Summary
Tilgang til desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk som kan distribueres i samfunnet for desentralisert testing er avgjørende for å bekjempe globale helsekriser. Dette manuskriptet beskriver hvordan man bygger papirbasert diagnostikk for virale RNA-sekvenser som kan oppdages med en bærbar optisk leser.
Abstract
Tilgang til molekylær diagnostikk med lav byrde som kan distribueres i samfunnet for testing, blir stadig viktigere og har meningsfulle bredere implikasjoner for samfunnets velvære og økonomisk stabilitet. De siste årene har flere nye isotermiske diagnostiske modaliteter dukket opp for å møte behovet for rask, billig molekylær diagnostikk. Vi har bidratt til dette arbeidet gjennom utvikling og pasientvalidering av tåholdbryterbasert diagnostikk, inkludert diagnostikk for myggbårne Zika- og chikungunya-virus, som ga ytelse som kan sammenlignes med gullstandard revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) baserte analyser. Disse diagnostikkene er billige å utvikle og produsere, og de har potensial til å gi diagnostisk kapasitet til lavressursmiljøer. Her gir protokollen alle trinnene som er nødvendige for utvikling av en bryterbasert analyse for Zika-virusdeteksjon. Artikkelen tar leserne gjennom den trinnvise diagnostiske utviklingsprosessen. For det første tjener genomiske sekvenser av Zika-virus som innganger for beregningsdesign av kandidatbrytere ved hjelp av åpen kildekode-programvare. Deretter vises samlingen av sensorene for empirisk screening med syntetiske RNA-sekvenser og optimalisering av diagnostisk følsomhet. Når den er fullført, utføres validering med pasientprøver parallelt med RT-qPCR, og en spesialbygd optisk leser, PLUM. Dette arbeidet gir et teknisk veikart til forskere for utvikling av rimelige tåholdbryterbaserte sensorer for applikasjoner innen menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.
Introduction
RT-qPCR har forblitt gullstandardteknologien for klinisk diagnostikk på grunn av sin utmerkede følsomhet og spesifisitet. Selv om metoden er svært robust, er den avhengig av dyrt, spesialisert utstyr og reagenser som krever temperaturkontrollert distribusjon og lagring. Dette gir betydelige barrierer for tilgjengeligheten av kvalitetsdiagnostikk globalt, spesielt i tider med sykdomsutbrudd og i regioner der tilgangen til velutstyrte laboratorier er begrenset 1,2. Dette ble observert under Zika-virusutbruddet 2015/2016 i Brasil. Med bare fem sentraliserte laboratorier tilgjengelig for å tilby RT-qPCR-testing, resulterte betydelige flaskehalser, noe som begrenset tilgangen til diagnostikk. Dette var spesielt utfordrende for personer i peri-urbane omgivelser, som ble mer alvorlig påvirket av utbruddet 3,4. I et forsøk på å forbedre tilgangen til diagnostikk, viser protokollen en plattform som er utviklet med potensial til å gi desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk i lavressursinnstillinger. Som en del av dette ble det etablert en diagnostisk oppdagelsesrørledning, som koblet isotermisk forsterkning og syntetiske RNA-bryterbaserte sensorer med papirbaserte cellefrie uttrykkssystemer 5,6.
Cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS), spesielt E. coli-baserte cellefrie systemer, er en attraktiv plattform for et bredt spekter av biosensingsapplikasjoner fra miljøovervåking 7,8 til patogendiagnostikk 5,6,9,10,11,12 . CFPS-systemer består av komponentene som er nødvendige for transkripsjon og oversettelse, og har betydelige fordeler i forhold til helcellebiosensorer. Spesielt er sensing ikke begrenset av en cellevegg, og generelt er de modulære i design, biosafe, billig og kan frysetørkes for bærbar bruk. Evnen til å frysetørke genkretsbaserte reaksjoner på underlag som papir eller tekstiler, muliggjør transport, langtidslagring ved romtemperatur5, og til og med innlemmelse i bærbar teknologi13.
Tidligere arbeid har vist at E. coli-cellefrie systemer kan brukes til å oppdage mange analytter, for eksempel giftige metaller som kvikksølv, antibiotika som tetracyklin 7,14, hormonforstyrrende kjemikalier15,16, biomarkører som hippursyre 17, patogenassosierte quorumsfølermolekyler 9,18 og ulovlige stoffer som kokain 17 og gammahydroksybutyrat (GHB)19 . For sekvensspesifikk påvisning av nukleinsyrer har strategier for det meste vært avhengig av bruk av bryterbaserte biosensorer koblet til isotermiske forsterkningsteknikker. Toehold-brytere er syntetiske riboregulatorer (også referert til som bare "brytere" i resten av teksten) som inneholder en hårnålsstruktur som blokkerer nedstrøms oversettelse ved å sekvestrere det ribosomale bindingsstedet (RBS) og startkodonet. Ved interaksjon med målutløseren RNA blir hårnålsstrukturen lettet og påfølgende oversettelse av en reporter åpen leseramme er aktivert20.
Isotermisk forsterkning kan også brukes som molekylær diagnostikk21; Imidlertid er disse metodene utsatt for ikke-spesifikk forsterkning, noe som kan redusere spesifisiteten og dermed nøyaktigheten av testen til under RT-qPCR 22. I arbeidet som er rapportert her, ble isotermisk forsterkning oppstrøms for bryterbaserte sensorer brukt til å gi kombinert signalforsterkning som muliggjør klinisk relevant deteksjon av nukleinsyrer (femtomolar til attomolar). Denne sammenkoblingen av de to metodene gir også to sekvensspesifikke sjekkpunkter som i kombinasjon gir et høyt spesifisitetsnivå. Ved hjelp av denne tilnærmingen har tidligere arbeid vist påvisning av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, samt patogene bakterier som C. difficile23 og antibiotikaresistent tyfus12. Senest har cellefrie tåholdbrytere blitt demonstrert for SARS-CoV-2-deteksjon i arbeidet med å gi tilgjengelig diagnostikk for COVID-19-pandemien11,12,13.
Følgende protokoll skisserer utvikling og validering av cellefri, papirbasert syntetisk tåholdbryteranalyse for Zika-virusdeteksjon, fra biosensordesign i silico , gjennom monterings- og optimaliseringstrinn, til feltvalidering med pasientprøver. Protokollen begynner med in silico-design av RNA toehold-bryterbaserte sensorer og isotermiske forsterkningsprimere som er spesifikke for Zika viral RNA. Selv om det finnes mange isotermiske amplifikasjonsmetoder, ble det her vist bruk av nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon (NASBA) for å øke konsentrasjonen av viralt RNA-mål som er tilstede i reaksjonen, noe som muliggjør klinisk signifikant følsomhet. Praktisk sett har isotermiske forsterkningsmetoder fordelen av å operere ved konstant temperatur, og eliminerer behovet for spesialutstyr, for eksempel termiske syklister, som generelt er begrenset til sentraliserte steder.
Deretter beskrives prosessen med å montere de syntetiske tåholdbrytersensorene med reporterkodingssekvenser gjennom overlappingsforlengelses-PCR, og screening av de syntetiske tåholdbrytersensorene for optimal ytelse i cellefrie systemer ved bruk av syntetisk RNA. For dette settet med Zika-virussensorer har vi valgt lacZ-genet som koder for β-galaktosidase-enzymet, som er i stand til å spalte et kolorimetrisk substrat, klorfenol rød-β-D-galaktopyranosid (CPRG), for å produsere en gul til lilla fargeendring som kan oppdages med øye eller med en plateleser. Når topppresterende syntetiske brytere er identifisert, beskrives prosessen for screening av primere for nukleinsyresekvensbasert isotermisk forsterkning av den tilsvarende målsekvensen ved bruk av syntetisk RNA for å finne sett som gir best følsomhet.
