan ana araç çubuğunun görüntüleme işlevinde "Mw in c(s)" tepe noktasını gösterin.
5. Histon chaperoning fonksiyonunu doğrulamak için plazmid süper sarma testi
- Nükleozom montaj reaksiyonu
- Bir montaj tamponunda 2 μM H3/H4 tetramer ve 4 μM H2A/H2B dimerini artan konsantrasyonlarla karıştırın [20 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0.1 mg/mL BSA ve 100 mM NaCl] 50 μL'lik son hacme kadar karışımı 4 °C'de 30 dk.
- Aynı zamanda, ayrı bir reaksiyonda, negatif süper sarmal pUC19 plazmidinin 500 ng'sini, montaj tamponunda 50 μL'lik son bir hacimde 1 μg topoizomeraz I enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile ön işlemden geçirin ve 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
NOT: Topoizomeraz I, tek sarmallı bir çentik üreterek süper sarmal çift sarmallı plazmid DNA'sını gevşetir. Ticari olarak temin edilebilen buğday tohumu topoizomeraz I veya rekombinant olarak eksprese edilen Drosophila melanogaster topoizomeraz I gibi ökaryotik kökenli bir topoizomeraz I enzimi kullanılabilir. - Daha sonra, H3 / H4 tetramer, H2A / H2B dimer, histon şaperon karışımı (adım 5.1.1'den itibaren), gevşemiş plazmid DNA reaksiyon karışımını (adım 5.1.2'den itibaren) birleştirin ve 90 dakika boyunca 30 ° C'de daha fazla inkübe edin.
NOT: Tahlil için iki kontrol reaksiyonu ayarlayın; biri histon şaperon ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histonlara değil), diğeri histon oligomerlerine ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histon şaperona değil) sahiptir. - 100 μL 2x durdurma tamponu (40 mM EDTA, %2 SDS ve 0,4 mg/mL proteinaz K) ekleyerek montaj reaksiyonunu durdurun ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
NOT: Stop buffer, bağlı histonların denatürasyonu ve proteolizi ile plazmid DNA'sını deproteinize eder.
- Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi
- Adım 5.1.4'ten itibaren reaksiyon karışımını içeren tüpe eşit miktarda Tris doymuş fenol ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüjleme yapın.
- Plazmid DNA'sına sahip üst sulu fazı bir mikropipetle nazikçe toplayın ve eşit miktarda kloroform ile karıştırın. Karışımı vorteks edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın.
NOT: İzoamil alkol, sulu ve organik fazlar arasında bulanık bir arayüzden kaçınmak için bu adıma dahil edilebilir. - Daha sonra, üst sulu fazı toplayın, 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ve 2.5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin (bkz. Tüpü 3-4 kez ters çevirerek çözeltiyi iyice karıştırın ve plazmid DNA'sının tamamen çökelmesi için karışımı -20 ° C'lik bir dondurucuda 30 dakika boyunca saklayın.
- Numuneyi 16200 x g'de 5.2.3 adımından 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı yavaşça atın. Tüpleri, eser miktarda etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında açık tutun ve çökelmiş plazmid DNA'sını tüpte bırakın.
- Plazmid süper sarmal etkisini gözlemlemek için agaroz jeli elektroforezini gerçekleştirin.
- Çökeltilmiş plazmid DNA'sını 5.2.4 adımından steril çift damıtılmış suda çözün.
- Numuneleri 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözün (bkz.
- Jeli 0.2-0.5 μg / mL ethidyum bromür konsantrasyonu ile lekeleyin ve jel üzerindeki DNA bantlarını görselleştirmek için UV altında gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arabidopsis thaliana'dan FKBP53 proteininin rekombinant N-terminal nükleoplazmin alanı analitik SEC'e tabi tutuldu. Elüsyon tepe hacmi, oligomerik durumunu tanımlamak için standart eğriye karşı çizildi. Analitik SEC sonuçları, alanın çözelti içinde yaklaşık 58 kDa'lık bir moleküler kütleye sahip bir pentamer olarak var olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1A, B). Ayrıca, nükleoplazmin alanı, analitik SEC ile birlikte termal ve kimyasal stabilite için analiz edildi. 90 ° C'ye kadar ısıl işleme tabi tutulan nükleoplazman numunesi, 20 ° C'de tutulan numunelere kıyasla elüsyon hacminde ve tepe yüksekliğinde belirgin bir kayma göstermedi, bu da alanın oldukça termostabil olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1C). Benzer şekilde, nükleoplazman alanı 2 M'ye kadar NaCl (Şekil 1D) tuz stabilitesi ve 4 M'ye kadar üre stabilitesi göstermiştir (Şekil 1E). Bununla birlikte, nükleoplazmin pentameri daha yüksek üre konsantrasyonlarında ayrışmaya başladı.
