Summary
이 원고는 근육 커프 재생 말초 신경 인터페이스 (MC-RPNI)라고하는 생물학적 말초 신경 인터페이스를 개발하기위한 혁신적인 방법을 제공합니다. 이 수술 구조는 관련 말초 신경의 운동 원심성 신호를 증폭하여 운동 의도의 정확한 감지와 외골격 장치의 잠재적 제어를 용이하게 할 수 있습니다.
Abstract
로봇 외골격은 최근 재활 의학 분야에서 사지 약점이 있는 개인의 기능 회복을 위한 유망한 양식으로 찬사를 받았습니다. 그러나 이들의 사용은 주로 연구 기관에 국한되어 있으며 모터 감지 방법이 신뢰할 수 없기 때문에 정적 사지 지원 수단으로 자주 작동합니다. 말초 신경 인터페이스는 이러한 단점에 대한 잠재적 인 해결책으로 등장했습니다. 그러나 본질적으로 작은 진폭으로 인해 이러한 신호는 배경 소음과 구별하기 어려워 전반적인 모터 감지 정확도가 떨어질 수 있습니다. 현재의 인터페이스는 비생물적 재료에 의존하기 때문에 시간이 지남에 따라 이물질 반응과 함께 고유한 재료 분해가 발생하여 정확도에 더욱 영향을 미칠 수 있습니다. 근육 커프 재생 말초 신경 인터페이스 (MC-RPNI)는 이러한 주목할만한 합병증을 극복하도록 설계되었습니다. 손상되지 않은 말초 신경에 원주방향으로 고정 된 자유 근육 이식편 세그먼트로 구성된이 구조물은 시간이 지남에 따라 포함 된 신경에 의해 재생되고 재 신경이 분포됩니다. 쥐에서 이 구조는 복합 근육 활동 전위(CMAP)의 생성을 통해 말초 신경의 운동 원심성 활동 전위를 정상 값의 최대 100배까지 증폭하는 능력을 입증했습니다. 이 신호 증폭은 모터 의도의 고정밀 감지를 용이하게 하여 잠재적으로 외골격 장치의 안정적인 활용을 가능하게 합니다.
Introduction
미국에서만 약 1억 3천만 명이 신경근 및 근골격계 질환의 영향을 받아 연간 8,000억 달러 이상의경제적 영향을 받고 있습니다1,2. 이 장애 그룹은 일반적으로 신경계 내, 신경근 접합부 또는 근육 자체 내의 병리학에 이차적입니다3. 다양한 병리학적 기원에도 불구하고 대다수는 어느 정도의 사지 약점을 공유합니다1,3. 불행히도, 이 약점은 신경 및 근육 조직 재생의 한계, 특히 심각한 외상 4,5,6의 설정을 고려할 때 종종 영구적입니다.
사지 쇠약 치료 알고리즘은 고전적으로 재활 및 지원 조치에 중점을 두었으며 종종 나머지 손상되지 않은 팔다리 (지팡이, 휠체어 등)의 기능을 활용하는 데 의존합니다. 7. 그러나이 전략은 약점이 단일 사지에 국한되지 않는 사람들에게는 부족합니다. 최근 로봇 기술의 혁신으로 사지 약점 8,9,10,11,12,13을 가진 사람들에게 사지 기능을 회복시키는 고급 외골격 장치가 개발되었습니다. 이러한 로봇 외골격은 종종 움직임의 시작 및 종료 또는 사지 위치 유지를 지원할 수 있는 전원이 공급되는 웨어러블 장치로, 사용자에게 개별적으로 맞춤화할 수 있는 다양한 양의 힘을 제공합니다. 8,9,10,11,12,13 . 이들 장치는 사용자에게 모터 지원을 제공하는 방법에 따라 수동 또는 능동으로 분류됩니다 : 능동 장치는 사용자에게 전력을 증가시키는 전기 액추에이터를 포함하는 반면, 수동 장치는 필요할 때 사용자에게 다시 방출하기 위해 사용자의 움직임으로부터 에너지를 저장합니다14. 능동 장치는 사용자의 전력 기능을 향상시킬 수 있기 때문에 이러한 장치는 사지 약점 설정에서 훨씬 더 자주 활용됩니다[14].
이 집단에서 운동 의도를 결정하기 위해 현대 외골격은 일반적으로 원위 사지 근육의 근전도 (EMG) 8,15,16,17 또는 뇌의 표면 뇌파 검사 (sEEG)18,19,20에서 생성 된 패턴 인식 알고리즘에 의존합니다. . 이러한 탐지 방식의 약속에도 불구하고 두 옵션 모두 이러한 장치의 광범위한 활용을 방해하는 중요한 제한 사항이 있습니다. sEEG가 마이크로 볼트 레벨 신호를 경두개 (18,19,20)로 감지함에 따라, 비판은 종종 이러한 신호를 배경 잡음(21)과 구별 할 수 없다는 것에 초점을 맞춘다. 배경 잡음이 원하는 기록 신호와 유사할 때, 이것은 낮은 신호 대 잡음비(SNR)를 생성하여, 부정확한 모터 검출 및 분류(22,23)를 초래한다. 정확한 신호 검출은 추가적으로 안정적이고 저임피던스 두피 접촉(21)에 의존하며, 이는 거칠고 두꺼운 모발의 존재, 사용자 활동, 심지어 발한(22, 24)에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 대조적으로, EMG 신호는 진폭이 몇 배 더 커서 모터 신호 감지 정확도를 높입니다15,18,25. 그러나, 이것은 근처의 근육이 신호를 오염시킬 수 있고, 장치(16,17,25)에 의해 제어될 수 있는 자유도를 감소시키고 깊은 근육 운동(25,26,27,28)을 검출할 수 없기 때문에 비용이 든다. 가장 중요한 것은, EMG는 상당한 근육 손상이 있고 조직이 완전히 부재할 때 제어 방법으로 사용될 수 없다는 것이다(29).