Til slutt valideres ytelsen til diagnoseplattformen på stedet i Latin-Amerika (figur 1). For å bestemme den kliniske diagnostiske nøyaktigheten utføres den papirbaserte cellefrie analysen ved bruk av Zika-virusprøver fra pasienter; parallelt utføres en gullstandard RT-qPCR-analyse for sammenligning. For å overvåke kolorimetriske cellefrie analyser aktiverer vi kvantifisering av resultater på stedet i områder der termiske sykluser ikke er tilgjengelige. Den håndmonterte plateleseren kalt Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; heretter kalt bærbar plateleser) introduseres også her24. Opprinnelig utviklet som en følgesvenn enhet for cellefri syntetisk tåholdbryterdiagnostikk, tilbyr den bærbare plateleseren en tilgjengelig måte å inkubere og lese resultater på en høy gjennomstrømningsmåte, og gir integrert, datasynsbasert programvareanalyse for brukere.
Figur 1: Arbeidsflyt for testing av pasientprøver med papirbaserte cellefrie tåholdsbryterreaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer mennesker skal utføres i samsvar med etiske standarder og relevante retningslinjer, inkludert de etiske prinsippene for medisinsk forskning som involverer mennesker, fastsatt av Helsinkideklarasjonen fra Verdens legeforening. Denne studien ble godkjent av human research ethics committee under lisensprotokollnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190. Informert samtykke fra alle pasienter inkludert i denne studien ble frafalt av Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) for diagnostiske prøver.
MERK: PLUM-enheten vil heretter bli referert til som en "bærbar plateleser".
1. Beregningsorientert design av nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsprimere
- Skann Zika-genomet for å identifisere et sett med kandidatregioner for forsterkning som er omtrent 200 nukleotider (nt) til 300 nt i lengde ved å sette genomisk sekvens i NCBI / Nucleotide BLAST25,26. Sammenlign genomet mot referanse RNA-sekvenser (refseq_rna) og søk etter nettsteder som forblir svært bevart og ikke har homologi med det menneskelige genomet (andre BLAST-parametere forblir uendret). Velg minst to steder for å designe den syntetiske tåholdbryteren.
- Bruk utvalgskriteriene til Deiman et al.27 for å generere par fremover og bakover nukleinsyresekvensbaserte amplifikasjonsprimere for hver kandidatforsterkningsregion. Kort sagt, følg disse kriteriene for å designe primere: (1) GC-innhold mellom 40% -60%; (2) 20 til 24 nt i lengde med DNA-smeltetemperatur over 41 °C; (3) ingen løp av fire eller flere identiske nukleotider; (4) det endelige 3' nukleotidet er en A-base; (5) lav primer sekundær struktur og dimer formasjon sannsynlighet. Skjerm 8-10 primerpar for hvert målområde (anbefales).
- Legg til prefikssekvensen som inneholder T7-promotorsekvensen AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(T7-promotorsekvens understreket) til 5'-enden av fremoverprimerne for å tillate transkripsjon av amplikonene ved bruk av T7 RNA-polymerase (RNAP). Bestill primerne som DNA-oligoer fra et DNA-synteseselskap.
2. Beregningsdesign av tåholdbrytere
- Installer NUPACK28 versjon 3.2 (nukleinsyredesignsuite) basert på instruksjonene på nettstedet29. Bruk et UNIX-operativsystem og MATLAB (numerisk databehandlingsplattform) som programmeringsspråk (anbefales).
- Identifiser målsekvensene (f.eks. virusgenom) som er spesifikke for patogenet av interesse for toehold-bryterdesignene som i trinn 1.1. Velg Zika-målsekvensene fra nukleinsyresekvensbaserte amplikoner generert i trinn 1.2.
MERK: I praksis kan enten nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsprimere eller syntetiske tåholdbrytere utformes og testes først, avhengig av brukernes behov. Hvis bestemte målområder av interesse allerede er etablert (f.eks. fra eksisterende publikasjoner eller diagnostiske protokoller), kan toehold-bryterdesign og screening forekomme først, etterfulgt av design og screening for nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsprimere. Hvis det ikke er noen etablerte målregioner, vil første skjermkjernesyresekvensbaserte forsterkningsprimere mot hele genomet begrense de valgte målene mens du velger for primerforsterkningseffektivitet. Hvis flere sekvenser for patogenet er tilgjengelige, er det best å designe nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsprimere som fokuserer på svært konserverte regioner (i stedet for å screene hele genomet). - Last ned og installer den nødvendige MATLAB-programvaren på datamaskinen.
- Sett opp miljøvariablene slik at nukleinsyredesignsuitefunksjonene kan kalles i programvaren. Dette gjør du ved å åpne programvaren og deretter åpne (eller opprette) en startup.m-fil i standard arbeidsmappe. Deretter kopierer du følgende kodelinjer til startup.m-filen, og til slutt legger du til mappen som inneholder binærfilene for nukleinsyredesignpakken til PATH:
NUPACKINSTALL = '/Brukere/[user_name]/.../nupack3.2.2';
setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]); - Åpne den numeriske databehandlingsplattformprogramvaren og naviger til designprogramvaremappen. Kjør designalgoritmene som er tilgjengelige på https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
- Skriv inn målsekvensene i design_input_file.csv som ligger i inndataundermappen. Inngangene inkluderer Navn, Ytre sekvens, Indre sekvens, Temperatur, Utgangsnavn og Utdatasekvens som definert i tabell 1. Hvis ingen grunningssteder er bestemt ennå for målet, må du holde indre og ytre sekvenser de samme. Bare de første 29 nt av reporteren vil bli vurdert under designprosessen. Når du er ferdig, lagrer og lukker du det oppdaterte regnearket.
MERK: Utgangssekvensen er sekvensen av reporterproteinet som er planlagt å bli brukt til analysen (f.eks. Spesifisering av indre og ytre sekvenser sikrer at algoritmen ikke genererer syntetiske tåholdbrytere som overlapper med noen av primerne. Det sikrer også at analysen gjenkjenner tre unike steder i Zika-genomet for å forbedre spesifisiteten. - Velg parametrene som skal brukes for designfunksjonen: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, alternativer). Fyll ut parameterverdiene som:
- num_designs - antall toppdesign for hver målutgang av programvaren. Standard er 6 og kan endres etter behov (minst seks utforminger for hvert mål anbefales).
- input_file - denne parameteren angir navnet på filen som gir inngangssekvensinformasjonen. Standardverdien er 'design_input_file.csv' og kan endres etter behov.
- Velg mellom følgende alternativer - (1) SeriesA og SeriesB: versjonen (e) av toehold-bryteren som koden vil generere. Sett SeriesB til 1 og SeriesA til 0 for å generere serie B toehold-bryter, som er formatet som brukes i Zika-virusdiagnostikken6; (2) Parallell: satt til 1 for å utnytte flere kjerner for å beregne designene; ellers satt til 0; (3) Antisense: satt til 1 for å generere tåholdbrytere som hybridiserer antisense-sekvensen (dvs. det omvendte komplementet) av målinngangen; Ellers settes du til 0.
- Kjør designfunksjonen ved hjelp av de valgte parametrene: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algoritmen vil da begynne å generere toehold-bryterdesignene for målene av interesse.
- Når designen er fullført, finn designsekvensene for topptåholdbryteren og de tilsvarende målsekvensene i final_designs-mappen i form av regneark .csv format. Toehold-bryterens DNA-sekvenser generert av algoritmen vil inneholde T7-promotorsekvensen i 5'-enden og den konserverte 21 nt linker-sekvensen AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG i 3'-enden.
- Screen den resulterende toppen tåhold bytte design sekvenser mot andre vanlige virus ved å sette dem på NCBI-BLAST og se etter sekvens homologi. Godta sekvenser med 40% homologi eller mindre.
