Summary
El protocolo describe el aislamiento, el cultivo y el perfil de las células endoteliales de la arteria mesentérica humana. Además, se proporciona un método para preparar la arteria humana para la transcriptómica espacial. La proteómica, la transcriptómica y los ensayos funcionales se pueden realizar en células aisladas. Este protocolo se puede reutilizar para cualquier arteria de tamaño mediano o grande.
Abstract
Las células endoteliales (CE) son cruciales para la función vascular y de todo el cuerpo a través de su respuesta dinámica a las señales ambientales. Dilucidar el transcriptoma y el epigenoma de las CE es primordial para comprender sus funciones en el desarrollo, la salud y la enfermedad, pero está limitado en la disponibilidad de células primarias aisladas. Las tecnologías recientes han permitido el perfil de alto rendimiento del transcriptoma y el epigenoma de la CE, lo que ha llevado a la identificación de subpoblaciones de células de la CE previamente desconocidas y trayectorias de desarrollo. Si bien los cultivos de EC son una herramienta útil en la exploración de la función y la disfunción de la EC, las condiciones de cultivo y los múltiples pasajes pueden introducir variables externas que alteran las propiedades de la EC nativa, incluida la morfología, el estado epigenético y el programa de expresión génica. Para superar esta limitación, el presente artículo demuestra un método para aislar las CE primarias humanas de las arterias mesentéricas de donantes con el objetivo de capturar su estado nativo. Las CE en la capa íntima se disocian mecánica y bioquímicamente con el uso de enzimas particulares. Las células resultantes se pueden usar directamente para la secuenciación de ARN a granel o ARN unicelular o enchapadas para cultivo. Además, se describe un flujo de trabajo para la preparación de tejido arterial humano para transcriptómica espacial, específicamente para una plataforma disponible comercialmente, aunque este método también es adecuado para otras técnicas de perfilado de transcriptoma espacial. Esta metodología se puede aplicar a diferentes vasos recolectados de una variedad de donantes en estados de salud o enfermedad para obtener información sobre la regulación transcripcional y epigenética de la CE, un aspecto fundamental de la biología celular endotelial.
Introduction
Al revestir la luz de los vasos sanguíneos, las células endoteliales (CE) son reguladores cruciales del tono vascular y la perfusión tisular. Las CE son notables en su capacidad para reaccionar al entorno extracelular y adaptarse a los cambios en la dinámica y composición del flujo sanguíneo. Estas respuestas dinámicas están mediadas a través de una red de eventos de señalización intracelular, incluyendo modulaciones transcripcionales y post-transcripcionales con resolución espacio-temporal. La desregulación de estas respuestas está implicada en muchas patologías, incluyendo pero no limitado a enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer 1,2.
Una gran proporción de los estudios utilizan líneas celulares o modelos animales para interrogar el transcriptoma de la CE. La primera es una herramienta útil, dada la relativa facilidad de uso y el bajo costo. Sin embargo, el cultivo en serie puede introducir alteraciones fenotípicas en las CE, como características fibroblásticas y una falta de polarización, desconectándolas de su estado in vivo 3. Las células primarias, por ejemplo, la EC de la vena umbilical humana (HUVEC) han sido una opción popular desde la década de 1980, pero se derivan de un lecho vascular del desarrollo que no existe en adultos, por lo que es poco probable que representen completamente las CE maduras. Los animales, especialmente los modelos de ratón, representan mejor el entorno fisiológico o fisiopatológico de las CE y permiten el interrogatorio de los transcriptomas como resultado de la perturbación genética. Las CE murinas se pueden aislar de varios tejidos, incluyendo la aorta, los pulmones y los tejidos adiposos utilizando procedimientos basados en enzimas 4,5,6,7. Sin embargo, las células aisladas no se pueden usar para múltiples pasajes a menos que se transformen6 y a menudo están limitadas en número, lo que requiere la agrupación de múltiples animales 5,8,9.