로봇 외골격의 개발을 발전시키기 위해서는 의도한 사용자의 운동 의도를 일관되고 정확하게 감지해야 합니다. 말초 신경계를 활용하는 인터페이스는 비교적 간단한 액세스와 기능적 선택성을 고려할 때 유망한 인터페이스 기술로 부상했습니다. 현재의 말초 신경 인터페이스 방법은 침습적이거나 비 침습적 일 수 있으며 일반적으로 신경 외 전극 30,31,32,33, 근막 내 전극34,35,36 및 침투 전극37,38,39,40의 세 가지 범주 중 하나에 속합니다. . 말초 신경 신호는 일반적으로 마이크로볼트 레벨에 있기 때문에, 이들 신호를 유사한 진폭의 배경 잡음(41, 42)으로부터 구별하는 것이 어려울 수 있으며, 이는 인터페이스의 전체 모터 검출 정확도 능력을 감소시킨다. 이러한 낮은 신호 대 잡음비(SNR)는 종종 장치(39,43)의 열화 또는 장치 주변의 흉터 조직 및/또는 국소 축삭 변성(37, 44)을 생성하는 국소 이물질 반응으로부터 생성된 악화되는 전극 임피던스(43)에 이차적으로 시간이 지남에 따라 악화된다. 이러한 단점은 일반적으로 새로운 말초 신경 인터페이스의 재수술 및 이식으로 해결할 수 있지만 이물질 관련 반응이 계속 발생하기 때문에 실행 가능한 장기적인 해결책은 아닙니다.
말초 신경과 비 생물 적 인터페이스의 상호 작용에서 발생하는 이러한 국소 조직 반응을 피하려면 생물학적 구성 요소를 통합 한 인터페이스가 필요합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 재생 말초 신경 인터페이스 (RPNI)는 보철 장치45,46,47,48로 절단 된 사람들의 절단단에 전이 된 말초 신경을 통합하기 위해 개발되었습니다. RPNI의 제조는 시간이 지남에 따라 혈관 재생, 재생 및 재신경 분포가 발생하는 자가 자유 근육 이식편의 세그먼트에 전이된 말초 신경의 외과적 이식을 포함합니다. 밀리볼트 레벨 복합 근육 활동 전위(CMAP)의 생성을 통해 RPNI는 포함된 신경의 마이크로 볼트 레벨 신호를 여러 크기로 증폭하여 운동 의도(45,48,49)의 정확한 감지를 용이하게 할 수 있습니다. 지난 10년 동안 RPNI가 상당히 발전하여 동물50,51 및 인간47회 시험 모두에서 원심성 운동 신경 신호를 증폭하고 전송하는 데 주목할만한 성공을 거두었으며 여러 자유도로 고정밀 보철 장치 제어를 용이하게 했습니다.
사지 약화가 있지만 손상되지 않은 말초 신경을 가진 개인은 외골격 장치를 제어하기 위해 말초 신경 인터페이스를 통해 운동 의도를 고정밀 감지함으로써 유사하게 이점을 얻을 수 있습니다. RPNI는 절단된 사람과 같이 전이된 말초 신경과의 통합을 위해 개발되었기 때문에 외과적 수정이 필요했습니다. RPNI에 대한 경험을 바탕으로 근육 커프 재생 말초 신경 인터페이스(MC-RPNI)가 개발되었습니다. RPNI에서와 같이 자유 근육 이식편의 유사한 부분으로 구성되어 대신 손상되지 않은 말초 신경에 원주 방향으로 고정됩니다 (그림 1). 시간이 지남에 따라 부수적 인 축삭 돋아를 통해 재생되고 재 신경이 분포되어 이러한 원심성 운동 신경 신호를 증폭하고 몇 배 더 큰 EMG 신호로 변환합니다52. MC-RPNI는 기원이 생물학적이기 때문에, 현재 사용되고 있는 말초 신경 계면(52)에서 발생하는 불가피한 이물질 반응을 피한다. 또한, MC-RPNI는 RPNIs49에서 이전에 입증된 바와 같이, 상당한 혼선 없이 개별 근육에 원위부 해부된 신경에 배치될 수 있기 때문에 동시에 다수의 자유도를 제어할 수 있는 능력을 부여한다. 마지막으로, MC-RPNI는 근위 신경에 위치하기 때문에 원위 근육 기능과 독립적으로 작동 할 수 있습니다. 현재 말초 신경 인터페이스에 비해 장점을 감안할 때 MC-RPNI는 안전하고 정확하며 신뢰할 수 있는 외골격 제어 방법을 제공할 수 있는 상당한 가능성을 가지고 있습니다.
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Protocol
모든 동물 절차 및 실험은 미시간 대학의 동물 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다. 생후 3-6개월의 수컷 및 암컷 Fischer F344 및 Lewis 쥐(~200-300g)가 실험에서 가장 자주 사용되지만 이론적으로는 모든 균주를 활용할 수 있습니다. 자가 근육 이식편 대신 기증자 쥐를 사용하는 경우, 기증자 쥐는 실험 균주에 대해 동종이어야 합니다. 쥐는 수술 전후에 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수 있습니다. 말기 종점 평가 후, 안락사는 심장 내 염화칼륨 주사로 심부 마취하에 수행되고 양측 기흉의 2 차 방법이 뒤 따른다.
1. 랫트의 실험적 준비
- 유도 챔버에서 0.8-1.0 L / min의 산소 중 5 % 이소 플루 란 용액을 사용하여 실험 쥐를 마취하십시오. 적절한 마취가 이루어지고 각막 반사가없는 것으로 확인되면 마취 유지를 위해 이소 플루 란을 1.75 % -2.25 %로 낮추어 재호흡기 코 콘에 쥐를 놓습니다.
- 수술 전후 진통제를 위해 견갑골 사이의 피하 평면에 27G 바늘로 멸균 식염수 0.2mL에 0.02-0.03mL Carprofen(50mg/mL) 용액을 주입합니다.