- Bestill tåholdbryterens hårnålssekvenser som DNA-oligoer og sett dem senere sammen med reportergenet til fullt funksjonelle brytere. Bestill de nødvendige PCR-primerne for påfølgende sensormontering, avhengig av det valgte reporterproteinet.
| Parameter | Definisjon |
| Navn | De ønskede navnene på utgangs-toehold-brytersekvensene. |
| Ytre sekvens | Full NASBA-transkripsjon produsert fra forsterkning. |
| Indre sekvens | Den ytre sekvensen unntatt primerbindingsstedene. Den samsvarer med den ytre sekvensen, men utelukker delene av transkripsjonene som binder seg til forover- og reversprimerne. |
| Temperatur | Temperaturen som brukes av algoritmene til å beregne RNA-strukturene. |
| Navn på utdata | Navnet på outputgenet (f.eks. lacZ, gfp). |
| Utgang sekvens | Sekvensen av utgangsgenet. |
Tabell 1: Definisjonen av hver parameter som brukes i toehold-bryterdesignprogramvaren.
3. Konstruksjon av tåholdbrytere med PCR
MERK: Disse trinnene beskriver konstruksjonen av LacZ tåholdbrytere ved overlappingsforlengelse PCR. Her brukes DNA-oligoen som en fremoverprimer og T7-terminatoren brukes som en omvendt primer. Vi bruker pCOLADuet-LacZ-plasmidet som mal for lacZ-genet (addgene: 75006). Eventuelle andre DNA-maler som inneholder den tilsvarende sekvensen kan brukes som maler, forutsatt at T7-terminatoren er inkludert i den endelige konstruksjonen.
- Når syntetiske DNA-oligoer er mottatt fra den kommersielle leverandøren, tilbered løsninger av syntetisk DNA og omvendt amplifikasjonsprimer i en konsentrasjon på 10 μM i nukleasefritt vann. Monter reaksjoner i PCR-rør på is i henhold til tabell 2.
MERK: PCR-volumer kan skaleres etter behov. Bruk en minimal mengde (0,1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA-mal for å unngå behovet for et ekstra plasmidfjerningstrinn eller bakgrunns LacZ-signal. For høyere DNA-malmengder, følg PCR med et DpnI-restriksjonsenzymfordøyelse for å fjerne gjenværende plasmidmal. - Plasser reaksjonene i en termisk syklus, etter sykkelforholdene som er oppført i tabell 3. Analyser PCR-produktene på en agarosegel (figur 2; se tilleggsprotokoll og30).
- Rens PCR-produktene ved hjelp av et spinnsøylebasert PCR-rensesett og eluer DNA i 15-30 μL nukleasefritt vann, i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifiser DNA ved hjelp av et spektrofotometer.
| Komponent | Volum | Konsentrasjon |
| 5X Q5 reaksjonsbuffer | 10 μL | 1x |
| 10 mM dNTP-er | 1 μL | 200 μM |
| 10 mM fremoverprimer (syntetisk bryter DNA FW) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| 10 mM omvendt primer (T7 terminator RV) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| Mal DNA (pCOLADuet-LacZ) | variabel | <1 ng |
| Q5 High-Fidelity DNA-polymerase | 0,5 μL | 0,02 U/μL |
| Nuclease-fritt vann | til 50 μL | - |
Tabell 2: PCR-komponentene som brukes til å konstruere tåholdsbrytere.
| Skritt | Temperatur | Tid | |
| Innledende denaturering | 98 °C | 30 s | |
| 35 sykluser | Denaturering | 98 °C | 10 s |
| Annealing | 60 °C | 20 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 1,45 min | |
| Endelig forlengelse | 72 °C | 5 minutter | |
| Holde | 4 °C | - | |
Tabell 3: Sykkelforhold brukt under bygging av tåholdbrytere ved PCR.
4. Fremstilling av syntetisk RNA-mål (Trigger)
- Ved hjelp av en molekylærbiologisk designprogramvare, modifiser de syntetiske utløser-RNA-malene (valgt i trinn 1.1) for å inkludere en oppstrøms T7-promotorsekvens, slik at hele malen forblir kort (<200 bp). Design forover- og reversprimere for å forsterke utløsersekvensprimeren (for oligo-sekvenser, se Tilleggsprotokoll).
- Bestill sekvensene som DNA-oligoer. Når mottatt, rekonstituer det syntetiske utløser-DNA og amplifikasjonsprimere til 10 μM i nukleasefritt vann. Monter de tilsvarende PCR-ene i tynnveggsrør på is i henhold til tabell 2 og bruk 0,5 μL av utløser-DNA-ultrameren (endelig konsentrasjon på 0,1 μM) som mal-DNA.
- Plasser reaksjonene i en termisk syklus og bruk sykkelforholdene som er oppført i tabell 3. Bruk en forlengelsestid på 15 s. Vurder kvaliteten og rens trigger-PCR-produkter som beskrevet i trinn 3.3 og tilleggsprotokollen.
MERK: For å fremskynde prosessen kan kolonnerensede trigger-PCR-produkter også brukes direkte til første toehold-bryterscreening.
5. In vitro transkripsjon av utvalgte triggersekvenser
- Monter reaksjonskomponenter på is i henhold til tabell 4.
- Inkubere inn vitro transkripsjon (IVT)-reaksjoner ved 37 °C i 4 timer, etterfulgt av DNase I-behandling for å fjerne mal-DNA. For DNase I-trinnet, tilsett 70 μL nukleasefritt vann, 10 μL 10x DNase I Buffer og 2 μL DNase I (RNase-fri), og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter. Hvis du ikke går videre til trinn 5.4 umiddelbart, må du deaktivere DNase I med tillegg av 50 mM EDTA og varmeinaktivering ved 65 °C i 10 minutter.
- Valgfritt trinn: Utfør denaturerende polyakrylamidgelelektroforese (f.eks. urea-PAGE) analyse på IVT-produktene for å vurdere RNA-kvalitet som beskrevet i tilleggsprotokollen.
- Rens utløseren IVT-produktene ved hjelp av et kolonnebasert RNA-oppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner, og kvantifiser deretter RNA-konsentrasjonen og renheten ved hjelp av spektrofotometri. Se tilleggsprotokoll for instruksjoner om hvordan du bestemmer molariteten og kopinummeret / μL av RNA.
| Komponent | Volum | Konsentrasjon |
| 10X reaksjonsbuffer | 1,5 μL | 0,75x |
| 25 mM NTP-blanding | 6 μL | 7,5 mM |
| Mal utløser DNA | X μL | 1 μg |
| T7 RNA-polymeraseblanding | 1,5 μL | - |
| Nuclease-fritt vann | X μL | Til 20 μL |
Tabell 4: In vitro transkripsjon (IVT) av utvalgte triggersekvenser.
6. Innledende screening av bryterne
MERK: Denne delen beskriver trinnene knyttet til å sette opp cellefrie, papirbaserte tåholdbryterreaksjoner, og hvordan du skjermer for høytytende tåholdbrytere. BSA-blokkert filterpapir som brukes i trinn 6.10, bør utarbeides på forhånd som beskrevet i tilleggsprotokollen.
- Forbered en CPRG-stamløsning ved å oppløse 25 mg av pulveret i 1 ml nukleasefritt vann. Oppbevar oppløsningen på is til enhver tid og oppbevar den ved -20 °C for langvarig bruk.
- Bestem antall reaksjoner som skal konfigureres. For hver toehold-bryter som vurderes, ta med en ingen malkontroll (ingen bryter og ingen mål-RNA-ellers kjent som cellefri alenekontroll) for å ta hensyn til bakgrunnssignal som kan oppstå fra hovedmiksen. Inkluder en bryterkontroll bare for å vurdere bakgrunnsbryterlekkasje eller AV-hastighet i fravær av mål-RNA.
