Summary
Ce travail analyse la dose vectorielle et le temps d’exposition nécessaires pour induire la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la déficience motrice dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Ces vecteurs codant pour la α-synucléine humaine sont introduits dans la substantia nigra pour récapituler la pathologie de la synucléine associée à la maladie de Parkinson.
Abstract
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui implique la mort des neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale et, par conséquent, la perte progressive du contrôle des mouvements volontaires. Ce processus neurodégénératif est déclenché par le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont principalement constitués de α-synucléine. Plusieurs études ont indiqué que la neuroinflammation est nécessaire pour développer la neurodégénérescence associée à la maladie de Parkinson. Notamment, le processus neuro-inflammatoire implique l’activation microgliale ainsi que l’infiltration de lymphocytes T périphériques dans la substantia nigra (SN). Ce travail analyse un modèle murin de la maladie de Parkinson qui récapitule l’activation microgliale, l’infiltration des lymphocytes T dans le SN, la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux et la déficience motrice. Ce modèle murin de la maladie de Parkinson est induit par l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine de type sauvage humain (AAV-hαSyn) dans le SN. L’administration correcte de vecteurs viraux dans le SN a été confirmée à l’aide de vecteurs témoins codant pour la protéine fluorescente verte (GFP). Par la suite, la façon dont la dose d’AAV-hαSyn administrée dans le SN a affecté l’étendue de l’expression de hαSyn, la perte de neurones dopaminergiques nigrals et la déficience motrice ont été évaluées. De plus, la dynamique de l’expression de hαSyn, de l’activation microgliale et de l’infiltration des lymphocytes T a été déterminée tout au long du développement de la maladie. Ainsi, cette étude fournit des points temporels critiques qui peuvent être utiles pour cibler la pathologie de la synucléine et la neuroinflammation dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson.
Introduction
Après la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue dans le monde. Les neurones primaires affectés dans la maladie de Parkinson sont ceux de la voie nigrostriatale, qui produisent de la dopamine et contrôlent le mouvement volontaire. En conséquence, le symptôme le plus caractéristique associé à ce trouble est la déficience motrice. Cette pathologie implique également le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont composés principalement de α-synucléine (αSyn)1, une protéine cytosolique associée aux terminaux présynaptiques. Des preuves ont montré que la génération d’inclusions pathogènes d’αSyn est déclenchée par un mauvais repliement ou par certaines modifications post-traductionnelles de cette protéine2.
Notamment, une relation étroite a été établie entre la pathologie αSyn et la perte de neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale dans la maladie de Parkinson humaine et les modèles animaux 3,4. Comprendre comment les agrégats αSyn sont générés et comment ils induisent la mort neuronale représente un défi important dans le domaine. Un groupe croissant d’études a montré que, en augmentant le stress oxydatif, le dysfonctionnement mitochondrial est l’une des principales causes de la génération d’agrégats αSyn2. En effet, plusieurs gènes associés au risque de maladie de Parkinson codent pour des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale, la morphologie et la dynamique 5,6. De plus, le dysfonctionnement lysosomal, qui entraîne l’accumulation de mitochondries dysfonctionnelles et d’αSyn mal repliés, constitue un autre événement majeur favorisant la génération d’agrégats αSyn7.
De nouvelles preuves ont indiqué que, une fois que les agrégats αSyn sont déposés dans le cerveau, ces protéines pathogènes stimulent les récepteurs de type toll (TLR) sur la microglie, déclenchant ainsi une activation microgliale et un environnement inflammatoire initial dans la substantia nigra (SN)8,9. En outre, les preuves indiquent que les agrégats αSyn sont capturés et présentés par les cellules présentatrices d’antigènes aux cellules T, induisant une réponse immunitaire adaptative spécifique à αSyn10,11. Ces lymphocytes T spécifiques d’αSyn s’infiltrent ensuite dans le cerveau et sont restimulés par des microglies activées, favorisant ainsi la sécrétion de facteurs neurotoxiques qui évoquent la mort neuronale 9,10. Fait intéressant, plusieurs sources de données ont suggéré que les agrégats αSyn sont générés d’abord dans le système nerveux entérique, puis transportés à travers le nerf vague jusqu’au tronc cérébral12.
Plusieurs modèles animaux de la maladie de Parkinson sont utilisés depuis de nombreuses années, y compris ceux induits par l’administration de substances neurotoxiques (c.-à-d. 6-hydroxydopamine, paraquat, roténone, 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) et ceux impliquant des conditions génétiques (c.-à-d. α-synucléine mutante, kinase répétée 2)13 mutante riche en leucine . Malgré les modèles impliquant une neurodégénérescence induite par les neurotoxines reproduisant certains aspects de la maladie de Parkinson, aucun d’entre eux ne récapitule tous les aspects essentiels de la maladie ou n’est pas progressif13. D’autre part, bien que les modèles génétiques murins impliquant l’expression de versions mutantes de la kinase répétitive 2 riche en leucine, les versions mutantes de la α-synucléine ou la surexpression de α-synucléine de type sauvage humain entraînent une déficience motrice et, dans certains cas, le développement d’une synucléinopathie, ils ne reproduisent pas la neurodégénérescence proéminente des neurones dopaminergiques nigraux, ce qui est un aspect essentiel de la maladie de Parkinson13, 14. Un troisième type de modèle animal de neurodégénérescence a réussi à répondre à la plupart des aspects essentiels de la maladie de Parkinson, l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés (AAV) codant pour la α-synucléine humaine (AAV-hαSyn)14,15. Il est important de noter que les AAV permettent la transduction des neurones avec une grande efficacité et à long terme dans le cerveau adulte des mammifères. En outre, il a été démontré que l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn dans le SN reproduit de nombreux aspects essentiels de la maladie, notamment la pathologie αSyn, l’activation microgliale, la neurodégénérescence et la déficience motrice 16,17,18,19,20. Cette étude présente une analyse de la façon dont la dose de vecteur viral et le temps après l’administration du vecteur viral affectent l’étendue de l’expression hαSyn, la neurodégénérescence et la neuroinflammation dans la voie nigrostriatale, ainsi que le degré de déficience motrice dans le modèle murin d’administration stéréotaxique unilatérale de hαSyn dans le SN.
Protocol
Toutes les études ont été réalisées dans le cadre de la 8e édition du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par l’IACUC à la Fundación Ciencia & Vida (Fondation Science for Life), y compris ceux impliquant l’anesthésie, la douleur, la détresse et l’euthanasie (numéro de permis P-035/2022).
1. La chirurgie stéréotaxique
- Préparation à la chirurgie (environ 1 h)
- Pour maintenir un environnement aseptique, portez des vêtements chirurgicaux appropriés pendant toute la chirurgie, y compris des couvre-chaussures, un masque chirurgical, une barrière sanitaire, des gants et une casquette chirurgicale.
- Vaporisez 70% d’éthanol sur la souris et tout le matériel chirurgical pour maintenir un environnement aseptique.
- Pour induire une analgésie, injecter à la souris du carprofène 5 mg/kg par voie sous-cutanée (c.v.s.) toutes les 12 h21 en commençant 1 h avant la chirurgie et en continuant jusqu’à 3 jours après la chirurgie.