Histon şaperon (AtFKBP53'ün nükleoplazmazmin alanı) ile histon oligomerleri H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramer arasındaki karmaşık formasyona katkıda bulunan etkileşimlerin tipini belirlemek için gradyan tuz yıkama kullanılarak bir pull-down testi yapıldı. Nükleoplazmin alanının H2A/H2B dimer ile etkileşimi 0.4 M NaCl tuz konsantrasyonuna kadar stabildi (Şekil 2A). Buna karşılık, H3 / H4 ile ilişki 0.7 M NaCl'ye kadar oldukça kararlıydı (Şekil 2B). Şaperon-histon komplekslerinin yüksek tuz konsantrasyonuna dayanma kabiliyeti, komplekslerin stabilize edilmesinde hidrofobik etkileşimlerin rolünü düşündürmektedir. H3 / H4'ün yüksek tuz konsantrasyonlarında bile stabil olduğu şaperon kompleksi, kompleks oluşumunda hidrofobik etkileşimlerin baskın bir rol oynadığını göstermektedir. H2A/H2B-şaperon kompleksinin yüksek tuz konsantrasyonlarındaki düşük stabilitesi, kompleks oluşumunda elektrostatik etkileşimler için önemli bir rol oynadığını ortaya koymaktadır. Başka bir deneyde, aşağı çekme testi, şaperonun H2A / H2B dimerini mi yoksa H3 / H4 tetramerini mi tercih ettiğini incelemek için kullanıldı. Sonuçlar, şaperonun H2A/H2B dimer ve H3/H4 tetramerine aynı anda ve şaperona eklenme sırasına bakılmaksızın bağlandığını ortaya koymuştur (Şekil 2C,D). Bu, şaperonun histon oligomerlerle etkileşimi için ayrı bölgelere sahip olduğunu gösterdi.
AUC-SV deneyleri (Şekil 3), histon oligomerleri ve şaperonlar arasındaki etkileşimin stokiyometrisini incelemek için yapıldı. AUC-SV veri analizi, 104 kDa'lık bir moleküler kütleye karşılık gelen H2A / H2B ile kompleks halindeki AtFKBP53 nükleoplazman alanı için 5.40 S'lik bir çökeltme katsayısı (s) değeri sağlamıştır. H3 / H4 ile nükleoplazmin alanının kompleksi, 129 kDa'ya karşılık gelen 7.35 S'lik bir çökeltme katsayısı değeri verdi. Komplekslerin tahmini moleküler kütlesi, pentamerik nükleoplazmanın 1: 1 stokiyometride hem H2A / H2B dimer hem de H3 / H4 tetramer ile kompleks oluşturduğunu ortaya koymaktadır.
Proteinin, bir histon şaperon olduğunu doğrulamak için histon oligomerleri DNA üzerine biriktirebileceğini göstermek önemlidir. Bu amaçla plazmid süperbobinleme testi kabul edilmiştir (Şekil 4). Gevşemiş dairesel plazmid, H2A/H2B ve H3/H4 histon oligomerleri ile NAP ailesinin rekombinant bitki histon şaperonları - AtNRP1 veAtNRP2 28 ile inkübe edildi. Şaperonun varlığı, süper sarmal plazmid miktarını arttırdı, bu da nükleozomları oluşturmak için DNA'ya histonlar bırakabileceğini ve DNA süper sarılmasına neden olabileceğini düşündürdü.
