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Biochemistry

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी या अन्य रोगजनक जीवों से डीएनए का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करने के लिए तैयार

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63316
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,2, 1,3
1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

Summary

वर्तमान कार्य टी क्रूज़ी डीएनए का पता लगाने के लिए रेडी-टू-यूज़ क्यूपीसीआर के उत्पादन के चरणों का वर्णन करता है जिसे प्रतिक्रिया पोत पर प्री-लोड किया जा सकता है और कई महीनों तक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है।

Abstract

रियल-टाइम पीसीआर (क्यूपीसीआर) एक उल्लेखनीय संवेदनशील और सटीक तकनीक है जो नमूनों की भीड़ से न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की छोटी मात्रा को बढ़ाने की अनुमति देती है। यह कई अनुसंधान क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है और आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (जीएमओ) फसलों की फसलों में मानव निदान और विशेषता चयन जैसे क्षेत्रों में औद्योगिक अनुप्रयोग प्राप्त किया है। हालांकि, QPCR एक त्रुटि-प्रूफ तकनीक नहीं है। सभी अभिकर्मकों को एक ही मास्टर मिश्रण में मिलाने से बाद में एक नियमित क्यूपीसीआर प्लेट के 96 कुओं पर वितरित किया जाता है, जिससे ऑपरेटर की गलतियां हो सकती हैं जैसे कि अभिकर्मकों का गलत मिश्रण या कुओं में गलत वितरण। यहां, गेलिफिकेशन नामक एक तकनीक प्रस्तुत की जाती है, जिससे मास्टर मिश्रण में मौजूद अधिकांश पानी को अभिकर्मकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जो वैक्यूम में प्रस्तुत होने पर सोल-जेल मिश्रण बनाते हैं। नतीजतन, क्यूपीसीआर अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर कुछ हफ्तों या 2-8 डिग्री सेल्सियसपर कुछ महीनों के लिए प्रभावी रूप से संरक्षित किया जाता है। प्रत्येक समाधान तैयार करने का विवरण टी क्रूज़ी उपग्रह डीएनए (एसएटीडीएनए) का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई जेलिफाइड प्रतिक्रिया के अपेक्षित पहलू के साथ यहां दिखाया गया है। अन्य जीवों का पता लगाने के लिए एक समान प्रक्रिया लागू की जा सकती है। एक गेलिफाइड क्यूपीसीआर रन शुरू करना उतना ही सरल है जितना कि रेफ्रिजरेटर से प्लेट को हटाना, नमूनों को अपने संबंधित कुओं में जोड़ना, और रन शुरू करना, इस प्रकार नमूने लोड करने में लगने वाले समय तक पूर्ण-प्लेट प्रतिक्रिया के सेटअप समय को कम करना। इसके अतिरिक्त, गेलिफाइड पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बैचों में गुणवत्ता के लिए उत्पादित और नियंत्रित किया जा सकता है, समय की बचत होती है और नियमित पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाते समय सामान्य ऑपरेटर गलतियों से बचा जा सकता है।

Introduction

चगास रोग की खोज 20वीं शताब्दी की शुरुआत में ब्राजील के ग्रामीण क्षेत्रों में की गई थी, जहां गरीबी व्यापक थी 1,2। आज भी, बीमारी अमेरिका में स्वास्थ्य के सामाजिक और आर्थिक निर्धारकों से जुड़ी हुई है। चगास रोग द्विध्रुवीय है, जिसमें एक तीव्र और एक पुराना चरण शामिल है। यह ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी द्वारा संक्रमण के कारण होता है, जो कीट वैक्टर, जन्मजात मार्ग के माध्यम से रक्त आधान, यादूषित भोजन के मौखिक अंतर्ग्रहण द्वारा प्रेषित होता है।

चगास रोग का निदान नैदानिक लक्षणों (विशेष रूप से रोमाना संकेत), रक्त स्मीयर माइक्रोस्कोपी, सीरोलॉजी और आणविक परीक्षणों जैसे वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) या आइसोथर्मल प्रवर्धन 4,5,6,7,8,9 के अवलोकन के माध्यम से किया जा सकता है। नैदानिक लक्षणों और रक्त स्मीयर माइक्रोस्कोपी का उपयोग तीव्र संक्रमण के संदिग्ध मामलों में किया जाता है, जबकि एंटीबॉडी की खोज का उपयोग स्पर्शोन्मुख रोगियों में स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जाता है। इसकी संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण, क्यूपीसीआर को पुराने रोगियों के लिए एक निगरानी उपकरण के रूप में उपयोग करने का सुझाव दिया गया है, रक्त में परजीवी भार को मापने वाले उपचार से गुजरने वाले तीव्र रोगियों के लिए, और चिकित्सीय विफलता के सरोगेट मार्कर के रूप में 6,8,10,11,12 . हालांकि वर्तमान में उपलब्ध परीक्षणों की तुलना में अधिक संवेदनशील और विशिष्ट, क्यूपीसीआर को परिवहन और भंडारण 13,14,15 के लिए ठंड के तापमान की आवश्यकता के कारण दुनिया भर में वंचित क्षेत्रों में नैदानिक उपकरण के रूप में जाना जाता है।