- Pour anesthésier la souris, placez l’animal dans une chambre à induction. Ouvrez le débit d’isoflurane à une vitesse de 0,5%, puis augmentez-le lentement jusqu’à 5% sur environ 5 min jusqu’à ce que la souris ait perdu son réflexe de redressement22.
- Retirez l’animal de la chambre d’induction. Transférez immédiatement l’animal dans un circuit non respirant avec un cône de nez de taille appropriée. Maintenir l’anesthésie de la souris avec l’isoflurane 1% pendant toute la durée de la chirurgie.
- Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée en pinçant sa queue et ses pattes. Lorsque la souris ne réagit pas au pincement de la queue et des pattes, cela signifie que la souris est complètement anesthésiée.
- Rasez la tête de la souris à l’aide de ciseaux. Nettoyez la peau de la souris à l’aide d’un coton-tige avec de la chlorhexidine à 2% et enlevez tous les poils.
- Fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique.
- Placez un protecteur cornéen dans les deux yeux de souris à l’aide d’un coton-tige. Pour prévenir l’induction du stress chez d’autres rongeurs, évitez la présence de toute autre souris dans la salle de chirurgie23.
- La chirurgie (environ 30 min)
- Nettoyez la tête de la souris avec trois cartouches de chlorhexidine à 2 % suivies d’éthanol à 70 %. Exposez le crâne à l’aide d’un matériel chirurgical et faites un trou mince avec une perceuse aux coordonnées suivantes: antéropostérieure -2,8 mm et médiolatéral 1,4 mm par rapport à la ligne médiale.
- Placez l’aiguille d’une seringue de 10 μL dans le trou et déplacez l’aiguille à l’intérieur du cerveau lentement jusqu’à ce qu’elle atteigne −7,2 mm dorsoventral par rapport à ladure-mère 24.
- Laissez l’aiguille en position finale pendant 2 min pour permettre au tissu de se déposer un peu, puis injectez 1 μL d’AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), d’AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) ou de véhicule (PBS à pH 7,4; chirurgie simulée) dans la substantia nigra droite à un taux de 0,2 μL / 30 s.
- Laissez l’aiguille dans la même position pendant 5 minutes après l’administration des vecteurs viraux, puis retirez-la lentement.
- Post-chirurgie (environ 5 min)
- Fermez la plaie à l’aide d’une suture stérile non résorbable tressée en soie.
- Mettez la souris dans la cage de la maison préavertée en la plaçant sur un matelas chauffant électrique (25 ° C).
REMARQUE: La souris doit être maintenue seule dans la cage de la maison jusqu’à ce qu’elle soit capable de marcher sans difficulté et que la plaie soit guérie.
2. Détermination des performances du moteur à l’aide de l’essai au faisceau
- Entraînement (environ 15 min par souris)
- Douze semaines après la chirurgie stéréotaxique, évaluez les performances motrices à l’aide d’une version simplifiée du test de faisceau décrit avant25 ans. À cette fin, utilisez une poutre horizontale de 25 cm de longueur et 3 cm de largeur. La surface de la poutre doit être recouverte d’une grille métallique avec des carrés de 1 cm et surélevée de 1 cm au-dessus de la poutre.
- Prenez une vidéo de la souris traversant le faisceau de surface de la grille d’une extrémité à l’extrémité opposée du faisceau, où se trouve la cage de la maison. Entraînez la souris pendant 2 jours avant la détermination des performances du moteur.
- Le premier jour, entraînez la souris à traverser le faisceau cinq fois sans la grille.
- Le deuxième jour, entraînez la souris à traverser le faisceau cinq fois en présence de la grille.
- Le test (environ 5 min par souris)
- Le troisième jour, évaluez les performances du moteur. Pour ce faire, quantifiez séparément le nombre d’erreurs commises par les pattes gauches ou par les pattes droites en regardant les vidéos en mode ralenti.
REMARQUE: Une erreur est définie comme lorsqu’une patte ne marche pas correctement sur la grille et, par conséquent, devient visible sur le côté de la grille ou entre la grille et la surface du faisceau.
- Le troisième jour, évaluez les performances du moteur. Pour ce faire, quantifiez séparément le nombre d’erreurs commises par les pattes gauches ou par les pattes droites en regardant les vidéos en mode ralenti.
3. Traitement des tissus
- Perfusion transcardique (environ 15 min par souris)
- Pour anesthésier la souris, injecter un mélange de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G26.
- Une fois la souris complètement anesthésiée (confirmée comme à l’étape 1.1.6.), ouvrez le thorax avec du matériel chirurgical et exposez le cœur.
- Ensuite, insérez une aiguille de 21 G (faites la pointe à plat à l’aide d’une perceuse) dans le ventricule gauche du cœur.
- En couplant l’aiguille à un tuyau, perfuser 50 mL de PBS (pH 7,4) à une vitesse de 9,5 mL/min à l’aide d’une pompe péristaltique.
- Fixation et cryoprotection du cerveau (environ 10 min par cerveau)
- Retirer le cerveau à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler, puis le fixer par immersion dans 5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,4) à 4 °C pendant 24 h.
- Ensuite, mettez le cerveau fixe dans 15 mL de saccharose à 30% à 4 °C pendant 48 h.
- Ensuite, mettez le cerveau dans 4 mL de solution de cryoprotection (20% de glycérine et 2% de DMSO dans le PBS) et sauvez le cerveau à −80 °C ou utilisez-le immédiatement à l’étape suivante.
- Obtention de tranches de cerveau (environ 20 min par cerveau).
REMARQUE: Assurez-vous que le cerveau est placé dans un cryostat dans une position appropriée pour faire des coupures coronales.- Pour obtenir des tranches de SN, couper le cerveau en sections de 40 μm d’épaisseur à partir de −2,92 mm et en terminant à −3,64 mm24.
- Récolter chaque tranche dans un puits (contenant 1 mL de solution de cryoprotection) d’une plaque de 24 puits suivant un ordre antéropostérieur tel que décrit avant 25,27,28.
- Pour effectuer des analyses immunohistochimiques (section 4.) et immunofluorescence (section 5.) dans le SN, choisissez six sections coronales de SN prises à intervalles uniformes (120 μm) qui couvrent toute l’étendue rostrocaudale du noyau (720 μm au total), comme décrit avant 25,27,28.
- Pour obtenir des tranches striatales, couper le cerveau en sections de 40 μm d’épaisseur à partir de +1,34 mm et finir à −0,26 mm24.
- Récolter chaque tranche dans un cryotube de 2 mL (contenant 1 mL de solution de cryoprotection) selon un ordre antéropostérieur.
- Pour effectuer des analyses immunohistochimiques (section 4.) et immunofluorescence (section 5.) dans le striatum, choisissez cinq sections striatales coronales prises à intervalles uniformes (320 μm) qui couvrent toute l’étendue rostrocaudale du noyau (1600 μm au total).