- 마취 중 각막 궤양을 예방하기 위해 양쪽 눈에 멸균 눈 연고를 바르십시오.
- 전기 면도기를 사용하여 고관절에서 허벅지 위로, 발의 등쪽 표면까지 확장되는 양측 하지의 측면 부분을 면도합니다.
- 먼저 알코올 준비 패드로 닦은 다음 포비돈-요오드 용액을 바르고 새 알코올 준비 패드로 최종 세척하여 잔류 포비돈-요오드 용액을 제거하여 수술 부위를 소독합니다. 이 번갈아 가며 클렌징 과정을 세 번 반복하여 무균 상태를 유지하십시오.
알림: 이것은 피부과 자극제 일 수 있습니다. 솔루션의 대부분이 제거되었는지 확인합니다.
2. 근육 이식편의 준비
- 체온 모니터링을 위해 선택한 구강 내 체온 프로브가 있는 수술용 현미경 아래의 가열 패드에 쥐를 놓습니다. 이소 플루 란을 1.75 % -2.25 %로, 산소를 0.8-1.0 L / min으로 유지하십시오.
- #15 메스로 발목 바로 위에서 무릎 바로 아래까지 연장되는 원하는 기증자 뒷다리의 앞쪽을 따라 세로 절개를합니다.
- 날카로운 홍채 가위를 사용하여 밑에있는 피하 조직을 해부하여 발목 관절 바로 근위에있는 밑에있는 근육 조직과 원위 힘줄을 노출시킵니다. 전경골 (TA)은 근육의 가장 크고 가장 앞쪽입니다. 신근 디지토룸 롱구스(EDL) 근육은 이 근육의 깊고 뒤쪽에서 찾을 수 있습니다. EDL 근육과 원위 힘줄을 주변 근육계에서 분리하십시오.
- 발목 관절 바로 근위의 원위 힘줄 아래에 집게 또는 홍채 가위의 두 타인을 삽입하여 올바른 힘줄의 분리를 보장합니다. 집게 또는 홍채 가위를 열어 힘줄에 위쪽 압력을 가하십시오. 이 동작은 모든 발가락을 동시에 확장해야합니다. 고립 된 발목 배측 굴곡, 발목 외전 또는 단일 발가락 배측 굴곡이 발생하면 잘못된 힘줄이 분리 된 것입니다.
- 날카로운 홍채 가위로 발목 수준에서 EDL 근육의 원위 건절개술을 수행하고 힘줄 기원을 향해 근위로 작동하는 주변 조직에서 근육을 해부합니다.
- 근위 힘줄이 시각화되면 날카로운 홍채 가위를 사용하여 근위 건절개술을 수행하여 이식편을 자유롭게합니다.
- 근육 이식편의 양쪽 힘줄 끝을 다듬고 날카로운 홍채 가위로 원하는 길이로 자릅니다.
알림: 8-13mm 크기의 이식편이 성공적으로 활용되었습니다. 그러나 가장 일반적으로 사용되는 길이는 10mm입니다. - 근육 이식편의 한쪽에서 전체 트리밍 된 길이를 따라 세로 절개를하여 근육 이식편 내에 신경을 쉽게 배치하고 신경과 자궁 내막균의 접촉을 제공합니다.
- 준비된 근육 이식편을 식염수에 적신 거즈에 넣어 조직 건조를 방지합니다.
- 기증자 부위 위에 놓인 피부를 4-0 크롬 봉합사로 닫으십시오.
3. 일반적인 비골 신경 격리 및 준비
- 좌골 노치에서 ~5mm 선에서 무릎 관절보다 약간 열등하게 확장되는 수술 절개를 표시하십시오. 이 표시가 아래에서 촉지 할 수있는 대퇴골보다 열등하고 각도가 떨어져 있는지 확인하십시오.
- #15 칼날로 표시된 절개 라인을 따라 피부와 피하 조직을 절개합니다. 좌골 신경이 바로 아래에 있기 때문에 근육의 전체 깊이를 통해 확장되지 않도록 주의하면서 밑에 있는 이두근근 대퇴골 근막을 조심스럽게 절개합니다.
- 끝이 뭉툭한 작은 가위 또는 지혈제를 사용하여 대퇴 이두근을 통해 조심스럽게 해부하십시오.
알림: 좌골 신경은 피부에 표시된 절개와 거의 같은 방향으로 향하는 이두근 아래의이 공간에서 이동합니다. 세 가지 주목할만한 좌골 신경 가지가 있습니다 : sural (가장 뒤쪽과 가장 작은 신경), 경골 (일반적으로 가장 앞쪽이지만이 신경은 항상 무릎 관절 깊숙이 잠수합니다) 및 공통 비골 (일반적으로 경골과 구강 사이에 위치하며 항상 무릎 관절 위로 이동합니다). - 일반적인 비골 (CP) 신경을 확인하고 한 쌍의 마이크로 집게와 마이크로 가위를 사용하여 주변 신경과 조심스럽게 분리하십시오. 신경의 중간 2cm에서 주변 결합 조직을 제거하십시오. 압착 부상은 종말점 결과를 변경할 수 있으므로 이 과정에서 집게로 CP 신경을 부수지 않도록 주의하십시오.
- 해방 된 CP 신경의 가장 중앙 부분에 걸쳐 근육 이식편의 원하는 길이와 일치하는 신경 길이를 따라 상피 신경의 25 %를 제거하여 상피 신경 창을 수행하십시오.
- 이를 수행하려면 마이크로 포셉으로 근위 상피신경을 잡고 미세 해부 가위로 바로 아래에 있는 상피신경을 절단하고 신경을 따라 말단으로 이동하는 상피신경의 ~25%를 제거합니다. 여러 번 시도하면 불규칙한 상피 신경 제거가 발생하여 신경 손상의 위험이 높아질 수 있으므로이 부분을 한 조각으로 제거하십시오.