Şekil 1: AtFBP53'ün nükleoplazman alanının oligomerik durumu ve stabilitesi. (A) AtFKBP53 nükleoplazman alanının analitik boyut-dışlama kromatografi profili. (B) Bilinen moleküler kütlenin küresel proteinleri kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi. Mavi noktalar bilinen proteinlerin moleküler kütlesini temsil ederken, kırmızı nokta AtFKBP53 nükleoplazman alanını temsil eder. (440 kDa - ferritin, 158 kDa-aldolaz, 75 kDa-con albümin, 44 kDa-ovalbümin, 6.5 kDa-aprotinin). (C) Farklı sıcaklıklarda ısıl işleme tabi tutulan 0,5 mg/mL AtFKBP53 nükleoplazmin alanının 500 μL'lik analitik boyut dışlama kromatogramı: 20 °C (yeşil), 40 °C (turuncu), 60 °C (siyah), 90 °C (açık mavi). (D) Farklı NaCl konsantrasyonları içeren tamponlarda 0,5 mg/mL AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanının 500 μL'lik analitik boyut dışlama kromatogramı: 0,3 M (mor), 0,6 M (kırmızı), 1,0 M (açık mavi), 1,5 M (yeşil), 2,0 M (siyah). (E) Farklı üre konsantrasyonlarına sahip tamponlarda AtFKBP53 nükleoplazman alanının analitik boyut dışlama kromatogramı: 0 M (kontrol; açık mavi), 1.0 M (pembe), 2.0 M (siyah), 3.0 M (koyu mavi), 4.0 M (yeşil), 5.0 M (kahverengi). Nükleoplazmain pentameri, termal ve kimyasal stres koşullarına karşı yüksek stabilite gösterir. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: AtFKBP53'ün nükleoplazman alanının histon oligomerlerle etkileşimi için aşağı çekme testleri. Tahlillerden elde edilen elüsyon fraksiyonlarının% 18'lik SDS-PAGE görüntüleri burada sunulmuştur. Burada negatif kontrol olarak ( A ) 20 μM H2A/H2B dimer ve (B) 5 μM AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanına sahip 20 μM H3/H4 tetramer için 0,3 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M ve 1,0 M. 5 μM AtFKBP53 FKBD aralığında artan konsantrasyonlarda pull-down testi kullanılmıştır. Rekabetçi bağlama deneyi için, ( C ) 20-60 μM H2A/H2B dimer aralığında inkübe edilmiş 5 μM AtFKBP53 nükleoplazman alanı ve 20 μM H3/H4 tetramer karışımı ve (D) 20-60 μM H3/H4 tetramer aralığı ile inkübe edilmiş 5 μM AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanı ve 20 μM H2A/H2B dimer karışımı kullanılmıştır. AtFKBP53 etiketi, AtFKBP53'ün nükleoplazman alanına karşılık gelir. Elüsyon fraksiyonları, her iki histon oligomerinin nükleoplazmine eşzamanlı bağlandığını gösterir. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Histon oligomerlerinin, AtFKBP53'ün nükleoplazmazmin alanının ve komplekslerinin analitik ultrasantrifüjleme - sedimantasyon hızı (AUC-SV) deneyi. AUC mesafe dağılımı ve çökeltme katsayısı (S) grafiği. Elde edilen sedimantasyon katsayısı/katsayısı değerleri ve moleküler kütleler de sağlanır. AtFKBP53 etiketi, AtFKBP53'ün nükleoplazman alanına karşılık gelir. Tahmini moleküler kütleler, histon oligomerleri H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramer ile AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanı için 1: 1 stokiyometri ortaya koymaktadır. AUC-SV deneyleri için OD280 değeri 0.3-0.5 olan tüm protein örneklerinin 450 μL'si kullanılmıştır. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Plazmid süper sarmal testi. Histon şaperonlar AtNRP1 ve AtNRP2 için plazmid süper sarma testi. Deney için 500 ng pUC19 plazmid DNA'sı 1 μg Topoizomeraz I ile ön işlemden geçirildi. 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2 ve 4 μM H2A / H2B dimer ve 2 μM H3 / H4 tetramer karışımı, önceden işlenmiş pUC19 DNA ile inkübe edildiğinde süper sarma aktivitesi göstermeyen kontrol olarak görülmüştür. 4 μM H2A / H2B dimer ve 2 μM H3 / H4 tetramer karışımı ve AtNRP1 ve AtNRP2'nin her biri 4 μM karışımına sahip şeritler, önceden işlenmiş pUC19 DNA ile inkübasyon üzerine süper sarmal DNA oluşumunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, varsayılan bir histon şaperonun biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol setini göstermekte ve doğrulamaktadır. Burada, protokolleri göstermek için rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan NAP ailesi proteinleri, AtNRP1 ve AtNRP2 ve AtFKBP53'ün N-terminal nükleoplazman alanı kullanılmıştır. Aynı deney seti, herhangi bir organizmadan daha önce karakterize edilmemiş histon şaperonların fonksiyonel özelliklerini tanımlamak için çok iyi kullanılabilir.