4. Analyse immunohistochimique pour quantifier les neurones dopaminergiques et la microgliose (environ 2 jours)
- Pour l’analyse immunohistochimique des tranches striatales ou nigrales, placez l’ensemble de cinq (striatum) ou six (SN) tranches du même cerveau dans un puits d’une plaque de 24 puits.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS puis incuber avec 0,5 mL de 0,03% H2O2 dans du méthanol à température ambiante et avec agitation pendant 30 min pour inactiver l’activité endogène de la peroxydase.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL de solution bloquante (sérum de chèvre à 4%, 0,05% de Triton X-100 et 4% de BSA dans du PBS) à température ambiante et avec agitation pendant 40 min.
- Ensuite, incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant l’anticorps primaire (anti-tyrosine hydroxylase [TH] pAb de lapin diluée à 1:1000 [voir tableau 1]; ou anticorps anti-Iba1 de lapin dilué à 1:1000) à température ambiante et avec agitation pendant la nuit.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant du pAb biotinylé anti-lapin de chèvre (1:500, voir tableau 1) à température ambiante et en agitant pendant 2 h.
- Ensuite, laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL d’avidine conjuguée à la peroxydase (1:5000, voir tableau 1) en solution bloquante à température ambiante et avec agitation pendant 90 min.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL de solution de substrat (0,05% de diaminobenzidine dans un tampon H2O 2/Trizma-HCl à 0,03% à pH 7,6). Portez des gants et une blouse de laboratoire pour cette étape, car la diaminobenzidine est un cancérogène potentiel.
- Lorsque la coloration spécifique est évidente (généralement 30 secondes pour TH et 5 min pour Iba1), retirez la solution de substrat et lavez les sections 3x avec 1 mL de PBS à température ambiante et avec agitation. Toujours effectuer l’immunocoloration de tranches de tous les cerveaux inclus dans la même expérience simultanément.
REMARQUE: La coloration spécifique de la TH est évidente lorsque l’immunocoloration de la TH apparaît dans la zone du SN, qui présente une forme caractéristique dans le cerveau. La marque spécifique d’Iba1 est déterminée lorsque l’immunocoloration d’Iba1 apparaît sur des tranches de cerveau de contrôle de formes microgliales typiques, qui sont confirmées par l’observation au microscope. De cette façon, le temps exact d’exposition du substrat pour l’analyse IHC est déterminé pour chaque expérience. - Montez les sections du cerveau sur des lames de verre à l’aide d’une solution de gélatine à 0,2% dans 0,05 M Tris (pH 7,6). Placez chaque ensemble de cinq (striatum) ou six (SN) tranches obtenues à partir du même cerveau dans l’ordre rostrocaudal sur la même lame de verre.
- Quantifier le nombre de neurones TH+ dans le SN.
- Pour quantifier les neurones TH+ dans le SN, acquérez des photos des six tranches à un grossissement de 20x à l’aide d’un microscope à champ lumineux, comme décrit précédemment 25,27,28. Utilisez le réglage de couleur suivant: température de couleur 3200 K, cyan-rouge 40%, magenta-vert 39%, jaune-bleu 54%, gamma 0,5, contraste 37, luminosité 13, saturation 5.
- À l’aide du logiciel Image J, sélectionnez le périmètre du SN pars compacta dans l’hémisphère analysé. Évitez la sélection de neurones TH+ dans l’aire tegmentale ventrale (VTA).
- Ensuite, demandez au logiciel de calculer la zone sélectionnée (généralement 0,04-0,07 mm2 / hémisphère, en fonction de la position rostrocaudale). Ensuite, à l’aide de l’outil multipoint, marquez chaque neurone TH + avec un point.
- À l’aide de l’outil de points, demandez au logiciel de compter le nombre total de points. Avec le nombre de points totaux (neurones TH+ ) et l’aire du SNpc, calculez la densité des neurones TH+ /mm2.
- Répétez le même calcul dans les deux hémisphères sur les six tranches SN, puis calculez la moyenne des neurones TH+ /mm2 sur les côtés ipsilatéral et controlatéral.
- Quantifier le nombre de microglies activées dans le striatum
- Pour quantifier la microglie activée dans le striatum, acquérir deux photos dans chaque hémisphère pour les cinq tranches striatales à un grossissement de 20x à l’aide d’un microscope à champ lumineux et des mêmes réglages indiqués à l’étape 4.10.1. À l’aide du logiciel Image J, dans chaque photo (affichant une surface de 660 μm x 877 μm), marquez avec un point chaque cellule exprimant une intensité Iba1 élevée et une forme améboïde à l’aide de l’outil multipoint. À l’aide de l’outil de points, demandez au logiciel de compter le nombre total de points.
- Avec le nombre total de points et la surface de la photo, calculez la densité de la microglie activée (celluleshautes Iba1 / mm2) telle qu’elle a été effectuée avant29.
| Antigène cible | Couplé à | Clonalité | Espèce hôte | Réactivité des espèces* | Dilution** |
| Tyrosine Hydroxylase | N/a | Polyclonal | Lapin | Souris, Rat, Humain | 1/200 - 1/1000 |
| Iba1 | N/a | Monoclonal | Lapin | Souris, Rat, Humain | 1/1000 |
| alpha-synucléine | N/a | Monoclonal | Lapin | Humain | 1/150 |
| CD4 | N/a | Monoclonal | Rat | Souris | 1/250 |
| IgG (H+L) | Biotinilé | Polyclonal | Chèvre | Lapin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 546 | Polyclonal | Chèvre | Lapin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 647 | Polyclonal | Chèvre | Lapin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 546 | Polyclonal | Chèvre | Rat | 1/500 |
Tableau 1 : Dilutions des anticorps. S.O., sans objet. *, Il n’est spécifié que s’il y a des réactivités avec la souris, le rat et l’homme, indépendamment de la réactivité avec d’autres espèces. **, Une seule dilution ou une plage de dilution est spécifiée.
5. Analyse d’immunofluorescence pour évaluer l’infiltration des lymphocytes T dans la voie nigrostriatale (environ 2 jours)
- Pour l’analyse d’immunofluorescence de hαSyn ou TH/GFP sur des tranches striatales ou nigrales, assemblez l’ensemble de cinq (striatum) ou six (SN) tranches du même cerveau dans un puits d’une plaque de 24 puits.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS puis incuber avec 0,5 mL de solution bloquante (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 et 5% BSA dans PBS) à température ambiante et avec agitation pendant 40 min.
- Ensuite, incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant l’anticorps primaire (anti-TH de lapin pAb dilué à 1:500; ou anticorps anti-hαSyn de lapin dilué à 1:150, voir tableau 1) à température ambiante et avec agitation pendant la nuit.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé AlexaFluor546 (1:500, voir tableau 1) et du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 1:1000) à température ambiante et avec agitation pendant 2 h. Ensuite, lavez les sections 3x avec 1 mL de PBS.
- Montez les sections du cerveau sur des lames de verre comme décrit ci-dessus (étape 4.9.). Les images ont été acquises avec un microscope à fluorescence inversée couplé à une unité d’alimentation.