알림: 상피신경의 밑에 있는 신경 조직은 끈적끈적한 질감을 가질 것입니다. 이 신경의 품질에 주목하면 올바른 조직 평면이 제거되었는지 확인할 수 있습니다.
4. MC-RPNI 구조물 제작
- 식염수에 적신 거즈에서 근육 이식편을 제거하고 상피 신경 창이 생성 된 CP 신경의 중앙 부분 아래에 놓습니다. 신경을 180° 회전시켜 상피창 부분이 손상되지 않은 근육과 접촉하고 최종 봉합선 밑에 놓이지 않도록 합니다.
- 8-0 사용 나일론 봉합사, CP 신경의 상피신경을 근위 및 원위부 모두 2.8단계에서 생성된 그루브 내 근육 이식편에 봉합하여 단순 중단 봉합사를 사용하여 외피신경을 엔도마이슘에 고정합니다.
알림: 이 바늘을 놓고 근육이 정상적인 휴식 길이에 있는지 확인하십시오. 근육을 너무 많이 늘리거나 압축하면 나중에 재생 및 신호 전달 능력에 영향을 줄 수 있습니다. - 이제 확보 된 신경을 둘러싼 근육 이식편의 가장자리를 원주 방향으로 감싸고 간단한 중단을 사용하여 봉합사를 제자리에 봉합합니다. 8-0 나일론 스티치 (길이에 따라 ~ 4-6).
- 지혈이 이루어지면 달리기 방식으로 5-0 크롬 봉합사로 구조물 위의 이두근 대퇴골 근막을 닫습니다.
- 4-0 크롬 봉합사로 러닝 방식으로 위에 놓인 피부를 닫습니다.
- 알코올 준비 패드로 수술 부위를 정화하고 항생제 연고를 바르십시오.
- 흡입 마취제를 종료하고 케이지 메이트로부터 격리 된 깨끗한 케이지에 쥐를 넣고 음식과 물로 회복 할 수 있도록합니다.
- 쥐가 적절하게 회복되면 케이지 메이트와 함께 깨끗한 케이지에 다시 넣으십시오.
참고: 이러한 구조는 적절한 신경 신호 증폭을 생성하기 위해 최소 3개월의 성숙이 필요합니다.
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Representative Results
MC-RPNI 수술 제조는 쥐가 수술 마취에서 생존하지 못하거나 수술 후 일주일 이내에 감염이 발생하는 경우 수술 전후 실패로 간주됩니다. 이전 연구에 따르면 3개월의 성숙 기간이 이 구조물42,45,48,49로부터 신뢰할 수 있는 신호 증폭을 초래할 것이라고 합니다. 그 시점 또는 그 이후에, 구축물의 외과적 노출 및 평가가 발생할 수 있다. MC-RPNI 제작이 성공적이었다면, 혈관재생된 근육은 원래의 MC-RPNI 이식 부위에서 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 2B). 성공적인 MC-RPNI는 근위 신경 자극 후에 추가로 수축합니다 (비디오 1). 때때로 상당한 흉터와 위축성 근육 이식편이 존재할 수 있으며(그림 2C), 이는 일반적으로 너무 큰 이식편, 부적절한 취급 또는 수술 전후 조직 손상에 이차적인 재혈관/재생 실패를 나타냅니다. 이러한 위축성 이식편은 일반적으로 근위 신경 자극시 어느 정도의 수축을 갖지만 더 낮은 신호 증폭을 생성합니다. 전반적으로, 노출 시 MC-RPNI가 신경에서 이탈되거나 근위 신경 자극 시 수축이 없는 것으로 밝혀지면 제조 실패로 간주됩니다.
이러한 구조물의 조직학적 분석은 심각한 섬유증이나 흉터 없이 생존 가능한 신경 및 근육 조직을 입증해야 합니다(그림 3). 면역 조직 화학은 또한 시냅스 후 아세틸 콜린 수용체의 마커로서 알파-붕가로 톡신과 함께 일반적인 신경 마커로서 신경 섬유와 신경 섬유 접합부의 존재를 확인하기 위해 수행 될 수 있습니다 (그림 4). 표적 이식 된 신경이 MC-RPNI의 근육 구성 요소를 자극하지 못하면 면역 염색은 구조물을 가로 지르는 측부 운동 신경 새싹이나 신경 분포 된 신경근 접합부를 나타내지 않습니다.
전기 생리 학적 시험은 성숙 후 언제든지 이들 구조물에 대해 수행 될 수 있으며, 발표 된 결과는 3 개월52 및 인간 피험자47의 RPNI에서 최대 3 년에 MC-RPNI에서 안정한 신호를 입증한다. 전기 생리학 테스트 회로도는 관심 분야 및 사용 가능한 장비에 따라 다를 수 있지만 (그림 5) 평가는 후크 전극으로 근위 신경에 최대 자극을 제공 한 다음 MC-RPNI에서 생성 된 복합 근육 활동 전위 (CMAP)를 기록하여 가장 일반적으로 수행됩니다 (표 1 ). 기록 전극은 사용자 선호도에 따라 다를 수 있지만 epimysial 패치 / 패드, epimysial bipolar 프로브 및 침투 양극성 전극이 실험적으로 성공적으로 사용되었습니다. 더 많은 근위 신경 자극 후 CP 신경에서 기록 된 평균 복합 신경 진폭 (CNAP)은 119.47 μV ± 14.87 μV였다. 유사한 근위 CP 신경 자극 후 MC-RPNI에서 기록 된 평균 CMAP 진폭은 3.28 mV ± 0.49 mV였으며, 그 결과 신경 신호가 11-87x에서 증폭되었으며 전체 평균 증폭 계수는 31.8 ± 7.70이었다. 이렇게 생성된 CMAP 파형은 모양이 기본 근육과 유사하며, 포함된 신경에 의해 재신경이 분포되었음을 더욱 뒷받침합니다(그림 6B).