El advenimiento de nuevas tecnologías que exploran la arquitectura de los vasos a nivel transcriptómico, particularmente con resolución de una sola célula, ha permitido una nueva era de biología endotelial al revelar nuevas funciones y propiedades de las CE 5,10,11,12,13,14. Un rico recurso construido por los investigadores de Tabula Muris recopiló perfiles transcriptómicos unicelulares de 100,000 células, incluidas las CE en 20 órganos murinos diferentes15, que revelaron genes marcadores de CE comunes y firmas transcriptómicas únicas con diferencias inter e intrasulares 5,13. Sin embargo, existen claras diferencias entre el ratón y el ser humano en el genoma, el epigenoma y el transcriptoma, especialmente en las regiones no codificantes 16,17,18. Estos inconvenientes antes mencionados enfatizan la importancia del análisis de las CE utilizando muestras humanas para obtener un perfil fiel de las CE en su estado nativo en salud y enfermedad.
La mayoría de los métodos de aislamiento de EC se basan en la disociación física a través de la homogeneización, el corte fino y el picado del tejido antes de la incubación con enzimas proteolíticas durante diferentes tiempos. Las enzimas y condiciones también varían considerablemente entre los tipos de tejido, desde tripsina hasta colagenasa, utilizada sola o en combinación 19,20,21. A menudo se incluye un enriquecimiento o purificación adicional basado en anticuerpos para aumentar la pureza de las CE. Por lo general, los anticuerpos contra los marcadores de membrana EC, por ejemplo, CD144 y CD31 se conjugan con perlas magnéticas y se agregan a la suspensión celular22,23. Dicha estrategia puede adaptarse generalmente para el aislamiento CE de múltiples tejidos humanos y de ratón, incluidas las técnicas introducidas en este protocolo.
En su estado nativo, las CE interactúan con múltiples tipos de células y pueden existir en nichos vasculares donde la proximidad celular es crucial para la función. Si bien los estudios de secuenciación de ARN unicelular y nuclear único (scRNA y snRNA-seq) han sido primordiales para los avances recientes en la descripción de la heterogeneidad de la CE, el proceso de disociación interrumpe el contexto tisular y el contacto célula-célula, que también son importantes para comprender la biología de la CE. Desarrollado en 2012 y nombrado Método del Año en 202024, el perfil del transcriptoma espacial se ha utilizado para perfilar la expresión génica global al tiempo que conserva las características espaciales en varios tejidos, incluidos el cerebro25, el tumor26 y el tejido adiposo27. Las tecnologías pueden ser dirigidas, utilizando sondas especializadas específicas para secuencias particulares de ARN unidas a reactivos de afinidad o etiquetas fluorescentes, detectando así genes seleccionados a resolución subcelular 28,29,30,31. También pueden ser no dirigidos32,33, típicamente usando oligonucleótidos con código de barras espaciales para capturar ARN, que juntos se convierten en ADNc para la posterior preparación de la biblioteca seq y, por lo tanto, tiene la ventaja de deducir la expresión génica de tejido completo de manera imparcial. Sin embargo, la resolución espacial no se logra actualmente a un solo nivel celular con tecnologías disponibles comercialmente. Esto se puede superar hasta cierto punto con la integración de datos con datos scRNA-seq, lo que en última instancia permite el mapeo del transcriptoma unicelular en un contexto tisular complejo al tiempo que conserva su información espacial original34.
Aquí, se describe un flujo de trabajo para perfilar el transcriptoma de EC utilizando la arteria mesentérica superior humana, una arteria periférica que se ha utilizado para estudiar la vasodilatación, la remodelación vascular, el estrés oxidativo y la inflamación 35,36,37. Se describen dos técnicas: 1) aislar y enriquecer las CE a partir de la íntima de los vasos sanguíneos combinando la disociación mecánica y la digestión enzimática adecuadas para la secuenciación del transcriptoma unicelular o el posterior cultivo in vitro; 2) preparar secciones arteriales para el perfil del transcriptoma espacial (Figura 1). Estas dos técnicas se pueden realizar de forma independiente o complementaria para perfilar las CE y sus células circundantes. Además, este flujo de trabajo se puede adaptar para su uso en cualquier arteria mediana o grande.
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Protocol
Se realizaron estudios de tejidos humanos en especímenes no identificados obtenidos del Centro de Recursos de Células de Islotes del Sur de California en City of Hope. Los consentimientos de la investigación para el uso de tejidos humanos postmortem se obtuvieron de los familiares de los donantes, y la aprobación ética para este estudio fue otorgada por la Junta de Revisión Institucional de City of Hope (IRB No. 01046).
1. Disociación física (tiempo estimado: 1-2 h)
- Coloque una arteria fresca en un plato de 10 cm y lávese con solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) estéril de Dulbecco.