- Pour l’analyse d’immunofluorescence de TH/CD4/GFP (Foxp3) sur des tranches nigrales, placez l’ensemble de six tranches (SN) du même cerveau dans un puits d’une plaque de 24 puits. Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS puis incuber avec 0,5 mL de solution bloquante (0,5% Triton X-100, 0,5% de gélatine pour peau de poisson dans PBS) à température ambiante et avec agitation pendant 2 h.
- Incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant les anticorps primaires anti-TH pAb de lapin (1:200, voir tableau 1) et anti-CD4 de rat (1:250) à 4 °C et avec agitation pendant la nuit.
- Laver les sections 3x avec 1 mL de PBS et incuber avec 0,5 mL de solution bloquante contenant de l’anti-lapin couplé à AlexaFluor 647 (1:500, voir tableau 1) et anti-rat couplé à AlexaFluor 546 (1:500) à température ambiante et avec agitation pendant 2 h. Ensuite, lavez les sections 3x avec 1 mL de PBS.
- Placez chaque ensemble de six tranches (SN) obtenues à partir du même cerveau dans l’ordre rostrocaudal sur la même lame de verre et montez-les à l’aide de Fluoromount G. Obtenez des images à l’aide d’un microscope Leica DMi8. Utilisez les paramètres du microscope confocal indiqués dans le tableau 2 pour acquérir des images à partir de l’analyse d’immunofluorescence.
| Nom Chanel | Cube | Longueur d’onde d’émission | Nom de la table de choix | Temps d’exposition | Gagner | Résolution XY | Résolution Z |
| Canal 1 | Y5 | 700 nm | Gris | 1 011,727 ms | grande capacité de puits | 2.237 um | 24.444 um |
| Canal 2 | GFP | 525 nm | Vert | 326,851 ms | grande capacité de puits | 2.237 um | 24.444 um |
| Canal 3 | Le | 630 nm | Rouge | 406,344 ms | grande capacité de puits | 2.237 um | 24.444 um |
| Canal 4 | Dapi | 460 nm | Bleu | 91.501 ms | grande capacité de puits | 2.237 um | 24.444 um |
Tableau 2 : Réglages du microscope confocal utilisés pour l’acquisition d’images issues de l’analyse d’immunofluorescence.
6. Analyse statistique
- Pour comparer les données obtenues à partir des côtés ipsilatéral et controlatéral, utilisez un test t de Student à deux queues apparié.
- Pour comparer les données obtenues chez des souris recevant AAV-hαSyn et des souris recevant AAV-GFP ou une chirurgie simulée, utilisez un test t de Student à deux queues non apparié. Considérez les différences significatives lorsque les valeurs P < 0,05.
Representative Results
Valider l’administration correcte des vecteurs AAV dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale
Pour étudier les processus de neuroinflammation, de neurodégénérescence et de déficience motrice favorisés par la pathologie de la synucléine, un modèle murin de la maladie de Parkinson induit par l’administration stéréotaxique unilatérale d’AAV codant hαSyn dans le SN 16,17,30,31 a été utilisé (voir le plan expérimental dans la figure supplémentaire 1 ). Pour valider l’administration correcte de vecteurs AAV dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, l’AAV codant pour GFP (AAV-GFP) a été injecté dans le SN, et 12 semaines plus tard, la fluorescence GFP et l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase (TH) ont été analysées dans le SN et le striatum par immunofluorescence. La fluorescence associée à la GFP a été observée exclusivement du côté ipsilatéral, et il y avait une colocalisation significative avec l’immunoréactivité TH dans le SN et le striatum, indiquant l’administration correcte de vecteurs AAV dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale (Figure 1).
Figure 1 : Analyse de l’administration de l’AAV-GFP dans la voie nigrostriatale. Les souris ont reçu de l’AAV-GFP (1 x 1010 vg/souris) et 12 semaines plus tard ont été sacrifiées, et la TH a été immunocolorée dans (A) le SN (les barres d’échelle sont de 118 μm) et (B) le striatum (les barres d’échelle sont de 100 μm). Les fluorescences associées à la TH et à la GFP ont été analysées par microscopie à épifluorescence. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. Des images représentatives de la coloration fusionnée ou unique de TH (rouge), GFP (vert) et DAPI (bleu) sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Mise en place de la dose de vecteur viral administrée pour induire la neurodégénérescence et la déficience motrice dans le modèle murin de la maladie de Parkinson induite par AAV-hαSyn
Pour tester la dose d’AAV-hαSyn nécessaire pour induire une surexpression significative de hαSyn qui favorise la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigrals, différentes doses (1 x 108 génomes viraux [vg]/souris, 1 x 109 vg/souris, ou 1 x 1010 vg/souris) d’AAV-hαSyn ont été injectées, et 12 semaines plus tard, l’immunoréactivité hαSyn et l’étendue de l’immunoréactivité TH ont été évaluées dans la voie nigrostriatale. Bien que l’immunoréactivité hαSyn ait été évidente avec toutes les doses testées dans le SN (Figure 2), seules les souris recevant 1 x 1010 vg/souris ont présenté une immunoréactivité hαSyn évidente dans le striatum (Figure 3). De plus, les souris recevant 1 x 1010 vg/souris d’AAV-hαSyn présentaient une perte significative de neurones dopaminergiques dans le SN (Figure 4A,B). Bien que les souris recevant 1 x 1010 vg/souris d’AAV-GFP présentaient un faible degré (~20%) de perte neuronale (Figure 4A,B), les souris recevant la même dose d’AAV-hαSyn présentaient un degré significativement plus élevé de neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux (Figure 4C). En conséquence, d’autres expériences ont été réalisées en utilisant 1 x10 10 vg/souris d’AAV-hαSyn. En outre, l’étendue de la déficience motrice a été déterminée chez des souris recevant différentes doses d’AAV-hαSyn à l’aide du test au faisceau (figure 5A), comme décrit ci-dessus25. Une réduction significative des performances du moteur a été détectée exclusivement avec 1 x 1010 vg/souris d’AAV-hαSyn dans le test de faisceau à la fois en comparant le nombre d’erreurs commises par les plaquettes droite et gauche (Figure 5B) et en comparant le nombre total d’erreurs de souris recevant AAV-hαSyn par rapport à des souris recevant le vecteur témoin AAV-GFP (Figure 5C). En conséquence, d’autres expériences ont été réalisées en utilisant 1 x10 10 vg/souris d’AAV-hαSyn.