- Sett sammen en cellefri reaksjonsmasterblanding av løsning A, løsning B, RNasehemmer og CPRG på is i henhold til standardprotokollen listet opp i tabell 5.
MERK: Trinnene beskrevet her er for en masterblanding som vil være tilstrekkelig for et tredobbelt sett med 1,8 μL reaksjoner med tilsatt 10% volum for å ta hensyn til pipetteringsfeil. Mastermiksvolumet bør justeres etter behov, avhengig av antall toehold-brytere som er screenet. - For hver tredoble cellefrie reaksjon, dispenser masterblandingen i et PCR-rør, og hold alle rørene på is. For røret som er satt til side som cellefri alenekontroll, tilsett nukleasefritt vann til et endelig volum på 5,84 μL, bland ved pipettering opp og ned, og sentrifuger kort. For resten av rørene, tilsett PCR-renset tåholdbryter-DNA til en endelig konsentrasjon på 33 nM.
- For rør som er satt til side som bryter alene, tilsett nukleasefritt vann til et endelig volum på 5,84 μL. For rør satt til side for å teste tåholdbryteren og mål-RNA-kombinasjonen, tilsett in vitro transkribert mål-RNA til en endelig konsentrasjon på 1 μM. Tilsett deretter nukleasefritt vann til et endelig volum på 5,84 μL. Bland alle reaksjoner grundig ved pipettering opp og ned, og sentrifuger kort.
- Tilsett 30 μL nukleasefritt vann til brønnene rundt reaksjonsbrønnene på en 384-brønns svart, klarbunnet plate. Dette minimerer fordampning i løpet av forsøket og forbedrer reproduserbarheten.
MERK: Hvis du bruker den bærbare plateleserenheten, plasserer du en PCR-folie over platen og bruker en presisjonskniv til å kutte ut brønnene som er beregnet for din reaksjon, samt hver av de fire hjørnebrønnene. PCR-folien forhindrer overeksponering av kameraet på den bærbare plateleseren fra tomme brønner. - Bruk en 2 mm biopsistans og pinsett, kutt BSA-blokkerte filterpapirdisker og plasser dem i reaksjonsbrønnene, enten ved å kaste ut stansen eller bruke pinsett (se Tilleggsprotokoll for fremstilling av BSA-blokkert filterpapir). Dispenser tre ganger 1,8 μL volumer fra hvert reaksjonsrør på filterpapirskivene i 384-brønnsplaten, og hold alle prøvene, så vel som 384-brønnplaten, på is til enhver tid.
MERK: Hvis du bruker den bærbare plateleserenheten, legger du til 1,8 μL CPRG (0,6 mg / ml) til hvert av de fire hjørnene på 384-brønnplaten. Den gule fargen fra CPRG gir mønstergjenkjenning til den bærbare plateleseren for justering av den digitale flerbrønnsplatemalen i bildeanalyse. Dekk platens brønner med PCR-film for å forhindre fordampning. - Legg platen i en plateleser, les OD570 ved 37 °C hvert minutt i 130 min.
| Komponent | Volum | Endelig konsentrasjon per reaksjon |
| Løsning A | 2,38 μL | 40% |
| Løsning B | 1,78 μL | 30% |
| RNase-hemmer | 0,03 μL | 0,5 % v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold-bryter | X μL | 33 nM |
| Mål RNA | X μL | 1 μM |
| Nuclease-fritt vann | til 5,94 μL | - |
| Totalt volum: | 5,94 μL | |
Tabell 5: PURExpress cellefrie transkripsjons-oversettelsesreaksjonskomponenter.
7. Identifisere høytytende tåholdbrytere
MERK: Denne delen beskriver hvordan du analyserer data fra trinn 6 for å velge de beste tåholdbryterne du vil gå videre med.
- Begynn dataanalysen ved først å normalisere til bakgrunnen OD570 absorbans. For å gjøre dette, trekk OD 570-målingene av reaksjoner som ikke har noen bryter- eller mål-RNA (dvs. cellefrie alenebrønner) fra de andre OD570-målingene.
- Glatt ut de normaliserte dataene ved hjelp av et trepunkts glidende gjennomsnitt og juster minimumsverdien for hver brønn til null. Se figur 3 for et eksempel på normaliserte tidskursdata samlet inn for tåholdbryterne 27B, 33B og 47B.
- Ved hjelp av disse behandlede dataene beregner du foldeendringen (eller ON / OFF-forholdet) ved å bestemme forskjellen i fargeendringshastigheten (dvs. endring i OD570 over tid) mellom tåholdbryteren og målet og bryteren alene brønner (se Tilleggsprotokoll for beregning av forholdet; Figur 4).
- Velg brytere med den høyeste PÅ/AV-foldeendringen for ytterligere karakterisering. Utelat de dårlig fungerende tåholdbryterne som viser den laveste foldeendringen.
8. Nukleinsyresekvensbasert amplifikasjonsprimerscreening og følsomhet
MERK: I de følgende trinnene gjøres først en skjerm for funksjonelle isotermiske forsterkningsprimere, og deretter vurderes følsomheten deres ved å bestemme antall mål-RNA-kopier per μL syntetisk RNA som en gitt tåholdbryter pålitelig kan oppdage når den kombineres med isotermisk forsterkning. Etter isotermisk forsterkning, utfør cellefrie reaksjoner for å identifisere vellykkede nukleinsyresekvensbaserte amplifikasjonsprimersett. Det kan imidlertid være mer kostnadseffektivt å kjøre polyakrylamid- eller agarosegeler på nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsreaksjoner for først å begrense bassenget av kandidatprimersett. I så fall kan nukleinsyresekvensbaserte amplifikasjonsprimersett som genererer et bånd på gelen ved riktig amplikonstørrelse, kortlistes for etterfølgende cellefri screening.
- Lag en 25 μM lagerløsning av alle fremre og omvendte grunningssett i nukleasfritt vann (se tilleggsprotokoll). Bestem antall nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsreaksjoner og påfølgende cellefrie reaksjoner som må settes opp. Dette vil avhenge av antall tåholdbrytere og respektive primersett.
MERK: Når du screener primerne, er det viktig å alltid inkludere en ikke-malkontroll for hvert primersett for å ta hensyn til eventuelle bakgrunnsartefakter som kan oppstå på grunn av primerassosiert uspesifikk forsterkning. - Sett opp en 5 μL reaksjon som følger (skaler dette etter behov). Tine alle reagensene på is. Sett sammen en reaksjonsmasterblanding av reaksjonsbufferen, nukleotidblandingen og RNase-hemmeren i henhold til tabell 6. Bland grundig ved pipettering opp og ned til det hvite bunnfallet er solubilisert, og dispenser deretter aliquots i PCR-rør.
- Hvis masterblandingen er for screening av nukleinsyresekvensbaserte forsterkningsprimere, ekskluder primerne fra masterblandingen først (dispenser 2,55 μL masterblanding). Ellers, hvis du utfører primerfølsomhetsanalyse, kan primerne inkluderes i masterblandingen (i så fall dispensere 2,75 μL aliquots). Tilsett enzymblandingen etter denaturerings- og likevektstrinnene.
- Hvis screening nukleinsyre sekvensbasert forsterkning primere, legg til fremover og bakover primere til de aktuelle rørene. På en termisk syklus, sett opp inkubasjonsprotokollen som beskrevet i tabell 7.
- Tilsett 1 μL av enten nukleasefritt vann eller 1 μL målutløser-RNA ved 2 pM eller ca. 106 kopier / μL, og sørg for å merke rørene tilsvarende. Bland ved forsiktig pipettering og spinn kort ned rørene.