- Con pinzas estériles y tijeras de disección, retire la grasa y los tejidos conectivos externos hasta que el vaso esté limpio. Mida la longitud del recipiente con una regla colocada fuera del plato y tome fotografías para los registros (Figura 1A).
- Tampón de digestión apropiado precalentado a 37 ° C: para scRNA-seq use la enzima de disociación celular; para los ensayos de cultivo celular utilizar 1-6 mg/mL de colagenasa D, 3 mg/mL de proteasa derivada de bacterias, 100 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5 mM de glucosa, con 1 mM de CaCl2 6,38 (pH 7,0, no requiere ajuste) añadido 5 min antes de su uso.
- Tome la arteria mesentérica (típicamente con un diámetro de 6-8 mm) y corte longitudinalmente con tijeras para abrir la luz del vaso verticalmente.
- Usando agujas, conecte el recipiente a la cera negra en las cuatro esquinas, dejando la íntima expuesta (Figura 1B).
- Agregue 1 ml de tampón de digestión precalentado a la íntima. Tome un bisturí estéril y raspe la luz del vaso suavemente dos veces.
NOTA: El propósito de este procedimiento es disociar la capa íntima, que puede necesitar práctica. Se necesita ejercer suficiente fuerza para eliminar el endotelio, pero no tanto como para que también se eliminen las capas más profundas de tejido, lo que reducirá la representación de la CE. - Transfiera el tampón de digestión a un tubo de 5 ml. Agregue 1 ml de tampón de digestión a la íntima y bombee hacia arriba y hacia abajo con cuidado para recoger las células restantes y agregar al tubo de 5 ml. Incubar las células a 37 °C, girando a 150 rpm durante 5 min.
- Agregue 2 ml de medio M199 (o D-PBS si procede con scRNA-seq) a la suspensión celular para apagar la reacción enzimática. Mezclar suavemente y centrifugar a 4 °C, 600 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y guarde el sobrenadante por separado para cultivarlo como control para observar si todas las células se capturan en el pellet en el paso 1.8. Resuspend el pellet celular en 1 mL de medio M199 (o D-PBS si se procede con scRNA-seq).
- Evaluar la viabilidad celular mezclando 10 μL de azul de tripano con 10 μL de stock celular. Observe la morfología celular y cuente las células usando un hemocitómetro.
NOTA: En este punto, las células pueden ser utilizadas para la cuantificación de proteínas o ARN o cultivadas in vitro utilizando medios de cultivo EC siguiendo los protocolos estándar39. Alternativamente, se pueden preparar para la secuenciación como se describe en la siguiente sección. - Para el cultivo, cubra dos pocillos de una placa de 6 pocillos pipeteando 500 μL de reactivo de fijación en pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el reactivo de fijación y lavarlo con D-PBS estéril, dispensar el stock de celdas completas en un pozo y mantener el sobrenadante como control en el segundo pozo.
2. Preparación para estudios de scRNA-seq (tiempo estimado: 3-4 h)
- Centrifugar el material celular desde el paso 1.11 a 4 °C, 600 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet suavemente con una pipeta P1000 y una punta de orificio ancho en 1 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% en D-PBS. Mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda.
- Pase la solución a través de un colador de 40 μm para eliminar los restos celulares. Si quedan escombros, pase a través de un segundo colador a 4 ml de BSA al 0.04% en D-PBS.
- Centrífuga a 4 °C, 600 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de BSA al 0,04% en D-PBS utilizando una pipeta P1000 con una punta de pipeta de diámetro ancho. Mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda.
- Evaluar la viabilidad celular mezclando 10 μL de stock celular con 10 μL de azul de tripano. Usando un hemocitómetro, observe la morfología, determine si hay una suspensión de una sola célula sin grupos, verifique si hay restos de tejido y calcule el número de células vivas y muertas.
- Si las células están agrupadas o quedan restos, repita el lavado con BSA al 0,04% en D-PBS o vuelva a pasar por el colador de 40 μm.
NOTA: Si bien esto reducirá el rendimiento, es importante que las células existan en una suspensión limpia de una sola célula para una secuenciación óptima. - La suspensión unicelular se puede utilizar para scRNA-seq.