Figure 2 : Analyse de l’expression humaine de la α-synucléine dans le SN de souris traitées avec différentes doses d’AAV-hαSyn. Les souris ont reçu AAV-hαSyn à (A) 1 x 1010 vg/souris, (B) 1 x 109 vg/souris, ou (C) 1 x 108 vg/souris et 12 semaines plus tard ont été sacrifiées, et l’expression de hαSyn a été analysée par immunofluorescence dans le SN à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. Des images représentatives de coloration fusionnée ou unique de hαSyn (rouge) ou de DAPI (bleu) sont montrées. Les barres d’échelle sont de 118 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Analyse de l’expression humaine de la α-synucléine dans le striatum de souris traitées avec différentes doses d’AAV-hαSyn. Les souris ont reçu AAV-hαSyn à (A) 1 x 1010 vg/souris, (B) 1 x 109 vg/souris, ou (C) 1 x 108 vg/souris) et 12 semaines plus tard ont été sacrifiées, et l’expression de hαSyn a été analysée par immunofluorescence dans le striatum à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. Des images représentatives de coloration fusionnée ou unique de hαSyn (rouge) ou de DAPI (bleu) sont montrées. Les barres d’échelle sont de 100 μm. L’insertion dans le coin supérieur droit des images fusionnées montre une zone d’intérêt avec un grossissement plus élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Perte de neurones dopaminergiques du SN chez des souris traitées avec différentes doses d’AAV-hαSyn ou vecteur témoin. Les souris ont reçu AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/souris, 1 x 109 vg/souris, ou 1 x 108 vg/souris) ou AAV-GFP (1 x 10 10 vg/souris) et12 semaines plus tard ont été sacrifiées, et la TH a été analysée dans le SNpc par immunohistochimie. (A) Images représentatives. Barres d’échelle, 100 μm. (B,C) La densité des neurones a été quantifiée comme le nombre de neurones TH+/mm2. Les données représentent la moyenne ± SEM. n = 3 à 8 souris par groupe. (B) Une comparaison des côtés ipsilatéral avec les côtés controlatéral a été effectuée à l’aide du test t de Student apparié à deux queues. (C) Une comparaison des côtés ipsilatéraux de souris recevant 1 x 1010 vg/souris d’AAV-hαSyn ou d’AAV-GFP a été effectuée. (B,C) Alors que les barres blanches indiquent la quantification des neurones TH+ du côté ipsilatéral des souris recevant AAV-hαSyn, les barres vertes indiquent la quantification des neurones TH+ du côté ipsilatéral des souris recevant AAV-GFP. Les barres grises indiquent la quantification des neurones TH+ du côté controlatéral du groupe correspondant. Les comparaisons ont été effectuées par un test t de Student non apparié à deux queues. *p < 0,05; **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse des performances motrices chez des souris traitées avec différentes doses d’AAV-hαSyn. Les souris ont reçu différentes doses (1 x10 10 vg/souris, 1 x 109 vg/souris, ou 1 x 108 vg/souris) d’AAV-hαSyn ou d’AAV-GFP, et 12 semaines plus tard, les performances du moteur ont été évaluées par le test au faisceau. (A) Image d’une souris marchant sur le faisceau. (B) Le nombre d’erreurs commises par les membres gauches (controlatéral) par rapport aux membres droits (ipsilatéral) a été quantifié dans les groupes de souris recevant AAV-hαSyn. (C) Le nombre total d’erreurs a été comparé entre différents groupes expérimentaux recevant la même dose d’AAV-hαSyn ou d’AAV-GFP. Les données représentent la moyenne ± SEM. n = 3–5 souris par groupe. Les comparaisons ont été effectuées par (B) un test t d’étudiant à deux queues apparié ou par (C) un test t d’étudiant à deux queues non apparié. *p < 0,05; **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Mise en place de la cinétique du modèle de la maladie de Parkinson induite par AAV-αSyn
Après avoir déterminé la dose appropriée d’AAV-hαSyn utilisée pour induire un niveau significatif de neurodégénérescence et de déficience motrice, des expériences visant à définir l’apparition de la surexpression de hαSyn ont été menées. À cette fin, les souris ont été traitées avec 1 x 1010 vg/souris d’AAV-hαSyn ou de chirurgie simulée. L’étendue de l’expression de hαSyn a été analysée dans le SN une fois par semaine pendant les semaines 2 à 5 après la chirurgie stéréotaxique (voir le plan expérimental de la figure supplémentaire 2). Les résultats montrent que, bien que l’expression de hαSyn ait été détectée à de faibles niveaux dès 2 semaines après la chirurgie, les grappes de hαSyn sont apparues à la semaine 5 après la chirurgie stéréotaxique (Figure 6).
Figure 6 : Analyse de l’évolution temporelle de l’expression de la α-synucléine humaine dans le SN de souris traitées par AAV-hαSyn. Les souris ont reçu AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/souris) ou simplement la chirurgie stéréotaxique simulée, et l’expression de hαSyn dans le SN a été analysée (A) 2 semaines, (B) 3 semaines, (C) 4 semaines, ou (D) 5 semaines plus tard par immunofluorescence par microscopie à épifluorescence. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. Des images représentatives de coloration fusionnée ou unique de hαSyn (rouge) ou de DAPI (bleu) sont montrées. Barres d’échelle, 100 μm. L’insertion dans le coin supérieur droit des images fusionnées montre une zone d’intérêt avec un grossissement plus élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Par la suite, des expériences ont été menées pour déterminer les points temporels appropriés pour analyser la neuroinflammation et l’infiltration des lymphocytes T dans le système nerveux central (SNC) après l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn. Pour déterminer le pic d’activation microgliale après le traitement des souris avec AAV-hαSyn, l’étendue des cellules exprimant des niveaux élevés d’Iba1 dans le striatum a été évaluée une fois par semaine pendant les semaines 2 à 15 après la chirurgie stéréotaxique. Les résultats montrent une augmentation significative de l’activation microgliale du côté ipsilatéral par rapport au côté controlatéral des souris 15 semaines après le traitement AAV-hαSyn (Figure 7). Le nombre de cellules Treg (CD4+ Foxp3+) infiltrées dans le SNpc a également été évalué à différents moments après l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn par immunofluorescence suite à une observation par microscopie confocale. Les résultats montrent que le pic d’infiltration de Treg dans le SNpc était à 11 semaines après la chirurgie, tandis que l’étendue de l’infiltration de Treg dans cette zone du cerveau était plus faible à la semaine 8 ou à la semaine 13 après la chirurgie (Figure 8). Aucun lymphocyte T CD4+ n’a été détecté s’infiltrant dans le striatum (données non présentées). Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que, en utilisant 1 x 1010 vg / souris d’AAV-hαSyn, le moment le plus approprié pour analyser la neuroinflammation est la semaine 15 après la chirurgie stéréotaxique, tandis qu’un point de temps approprié pour analyser l’infiltration des lymphocytes T dans le SNC semble être la semaine 11 après le traitement AAV-hαSyn.