MC-RPNI 제조가 부정적인 기능적 영향을 일으키지 않도록 하기 위해 원위 신경분포 근육에 대해 전기생리학적 및 근력 테스트를 수행할 수 있습니다. 대부분의 테스트는 테스트를 위해 쉽게 접근 할 수 있고 일반적인 비골 신경에 의해 신경이 분포되기 때문에 동측 EDL 근육에서 수행되었습니다 (반대쪽 EDL은 MC-RPNI 제조를 위해 수확되므로 평가되지 않음). 근위 CP 신경 자극에 따른 생리학적 EDL 근육에 의해 생성된 CMAP는 전형적으로 20-30mV52의 범위이다. 이식 된 MC-RPNI를 가진 쥐에서이 테스트를 수행 할 때, EDL CMAP는 평균 24.27 mV ± 1.34 mV로 크게 다르지 않습니다. 또한 이 두 그룹 간에 생성된 CMAP 파형을 비교할 때 매우 유사합니다(그림 6C). 원위 신경 분포 근육 기능의 추가 측정으로서, 관심 근육의 근력 테스트가 추구 될 수있다 (표 2). 근위 CP 신경 자극 후, MC-RPNI 피험자에서 생성된 평균 EDL 최대 파상풍력은 2451mN ± 115mN이며, 이는 대조군 피험자(52)의 EDL 근육으로부터 얻은 2497mN ± 122mN의 평균 힘과 유사하다.
MC-RPNI의 전반적인 목적은 포함된 신경의 마이크로볼트 레벨 신호를 여러 크기로 증폭하여 SNR 비율을 증가시켜 모터 의도의 정확한 감지를 용이하게 하는 것입니다. 이 증폭은 10-20 배 52의 범위에서 신뢰할 수있는 방식으로 발생하는 것으로 입증되었으며,보다 최근의 실험은50 배 이상의 증폭 인자를 달성했습니다. 따라서 구축물이 유사한 수준의 증폭을 제공하지 않으면 차선책으로 간주됩니다. 차선의 결과는 일반적으로 MC-RPNI의 근육 이식편 수준의 문제에 기인할 수 있는데, 이는 불완전한 재생 및 그에 따른 재신경 분포가 표준 CMAP보다 낮아져 구조물의 전반적인 증폭 능력을 저하시킬 수 있기 때문입니다. 생성된 파형은 일반적으로 감쇠되어 눈에 띄게 비정상적인 모양으로 나타납니다. 근육 이식편이 완전히 실패하면 근육 구성 요소에서 측정 된 신호가 존재하지 않거나 (중요한 흉터 조직에 이차적) 상류 신경에서 생성 된 CNAP를 미러링 할 수 있습니다.
그림 1: MC-RPNI의 예시적인 개략도. 표적 말초 신경은 주변 근육 이식편 내에서 노란색으로 볼 수 있습니다. MC-RPNI는 몇 배 더 큰 복합 근육 활동 전위 (CMAP)의 생성을 통해 마이크로 볼트 수준에서 포함 된 신경의 모터 원심성 활동 전위를 증폭 할 수 있습니다. 이것은 배경 소음과 쉽게 구별되는 모터 의도의 감지를 용이하게합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생체 내 MC-RPNI. MC-RPNI는 반대쪽 사지에서 채취한 자가 신근 디지토룸 롱구스(EDL) 근육 이식편을 사용하여 제작됩니다. 그런 다음 초기 제조시 흰색 (A)으로 윤곽이 그려진 MC-RPNI의 예와 함께 공통 비골 신경에 원주 방향으로 고정됩니다. 이와 동일한 MC-RPNI는 3개월 후 종말점 평가 시점의 (B)에 다시 나타나 있다. MC-RPNI는 주변 근육과 유사한 착색을 가지며 볼륨의 좋은 부분을 유지했습니다. 위축성 근육 이식편의 예가 (C)에 나와 있습니다. MC-RPNI는 주변 흉터 및 결합 조직과 유사한 모양을 가지며 상당한 부피를 잃었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MC-RPNI 조직학. (A) M은 근육 구성 요소를 나타내고 N은 신경을 나타내는 MC-RPNI 단면의 H & E. (b) MC-RPNI를 갖는 래트에서 동측측 원위신경분포 EDL 근육의 단면. (c) MC-RPNI가 없는 대조군 래트에서 EDL 근육의 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: MC-RPNI의 면역염색. 왼쪽 상단의 이미지는 핵이 파란색(DAPI)으로 표시되고 신경 조직이 녹색(뉴로필라멘트)으로 표시된 MC-RPNI 표본의 세로 부분을 보여줍니다. 다른 MC-RPNI의 클로즈업은 오른쪽 하단에 여러 신경근 접합부가 있는 상태로 표시됩니다(아세틸콜린 수용체의 경우 빨간색의 알파-붕가로톡신). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 엔드포인트 전기생리학적 평가 설정. 전기 생리 학적 테스트에는 최소 3 개의 전극이 필요합니다 : (1) 접지 전극 - 그림이 표시되지 않음; (2) 신경 자극 양극성 전극; 및 (3) 바이폴라 기록 전극. 이 설정에서 양극성 자극 후크 전극은 일반적인 비골 신경에 배치 된 이미지의 오른쪽에 흰색으로 볼 수 있습니다. 기록 바이폴라 프로브 전극은 원위 MC-RPNI에 배치됩니다. 그런 다음 최대 CMAP가 달성 될 때까지 후크 전극에서 근위 신경 자극 후 MC-RPNI에서 신호가 기록됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 표준 전기생리학적 파형. 이 그래프는 근위 CP 신경 자극 후 이식된 MC-RPNI를 가진 쥐의 전기생리학적 분석 중에 캡처된 전형적인 파형을 보여줍니다. (A) 파란색으로 MC-RPNI에 가까운 CP 신경에서 기록 된 CNAP (*)가 그림으로 표시됩니다. 시스템 아티팩트는 (**)로 표시됩니다. (B) (A)에서 생성된 CNAP에 이어 MC-RPNI로부터 기록된 대표적인 CMAP이다. (C) 동측 원위 신경 분포 EDL 근육으로부터 기록 된 결과적인 CMAP 파형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 쥐 아이디 | 쥐 무게 (g) | 신경 CNAP 진폭 (μV) | MC-RPNI CMAP 진폭 (MV) | 신경 신호 증폭 인자 | 대기 시간(밀리초) |