3. Perfil del transcriptoma espacial (tiempo estimado: 3-4 h)
- Agregue isopentano (2-metilbutano) a un recipiente de metal y enfríe en nitrógeno líquido (LN2) o hielo seco (se prefiere LN2 , ya que llevará la temperatura más baja que el hielo seco). Vierta el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en los pocillos de criomolds de plástico etiquetados teniendo cuidado de no crear burbujas y eliminar las que aparecen. Deje criomold sobre hielo seco para que se enfríe.
- Cortar al menos dos secciones coronales, 1 cm de longitud del vaso. Usando fórceps largas (12"), sumerja el tejido en isopentano hasta que se congele. Sumerja rápidamente el tejido en OCT en orientación con el lumen visible en el centro. Tenga cuidado de eliminar cualquier burbuja, especialmente las que están al lado del tejido.
- Usando fórceps largas (12"), agarre los criomoldes y sosténgalos en el bote de metal. Si bien la base de los moldes debe estar en el líquido, no debe ser demasiado profunda para permitir que el isopentano corra sobre el tejido. Observe la congelación, la OCT se volverá blanca progresivamente desde el exterior en 1-2 min.
- Guarde estas secciones en un recipiente sellado a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
NOTA: Mantenga las muestras en hielo seco en todo momento y no permita más de un ciclo de congelación-descongelación. Este tejido se puede utilizar para análisis histológicos, hibridación in situ de fluorescencia de ARN / ADN (FISH) o transcriptómica espacial, que se describirá ahora. - Ajuste la temperatura del criostato a -20 °C para la cámara y -10 °C para la cabeza de la muestra. Equilibre las secciones de recipientes incrustados en OCT, cuchillos, cepillos y diapositivas a -20 ° C en el criostato durante aproximadamente 30 minutos. Mientras equilibra, limpie la máquina y todo el equipo que pueda tocar las secciones, incluida la cuchilla, con etanol al 70% seguido de una solución de descontaminación RNasa.
- Coloque la muestra dispensando una pequeña cantidad de OCT en el bloque de criostato circular y colocando la muestra encima antes de que se congele. Coloque el bloque en el centro de la cabeza de la muestra y atornille el bloque en su lugar con un mango negro alto a la izquierda. Elimine cualquier exceso de OCT que rodee el recipiente.
- Ajuste el espesor de corte a 10 μm en el criostato, corte aproximadamente 60 secciones y colóquelas en un tubo preenfriado de 1,5 ml. Estas secciones se utilizarán para evaluar la calidad del ARN. Tras la extracción del criostato, agregue inmediatamente 1 ml de reactivo de extracción de ARN y vórtice hasta que las secciones se disuelvan por completo.
- Agregue 200 μL de cloroformo y mezcle hasta que la solución se asemeje a un batido de fresa. Centrifugadora a 11.200 x g durante 10 min a 4 °C.
- Recoger la fase acuosa (fase clara sobre las capas blancas y rosadas) y añadirle 500 μL de isopropanol. Mezclar invirtiendo los tubos más de 10 veces y colocar a -80 °C durante al menos 20 min.
- Centrifugadora a 11.200 x g durante 10 min a 4 °C. Disuelva el pellet de ARN purificado en 5 μL de agua libre de RNasa. Examine el número de integridad del ARN (RIN).
NOTA: Se prefieren las muestras con RIN ≥ 7, pero RIN ≥ 6 es aceptable. El número de secciones de tejido y el volumen de solución para la disolución de ARN pueden requerir optimización dependiendo del sistema utilizado para garantizar que la concentración final de ARN esté dentro del rango de función RIN para permitir una evaluación precisa de RIN. - Practique cortar y colocar secciones correctamente dentro de los marcos fiduciarios utilizando portaobjetos de vidrio lisos antes de proceder a la optimización de tejidos disponibles comercialmente o a los portaobjetos de expresión génica. Esto se puede lograr dibujando cuadrados de 6,5 mm x 6,5 mm en un portaobjetos de vidrio liso, enfriando a -20 ° C en el criostato y colocando secciones en esta área de captura.
- Corte las secciones de 10 μm con la placa estabilizadora en su lugar, voltee y aplane cuidadosamente tocando suavemente la sección a través de la OCT circundante.
- Usando cepillos de criostato sin RNasa, coloque la sección de tejido dentro del cuadrado, usando solo la OCT circundante. Coloque inmediatamente un dedo (con guantes) en la parte posterior del área de captura para derretir la sección en la diapositiva.