MERK: For primer sett screening, bruk en konsentrasjon av målutløser RNA som er høy nok til ikke å påvirke den nedre grensen for deteksjon av isotermisk amplifikasjonsmetode, men ikke høy nok til å gi aktivering av tåholdbryteren hvis ingen forsterkning skulle oppstå. - Flytt rørene til termisk syklist og start inkubasjonen. Etter 12 min, fjern rørene og tilsett 1,25 μL av enzymblandingen til hvert rør. Bland ved pipettering opp og ned og sentrifuger rørene kort.
MERK: På dette tidspunktet kan rørene oppbevares ved romtemperatur; Enzymblandingen bør imidlertid holdes på is til den tilsettes rørene. - Returner rørene til den termiske syklusen, hopp over 41 ° C hold-trinnet for å starte 1 time reaksjonsinkubasjon.
MERK: Etter inkubasjon kan reaksjonene legges på is for behandling samme dag eller fryses ved -20 °C for senere behandling. - Følg trinn 6.2-6.7 og tabell 8 for å montere papirbaserte cellefrie tåholdbryterreaksjoner for å vurdere primerytelsen. Analyser data som beskrevet i trinn 7.1-7.2 og figur 3.
MERK: I tillegg til kontrollene som tidligere er nevnt, er det viktig å også inkludere den negative kontrollen for å ta hensyn til eventuelle bakgrunnssignaler som kan oppstå fra reaksjonen. I tillegg er det viktig å også inkludere en kontroll med bryteren og 2 pM (endelig konsentrasjon) av mål-RNA, som en ikke-NASBA-forsterkningskontroll. - Identifiser kandidatprimerpar for å gå videre med sensitivitetsanalyse. Primerpar velges basert på om tåholdbryteraktivering oppstår etter tilsetning av den inkuberte reaksjonen. Gjenta om nødvendig primerskjermen med flere primerkombinasjoner.
- Ved å holde RNA-prøver på is til enhver tid, gjør du følgende serielle fortynningssett med mål-RNA i nukleasefritt vann: 104, 103, 10 2, 101 og 100 RNA-kopier / μL. Gjenta nukleinsyresekvensbasert forsterkning og cellefrie reaksjoner med de valgte primersettene (trinn 8.2-8.7), og test seriell fortynningsserie for å identifisere primersettene som gir best følsomhet. Se figur 5 for et eksempel på resultater for å bestemme primersettfølsomheten.
MERK: Ideelt sett bør den valgte tåholdbryteren og primerparet oppdage så få som 1-100 mål-RNA-kopier per μL av RNA (lagerløsningskonsentrasjon). - Gjenta nukleinsyresekvensbasert amplifikasjonsfølsomhetseksperiment i biologisk triplikat. Dette trinnet tjener til å bekrefte reproduserbarheten av resultatene før du går over til eksperimenter med pasientprøver.
- Valgfri: For å ha en pålitelig kilde til bryter-DNA for langvarig bruk og for transport, klone de valgte brytersekvensene til et plasmid ved hjelp av en hvilken som helst konvensjonell kloningsmetode. På samme måte kan målutløser-RNA-sekvensen også klones til et valgfritt plasmid for lagring.
| Komponent | Volum per reaksjon | Endelig konsentrasjon |
| NASBA Reaksjon Buffer | 1,67 μL | 1x |
| NASBA Nukleotid Mix | 0,833 μL | 1x |
| 25 μM fremadrettet primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| 25 μM omvendt primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| RNase-hemmer (40 U/μL) | 0,05 μL | 0,4 U/μL |
| Mål RNA | 1 μL | |
| NASBA Enzym Mix | 1,25 μL | 1x |
| Totalt volum | 5 μL |
Tabell 6: NASBA reaksjonskomponenter.
| Skritt | Temperatur | Tid |
| Denaturering | 65 °C | 2 minutter |
| Likevekt | 41 °C | 10 minutter |
| Holde | 41 °C | ∞ |
| Inkubasjon | 41 °C | 1 time |
| Holde | 4 °C | - |
Tabell 7: Reaksjonsbetingelser for NASBA.
| Komponent | Volum | Endelig konsentrasjon per reaksjon |
| Løsning A | 2,38 μL | 40% |
| Løsning B | 1,78 μL | 30% |
| RNase-hemmer | 0,03 μL | 0,5 % v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold-bryter | X μL | 33 nM |
| Mål-RNA (hvis aktuelt) | X μL | 1 μM |
| NASBA (hvis aktuelt) | 0,85 μL | 1:7 |
| Nuclease-fritt vann | til 5,94 μL | - |
| Totalt volum: | 5,94 μL | |
Tabell 8: Papirbaserte cellefrie reaksjonskomponenter.
9. Innsamling av pasientprøver og viral RNA-ekstraksjon
MERK: Denne delen beskriver protokollen for å samle pasientprøver og å trekke ut RNA ved hjelp av et RNA-rensesett. Protokollen nedenfor brukes til å oppnå serum fra perifert blod. Prøvene som ble brukt i denne studien ble samlet inn fra pasienter med feber, eksantem, artralgi eller andre relaterte symptomer på arbovirusinfeksjon i Pernambuco-staten, Brasil.
- Samle perifere blodprøver fra mistenkte arbovirusinfiserte pasienter. Utfør venepunktur (fullblodsrør) ved hjelp av en standard aseptisk teknikk. Merk prøverørene med en anonym kode og datoen for prøveinnsamlingen.
- Sentrifugeblod for å skille serumet ved 2,300 x g i 10 minutter. Bruk en pipette, lag aliquots av serum (200 μL) som skal brukes til RNA-ekstraksjon i 1,5 ml rør.
MERK: Hvis det ikke er mulig å utføre RNA-ekstraksjonen kort tid etter prøveinnsamling, bør serumprøver lagres ved -80 °C før nedstrøms applikasjoner. - Pipette 560 μL forberedt Buffer AVL (viral lysisbuffer) som inneholder bærer-RNA i et 1,5 ml rør. Tilsett 140 μL serum til Buffer AVL / carrier RNA-blandingen i røret. Bland ved puls-vortexing i 15 s.
- Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, og sentrifuger deretter prøven kort for å samle innholdet i bunnen av røret. Tilsett 560 μL etanol (96% -100%) til prøven og bland ved pulsvirvel i 15 s. Etter blanding sentrifuger du prøven for å samle innholdet i bunnen av røret.
- Tilsett forsiktig 630 μL av løsningen fra trinn 9,4 til spinnsøylen uten å fukte felgen. Følg dette trinnet, lukk hetten og sentrifugen ved 6,000 x g i 1 min. Plasser spinnsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast det brukte oppsamlingsrøret som inneholder filtratet.
- Åpne spinnsøylen forsiktig, og gjenta trinn 9.5. Åpne spinnsøylen forsiktig og tilsett 500 μL buffer AW1 (vaskebuffer 1). Lukk hetten, og sentrifuger ved 6000 x g i 1 min. Plasser spinnsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast det brukte oppsamlingsrøret som inneholder filtratet.
- Åpne spinnsøylen forsiktig og tilsett 500 μL buffer AW2 (vaskebuffer 2). Lukk lokket og sentrifugen ved 20 000 x g i 3 minutter. Plasser spinnsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør, og kast det brukte oppsamlingsrøret som inneholder filtratet.
- For å unngå kontaminering med restbuffer AW2, som kan forårsake problemer i nedstrøms enzymatiske reaksjoner, plasser spinnsøylen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast det brukte oppsamlingsrøret med filtratet. Sentrifuge ved 20 000 x g i 1 min.
- Plasser spinnsøylen i et rent 1,5 ml rør og kast det brukte oppsamlingsrøret med filtratet. Åpne spinnsøylen forsiktig og tilsett 60 μL buffer AVE (elueringsbuffer) som er likevektet til romtemperatur. Følg dette trinnet, lukk hetten og inkuber ved romtemperatur i 1 min.
- Sentrifuge ved 6,000 x g i 1 min. Det eluerte RNA kan deretter brukes som inngang for NASBA- og RT-qPCR-ene parallelt.
