Summary
Het huidige protocol biedt instructieve informatie voor het gebruik van tabakshoornworm Manduca sexta in cannabinoïde onderzoek. De hier beschreven methode omvat alle noodzakelijke benodigdheden en protocollen om fysiologische en gedragsveranderingen van het insectenmodel te volgen als reactie op cannabidiol (CBD) -behandeling.
Abstract
Met de toegenomen aandacht voor cannabinoïden in de geneeskunde, zijn verschillende zoogdiermodelorganismen gebruikt om hun onbekende farmaceutische functies op te helderen. Er zijn echter nog veel problemen in het onderzoek naar zoogdieren, wat de ontwikkeling van niet-zoogdiermodelorganismen voor cannabinoïde-onderzoek noodzakelijk maakt. De auteurs suggereren de tabakshoornworm Manduca sexta als een nieuw insectenmodelsysteem. Dit protocol biedt informatie over het voorbereiden van het kunstmatige dieet met verschillende hoeveelheden cannabidiol (CBD), het opzetten van een kweekomgeving en het monitoren van hun fysiologische en gedragsveranderingen als reactie op CBD-behandeling. Kortom, na ontvangst van hoornwormeieren kregen de eieren 1-3 dagen bij 25 °C op een licht-donkercyclus van 12:12 om uit te komen voordat ze willekeurig in de controle werden verdeeld (op tarwekiemen gebaseerd kunstmatig dieet; AD), voertuig (AD + 0,1% middellange keten triglyceride olie; MCT olie) en behandelingsgroepen (AD + 0,1% MCT + 1 mM of 2 mM CBD). Nadat de media waren voorbereid, werden de 1e instarlarven individueel in een reageerbuis van 50 ml geplaatst met een houten spiesstok en vervolgens werd de reageerbuis bedekt met een kaasdoek. Metingen werden genomen in intervallen van 2 dagen voor fysiologische en gedragsmatige reacties op de CBD-toediening. Deze eenvoudige kweekprocedure stelt onderzoekers in staat om grote exemplaren in een bepaald experiment te testen. Bovendien stellen de relatief korte levenscycli onderzoekers in staat om de impact van cannabinoïdebehandelingen over meerdere generaties van een homogene populatie te bestuderen, waardoor gegevens een experimenteel ontwerp in organismen met een hoger zoogdiermodel kunnen ondersteunen.
Introduction
In de afgelopen jaren is de publieke aandacht gericht op cannabinoïden vanwege hun therapeutisch potentieel, waaronder de behandeling van epilepsie1, de ziekte van Parkinson2, multiple sclerose3 en verschillende vormen van kanker4,5,6 met cannabidiol (CBD). Sinds cannabis is gelegaliseerd als een agrarisch product in de Agricultural Improvement Act van 2018, Public Law 115-334 (de Farm Bill van 2018), zijn cannabis en zijn cannabinoïdederivaten in de voedsel-, cosmetische en farmaceutische industrie exponentieel toegenomen. Daarnaast zijn klinische isolaten van enkelvoudige cannabinoïden en cannabinoïdemengsels met succes getest bij menselijke proefpersonen7, cellijnen5,8 en diverse diermodelsystemen9,10.
Een klinische studie zou ideaal zijn voor het valideren van de werkzaamheid en nadelige effecten van cannabinoïden op een specifieke ziekte. Er zijn echter tal van uitdagingen in klinische onderzoeken, waaronder ethische / IRB-goedkeuring, werving en behoud van de proefpersonen11. Om deze hindernissen te overwinnen, werden verschillende menselijke cellijnen gebruikt omdat van de mens afgeleide cellijnen kosteneffectief zijn, gemakkelijk te hanteren, de ethische kwesties kunnen omzeilen en consistente en reproduceerbare resultaten kunnen opleveren, omdat de cellijnen een 'zuivere populatie van cellen zijn die geen kruisbesmetting van andere cellen en chemicaliën hebben'12.