Protokol bölümünün ilk bölümü, bir histon şaperonun oligomerik durumunu ve stabilitesini araştırmayı içerir. Birkaç rapor, histon şaperonların oligomerik durumlarında önemli bir çeşitlilik sergilediğini göstermektedir. Örneğin, insan CAF-1 bir monomer29 olarak bulunur. NAP ailesi üyeleri dimer veya tetramer 29,30,31 olarak mevcuttur. Nükleoplazminler pentamerik ve sıklıkla dekamerik oligomerik durumları ortaya çıkarır32,33. Analitik bir SEC deneyi, bir histon şaperonun oligomerik durumunu belirleyebilir ve AUC-SV deneyleri de aynı şeyi doğrulayabilir. Histon şaperonların birçoğunun çeşitli termal ve kimyasal stres koşulları altında oldukça kararlı olduğu bilinmektedir33,34. Histon şaperonların termal ve kimyasal kararlılık özellikleri analitik SEC ile birlikte de araştırılabilir. Ayrıca, dairesel dikroizm spektroskopisi, artan sıcaklıklara veya kimyasal bir maddenin daha yüksek konsantrasyonlarına maruz kaldığında şaperonun ikincil yapısındaki değişikliklerin derinlemesine analizi için etkili bir şekilde kullanılabilir.
Protokol bölümünün ikinci bölümü, bir şaperonun histon oligomer tercihini tanımlamak için tuz gradyanı yaklaşımı ve rekabetçi bir aşağı çekme testi kullanarak histon oligomerlerinin şaperon ile ilişkisine yardımcı olan temel etkileşimleri inceleyebilecek pull-down testlerini kapsamaktadır. Kompleks, tuz konsantrasyonunda hafif bir artışla parçalanırsa, bu, kompleksin stabilize edilmesinde elektrostatik etkileşimlerin büyük bir katkısını gösterir. Yüksek tuzda bozulmamış bir kompleks, kompleksin stabilize edilmesinde hidrofobiklik için önemli bir rol oynayacaktır35. Rekabetçi pull-down testi, bir histon şaperonun spesifik bir histon oligomer sınıfına özgüllüğünü veya tercihini belirlemek için kolayca kullanılabilir. Histon oligomerlere yönelik tercihlerine bağlı olarak, histon şaperonlar H2A / H2B şaperonlar, H3 / H4 şaperonları ve H2A / H2B-H3 / H4 şaperonları10,36 gibi üç kategoriye ayrılabilir. Ek olarak, gerekirse, belirli bir şaperonun histon oligomer özgüllüğünü ve etkileşimlerinin termodinamik özelliklerini anlamak için izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılabilir.
Protokol bölümünün üçüncü bölümü, bir histon şaperon ile histon oligomerleri arasındaki etkileşim stokiyometrisinin araştırılmasını kapsamaktadır. Genel olarak, histon şaperonların farklı aileleri, H2A / H2B veya / ve H3 / H421,28,37,38 ile ilişkilerinin stokiyometrisi için önemli ölçüde farklılık gösterir. AUC-SV deneyi, bir proteinin veya kompleksinin çökeltme katsayısı (s) ve moleküler kütlesinin elde edilmesine yardımcı olur, bu da karmaşık oluşumdaki stokiyometrinin doğru bir şekilde tahmin edilmesinde çok yararlı olur. Alternatif olarak, ITC stokiyometriyi incelemek için de kullanılabilir.
Protokol bölümünün dördüncü bölümü, histon şaperonların nükleozom montaj fonksiyonunun araştırılmasına odaklanmaktadır. Histon şaperonları, replikasyon, transkripsiyon ve DNA onarımı gibi hayati hücresel süreçleri düzenleyen nükleozom montajında çok önemli bir rol oynar39. Histon şaperonların histon chaperoning aktivitesinin in vitro değerlendirilmesi için tipik olarak kullanılan plazmid süperbobinleme testi bu bölümde detaylandırılmıştır.
Tüm histon şaperonların tam olarak yapılandırılmadığı belirtilebilir. Çok azının özünde düzensiz bölgelerolduğu bilinmektedir 40,41. Bu nedenle, termal ve kimyasal stabilite testleri bu tür proteinler için uygun olmayabilir. Ayrıca, farklı organizmalardan histon şaperonları farklı oligomerik durumlara ve histonlara bağlanmak için farklı yeteneklere sahiptir. Bu nedenle, bu protokol iyi bir başlangıç noktası olabilir, ancak gerektiğinde değişiklikler gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti [CRG / 2018 / 000695 / PS] ve Biyoteknoloji Bölümü, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Hindistan Hükümeti [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] 'dan Dileep Vasudevan'a yapılan ekstramural hibelerin yanı sıra Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Bhubaneswar'ın intramural desteği büyük ölçüde kabul edilmektedir. Bayan Sudeshna Sen ve Bayan Annapurna Sahoo'ya histon hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Meslektaşlarımız Dr. Chinmayee Mohapatra, Bay Manas Kumar Jagdev ve Dr. Shaikh Nausad Hossain ile yapılan görüşmeler de kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L.
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L.
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J.
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