- Følg trinn 8.3 til 8.11 for å utføre nukleinsyresekvensbasert forsterkning og papirbaserte cellefrie reaksjoner ved bruk av 1 μL ekstrahert pasient-RNA, og sørg for å inkludere negative og positive kontrollreaksjoner. Etter reaksjonene, klargjør du reaksjonsplaten med 384 brønner og kjører analysen i den bærbare plateleserenheten ved 37 °C (se detaljer i tilleggsprotokollen).
MERK: To RNA-konsentrasjoner på 104 og 102 PFU/ml, ekstrahert fra dyrket zikavirus, brukes som positive kontroller for alle eksperimenter under den kliniske valideringen. I tillegg til kontrollene som tidligere er nevnt, er det viktig å også inkludere utløseren (10 ng/μL) som en positiv kontroll. - På slutten av hvert eksperiment kan rådataene (.csv-filen) fra den bærbare plateleseren lastes opp til en sikker database online. I tillegg genererer den bærbare plateleseren en rapport som indikerer om prøvene er positive eller negative for Zika-virus (figur 6); se avsnittet om representative resultater for eksempler på alle grafene som er oppnådd under inkubasjonen (figur 7).
MERK: Brukere kan også overføre filer fra den bærbare plateleseren til sin egen datamaskin via USB.
10. Bærbar plateleserenhet
- Den bærbare plateleserenheten (figur 8) kan brukes som et alternativ til en konvensjonell plateleser24. For protokollen og representative resultater, se Tilleggsprotokoll.
11. RT-qPCR for Zika virus deteksjon
MERK: Denne delen beskriver trinnene for å utføre RT-qPCR for Zika-virusdeteksjon fra pasientprøver (se Tilleggsprotokoll).
- For å unngå kontaminering monterer du RT-qPCR-komponentene i et område som er isolert fra forsterkningsprosessen (f.eks. Ren hette). Plasser RT-qPCR-bufferen, enzymer og primer/sonder på is eller en kuldeblokk. Etter dette legger du til reaksjonene på en 384-brønnplate på is i henhold til tabell 9.
MERK: Negativ (ekstraksjonskontroll og ikke-malkontroll [NTC]) og positiv kontroll (104 PFU/ml) anbefales for alle eksperimenter. - Etter tilsetning av reagensene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, bland reaksjonen ved pipettering opp og ned (ikke vortex), og dispenser 6,5 μL i hver brønn. Legg til 3,5 μL av hver RNA-mal i tre eksemplarer.
- Plasser en PCR-film over toppen av platen. Sentrifuge 384-brønnplaten ved 600 x g i 2 minutter.
- Plasser platen i en RT-qPCR-maskin ved hjelp av følgende sykkelforhold som er beskrevet i tabell 10. For å analysere resultatene, bruk RT-qPCR-maskinens design- og analyseprogramvare og vurder automatisk terskel og grunnlinje (se detaljer i tilleggsprotokollen).
| Komponent | Volum | Konsentrasjon |
| 2X QuantiNova-sonde RT-PCR Master Mix | 5 μL | 1 X |
| 100 μM fremadrettet primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 100 μM omvendt primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 25 μM sonde | 0,04 μL | 0,1 μM |
| QuantiNova ROX Referanse fargestoff | 0,05 μL | 1 X |
| QuantiNova sonde RT Mix | 0,1 μL | 1 X |
| Mal RNA | 3,5 μL | - |
| Nuclease-fritt vann | til 10 μL | - |
Tabell 9: RT-qPCR-komponenter for å forsterke Zika-virus RNA basert på Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA-protokoll for å oppdage Zika-virus fra pasientprøver31.
| Skritt | Temperatur | Tid | |
| Omvendt transkripsjon | 45 °C | 15 minutter | |
| Første aktiveringstrinn for PCR | 95 °C | 5 minutter | |
| 45 sykluser | Denaturering | 95 °C | 5 s |
| Kombinert glødning/forlengelse | 60 °C | 45 s | |
Tabell 10: Sykkelforhold for RT-qPCR.
Representative Results
Etter beregningsdesignrørledningen ble konstruksjonen av tre tåholdbrytere utført av PCR. PCR-produktene ble analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese (figur 2). Tilstedeværelsen av et klart bånd rundt 3000 bp, omtrent størrelsen på lacZ-genet koblet til en tåholdbryter, indikerer vanligvis en vellykket reaksjon. Alternativt indikerer et kjørefelt uten bånd, flere bånd eller et bånd av feil størrelse en mislykket PCR. Ved mislykket PCR bør reaksjonsbetingelsene og/eller primersekvensene optimaliseres.
De monterte tåholdbryterne ble screenet for å vurdere hver sensor mot sine respektive in vitro transkriberte trigger-RNA (figur 3). Mens alle tre sensorene viste økt OD 570-absorbans, hadde bryter27B (figur 3A) den raskeste frekvensen. Brytere 33B og i mindre grad 47B viste en økt OD570-absorbans i fravær av målutløser-RNA, noe som indikerer at disse bryterne har noe bakgrunnsaktivitet eller lekkasje (figur 3B, C) -en egenskap som ikke er ønsket i en kandidatsensor, da den kan redusere spesifisiteten. For å tydeligere identifisere sensoren med det høyeste ON/OFF-signalforholdet ble foldeendringen av OD 570-absorbansen beregnet (se tilleggsinformasjon avsnitt 5) og plottet inn (figur 4). Fra denne analysen er det klart at bryter 27B er sensoren som har best ytelse med et ON / OFF-forhold på rundt 60.
Følsomheten til den topppresterende tåholdbryteren (27B) ble deretter evaluert ved å bestemme den laveste RNA-konsentrasjonen som kreves for å aktivere tåholdbryteren når den kombineres med en NASBA-reaksjon. Grafen illustrerer at de beste Zika-sensorene kan oppdage RNA i konsentrasjoner så lave som 1,24 molekyler per μL (tilsvarende ~ 2 aM; Figur 5).
Etter at bryter 27B ble identifisert og validert, ble sensormaterialet distribuert til teammedlemmene i Recife i Pernambuco-staten i Brasil. I Brasil ble den kliniske diagnostiske nøyaktigheten til Zika-virusdiagnostisk plattform vurdert ved hjelp av Zika-viruspasientprøver, parallelt med RT-qPCR for sammenligning. For å validere den papirbaserte Zika-diagnostiske plattformen ble den bærbare plateleseren brukt, som er i stand til å inkubere og lese kolorimetrisk utgang av papirbaserte sensorer. Fargeendringen fra gul til lilla brukes til å identifisere en positiv prøve, mens en negativ prøve forblir gul (figur 6). Et ekstra alternativ for å visualisere resultatene generert av den bærbare plateleseren (figur 8) er å plotte kolorimetrisk respons for hver papirbasert reaksjon over tid. Prøvene ble testet i tre eksemplarer og de som oversteg grenseverdien (rød linje satt til 1) ble vurdert som positive, mens prøver under grenseverdien ble vurdert som negative (figur 6 og figur 7).
Til slutt, for å evaluere og sammenligne den kliniske ytelsen til Zika toehold-brytersensoren med den nåværende gullstandardmetoden for diagnostisering av Zika-virusinfeksjon, ble alle pasientprøver testet parallelt med RT-qPCR. Forsterkningsplottet til to representative pasientprøver ble testet i tre eksemplarer for påvisning av zikavirus med RT-qPCR (figur 9). Prøvene anses som positive når syklusterskelverdien (Ct) er ≤38; den røde linjen indikerer en positiv prøve og den blå linjen indikerer en negativ prøve for Zika-virus.