Alves et al. (2021)13 testten CBD op een dosisafhankelijke manier in de placentale trofoblasten, gespecialiseerde cellen van de placenta die een essentiële rol spelen bij embryo-implantatie en interactie met de gedecidualiseerde maternale baarmoeder14. Hun resultaten toonden aan dat CBD verlies van levensvatbaarheid van cellen, verstoring van de celcyclusprogressie en apoptose-inductie veroorzaakte. Deze observaties tonen de potentiële negatieve effecten van cannabisgebruik door zwangere vrouwen13. Evenzo werd een reeks cellijnen ook gebruikt om de farmacologische effecten van CBD bij menselijke ziekten te onderzoeken, in het bijzonder verschillende vormen van kanker. De in vitro studies hebben met succes anti-kanker effecten aangetoond in pancreas15, borst8 en colorectale kankercellen16. Hoewel ze op grote schaal beschikbaar en gemakkelijk te hanteren zijn, zijn specifieke cellijnen zoals HeLa, HEK293 gevoelig voor genetische en fenotypische veranderingen als gevolg van veranderingen in hun groeiomstandigheden of hantering17.
In cannabisonderzoek zijn verschillende diermodelsystemen, variërend van kleine dieren zoals muis18, cavia19 en konijn19 tot grote dieren zoals canine20, piglet21, monkey22, horse23, gebruikt om onbekende therapeutische effecten te onderzoeken. Muizen zijn het meest geprefereerde diermodelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek vanwege hun anatomische, fysiologische en genetische gelijkenis met mensen24. Het belangrijkste is dat muizen CB1 / 2-receptoren in hun zenuwstelsel hebben, die aanwezig zijn bij mensen. Ze hebben ook een kortere levenscyclus dan menselijke proefpersonen, met gemakkelijker onderhoud en overvloedige genetische bronnen, waardoor het veel gemakkelijker is om de effecten van cannabinoïden gedurende een hele levenscyclus te volgen. Het zoogdiersysteem wordt veel gebruikt en heeft met succes aangetoond dat CBD epileptische stoornissen1, posttraumatische stressstoornis9, orale zweren25 en dementie-achtige symptomen verlicht10. Het muismodel heeft ook een sociale interactiestudie van individuen binnen een gemeenschap mogelijk gemaakt, wat uiterst moeilijk is bij grote dieren en mensen26.
Ondanks alle voordelen van het diermodelsysteem is het nog steeds duur en vereist het intensieve zorg tijdens de toediening van geneesmiddelen en het verzamelen van gegevens. Bovendien is er onderzoek naar het gebruik van muizen in onderzoek vanwege onherleidbaarheid en slechte recapitulatie van menselijke omstandigheden als gevolg van beperkingen in experimenteel ontwerp en striktheid27.
Met de toenemende vraag naar medische/preklinische studies van cannabinoïden, is een niet-zoogdiermodelsysteem nodig. Ongewervelde modellen verleenden traditioneel onderscheidende voordelen ten opzichte van gewervelde modellen. De belangrijke voordelen zijn onder meer het gemak en de lage kosten van het fokken van veel exemplaren en het in staat stellen van onderzoekers om meerdere generaties genetisch homogene populaties te volgen28. Een recente studie bewees dat de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, een effectief insectenmodelsysteem is om farmacologische functies van cannabinoïden te onderzoeken bij het moduleren van voedingsgedrag29. Onder de insectenmodelsystemen concentreerden de auteurs zich op de tabakshoornworm, Manduca sexta, ook bekend als Carolina-sfinxmot of haviksmot, als een nieuw insectenmodelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek.
Manduca sexta behoort tot de familie van de pijlstaarten . Het insect is de meest voorkomende plantenplaag in het zuiden van de Verenigde Staten, waar ze zich voeden met solanaceous planten. Het insectenmodel heeft een lange geschiedenis in onderzoek in insectenfysiologie, biochemie, neurobiologie en geneesmiddelinteractiestudies. Manduca sexta's onderzoeksportfolio omvat een concept-genoomsequentie, waardoor een begrip op moleculair niveau van essentiële cellulaire processen mogelijk is30. Een ander cruciaal voordeel van dit modelsysteem is de grote omvang, die meer dan 100 mm lang en 10 g in gewicht bereikt in de 18-25 dagen van larvale ontwikkeling. De grote omvang stelt onderzoekers in staat om morfologische en gedragsveranderingen in realtime te volgen als reactie op de CBD-behandeling. Ook werden vanwege de grootte elektrofysiologische reacties onderzocht met het abdominale zenuwstelsel, inclusief ganglia ontleed uit de larven zonder hoge resolutie microscoopinstellingen. Het unieke kenmerk stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk acute en langetermijnreacties op de toegediende cannabinoïde (s) te onderzoeken.