- Una vez que la sección se haya adherido, coloque la diapositiva en la criobar para permitir que la sección se congele. Se debe tener cuidado para evitar el plegamiento del tejido y el tejido que recubre los bordes demarcados del marco fiduciario. Si es necesario, corte el tejido en mitades o cuartos a lo largo del lumen con una cuchilla para asegurarse de que la sección del recipiente encaje dentro del marco de 6,5 mm x 6,5 mm.
- Corte secciones de tejido de 10 μm según 3.12-3.14 en diapositivas de optimización de tejidos o de expresión génica. Transfiera la diapositiva a un correo de diapositivas colocado sobre hielo seco. Almacene las diapositivas a -80 °C durante un máximo de 4 semanas antes de continuar con los protocolos espaciales publicados33,34.
4. Análisis de datos de secuenciación (tiempo estimado: hasta 1 semana dependiendo de la familiaridad con el software)
NOTA: Solo para el análisis transcriptómico espacial, vaya al paso 4.8. Los datos de scRNA-seq se procesan utilizando la tubería estandarizada alineada con el transcriptoma de referencia hg38 humano. El paquete R Seurat (v3.2.2) se utiliza para analizar datos de scRNA-seq siguiendo las directrices publicadas40.
- Filtrar utilizando métricas de control de calidad bien establecidas: se eliminan las células raras con un número muy alto de genes (potencialmente multiplets) y las células con altos porcentajes mitocondriales (las células de baja calidad o moribundas a menudo presentan contaminación mitocondrial).
- Normalice los datos utilizando "sctransform", un método para mejorar la integración de muestras en comparación con la normalización de registros. Estos datos normalizados se utilizan para la reducción de la dimensionalidad y la agrupación, mientras que los niveles de expresión logarítmicos se utilizan para el análisis basado en los niveles de expresión génica, como la clasificación de tipo celular41.
- Seleccionar genes marcadores por tipo de célula, por ejemplo, molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM1) y factor von Willebrand (VWF) para CE, lumican (LUM) y potenciador de procolágeno C-endopeptidasa (PCOLCE) para fibroblastos, gen de translocación de células B 1 (BTG1) y CD52 para macrófagos, C1QA y C1QB para monocitos, y cadena pesada de miosina 11 (MYH11) y transgelina (TAGLN) para las células del músculo liso vascular36.
- Calcule el nivel de expresión promedio entre celdas individuales entre cada par de marcadores para tener un solo marcador con un nivel de expresión promedio asociado con cada tipo de celda42.
- Aplicar un modelo de mezcla gaussiana (GMM) con dos componentes a los datos de expresión de cada marcador a través de celdas individuales para separar las celdas en dos conjuntos, es decir, expresar altamente el marcador y expresar humildemente el marcador. De esta manera, para cada marcador, cada celda individual se asigna a uno de los dos componentes42.
- Utilice el enriquecimiento estadístico para el conjunto de genes marcadores, una prueba exacta de Fisher, para asignar un tipo de célula a cada grupo. Al hacerlo, se obtiene un conjunto de valores p por clúster, cada uno correspondiente a un tipo de celda. El tipo de celda con el valor p más bajo se asigna a ese clúster.
- Procese los datos transcriptómicos espaciales utilizando las tuberías de Space Ranger, lo que resulta en descócidos espaciales y generación de métricas de control de calidad (QC), incluidas las lecturas alineadas totales con el transcriptoma humano hg38, el número medio de identificador molecular único (UMI) o genes por punto35.
NOTA: El paquete R Seurat (v3.2.2) se utiliza para analizar los datos procesados por Space Ranger siguiendo las directrices publicadas40. - Normalizar los datos utilizando "sctransform", un método que se ha demostrado que mejora el análisis aguas abajo en comparación con la normalización logarítmica dada la heterogeneidad del tejido y la varianza muy alta en los recuentos a través de las manchas.
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Representative Results
El análisis de las CE de la arteria mesentérica utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática o criopreservación para su uso en varios ensayos aguas abajo se representa aquí (Figura 1). Las CE se pueden perfilar en las arterias mesentéricas utilizando los siguientes pasos: A) disociación mecánica de la íntima junto con la digestión de la colagenasa a las células de cultivo; B) generación de suspensión unicelular para scRNA-seq; o C) las secciones transversales de la arteria se pueden incrustar en la OCT para criomeccionar para perfilar el transcriptoma espacial (Figura 1 y Figura 2).