Figur 2: Agarosegelelektroforese for å vurdere kvaliteten på PCR-produkter. PCR-produkter analyseres på en 1% agarosegel i 1X TAE, kjørt ved 80 V i 90 minutter. Et enkelt klart bånd indikerer vanligvis en vellykket reaksjon. Kjørefelt 1: 1 kb DNA-stige; Baner 2-4: 27B bryter DNA, 33B utløser DNA og 47B utløser DNA, henholdsvis. Tallene på venstre side representerer båndstørrelse i bp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prototyping av tre tåholdbrytere for papirbaserte zikasensorer. Ytelsen til tre papirbaserte RNA toehold-brytersensorer ble målt ved 37 °C i over 130 minutter. Hver graf inneholder to spor, den ene representerer bryteren bare kontroll, mens den andre representerer bryteren og utløseren. De tre grafene representerer data samlet inn ved hjelp av tåholdbrytersensorer 27B (A), 33B (B) og 47B (C). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) fra tre replikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sensorer med best ytelse identifiseres ved å beregne foldeendringen i absorbans ved 570 nm. Foldeendring (eller maksimalt ON / OFF-forhold) beregnes ved å måle forholdet mellom absorbans (OD570) ved 130 minutter mellom bryterkontrollen, og bryteren pluss utløser CFPS-analysen. Feilfelt representerer SEM fra tre replikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Sensitivitetsvurdering av bryteren som gir best resultater. In vitro transkribert Zika RNA titreres til NASBA-reaksjoner. Etter en inkubasjon på 1 time ble reaksjonene tilsatt cellefrie PURExpress-reaksjoner på papirplater i forholdet 1:7. Foldeendringen etter 130 min ved 37 °C er plottet. Dette tallet er gjengitt fra24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Bærbar plateleseropptaksside lastet med fangede bildedata. Denne illustrasjonen viser et eksempelbilde av det endelige bildet som ble tatt av den bærbare plateleseren under en datainnsamling. Det opprinnelige dato-/tidsstempelet er synlig øverst på bildet. Gul farge indikerer kontroll eller negative reaksjoner, og den lilla fargen indikerer en positiv reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Dataanalysemodus. Til venstre velger brukerne datasettene de vil tegne inn; Grafene vises deretter til høyre med unike farger for hver prøve eller kontrollsett. Den stiplede røde linjen fungerer som en terskel for å bestemme positive og negative prøver. Prøver testet i tre eksemplarer som overskrider terskelen anses som positive, mens prøver under terskelen anses som negative. Feilfelt representerer standardavvik (SD) fra tre replikasjoner. Ctrl 1 til Ctrl 5 indikerer kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. PLUM, en bærbar plateleser. Denne bærbare plateleseren fungerer som en lab-in-a-box og fungerer som en temperaturkontrollert plateleser for å inkubere og overvåke kolorimetriske reaksjoner. Denne bærbare enheten kan gi kvantitative målinger og målinger med høy gjennomstrømning av papirbaserte Zika-sensorer på stedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: RT-qPCR-plott av forsterkningen av to pasientprøver testet i tre eksemplarer for påvisning av Zika-viruset. Prøver anses som positive når syklusterskelverdien (Ct) er ≤38. Den stiplede røde linjen fungerer som en terskel for å bestemme positive og negative prøver. Det røde sporet indikerer en positiv prøve, og det blå sporet indikerer en negativ prøve. ΔRn (delta Rn) -verdien representerer den normaliserte størrelsen på fluorescenssignalet oppdaget av RT-qPCR-instrumentet for alle prøvene som ble testet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende protokollfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tall. Klikk her for å laste ned disse tallene.
Discussion
Det kombinerte papirbaserte systemet beskrevet her kan bringe klinisk relevant molekylær diagnostikk, med ytelse som er funksjonelt sammenlignbar med RT-qPCR, til behovspunktet6. Det er viktig at for eksterne innstillinger kan tilgjengeligheten av diagnostikk på stedet redusere tiden til resultatene fra dager til timer. Ved å fremheve programmerbarheten til denne tilnærmingen, kan rørledningen som er beskrevet, brukes til å oppdage praktisk talt alle patogenmål. Vi har paret de molekylære verktøyene med en spesialbygd bærbar plateleser, som er kompakt og kompatibel med batteridrift (8–9 timer) og gir innebygd dataanalyse for å muliggjøre distribuerte applikasjoner. I annet arbeid har vi validert den kombinerte maskinvare- og Zika-virusdiagnostiske plattformen med 268 pasientprøver, parallelt med RT-qPCR, og funnet en diagnostisk nøyaktighet på 98,5%24. Samlet sett er målet vårt å muliggjøre teknologioverføring av denne plattformen til forskere slik at den kan brukes på nytt og forbedres av samfunnet for å møte udekkede diagnostiske behov.
Designprosessen for in silico toehold-bryteren er integrert og automatisert i en rørledning som kan deles inn i tre trinn. Den første fasen genererer et basseng med tåholdbryterdesign som hybridiserer til målsekvensen i trinn på ett nukleotid. Den andre fasen undersøker tilgjengeligheten av sekundærstrukturen og tåholdbryteren og eliminerer sensorer med for tidlige stoppkodoner i rammen. En scoringsfunksjon som vurderer flere faktorer (f.eks. feilnivå for toehold-bryteren, tilgjengeligheten av toehold-bryteren og tilgjengelighet på målstedet) implementeres deretter for å velge de beste tåholdbryterdesignene basert på samlede poengsummer. I sluttfasen genereres en liste over sekvenser for de øverste tåholdbryterdesignene og deres tilsvarende målutløsere. De øverste sensorsekvensene bør screenes for spesifisitet mot det humane transkriptomet og nært beslektede virale genomer ved bruk av NCBI/Primer-BLAST25. Det er også beste praksis å skjerme sensormålstedene for sekvensbevaring i Zika-virusgenomet for å sikre at sensorene vil gi bred og robust deteksjon. Flere versjoner av toehold switch design programvare er utviklet og designalgoritmen tillater brukere å generere to versjoner, enten serie A 6 eller serie B toehold brytere6. I denne artikkelen har fokuset vært på serie B toehold switch design.
Etter kommersiell DNA-syntese kan tåholdbryterne raskt settes sammen, og deretter testes ved å utføre en innledende skjerm mot en syntetisk målutløsersekvens som tilsvarer korte regioner (200-300 nt) av målgenomet. For screening av ytelsen til tåholdbryterbaserte sensorer, er det ideelt å legge til målsekvensen i form av RNA. I denne artikkelen er trinnene som kreves for å legge til in vitro transkribert utløser-RNA skissert. Imidlertid, hvis tilgjengelig, kan full-lengde genommaler som kvantifiserte virale RNA-ekstrakter eller kommersielle syntetiske RNA-genomer eller standarder brukes. Bruk av RNA-genomer i full lengde for innledende toehold-bryterscreening er gunstig, da det kan informere om flere faktorer, for eksempel RNA-sekundærstruktur, vil påvirke sensorens ytelse. For å optimalisere ON/OFF-forholdet mellom kandidatbrytere, kan toehold-bryterens DNA titreres til den cellefrie reaksjonen. Dette trinnet kan også tjene til å identifisere høytytende tåholdbrytere (foldforsterkning eller høyt ON / AV-forhold) og utelate lekkende tåholdbrytere (høyt signal i fravær av mål-RNA) fra nedstrøms karakteriseringstrinn.