Ondanks deze veelzijdigheid is M. sexta pas onlangs onderzocht op zijn geschiktheid als experimenteel model voor cannabis- en cannabinoïdestudies. In 2019 gebruikten de auteurs voor het eerst het insectenmodelsysteem om de hypothese aan te pakken dat cannabis is geëvolueerd om Cannabidiol te produceren om zichzelf te beschermen tegen insectenbivoor30,31. Het resultaat toonde duidelijk aan dat de planten CBD gebruikten als een voedingsafschrikmiddel en de groei van het plaaginsect M. sexta-rups remden, en ook een verhoogde mortaliteit veroorzaakten31. De studie toonde ook de reddende effecten van CBD op bedwelmde ethanollarven aan, waardoor het potentiële voertuigeffect van ethanol als drager van de CBD werd geïdentificeerd. Zoals getoond, onderzocht het insectenmodelsysteem effectief de therapeutische effecten van cannabinoïden binnen 3-4 weken met minder arbeid en kosten dan andere dierlijke systemen. Hoewel het insectenmodel cannabinoïdereceptoren mist (d.w.z. geen CB1/2-receptoren), biedt het modelsysteem een waardevol hulpmiddel om de farmacologische rollen van cannabinoïden te begrijpen via een cannabinoïdereceptoronafhankelijke manier.
De auteurs van deze studie hebben eerder gewerkt met de tabakshoornworm als een modelsysteem voor cannabinoïde-onderzoek31. Na zorgvuldige afweging van de voordelen en risico's van het gebruik van M. sexta, hebben we een methode verstrekt met de juiste verzorging en voorbereiding van het dieet voor preklinische onderzoeken die mogelijkheden bieden voor toekomstig preklinisch laboratoriumgebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hoornwormpreparaat en cannabidiol-behandeling
- Verkrijg 150-200 haalbare M. sexta-eieren en kunstmatige diëten op basis van tarwekiemen (zie Tabel met materialen).
- Plaats de hoornwormeieren in een polystyreen petrischaal met een op tarwekiemen gebaseerde kunstmatige dieetlaag (AD) en breng de eieren over naar een insectenopfokkamer (zie Tabel met materialen) die op 25 °C wordt gehouden met een relatieve vochtigheid van 40%-60%.
- Laat de eieren van tabakshoornwormen gedurende 1-3 dagen uitkomen in de insectenkweek die op 25 °C wordt gehouden met een relatieve vochtigheid van 40% -60%.
- Bereid cannabidiol (CBD) stockoplossing (200 mM) door 1,26 g >98% zuiverheid CBD-isolaat toe te voegen in 20 ml EtOH (200 proof) of 100% middellange keten triglyceriden (MCT) olie (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: CBD-isolaat is lichtgevoelig, dus behandel in het donker. - Voeg 5 ml en 10 ml van de 200 mM CBD-voorraadoplossing toe aan de 1.000 g AD om de uiteindelijke concentraties van de diëten respectievelijk 1 mM en 2 mM CBD te brengen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het dieet en de CBD-bouillonoplossing goed zijn gemengd totdat een volledig homogeen mengsel is gevormd. Meng de AD-bevattende voorraad CBD minstens 45 minuten met de hand in een plastic zak.
LET OP: Koffiemixer of een andere metalen molen bleek niet effectief te zijn. - Doseer 20 g van de drie media, controle (AD), voertuig (AD + 0,1% EtOH- of MCT-olie) en CBD-bevattende media (AD + 0,1% EtOH- of MCT-olie + 1 mM / 2 mM CBD) op de bodem van de buis van 50 ml.
- Verdeel willekeurig 1e instarlarven (~ 2 mm lang) individueel in een reageerbuis van 50 ml en dek af met een geperforeerd deksel of kaasdoek (zie Materialentabel).
OPMERKING: Plaats de buis ondersteboven en kweek insecten in een insectenopfokkamer met een temperatuur van 25 °C met een relatieve vochtigheid van 40%-60%. - Kweek ze in een insectenopfokkamer (zie Tabel met materialen) die op 25 °C wordt gehouden met een licht/donkercyclus van 12 uur.