| 1 | 421 | 123.3 | 1.4 | 11.35 | 0.8 |
| 2 | 368 | 65.6 | 1.6 | 24.39 | 1.05 |
| 3 | 390 | 110.7 | 4.5 | 40.65 | 1.45 |
| 4 | 482 | 217.2 | 3.61 | 16.62 | 0.95 |
| 5 | 417 | 144.6 | 1.39 | 9.61 | 0.9 |
| 6 | 417 | 156.1 | 3.4 | 21.78 | 0.95 |
| 7 | 381 | 82 | 7.2 | 87.8 | 0.9 |
| 8 | 393 | 87.9 | 2.3 | 26.17 | 1.15 |
| 9 | 378 | 87.8 | 4.2 | 47.84 | 1 |
| 10 | 459 | 해당 없음 | 5.3 | 해당 없음 | 1.55 |
| 11 | 380 | 해당 없음 | 2.1 | 해당 없음 | 0.75 |
| 12 | 415 | 해당 없음 | 2.4 | 해당 없음 | 1 |
표 1: MC-RPNI의 종말점 전기생리학적 분석. 제조 후 3 (래트 1-9) 및 6 (래트 10-12) 개월에 종점 분석을받는 래트로부터 얻은 결과의 선택. 근위 공통 비골 (CP) 신경 자극 후, 하류 CP 신경에서 복합 신경 활동 전위 (CNAP)가 기록되었고, 하류 MC-RPNI에서 복합 근육 활동 전위 (CMAP)가 기록되었다. 각 테스트의 증폭 인자는 오른쪽 열에서 볼 수 있습니다. 참고 : 쥐 10-12의 경우, MC-RPNI에 근접한 CNAP는 좌골 신경에서 CP 신경의 이륙에 너무 가깝게 MC-RPNI를 제조함으로써 발생하는 해부학 적 한계를 감안할 때 측정 할 수 없었다. 기록된 평균 CNAP 진폭은 14.87μV± 119.47μV인 반면 평균 CMAP 진폭은 3.28mV ± 0.49mV로 평균 증폭 계수는 31.8± 7.70이었습니다.
| 쥐 아이디 | 맥시멀 트위치 (mN) | V | 맥시멀 테타니 (mN) | V | Hz | 로 (밀리미터) |
| 1 | 927.13 | 3 | 2668.29 | 3 | 80 | 30.64 |
| 2 | 768.22 | 3.5 | 2677.85 | 3.5 | 80 | 31.15 |
| 3 | 646.99 | 3 | 2164.84 | 3 | 80 | 28.36 |
| 4 | 863.62 | 3.5 | 3109.67 | 3.5 | 150 | 31.07 |
| 5 | 774.48 | 1.5 | 2723.24 | 2 | 80 | 28.83 |
| 6 | 558.19 | 4 | 1930.22 | 4 | 120 | 29.46 |
| 7 | 753.97 | 1 | 2605.64 | 1 | 100 | 31.13 |
| 8 | 768.38 | 2 | 2897.08 | 2 | 100 | 31.86 |
| 9 | 559.9 | 1.5 | 1984.17 | 1.5 | 100 | 31.11 |
| 10 | 600.6 | 5.5 | 2416.09 | 5.5 | 80 | 32.51 |
| 11 | 770.27 | 5.5 | 2496.89 | 5.5 | 80 | 31.89 |
| 12 | 672.22 | 2.5 | 1740.04 | 2.5 | 50 | 31.34 |
표 2: 이식된 MC-RPNI를 사용한 쥐의 근력 분석. MC-RPNI가 원위 신경 분포 근육 기능에 영향을 미치는지 확인하기 위해 동측 신근 디지토룸 롱구스(EDL) 근육에 대한 근력 테스트를 수행했습니다. 근위 CP 신경 자극 후, 힘 추적이 기록되고 관심 테스트와 관련된 활성 힘이 계산되었습니다. Lo는 최대 힘을 생성하는 최적의 근육 휴식 길이로 정의되었습니다. 이식 된 MC-RPNI를 가진 쥐로부터 기록 된 평균 최대 트 위치 힘은 722.0 mN ± 32.11 mN이었고 기록 된 평균 최대 파상풍 힘은 2451 mN ± 115 mN으로 대조군 동물로부터 얻은 값과 유사합니다 (최대 트 위치 : 822.2 mN ± 41.11 mN; 최대 테 타니 : 2497 mN ± 122 mN).
동영상 1: 근위부 신경 전기 자극 후 MC-RPNI 수축. 오른쪽의 후크 전극이 제공하는 근위 신경 전기 자극에 따라 MC-RPNI의 가시적 인 근육 수축이 중앙에서 볼 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MC-RPNI는 외골격 장치를 정확하게 제어하기 위해 손상되지 않은 말초 운동 신경의 원심성 활동 전위를 증폭할 수 있는 새로운 구조입니다. 특히, MC-RPNI는 EMG 신호를 기록할 수 없는 심각한 근육 질환 및/또는 근육 부재로 인한 사지 약화가 있는 개인에게 특별한 이점을 제공합니다. 이미 손상된 근육 기능을 줄이면이 인구에서 치명적일 것입니다. 그러나, MC-RPNI는 원위-신경분포된 근육(52 )에 해를 끼치지 않고 이러한 신경 신호 증폭을 제공할 수 있는 능력을 갖는다(표 1 및 표 2). 근육계 또는 하부 운동 뉴런 질환을 갖는 개인에서, 말초 감각 신경은 전형적으로 질환 과정에 의해 영향을 받지 않는다(53). 감각이 보존됨에 따라 신경을 연속적으로 유지하고 손상을 방지하는 것이 필수적이며, MC-RPNI는 조직학(그림 3), 면역조직화학(그림 4) 및 근육 기능 평가(표 2)를 기반으로 원위 신경분포 표적 전체에 대한 손상을 방지하는 것으로 보입니다.