For å forbedre deteksjonsgrensen for de beste toehold-bryterkandidatene, brukes NASBA til å øke klinisk relevante konsentrasjoner av mål Zika viral RNA til et nivå som kan oppdages av toehold-brytere6. Ulike kombinasjoner av fremre og bakover primersett screenes for å bestemme de beste NASBA-primer- og tåholdbryterkombinasjonene for å muliggjøre deteksjon ved klinisk relevante konsentrasjoner. Når et ideelt primersett og toehold-bryterkombinasjon er identifisert, blir analysen tatt frem til klinisk validering. Det er viktig å merke seg at toehold-bryteren og NASBA-screeningsstadiene kan være arbeids- og ressurskrevende, og derfor er testutvikling best egnet for ressurssterke forskningssteder. Selv om vi ikke har brukt prosessautomatisering, er det sannsynlig at dette kan akselerere den iterative design-, bygge- og testsyklusen32. Heldigvis kan behandlingstiden fra sensordesign og testing til distribusjon være bemerkelsesverdig kort (mindre enn en uke), noe som gjør denne strategien ideell for tidskritiske situasjoner, for eksempel epidemiske utbrudd6.
Selv etter at en biosensor med klinisk relevant sensitivitet er utviklet, er det tekniske utfordringer som må løses. Siden denne protokollen innebærer manuell betjening og er en flertrinnsprosedyre, er det fare for krysskontaminering mellom prøvene. Vi gjør vårt beste for å redusere denne risikoen gjennom nøye laboratoriepraksis. I en nylig klinisk studie av 268 pasientprøver møtte vi ingen forurensningsproblemer; Det er imidlertid et viktig hensyn24. Med dette i bakhodet forblir protokollen en laboratorieanalyse og krever en dyktig bruker med kommando av riktige molekylærbiologiske teknikker. En ekstra vurdering for distribusjon er RNA-isolasjonen fra pasientprøver. Her beskriver vi RNA-isolasjon ved hjelp av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett. I andre arbeider har vi imidlertid vist en effektiv og enkel kokelysemetode (95 °C i 2 min) for pasientprøvebehandling med lav belastning6. Denne strategien eliminerer nesten kostnadene forbundet med RNA-ekstraksjon og unngår bruk av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett, noe som kan utgjøre en logistikkutfordring i lavressursinnstillinger eller forsyningskjedeproblemer under kriser, for eksempel COVID-19-pandemien33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemien, kan instrumentene som brukes til å utføre RT-qPCR selv tjene som en flaskehals og begrense pasientens tilgang til testing. Denne faktoren, som også i stor grad er økonomisk, fører til en sentralisert testmodus som kan begrense diagnostisk tilgang. For eksempel, under Zika-utbruddet 2015/2016, var bare fem nasjonale referanselaboratorier tilgjengelige i Brasil, noe som forårsaket forsinkelser i pasienttesting. Uten å vurdere den potensielle fordelen med stordriftsfordeler, er dagens varekostnad for den bærbare plateleseren ~ $ 500 USD, som selv om den økes fem ganger for å ta hensyn til arbeidskraft og kommersiell margin, fortsatt gir et rimelig instrument. Dette sammenligner godt med RT-qPCR-instrumenter som varierer i pris fra $ 15.000 - $ 90.000 USD34. Videre er den estimerte kostnaden per test for den cellefrie analysen i Latin-Amerika rundt $ 5.48 USD, mens kostnaden per test av RT-qPCR i Brasil var ~ $ 10-11 USD på tidspunktet for Zika-utbruddet36. Utover kostnadene for utstyr har den bærbare plateleseren et lite fotavtrykk (20 cm3), automatisk analyse, dataopplasting til skyen via internett, og kan kjøres på batteristrøm. Disse funksjonene utvider dramatisk de potensielle innstillingene der testing kan distribueres og samtidig utvider pasientpopulasjonen som kan betjenes.
Til dags dato er de vanligste kommersielle E. coli CFPS-plattformene S30 og PURE systems37; Et viktig hensyn for å forbedre tilgangen til diagnostikk i lav- og mellominntektsland er imidlertid den begrensede innenlandske tilgjengeligheten av disse reagensene. Et viktig skritt mot å løse denne utfordringen er utviklingen av lokal CFPS-produksjon. Federici-laboratoriet har nylig gjort betydelige fremskritt mot å utvikle en ikke-kommersiell plattform for å implementere toehold-bryterbaserte sensorer i lysatbaserte cellefrie systemer, og nå en 2,7 fM LOD med Zika-virus RNA14. Ikke bare tillater denne oppnåelsen at reagensene kan gjøres i brukslandet, og unngår importtariffer og forsinkelser, men lønnskostnadene skaleres også til lokale priser, og dermed kan den totale kostnaden reduseres betydelig. I arbeidet skissert av Federici-gruppen var kostnadene ved å produsere CFPS-uttrykksreaksjonen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD) 35,38, noe som gir et dobbelt insentiv (forbedret logistikk og kostnad) for å implementere lysatbaserte systemer 35,38.
Plasseringen av RT-qPCR-sammenlignbar testing i distribuerte diagnostiske nettverk kan gi betydelige fordeler i forhold til dagens praksis som er avhengig av transport av prøver til sentraliserte RT-qPCR-anlegg. I peri-urbane omgivelser, hvor Zika-tilfeller var konsentrert, reduserer den fysiske avstanden mellom en pasient og det diagnostiske anlegget diagnosen og øker risikoen for at resultatene ikke når pasienten på et klinisk relevant tidspunkt. Det er vårt håp at arbeidet som presenteres her kan bidra til at forskningsmiljøet, gjennom overføring av kunnskap, kan skape desentralisert bioteknologi og bærbar maskinvare for menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.
Disclosures
K.P. og A.A.G. er medoppfinnere av papirbaserte tåholdsensorrelaterte teknologier. Y.G., S.C. og K.P. er medstiftere av LSK Technologies, Inc., og er medoppfinnere av PLUM-relaterte teknologier. M.K., K.P. og A.A.G. er medgrunnleggere av En Carta Diagnostics Ltd. Andre forfattere har ingen interessekonflikter. Patenter: PLUM-enhet: Y.G., S.C., og K.P. patentsøknad ble innlevert av University of Toronto og tildelt LSK Technologies Inc. US Provisional Patent Application No. 62/982,323 arkivert februar 27, 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., og J.J. C. "Riboregulator komposisjoner og metoder for bruk", Patent. WO2014074648A3 arkivert 6. november 2012; Papirbasert diagnostisk patent: K.P. og J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" USAs patentsøkte nr. US15/963,831 arkivert 6. desember 2013; Zika patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," US Provisional Patent Application No. 62/403,778 arkivert 4. oktober 2016; Zika patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," US Provisional Patent Application No. 62/341,221 arkivert 25. mai 2016.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle medlemmer av Green, Pardee og Pena laboratorier, samt alle medforfattere av tidligere manuskripter knyttet til arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet. SJRDS ble støttet av et doktorgradsstipend sponset av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasil, referansenummer IBPG-1321-2.12/18, og støttes for tiden av et postdoktorstipend sponset av University of Toronto, Canada. PB støttes av William Knapp Buckley Award fra Fakultet for farmasi, University of Toronto. M.K. ble støttet av Precision Medicine Initiative (PRiME) ved University of Toronto interne fellesskap nummer PRMF2019-002. Dette arbeidet ble støttet av midler til K.P fra Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 og 950-233107), University of Toronto's Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469), og til L.P, A.A.G. og K.P gjennom CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt av midler til K.P. fra Canadas International Development Research Center (stipend 109434-001) gjennom Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Dette arbeidet ble også støttet av midler til AAG fra en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-pris (1R21AI136571-01A1) til K.P./A.A.G, og et Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 ble opprettet med Biorender.com under akademisk lisens til K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 well plate covers - aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
| 384 well plate covers - transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
| 384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
| Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
| BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
| Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
| CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
| Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
| DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
| DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
| electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
| Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
| IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
| NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
| Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
| PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
| pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
| Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
| Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
| Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
| Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
| RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
| RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
| SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
| TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
| Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
- Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
- Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
- Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
- Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
- Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
- Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
- Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
- Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
- Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
- Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
- Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
- Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
- BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022).
- Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
- Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
- NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: http://www.nupack.org/ (2022).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
- Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
- Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
- Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
- Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
- Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