2. M. sexta larvale groei, dieetconsumptie en sterftemetingen
- Meet de larvale groei (d.w.z. grootte en gewicht) met een analytische balans en mortaliteit met intervallen van 2 dagen na overdracht naar individuele containers totdat de verpopping wordt herkend als de donkerbruine kleuring van een verharde excuticlelaag.
- Noteer de beginmassa (in grammen) van elke groep larven voordat de larven in hun respectieve voeding worden geïntroduceerd en trek de massa van de larven bij elke meting af van de beginmassa om de massawinst tussen de ontwikkelingsstadia van de larven te bepalen totdat de larven het verpoppingsstadium voltooien.
- Noteer het aantal dagen tussen de instar-ontwikkelingsstadia om verschillen in het ontwikkelingstijdframe tussen stadia van larvengroei tot verpopping op elk dieet te begrijpen.
OPMERKING: Schraap de ontlasting van de container af om schimmelbesmetting te voorkomen. Verzamel de stof voor toekomstige tests, afhankelijk van experimentdoeleinden (bijv. Berekening van de CBD-accumulatiesnelheid, microbiële profilering). Het is belangrijk om zorgvuldig met het insect om te gaan tijdens de fragiele periodes van apolyse of ecdysis. Wanneer u de larven uit een container haalt, pak dan voorzichtig het hoofdlichaam van het insect met een platte punt en brede tang en forceer niet om de buitenste huidlaag te verwijderen wanneer een insect bezig is met afstoten.
- Meet de dieetconsumptie31 door het dieetverlies van de container tussen de 1e instarlarven en de verpopping te wegen. Noteer de eerste grammen dieet aan het begin van het experiment en trek de initiële hoeveelheid af van de resterende hoeveelheid dieet wanneer de larven de volledige verpoppingsfase ingingen.
OPMERKING: De fecale materie moet worden uitgesloten van de dieetmeting. De ontlasting en ander vuil (d.w.z. huidschuren) kunnen gemakkelijk uit de media worden verwijderd door de container ondersteboven te plaatsen. - Laat het onderworpen insect voor mobiliteitsmetingen gedurende ten minste 5 minuten acclimatiseren in de kameromgeving en volg de afstanden31 die drie groepen 5e instar-insecten (80-100 mm lang) hebben afgelegd met behulp van een geautomatiseerde, geautomatiseerde angstconditioneringskamer (zie Tabel met materialen).
- Analyseer de mobiliteitsrespons31 door middel van video opgenomen 60 frames / s gedurende 5 minuten met behulp van een bewegingsdetectiesoftware (zie Tabel met materialen) die een bewegingsindex genereert.
3. Statistische analyse
- Analyseer de verschillen in de larvale groei (d.w.z. grootte en gewicht) en de bewegingsindex door eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-test32.
- Gebruik de log-rank (Mantel-Cox) test33 voor vergelijkingen van overlevingscurves.
OPMERKING: Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manduca sexta als modelsysteem om de toxiciteit van cannabinoïden te onderzoeken
Figuur 1 toont de belangrijkste componenten van het CBD-experiment met tabakshoornworm Manduca sexta. Grote aantallen insecten (>20) werden individueel gekweekt bij 25 °C op een 12 h:12 h = licht: donkere cyclus. De grootte, het gewicht en de mortaliteit van de insecten werden gemeten met intervallen van 2 dagen om te controleren op korte- en langetermijnresponsen na een behandeling met een hoge dosis CBD (2 mM).
Figuur 2 toont de nadelige effecten van CBD op de groei en ontwikkeling van het insect. De insecten die op een kunstmatig dieet (AD) werden gekweekt, vertoonden de beste groeiprestaties. De voertuigcontrole die 0,1% middellange keten triglyceride (MCT) olie gebruikte als een oplossend middel voor CBD-isolaat vertoonde ook een normale groei zonder nadelige effecten. Een hoge dosis CBD (2 mM) veroorzaakte echter gewichtsverlies (figuur 2C) en leidde tot een hoger sterftecijfer dan die van controle- en voertuiggroepen (figuur 2D).