Figura 1: Procesamiento del tejido arterial y perfilado espacial. (A) Una arteria mesentérica limpia. (B) Vaso cortado abierto para exponer íntimamente. (C) Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de la sección transversal de la arteria mesentérica en el marco fiducial. Imagen capturada con una lente 5x bajo microscopio invertido de fluorescencia de campo ancho. (D) Archivo representativo de salida de Space Ranger de expresión génica total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general de las técnicas de aislamiento y elaboración de perfiles de CE. Diagrama de flujo que muestra diferentes métodos de procesamiento de la arteria mesentérica. Las técnicas de procesamiento dan como resultado suspensiones celulares adecuadas para el ARN-seq de una sola célula (sc), el cultivo de células endoteliales (CE) o el tejido entero está incrustado en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para el perfil del transcriptoma espacial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las CE aisladas cultivadas utilizando el protocolo descrito muestran una morfología distinta similar a un adoquín con células contaminantes mínimas (Figura 3A). La expresión del marcador EC endotelial vascular (VE)-Cadherina se confirmó mediante inmunofluorescencia visualizando las uniones célula-célula (Figura 3B). Las CE aisladas se sometieron a análisis de citometría de flujo para CD31. Como controles negativos, los HUVEC no teñidos (sin anticuerpos) produjeron una señal del 1,1% y los HUVEC incubados con IgG produjeron una señal del 0,8%. Como control positivo, los HUVEC teñidos con anticuerpos CD31 mostraron una pureza del 99% y se utilizaron para cerrar los canales de las células endoteliales arteriales mesentéricas humanas (HMAEC). Aproximadamente el 80% de las células eran CD31 positivas, lo que indica que los HMAEC constituían la mayoría de la población de células recién aisladas (Figura 3C). Los aislamientos fallidos, ya sea raspando demasiado duro / profundo, sembrando las células a una densidad demasiado baja o manteniendo el cultivo más allá del paso 3, dan como resultado células con morfología alterada, que potencialmente expresan marcadores mesenquimales (αSMA) o se alargan asemejándose a un estado fibroblástico (Figura 3D).
Figura 3: Validación de CE arteriales mesentéricas cultivadas aisladas. (A) Imagen de campo brillante de CE aisladas, lente 10x, barra de escala = 50 μm. (B) Inmunofluorescencia de la expresión de VE-Cadherina con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como marcador nuclear. Imagen capturada con una lente 10x bajo microscopio invertido de fluorescencia de campo ancho. La imagen representativa muestra la localización de VE-Cadherin. Barra de escala = 50 μm. (C) Gráficos FACS de HUVEC no teñido (arriba a la izquierda), HUVEC teñido con control de IgG (arriba a la derecha), HUVEC teñido con CD31 (abajo a la izquierda) y las células endoteliales arteriales mesentéricas humanas aisladas (HMAEC) teñidas con CD31 (abajo a la derecha) (D) Imágenes de inmunofluorescencia de HMAEC con DAPI (marcador nuclear), actina del músculo alfa-liso (αSMA) y CD31. Lente 40x, barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las CE aisladas utilizando la enzima de disociación celular se sometieron a scRNA-seq. La Figura 4A muestra una aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) representativa aislada de la arteria mesentérica utilizando el protocolo actual para scRNA-seq en HMAEC aislados, con un 34% de células agrupadas como CE utilizando PECAM1 y VWF (Figura 4B, C respectivamente) como marcadores.