MC-RPNI는 포함된 말초 신경의 측부 축삭 돋아 개념에 의존하는데, 이는 선행 연구(52)와 잘 설명된 종단 간 뉴로라피(54,55)의 수술 기술 모두에서 쉽게 입증된 개념이다. MC-RPNI 제조 중 근육 이식편의 적절한 재신경 분포를 보장하고 원위 신경 분포 대상에 대한 부정적인 영향을 방지하려면 신경을 세심하게 다루는 것이 필수적입니다. 신경을 해부하는 동안 상피 신경 또는 결합 조직의 간결한 취급만으로 외상을 피할 수 있습니다. 그러나, MC-RPNI 제조에서 신경 손상의 가능성은 상피신경 창 단계 동안 가장 높다. 신경 섬유의 날카로운 절개를 피하려면 실험적이지 않은 쥐를 여러 번 연습 한 후에 고출력 수술 현미경 (최소 5x)으로만이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 이 단계는 마스터하기 위해 여러 번 시도 할 수 있으며 실험 분석을 목적으로하는 쥐에게이 단계를 먼저 수행하지 않는 것이 좋습니다. 이론적으로, 연속성 신경종은 MC-RPNI 제조 후, 특히 심각한 신경 외상이있는 경우 발생할 수있는 합병증입니다. 그러나이 합병증은 개발 과정에서 수년 동안 발생하지 않았습니다.
MC-RPNI로 수행 된 대부분의 실험은 원위 신경 분포 표적의 평가뿐만 아니라 상대적으로 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 일반적인 비골 신경에서 수행되었습니다. 이론적으로 운동 구성 요소가있는 말초 신경을 대체 할 수 있습니다. 순수 감각 축삭은 근육 조직에 감각 구성 요소 (스핀들 섬유, 골지 힘줄 기관 등)가 있기 때문에 활용 될 수 있지만 이러한 실험은 지금까지 수행되지 않았으며 결과를 예측하기 어렵습니다. MC-RPNI의 근육 이식편 성분의 경우, 이식편은 이식편 길이 및 쥐의 연령에 따라 20-150mg의 범위이며, 임의의 유사한 크기의 근육 이식편이 성공적으로 활용될 수 있다. 근육 이식편 재생은 부분적으로 혈관 재생 능력에 의존하며, 크고 두꺼운 이식편은 괴사 및 섬유증을 겪을 가능성이 더 높으며 전체 신호 전달 능력56에 영향을 미칩니다. RPNI에 대해 특별히 수행 된 연구에 따르면 성공적인 근육 재생 및 최대 300mg56의 이식편에서 신호 증폭 유지가 나타났습니다. 쥐 번식과 관련하여, 실험 목적으로 사용되는 다른 쥐의 대다수가 신경 손상57,58에 이차적으로 자해하는 것으로 알려져 있기 때문에 Lewis와 Fischer가 권장됩니다.
전반적으로 MC-RPNI 제조에 대한 현재 경험은 <5%의 실패율을 생성했습니다. 보이는 가장 흔한 구조 실패는 일반적으로 근육 이식편에 기인하며, 노출시 위축되거나 신경에서 이탈되는 것으로 나타납니다. 이탈된 MC-RPNI는 일반적으로 제조 시 부적절한 봉합으로 인해 발생하며, 이는 원주방향으로 감싼 근육 이식편의 "개방"과 포함된 신경의 최종 부분 압출로 이어집니다. 그러나 이러한 MC-RPNI는 일반적으로 이식편의 일부가 여전히 신경에 고정된 상태로 유지되기 때문에 신호 증폭 능력의 어느 정도(감소되었지만)를 유지합니다. 위축성 MC-RPNI는 전형적인 골격근 모양이 없기 때문에 노출시 분명하며 밝은 분홍색에서 회색 / 흰색 착색의 흉터 조직과 구별 할 수없는 경우가 많습니다 (그림 2C). 근육 조직의 위축은 감염, 너무 크거나 두꺼운 근육 이식편, 급성 혈액 손실 빈혈, 제조 중 근육 및/또는 신경 손상, 신경에 이식편의 피스톤을 유발하는 상피신경 고정 봉합사의 실패를 포함한 많은 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 전기 생리학 테스트에서 위축성 MC-RPNI는 일반적으로 신호 증폭을 거의 또는 전혀 생성하지 않습니다. 고감도 전극을 사용하는 경우 위축성 근육을 통해 기저 신경의 CNAP를 기록할 수 있습니다. 여러 실험 대상에서 심각한 위축이 발견되면 프로토콜로 돌아가서 조정이 필요한 단계를 결정해야합니다. 물론 평가를 수행할 때 신호가 기록되지 않으면 문제를 해결하고 구성이 실패했다고 가정하지 않는 것이 중요합니다. 신호 부족은 손상된 전극(임피던스 <16 Ω 권장), 잘못된 전극 구성 또는 부적절한 근위 신경 자극(일부 신경은 다운스트림 MC-RPNI에서 CMAP를 생성하기 위해 0.5-5mA 전기 자극이 필요함)에 이차적일 수 있으므로 장치 설정 문제를 해결하는 것이 가장 중요합니다.