Op dag 24 was de gemiddelde grootte van de larven gevoed met AD 63,9 mm (n = 20-22). De grootte van larven die op AD werden grootgebracht en 2 mM CBD bevatten, was echter 50,7 mm, wat ~ 21% kleiner was dan de larven die op AD werden gekweekt (rode lijn in figuur 2C)31. Op dag 24 was het gemiddelde gewicht van de op AD gekweekte larven 6,5 g, wat 2,2-voudig groter was dan die van larven gekweekt op AD met 2 mM CBD (n = 12-16, p < 0,00001)31. Met name de hoge dosis CBD (2 mM) verhoogde het sterftecijfer aanzienlijk tot 40%, terwijl de controle- en voertuiggroepen slechts een sterftecijfer van 20% vertoonden (figuur 2D)31. De resultaten gaven aan dat de hoge dosis CBD (2 mM) in het dieet schadelijk is voor de ontwikkeling van insecten en correleert met verhoogde sterfte.
Manduca sexta als modelsysteem om onbekende therapeutische functies van cannabinoïden te onderzoeken
Figuur 2 toonde aan dat het insectenmodelsysteem effectief eventuele schadelijke effecten van CBD monitort door hun morfologische en fysiologische veranderingen te monitoren. Het voorlopige resultaat gaf aan dat >1% ethanol (EtOH) negatief gerelateerd is aan hun groei, mobiliteit, dieetconsumptie en overlevingskans. Om te onderzoeken of CBD de mobiliteit en het voedingsgedrag van insecten in de EtOH-bedwelmde M. sexta-larven verbetert, werden de totale hoeveelheid dieet die door insecten werd geconsumeerd en de afstand die ze gedurende 10 minuten aflegden gemeten van insecten die onder drie voedingsomstandigheden werden gekweekt (AD, AD + 1% EtOH en AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). Figuur 3A laat zien dat M. sextalarven gekweekt op AD met 1 mM CBD consumeerden minstens 3,1 keer meer dieetmassa dan die gekweekt op EtOH-toegevoegd dieet31. De dieetconsumptie van de insecten gekweekt op 2 mM CBD-toegevoegde media was echter niet significant anders dan die van larven die werden gekweekt op EtOH-only diëten (p > 0,05)31.
Larvale mobiliteit werd ook gevolgd om te onderzoeken of CBD hun mobiliteit beïnvloedde wanneer ze bedwelmd waren met EtOH. De mobiele index wordt gepresenteerd als het percentage (%) van de bevriezing. Figuur 3B vergelijkt de mobiele index van M. sextalarven gekweekt onder verschillende omstandigheden. De resultaten tonen aan dat 1% met EtOH behandelde larven de mobiliteit niet beïnvloedde (p > 0,05). De toediening van 1 mM CBD had ook geen invloed op de mobiliteit (p > 0,05)31. De 2% EtOH-behandelingen bleken dodelijk voor M. sextalarven ; daarom werd er geen mobiliteitsindex geregistreerd. Met de toevoeging van de hoge dosis CBD (2 mM) aan AD met 2% EtOH bleef de mobiliteit laag (80% bevriezen)31.