Figura 4: scRNA-seq de las CE arteriales mesentéricas. (A) Aproximación y proyección de variedades uniformes (UMAP) gráfica de datos de scRNA-seq de la arteria mesentérica. Una proyección en 2 dimensiones de la variedad en un espacio de alta dimensión, donde cada punto representa una sola celda y la proximidad a otros puntos indican cuán similar es el transcriptoma entre sí. Las celdas están codificadas por colores por sus tipos de células. (B) Expresión PECAM1 proyectada sobre UMAP. (C) Expresión VWF proyectada en UMAP. Las barras de color representan la expresión de los niveles de genes donde los niveles de ARN se representan mediante recuentos de identificadores moleculares únicos normalizados logarítmicamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para el flujo de trabajo transcriptómico espacial, el ARN extraído de las secciones de tejido se electroforizó en un gel para visualizar la calidad del ARN. Una señal débil o ausencia de bandas de ARN ribosómico 18S y 28S, y la presencia de productos de degradación observados en la Figura 5A, carril A1, es un ejemplo de ARN de mala calidad y no debe procesarse más. Las muestras con una concentración fuera del rango podrían conducir a un RIN más bajo (Figura 5A, carril B1). Sin embargo, diluir el ARN en dos veces aumentó el RIN suficiente para continuar (Figura 5A, carril C1). Antes de determinar la expresión génica, se realizó una optimización tisular para determinar el tiempo óptimo de permeabilización para liberar ARN que será capturado por los oligonucleótidos en el portaobjetos de expresión génica (Figura 5B). Sobre la base de la imagen de fluorescencia de la huella de ADN complementario (ADNc), la permeabilización de 18 minutos produjo el fondo más bajo pero la señal más fuerte, y por lo tanto se seleccionó para ser la duración óptima. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) visualizó la morfología del vaso permitiendo identificar regiones de interés (Figura 5C). Se evaluó la calidad de la biblioteca (Figura 5D) y se determinó que era adecuada para la secuenciación. Los recuentos de UMI por punto, el número de lecturas por punto y los genes totales son métricas de calidad producidas por la tubería Space Ranger, la variabilidad de cada una se muestra en la Figura 5E. Finalmente, la expresión génica (utilizando actina alfa-2 (ACTA2) como ejemplo, Figura 5F) se visualizó con anclaje espacial en el recipiente teñido de H&E.
Figura 5: Flujo de trabajo transcriptómico espacial y resultados representativos (A) Evaluación de la calidad del ARN extraído de dos muestras de arteria mesentérica, A1 de una muestra, B1 de la segunda muestra, C1 diluido 2x de B1. Las flechas rojas indican bandas ribosómicas 28S y 18S. (B) Flujo de trabajo de optimización espacial de tejidos (TO). (C) Diapositivas de expresión génica (GEX) que muestran las secciones de tejido (panel izquierdo); Imágenes H&E de las secciones de tejido cargadas en la diapositiva GEX antes de la permeabilización durante 18 min, transcripción inversa y construcción de la biblioteca (panel derecho), barra de escala = 1 cm. (D) Evaluación de la calidad de las bibliotecas preparadas. (E) Las métricas de salida de Space Ranger muestran rangos entre lecturas promedio, UMI y genes por punto para diferentes bibliotecas. Las barras de error denotan la expresión ACTA2 mín. y máx. (F) en toda la sección del vaso. Todas las imágenes de microscopía se tomaron utilizando un microscopio invertido de campo ancho, desde una lente 5x, módulo tilescan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El flujo de trabajo presentado detalla un conjunto de técnicas para perfilar las CE a partir de una sola pieza de arteria humana con resolución espacial y de una sola célula. Hay varios pasos críticos y factores limitantes en el protocolo. Una clave para el perfil del transcriptoma es la frescura del tejido y la integridad del ARN. Es importante mantener los tejidos en hielo tanto como sea posible antes del procesamiento para minimizar la degradación del ARN. Por lo general, los tejidos post mortem se procesan entre 8-14 h después del momento de la muerte. Sin embargo, se recomienda comenzar el aislamiento o la criopreservación tan pronto como sea posible después de la extracción de los donantes. Específicamente para el mapeo del transcriptoma espacial, el tejido debe mantenerse en hielo seco y no se debe permitir más de un ciclo de congelación-descongelación. Debe integrarse más de una sección transversal de un recipiente en los PTU, para permitir repeticiones si es necesario. También se deben hacer esfuerzos para promover un ambiente libre de RNasa durante el procesamiento de tejidos y el aislamiento celular. En segundo lugar, el tamaño de los buques puede ser un factor limitante. Para la transcriptómica espacial, el protocolo se puede realizar en 1 mm del vaso en total, independientemente del diámetro. Para el protocolo de disociación para cultivo celular y scRNA-seq, el límite inferior sería si el vaso es demasiado estrecho (es decir, por debajo de 1 mm de diámetro) para permitir la inserción de tijeras de disección. Sobre la base de estos principios, el protocolo de disociación se puede adaptar para cualquier arteria o vena de tamaño mediano o grande, siempre que el tamaño de los vasos permita la apertura, y el procedimiento de transcriptoma espacial se puede aplicar a cualquier vaso que pueda encajar total o parcialmente en el marco fiduciario.