Figure 7 : Analyse de l’évolution temporelle de l’activation microgliale chez les souris inoculées avec AAV-hαSyn. Les souris ont reçu AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/souris), et l’activation microgliale a été évaluée par analyse immunohistochimique d’Iba1 dans le striatum à différents moments après la chirurgie. (A) Des images d’ensemble représentatives de l’analyse immunohistochimique d’Iba1 provenant de souris sacrifiées 5 semaines, 10 semaines ou 15 semaines après l’inoculation avec AAV-hαSyn sont montrées. Barres d’échelle, 110 μm. (B) La densité de la microglie activée a été quantifiée comme le nombre de cellules exprimant des niveaux élevés d’Iba1 et de forme améboïde par zone. Les données représentent la moyenne ± SEM. n = 3 souris par groupe. Un test t de Student apparié à deux queues a été utilisé pour déterminer les différences statistiques entre l’Iba1 ipsilatéral et le Iba1 controlatéral dans chaque groupe. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Analyse de l’évolution temporelle de l’infiltration des lymphocytes T CD4+ dans le SN de souris inoculées avec AAV-hαSyn. Les souris rapporteures Foxp3gfp ont reçu AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/souris). La présence de lymphocytes T CD4+ exprimant Foxp3 et la présence de neurones TH+ ont été analysées à différents moments (semaine 8, semaine 11 et semaine 13 après la chirurgie) dans le SN par immunofluorescence. (A) Des images représentatives pour l’immunocoloration unique ou la fusion sont montrées. Barres d’échelle, 100 μm. (B) Le nombre de lymphocytes T CD4+ Foxp3+ par zone dans le SN a été quantifié. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 souris par groupe. *p<0,05, cellules T IPSilatérales versus lymphocytes T CD4+ Foxp3+ controlatérales par test t de Student à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Plan expérimental pour évaluer l’effet de différentes doses de vecteurs AAV sur la pathologie de la synucléine, la neurodégénérescence et la déficience motrice. Des souris mâles de type sauvage C57BL/6 ont été anesthésiées et ont reçu une inoculation stéréotaxique de différentes doses (1 x 10 10 vg/souris, 1 x 109 vg/souris ou 1 x 108 vg/souris) d’AAV codant pour la α-synucléine humaine (AAV-hαSyn) ou l’eGFP (AAV-GFP) sous le contrôle du promoteur de l’ACA dans la substantia nigra (SN) droite. Après 12 semaines, l’expression de GFP et de hαSyn dans le SN et le striatum (Str) a été évaluée par immunofluorescence (FI), les cellules tyrosine hydroxylase positives (TH+) ont été quantifiées par immunohistochimie (IHC) dans le SN, et les performances motrices ont été évaluées par le test au faisceau. Le nombre de souris dans chaque groupe expérimental est indiqué entre parenthèses. * indique les groupes où une souris est morte avant les analyses. Chaque analyse indique entre parenthèses le numéro de la figure du corps de l’article où les résultats correspondants sont affichés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Plan expérimental pour déterminer la cinétique de l’infiltration des lymphocytes T, de la neuroinflammation et de l’expression de hαSyn. Les souris rapporteures Foxp3gfp ont été anesthésiées et ont reçu une inoculation stéréotaxique d’AAV (1 x10 10 vg/souris) codant pour la α-synucléine humaine (AAV-hαSyn) sous le contrôle du promoteur de l’ABC dans la substantia nigra droite (SN) ou la chirurgie simulée (PBS). Des souris ont été sacrifiées à différents moments, et l’expression de hαSyn dans le SN et le striatum a été évaluée par immunofluorescence (IF), GFP (Foxp3), CD4 et tyrosine hydroxylase positive (TH+) cellules ont été quantifiées par IF dans le SN, et l’expression d’Iba1 a été analysée par immunohistochimie (IHC) dans le striatum (Str). Le nombre de souris dans chaque groupe expérimental est indiqué. La plage de points temporels inclus dans chaque analyse est indiquée. Chaque analyse indique entre parenthèses le numéro de la figure du corps de l’article où les résultats correspondants sont affichés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le modèle murin de neurodégénérescence analysé ici pourrait aider à étudier de nombreux aspects critiques impliqués dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson, y compris les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn et l’activation microgliale, l’implication du système immunitaire périphérique dans la régulation de la neuroinflammation et les mécanismes de la neurodégénérescence. Parmi les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn figurent les mécanismes subcellulaires associés à un dysfonctionnement mitochondrial, lysosomal ou protéasomal en présence d’une charge excessive d’αSyn dans les neurones dopaminergiques du SN2. Il est important de considérer que, en plus de l’expression hαSyn induite par la transduction médiée par l’AAV, la souris endogène αSyn contribue également à la charge d’expression totale d’αSyn. Les souris transgéniques surexprimant la souris αSyn développent une pathologie de la synucléine, une neuropathologie et une déficience motrice similaires à celles de ces modèles murins basées sur la surexpression de hαSyn32. En ce qui concerne l’activation microgliale, le présent modèle murin pourrait être utilisé pour étudier comment différents acteurs moléculaires et cellulaires tels que les cytokines, les neurotransmetteurs, les astrocytes, les neurones, la barrière hémato-encéphalique et les lymphocytes T pourraient réguler l’acquisition de phénotypes fonctionnels pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires 8,10,11 . Ce modèle constitue également un outil important pour étudier le rôle du système immunitaire périphérique, comprenant non seulement les lymphocytes T mais aussi les macrophages, les monocytes et les neutrophiles, sur les processus de neuroinflammation et de neurodégénérescence des neuronesnigrals 11,33,34. Enfin, ce modèle murin représente également un système précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neurodégénérescence in vivo, y compris ceux induits par des processus cellulaires internes, tels que le stress oxydatif, les déficits énergétiques et les organites endommagés 2, ou ceux exercés par des acteurs externes, tels que les facteurs neurotoxiques produits par les cellules microgliales, les astrocytes et les lymphocytes T cytotoxiques8, 28,29,35.
Une limitation de ce modèle murin est l’étude de la façon dont l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux pourrait constituer les premiers stades du développement de la maladie de Parkinson36. À cet égard, il existe de plus en plus de preuves indiquant que, avant la neurodégénérescence des neurones nigral et la déficience motrice, la pathologie αSyn commence dans la muqueuse intestinale et l’épithélium olfactif36 et, probablement, la réponse des lymphocytes T spécifiques à αSyn ainsi que12. Par la suite, les agrégats αSyn migreraient à travers le nerf vague vers le tronc cérébral, déclenchant la neuroinflammation et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques12. Bien que le modèle AAV-hαSyn récapitule la plupart des aspects de la maladie de Parkinson, il n’y a pas d’implication évidente de l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux dans ce modèle. Un modèle alternatif impliquant la pathologie hαSyn approprié pour étudier ces aspects de la maladie de Parkinson pourrait être des souris transgéniques surexprimant hαSyn sous le contrôle du promoteur Thy1, le modèle Thy1-SNCA 37, dans lequel le développement de la maladie dépend du microbiote intestinal et implique une déficience gastro-intestinale évidente38.
Bien qu’il soit utile pour l’étude des divers processus associés à la physiopathologie de la maladie de Parkinson, le présent modèle murin implique des étapes critiques qui doivent être minutieusement vérifiées, y compris la livraison correcte des vecteurs viraux dans les coordonnées spatiales correspondantes, l’expression sélective de hαSyn dans les neurones (qui dépend du sérotype AAV et de la construction vectorielle), et la dose et le moment appropriés de l’AAV avant d’analyser le phénotype parkinsonien. L’analyse de la bonne administration des vecteurs viraux dans le SN est nécessaire, car l’utilisation des coordonnées spatiales correctes du SN peut ne pas suffire lorsque l’aiguille n’est pas entièrement droite, ce qui est parfois imperceptible à l’œil humain. De plus, la diffusion des vecteurs AAV dépend du sérotypeAAV 39. Pour ces raisons, il est nécessaire d’effectuer des contrôles de qualité périodiques vérifiant l’administration et la diffusion correctes des vecteurs AAV-GFP injectés après l’observation de GFP dans des tranches de cerveau contenant la zone du SN.