사지 약화 환자에서 외골격 사용을위한 인간-기계 인터페이스의 현재 방법은 일반적으로 말초 신경 또는 근육 조직의 EMG에서 얻은 기록에 의존합니다. 이전에 논의된 바와 같이, MC-RPNI는 EMG 기록이 불가능한 심하게 손상되거나 결석한 근육 조직을 가진 개인에 대한 외골격 제어와 관련하여 상당한 이점을 제공합니다29. MC-RPNI는 또한 신경외 전극 30,31,32,33, 근막 내 전극34,35,36 및 관통 전극37,38,39,40을 포함한 전류 말초 신경 인터페이스 옵션에 비해 이점을 제공합니다. . 고유한 신경 신호는 일반적으로 마이크로볼트 수준이므로 MC-RPNI는 이러한 신경 신호를 30배 이상 증폭할 수 있어 배경 소음으로부터 운동 의도를 정확하게 감지하여 신뢰할 수 있는 외골격 제어를 가능하게 합니다. 만성적으로 사용되는 현재의 전극 기반 방법은 궁극적으로 생체 내 물질 수명 및 이물질 반응에 내재된 합병증을 극복하기 위해 고군분투하며, MC-RPNI는 생물학적 기원을 고려할 때 피할 수 있는 합병증입니다. 시간이 지남에 따라 이러한 이물질 반응은 조직 손상, 흉터 조직 형성, 궁극적인 축삭 탈수초 및 변성을 초래합니다. 최대 6개월까지 수행된 실험에서는 원위 신경분포 근육 조직의 신경 손상, 흉터 또는 섬유증/퇴행의 증거가 발견되지 않았으며(그림 3), 3년의 관찰 기간 동안 인간 피험자에서 관찰된 RPNI 안정성과 함께47, MC-RPNI가 수년에서 수십 년의 규모로 말초 신경과 성공적으로 인터페이스할 수 있다는 결론을 내리는 것이 합리적입니다.
MC-RPNI는 근육 자체뿐만 아니라 신경계 수준에서 발생하는 병리를 포함하여 다양한 병리학에서 외골격 제어에 활용되도록 고안되었습니다. 예를 들어, 근육 기반 병리에는 외상, 근이영양증, 염증성 근병증 및 중증 근무력증에 이르는 상태가 포함될 수 있습니다. 이러한 상태 1,2,3을 초래할 수있는 심각한 근육 손상과 약화에도 불구하고 대다수는 MC-RPNI 재 신경 분포 및 운동 의도 감지를 용이하게하는 낮은 운동 뉴런 기능을 가지고 있습니다. 광범위한 근육 질환 (근이영양증 등)을 초래하는 조건의 경우, 자유 근육 이식 성분이 영향을받을 수 있으므로 증폭 가능성이 제한 될 수 있습니다. 그러나 단일 모터 유닛(10-400μV)59의 검출이 말초 신경 신호의 증폭을 제공할 수 있다는 점을 감안할 때, MC-RPNI가 이 집단에서 외골격 제어를 용이하게 하기 위해 더 작고 정의된 영역 내에 충분한 모터 유닛을 포함할 것이라고 가정하는 것이 합리적입니다. 그러나 구조물의 중요한 한계는 뇌졸중, 척수 손상, 척수 근육 위축 (SMA) 및 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 같이 상부 및 / 또는 하부 운동 뉴런을 현저하게 감소시키는 병리학에 있습니다. MC-RPNI를 재신경질시키는 데 적합한 말초 신경 섬유 집단이 없으면 재생 및 신호 증폭을 제공할 수 없어 구성 실패로 이어집니다. 적절한 MC-RPNI 기능에 필요한 기능적 말초 신경 섬유의 최소 집단을 결정하기 위한 실험이 수행되고 있습니다.
MC-RPNI의 전신 인 RPNI는 전이 된 말초 신경에서 생성 된 신호의 증폭 및 기록을 통해 인간 피험자의 전동 보철물을 정확하게 제어함으로써 헤아릴 수없는 성공을 보여주었습니다. 특히 보철 장치의 재수술이나 재교정 없이 수개월에서 몇 년 규모로 그렇게 할 수 있습니다. 외골격 제어를 위한 인간-기계 인터페이스 방법의 일반적인 불만은 누화로 인한 신호 오염 및 EMG 의존 방법에서 빈번한 재교정의 필요성26,27,28 및 2차 수술이 필요한 시간 경과에 따른 말초 신경 인터페이스 불안정성37,39,44 . 그러나 MC-RPNI는 생물학적 구성과 전략적 배치 능력을 고려할 때 이러한 합병증을 피할 수 있습니다. 인간 피험자에게 사용할 수 있는 길을 닦고 궁극적으로 사지 쇠약이 있는 사람들에게 정확하고 신뢰할 수 있는 외골격 장치를 널리 활용하기 위해서는 이 구조에 대한 철저한 이해를 확립하는 것이 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 전문적인 실험실 관리 및 기술 지원에 대해 Jana Moon과 이미징 전문 지식에 대해 Charles Hwang에게 감사를 표합니다. 이 논문의 실험은 SS (3135146.4)에 대한 성형 외과 재단 보조금과 SS에 대한 수상 번호 1F32HD100286-01에 따른 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소, 국립 보건원의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 수상 번호 P30 AR069620.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 2-N-thin film load cell (S100) | Strain Measurement Devices, Inc | SMD100-0002 | Measures force generated by the attached muscle |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fine Forceps - mirror finish | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine tipped forceps with mirror finish ideal for handling delicate structures like nerves |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Force Measurement Jig | Red Rock | n/a | Custom designed force measurement jig that allows for immobilization of hindlimb to allow for accurate muscle force recording |
| MATLAB software | Mathworks, Inc | PR-MATLAB-MU-MW-707-NNU | Calculates active force for each recorded force trace from passive and total force measurements |
| Nicolet Viasys EMG EP System | Nicolet | MFI-NCL-VIKING-SELECT-2CH-EMG | Portable EMG and nerve signal recording system capable of simultaneous 2 channel recordings from nerve and/or muscle |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| Vannas Spring Scissors - 2mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-04 | Curved micro-dissection scissors used to perform the epineurial window |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
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