Figuur 1: Het samengevatte proces van het gebruik van tabakshoornworm Manduca sexta-rupsen in cannabidiolstudie. (A) Hoornwormeieren uitgekomen in een aparte grote container met een laag kunstmatig dieet. (B) Een spuit werd gebruikt om de container te vullen om te voorkomen dat een dieet aan de zijkanten van de containers zou blijven plakken. (C) Een 2e instar tabakshoornworm in een reageerbuis van 50 ml met kaasdoek. (D) Een 3e instar tabakshoornworm. (E) De lengte van de hoornworm (mm) en het gewicht (g) werden gemeten op een weegschaal. (F) 5e instar tabakshoornworm die ecdysis ondergaat en klaar is voor verpopping. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van Cannabidiol (CBD) op de groei en mortaliteit van tabakshoornworm Manduca sexta. (A) Tabakshoornwormrupsen bij 5e, 3e instar en vroege verpopping. De grootte (B), het gewicht (C) en de mortaliteit (D) van M. sexta bij voeding op kunstmatig dieet (AD), AD + 0,1% middellange keten triglyceride (MCT) en AD + 0,1% MCT + 2 mM CBD. Voor statistische analyses van insectengroei en overlevingskans werden respectievelijk een eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest (n = 20-22, p < 0,05) en Mantel-Cox-test (n = 20-22, p < 0,05) gebruikt. De figuur is aangepast van Reference31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De effecten van Cannabidiol (CBD) op het voedingsgedrag en de mobiliteit van insecten. (A) Dieetconsumptie van tabakshoornwormrupsen gekweekt op kunstmatig dieet (AD), AD + 1-2% ethanol (EtOH) en AD + 1-2% van EtOH + 1-2mM CBD (eenrichtingsverkeer ANOVA, Tukey's meervoudige vergelijking op p < 0,05). (B) Mobiliteit van insecten. De mobiliteit wordt afgebeeld als freeze %. geeft p < 0,01 aan. De figuur is aangepast van Reference31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voedingsstudie toonde aan dat hoge doses CBD (2 mM) de groei van het insect remden en de mortaliteit verhoogden31. Het insectenmodel toonde ook gevoeligheid voor ethanol; CBD ontgifte echter effectief de ethanoltoxiciteit, waardoor hun overlevingskans, dieetconsumptie en voedselzoekgedrag tot vergelijkbare niveaus als de controlegroep werden verhoogd (figuur 3A, B) 31. Het beschreven insectenmodelsysteem bestaat uit drie kritieke stappen: (1) ervoor zorgen dat de eieren van M. sexta uniform worden uitgebroed in grootte en timing, (2) het voorbereiden van de groeimedia die homogeen zijn gemengd met cannabinoïden tot een gerichte concentratie, en (3) het handhaven van de groeimedia om vrij te zijn van schimmelbesmetting met behoud van de ideale vochtigheidsgraad op 40% -60%. Het insectenmodelsysteem stelde ons in staat om de onderzoeksvraag binnen 25 dagen aan te pakken, van mediavoorbereiding tot gegevensverzameling en -interpretatie. Het belangrijkste was dat het insectensysteem consistente resultaten van grote exemplaren produceerde.
Om het succes van de gekweekte M. sexta-larven te garanderen, is het essentieel om de relatieve vochtigheid op 40% -60% in de container te houden. Als een container de hoge luchtvochtigheid niet vasthoudt, zal een kunstmatig dieet met de cannabinoïden snel worden uitgedroogd, waardoor het experiment vroegtijdig wordt beëindigd vanwege de dood van de insecten. In een gesloten systeem biedt de hoge luchtvochtigheid echter een ideale conditie voor de schimmeluitbraak, die moeilijk uit te roeien is. De auteurs stellen voor om een geperforeerd deksel of kaasdoek te gebruiken om voldoende luchtcirculatie te bieden en tegelijkertijd waterverlies uit de media te minimaliseren. In een natuurlijke omgeving voeden de rupsen zich het liefst aan de abaxiale kant van een blad waar de luchtvochtigheid hoger is, terwijl ze minder trichomen vertonen dan het oppervlak van het blad34. Het ondersteboven plaatsen van een container was dus buitengewoon nuttig tijdens het bieden van een toevluchtsoord of kruipende houten stok. Dit helpt ook om fecale materie uit het mediagebied te verwijderen en maakt het gemakkelijk om het afval te verzamelen voor verdere testen.
Omdat cannabinoïdenreceptoren afwezig zijn in invertabraten35, is de tabakshoornworm M. sexta mogelijk niet geschikt voor therapeutische studies gemedieerd door het endocannabinoïdesysteem. Met de vele voordelen die in onze pilotstudie zijn aangetoond, moet het insect echter worden beschouwd als een nieuw modelsysteem om de farmacologische functies van cannabinoïden te onderzoeken, met name studies met niet-CB-receptorgemedieerde farmacokinetiek. De relatief korte levenscyclus van M. sexta stelt onderzoekers in staat om de effecten van een cannabinoïde-bevattend dieet over meerdere generaties te begrijpen, waardoor een experimenteel ontwerp in organismen met hogere zoogdiermodellen mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het Institute of Cannabis Research van de Colorado State University-Pueblo en het ministerie van Wetenschap en ICT (2021-DD-UP-0379) en Chuncheon city (Hennep R & D en industrialisatie, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M.