En ce qui concerne l’expression sélective de hαSyn dans les neurones, en principe, l’expression de hαSyn pourrait être conçue pour être contrôlée par un promoteur sélectif pour les neurones ou, plus précisément encore, sélectif pour les neurones dopaminergiques, comme l’utilisation du promoteur TH dans les vecteurs AAV pour induire l’expression sélective des gènes dans les neurones dopaminergiques40 . Cependant, cette stratégie ne fonctionne pas lorsque ce qui est recherché est la surexpression du gène d’intérêt. Pour cette raison, dans le présent modèle, il est essentiel d’utiliser un promoteur fort (un promoteur induisant une forte expression du gène en aval) et des sérotypes AAV avec tropisme neuronal. Dans cette étude, le promoteur de l’ACA a été utilisé comme promoteur puissant pour induire la surexpression de hαSyn, et le sérotype AAV5 a été utilisé pour le vecteur viral. Ce sérotype a déjà été utilisé pour transduire les neurones de souris et de rats41,42. Ici, les résultats ont démontré que, 12 semaines après l’administration d’AAV5-GFP dans le SN de souris, la fluorescence verte était sélectivement présente sur le côté ipsilatéral du SN et du striatum (Figure 1), indiquant la transduction efficace des neurones de la voie nigrostriatale.
Un autre aspect critique de ce modèle murin de la maladie de Parkinson est le temps nécessaire pour analyser un processus particulier après la chirurgie. À cet égard, ce travail montre une étude cinétique des différents processus impliqués dans la pathologie. Étant donné que les points temporels clés changent avec la dose de génomes viraux administrée par souris, le sérotype d’AAV utilisé, ou même avec le lot d’AAV utilisé, une analyse dose-réponse de la quantité d’AAV-αSyn nécessaire pour induire une perte significative de neurones TH + et une déficience motrice a d’abord été effectuée. Des études antérieures ont montré une déficience motrice significative et une perte de neurones TH + de la voie nigrostriatale après 12 semaines d’injections d’AAV-αSyn chez la souris à des doses allant de 6 x 108–3 x10 10 génomes viraux par souris 16,17,30,31. En conséquence, la dose d’AAV-hαSyn utilisée pour induire l’expression de hαSyn dans la voie nigrostriatale, la perte de neurones TH+ et la déficience motrice chez la souris variait de 1 x 108–1 x 1010 génomes viraux par souris. De plus, pour contrôler que la perte de neurones TH+ et la déficience motrice étaient induites par la surexpression de hαSyn dans le SN et non par l’infection AAV des neurones du SN, des groupes témoins ont été inclus dans lesquels le codage AAV pour un gène rapporteur (AAV-eGFP) a été administré unilatéralement dans le SN de souris et la neurodégénérescence et la déficience motrice ont été déterminées. Les résultats ont montré que, 12 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 x 1010 génomes viraux par souris était une dose appropriée d’AAV5-hαSyn, car les souris recevant cette charge virale présentaient une hαSyn significative dans la voie nigrostriatale (Figure 2 et Figure 3), une perte de neurones TH+ (Figure 4) et une déficience motrice (Figure 5). En revanche, des doses plus faibles d’AAV5-hαSyn (1 x 108 génomes viraux par souris et 1 x 109 génomes viraux par souris) n’étaient pas assez fortes pour atteindre des changements significatifs dans tous ces paramètres ensemble (figures 2-4). Il est à noter que l’administration d’AAV-GFP à 1 x10 10 génomes viraux par souris a induit un degré faible (~20%), mais significatif de perte des neurones TH+ des neurones dopaminergiques nigrals (Figure 4A,B). Ce résultat concorde avec les observations précédentes utilisant ce modèle41 et est probablement la conséquence d’un faible niveau de neuroinflammation induit par l’administration de vecteurs AAV dans le SN. Néanmoins, l’étendue de la perte de neurones TH+ était significativement plus élevée chez les souris recevant AAV5-hαSyn par rapport à celles recevant la même dose d’AAV-GFP (Figure 4C). Il est à noter que la cinétique de l’expression de hαSyn dépend non seulement de l’efficacité de la transduction, mais aussi de l’étendue de la diffusion de l’AAV39. Étant donné que la diffusion de l’AAV dépend du sérotype de l’AAV, les points temporels clés précis de ce modèle animal peuvent varier lors de l’utilisation d’un autre sérotype d’AAV différent de l’AAV5.
Par la suite, une analyse cinétique a été réalisée en utilisant 1 x 1010 génomes viraux par souris pour déterminer les points temporels clés dans ce modèle murin. Étant donné que les preuves actuelles ont montré certains symptômes précoces qui apparaissent avant la déficience motrice, ce qui permettrait le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson 43,44, ces expériences ont cherché à trouver le moment où l’expression de hαSyn était déjà évidente, mais en l’absence de déficience motrice. Les résultats montrent que l’apparition de l’expression de hαSyn dans le SN a eu lieu 5 semaines après l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn (Figure 6). Ce point temporel constitue un point temporel intéressant pour commencer à administrer des thérapies adaptées pour arrêter les processus neuro-inflammatoires et neurodégénératifs. D’autres points temporels clés déterminés ici étaient les heures de pointe pour deux événements critiques associés au processus de neuroinflammation: le moment où la microglie atteint le degré maximal d’activation et le temps d’infiltration maximale des lymphocytes T dans le SN. Les résultats ont montré une courbe avec une tendance atteignant deux vagues d’activation microgliale maximale, la première à 10 semaines après la chirurgie et la seconde à 15 semaines après la chirurgie (Figure 7). L’analyse cinétique de l’infiltration des lymphocytes T a montré le pic d’infiltration du Treg dans le SN à 11 semaines après la chirurgie stéréotaxique (Figure 8). Étonnamment, aucun lymphocyte T effecteur (CD4+ Foxp3-) n’a été détecté infiltrant le SN au cours de la période analysée (semaines 8 à 13 après la chirurgie). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent un laps de temps approprié pour commencer à administrer des thérapies visant à arrêter le processus de neuroinflammation et à atténuer l’infiltration des lymphocytes T dans le SN à l’aide de ce modèle préclinique, qui varie entre la semaine 5 après la chirurgie (le début de la surexpression de hαSyn) et la semaine 10 après la chirurgie (la première vague de neuroinflammation et d’infiltration des lymphocytes T) (Figure 9).
Figure 9: Résumé des principaux points temporels trouvés pour ce modèle animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence d’intérêts financiers ou non financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Sebastián Valenzuela et le Dr Micaela Ricca pour leur précieuse assistance vétérinaire dans notre établissement pour animaux. Ce travail a été soutenu par « Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID » Centro Ciencia & Vida, FB210008 (à la Fundación Ciencia & Vida), et le Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Ce travail a également été financé par les subventions FONDECYT-1210013 (à R.P.) et FONDECYT-1150766 (à F.C.) de « Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID) » et MJFF-10332.01 (à R.P.) et MJFF-17303 (à F.C.) de la Fondation Michael J Fox pour la recherche sur la maladie de Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
| Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
| VIRAL VECTORS | |||
| AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
| AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
| ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
| Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
| Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
| Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
| Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
| Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
| EQUIPMENT | |||
| Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
| Cryostate | Leica | CM1520 | |
| Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
| Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
| Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
| New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
| Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
| Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
| Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
| Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
| BUFFERS AND REAGENTS | |||
| Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
| Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
| Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
| Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
| Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
| PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
| Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
| ANTIBODIES | |||
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
| Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
| Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
| Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
| SOFTWARES | |||
| GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
| ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
| LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
| ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
| VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |
References
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Lim, K. L., Zhang, C. W. Molecular events underlying Parkinson's disease - An interwoven tapestry. Frontiers in Neurology. 4, 33 (2013).
- Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Mori, F., et al. Relationship among alpha-synuclein accumulation, dopamine synthesis, and neurodegeneration in Parkinson disease substantia nigra. The Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 65 (8), 808-815 (2006).
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Vazquez-Velez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44, 87-108 (2021).
- Dehay, B., et al.
- Gonzalez, H., Elgueta, D., Montoya, A., Pacheco, R. Neuroimmune regulation of microglial activity involved in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. Journal of Neuroimmunology. 274 (1-2), 1-13 (2014).
- Pacheco, R. T-cell based immunotherapies for Parkinson's disease. Exploration of Neuroprotective Therapy. 1 (2), 72-85 (2021).
- Gonzalez, H., Contreras, F., Pacheco, R. Regulation of the neurodegenerative process associated to Parkinson's disease by CD4+ T-cells. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 10 (4), 561-575 (2015).
- Gonzalez, H., Pacheco, R. T-cell-mediated regulation of neuroinflammation involved in neurodegenerative diseases. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 201 (2014).
- Campos-Acuna, J., Elgueta, D., Pacheco, R. T-cell-driven inflammation as a mediator of the gut-brain axis involved in Parkinson's disease. Frontiers in Immunology. 10, 239 (2019).
- Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
- Ulusoy, A., Decressac, M., Kirik, D., Bjorklund, A. Viral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein as a progressive model of Parkinson's disease. Progress in Brain Research. 184, 89-111 (2010).
- Gomez-Benito, M., et al. Modeling Parkinson's disease with the alpha-synuclein protein. Frontiers in Pharmacology. 11, 356 (2020).
- Song, L. K., et al. Targeted overexpression of alpha-synuclein by rAAV2/1 vectors induces progressive nigrostriatal degeneration and increases vulnerability to MPTP in mouse. PLoS One. 10 (6), 0131281 (2015).
- Theodore, S., Cao, S., McLean, P. J., Standaert, D. G. Targeted overexpression of human alpha-synuclein triggers microglial activation and an adaptive immune response in a mouse model of Parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 67 (12), 1149-1158 (2008).
- Sanchez-Guajardo, V., Annibali, A., Jensen, P. H., Romero-Ramos, M. alpha-Synuclein vaccination prevents the accumulation of parkinson disease-like pathologic inclusions in striatum in association with regulatory T cell recruitment in a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 72 (7), 624-645 (2013).
- Sanchez-Guajardo, V., Febbraro, F., Kirik, D., Romero-Ramos, M. Microglia acquire distinct activation profiles depending on the degree of alpha-synuclein neuropathology in a rAAV based model of Parkinson's disease. PLoS One. 5 (1), 8784 (2010).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 8, 44 (2013).
- Cho, C., et al. Evaluating analgesic efficacy and administration route following craniotomy in mice using the grimace scale. Scientific Reports. 9 (1), 359 (2019).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. 3rd Ed. , ElsevierAcademic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Bind, R. H., Minney, S. M., Rosenfeld, S., Hallock, R. M. The role of pheromonal responses in rodent behavior: Future directions for the development of laboratory protocols. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (2), 124-129 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Cambridge, MA. (2001).
- Elgueta, D., et al. Dopamine receptor D3 expression is altered in CD4+ T-cells from Parkinson's disease patients and its pharmacologic inhibition attenuates the motor impairment in a mouse model. Frontiers in Immunology. 10, 981 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Fernandez-Suarez, D., et al. The monoacylglycerol lipase inhibitor JZL184 is neuroprotective and alters glial cell phenotype in the chronic MPTP mouse model. Neurobiology of Aging. 35 (11), 2603-2616 (2014).
- Elgueta, D., et al. Pharmacologic antagonism of dopamine receptor D3 attenuates neurodegeneration and motor impairment in a mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 113, 110-123 (2017).
- Montoya, A., et al. Dopamine receptor D3 signalling in astrocytes promotes neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 258 (2019).
- Williams, G. P., et al. Targeting of the class II transactivator attenuates inflammation and neurodegeneration in an alpha-synuclein model of Parkinson's disease. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 244 (2018).
- Benskey, M. J., et al. Silencing alpha synuclein in mature nigral neurons results in rapid neuroinflammation and subsequent toxicity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 36 (2018).
- Rieker, C., et al. Neuropathology in mice expressing mouse alpha-synuclein. PLoS One. 6 (9), 24834 (2011).
- Harms, A. S., et al. alpha-Synuclein fibrils recruit peripheral immune cells in the rat brain prior to neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 85 (2017).
- Williams, G. P., et al. CD4 T cells mediate brain inflammation and neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease. Brain. 144 (7), 2047-2059 (2021).
- Matheoud, D., et al. Intestinal infection triggers Parkinson's disease-like symptoms in Pink1(-/-) mice. Nature. 571 (7766), 565-569 (2019).
- Jan, A., Goncalves, N. P., Vaegter, C. B., Jensen, P. H., Ferreira, N. The prion-like spreading of alpha-synuclein in Parkinson's disease: Update on models and hypotheses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 8338 (2021).
- Chesselet, M. F., et al. A progressive mouse model of Parkinson's disease: The Thy1-aSyn ("Line 61") mice. Neurotherapeutics. 9 (2), 297-314 (2012).
- Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480 (2016).
- Ciron, C., et al. Human alpha-iduronidase gene transfer mediated by adeno-associated virus types 1, 2, and 5 in the brain of nonhuman primates: Vector diffusion and biodistribution. Human Gene Therapy. 20 (4), 350-360 (2009).
- Ben-Shaanan, T. L., et al. Activation of the reward system boosts innate and adaptive immunity. Nature Medicine. 22 (8), 940-944 (2016).
- Albert, K., Voutilainen, M. H., Domanskyi, A., Airavaara, M. AAV vector-mediated gene delivery to substantia nigra dopamine neurons: Implications for gene therapy and disease models. Genes. 8 (2), 63 (2017).
- Bordia, T., Perez, X. A., Heiss, J., Zhang, D., Quik, M. Optogenetic activation of striatal cholinergic interneurons regulates L-dopa-induced dyskinesias. Neurobiology of Disease. 91, 47-58 (2016).
- Kim, A., et al. Upgraded methodology for the development of early diagnosis of Parkinson's disease based on searching blood markers in patients and experimental models. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3437-3450 (2018).
- Lei, H., et al. Parkinson's disease diagnosis via joint learning from multiple modalities and relations. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 23 (4), 1437-1449 (2018).