Para procesar el tejido para el análisis del transcriptoma unicelular, varios grupos han descrito el uso de liberasa y elastasa para obtener todas las poblaciones celulares dentro de la pared del vaso 9,43,44. Sin embargo, los conjuntos de datos resultantes contienen en promedio solo el 3-7% de la población celular total anotada como CE 9,45. Una forma de mejorar la limitada representación de la CE en los datos de scRNA-seq es enriqueciendo la fracción EC aprovechando los marcadores de superficie de la CE a través de FACS44,46. Sin embargo, esto generalmente requiere grandes cantidades de tejido de partida y equipos costosos que pueden no estar disponibles de forma rutinaria para todos los laboratorios. Este protocolo aprovecha la posición anatómica única de las CE, es decir, principalmente en la capa íntima, lo que permite el enriquecimiento de las CE sin la necesidad de una digestión tisular intensa y mejora la viabilidad celular para scRNA-seq o cultivo posterior. El porcentaje de CE en la mezcla celular final para scRNA-seq se puede aumentar agregando un paso utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos VE-Cadherin/CD144. Sin embargo, este paso puede no excluir todas las demás células que interactúan con las CE debido a la interacción célula-célula nativa. No obstante, aunque tradicionalmente los otros tipos de células (por ejemplo, macrófagos, células del músculo liso y fibroblastos) se considerarían como "contaminación" en el aislamiento de EC, pueden proporcionar información útil para las interacciones célula-célula en el contexto tisular. En el análisis de datos scRNA-seq, las CE se pueden anotar de manera eficiente utilizando los marcadores EC y las interacciones célula-célula se pueden inferir bioinformáticamente utilizando varios métodos bioinformáticos populares (por ejemplo, CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 entre otros). Además, la inclusión de estos datos puede permitir una integración y deconvolución más eficaces de los datos de elaboración de perfiles del transcriptoma espacial, que no tienen una resolución de una sola celda (véase más adelante)34.
Para el transcriptoma espacial, actualmente no existe un estándar de oro para preparar ningún tejido para esta técnica y la investigación limitada en la preparación de la vasculatura, con la mayoría de las investigaciones publicadas utilizando tejido animal50,51. La técnica requiere diapositivas disponibles comercialmente con marcos fudiciales especializados con un área de captura que contiene aproximadamente 5.000 puntos con código de barras con un diámetro de 55 μm. Las manchas se colocan a 100 μm de distancia del centro de la mancha a las manchas adyacentes dejando aproximadamente 45 μm de espacios entre las manchas que no se perfilarán, lo que limita la resolución. Además, un solo punto contendrá múltiples células, ya que la mayoría de las células están por debajo de los 55 μm de área. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, esta no es una técnica de secuenciación de una sola célula. Sin embargo, al integrar los datos con scRNA-seq, se puede mejorar la resolución y se puede revelar la heterogeneidad dentro de un punto34. Aunque el presente protocolo se centra en un ensayo de perfilado transcriptómico espacial, esta técnica podría adaptarse a otros métodos de perfilado espacialemergentes 52,53 ya que la calidad de proteína y ARN se mantiene en este procedimiento.
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Disclosures
S.Z. es fundador y miembro de la junta directiva de Genemo, Inc.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 y DP1HD087990 (a S.Z.); una subvención de la Fundación Ella Fitzgerald y un Proyecto de la Familia Wanek (a Z.B.C.); y una subvención de la red de semillas del Atlas de Células Humanas (a Z.B.C. y S.Z.). La investigación reportada en esta publicación incluyó el trabajo realizado en el Núcleo de Genómica Integrativa en City of Hope con el apoyo del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA033572. Los autores desean agradecer al Dr. Ismail Al-Abdullah y al Dr. Meirigeng Qi del equipo de trasplante de islotes en City of Hope por el aislamiento de tejidos humanos, al Dr. Dongqiang Yuan en City of Hope por su ayuda con el análisis scRNA-seq, y al Dr. Marc Halushka en la División de Patología Cardiovascular de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins por sus invaluables conocimientos sobre histología vascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
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