इस बाधा को दरकिनार करने के लिए, लियोफिलाइजेशन और गेलिफिकेशन जैसी संरक्षण तकनीकोंका पता लगाया गया है। जबकि लियोफिलाइजेशन वर्षों तक संरक्षण प्रदान करता है, इसके लिए ग्लिसरॉल की उपस्थिति के बिना विशेष रूप से बनाए गए अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग आमतौर पर एंजाइम स्थिरीकरण / संरक्षणके लिए किया जाता है। जबकि गेलिफिकेशन को महीनों तक संरक्षण प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, यह नियमित अभिकर्मकों के उपयोग की अनुमति देताहै। गेलिफिकेशन समाधान में चार घटक शामिल होते हैं, जिनमें से प्रत्येक प्रक्रिया में विशिष्ट भूमिका निभाता है: शर्करा ट्रेहलोस और मेलेज़िटोज समाधान में मुक्त पानी के अणुओं को कम करके निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान बायोमोलेक्यूल्स की रक्षा करते हैं, ग्लाइकोजन एक व्यापक सुरक्षात्मक मैट्रिक्स का उत्पादन करता है, और अमीनो एसिड लाइसिन का उपयोग बायोमोलेक्यूल के कार्बोक्सिल के बीच ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए एक मुक्त कट्टरपंथी मेहतर के रूप में किया जाता है, अमीनो और फॉस्फेट समूह। ये घटक एक सोल-जेल मिश्रण को परिभाषित करते हैं जो निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान तृतीयक या चतुर्धातुक संरचना के नुकसान को रोकता है, इस प्रकार पुनर्जलीकरण19 पर बायोमोलेक्यूल्स की गतिविधि को बनाए रखने में मदद करता है। एक बार प्रतिक्रिया ट्यूबों के अंदर स्थिर होने के बाद, प्रतिक्रियाओं को नियमित -20 डिग्री सेल्सियस के बजाय 2-8 डिग्री सेल्सियस या कुछ हफ्तों के लिए 21-23 डिग्री सेल्सियस पर कुछ महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को पहले से ही चगास रोग, मलेरिया, लीशमैनियासिस, तपेदिक और साइक्लोस्पोरियासिस13,14,15,20 जैसी बीमारियों के निदान में मदद करने के लिए डिज़ाइन किए गए परीक्षणों में शामिल किया गया है।

वर्तमान कार्य में गेलिफिकेशन प्रक्रिया के लिए आवश्यक समाधान तैयार करने के लिए सभी चरणों, प्रक्रिया में नुकसान और आठ-ट्यूब स्ट्रिप्स के अंदर रेडी-टू-यूज़ गेलिफाइड क्यूपीसीआर के अपेक्षित अंतिम पहलू का वर्णन किया गया है। एक ही प्रोटोकॉल को एकल ट्यूबों या 96-वेल प्लेटों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, टी क्रूज़ी डीएनए का पता लगाने को एक नियंत्रण रन के रूप में दिखाया जाएगा।

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Protocol

1. स्टॉक समाधान और गेलिफिकेशन मिश्रण की तैयारी

नोट: चार स्टॉक समाधान तैयार किए जाएंगे (400 मिलीग्राम / एमएल मेलेज़िटोज, 400 मिलीग्राम / एमएल ट्रेहलोस, 0.75 मिलीग्राम / एमएल लाइसिन, और 200 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन) और गेलिफिकेशन मिश्रण का उत्पादन करने के लिए तालिका 1 में दिखाए गए अनुपात के अनुसार मिलाया जाएगा । यद्यपि प्रोटोकॉल स्टॉक समाधान उत्पादन के 10 एमएल का वर्णन करता है, इसे कम या उच्च मात्रा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. Melezitose solution
    1. 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 4 ग्राम मेलेज़िटोज का वजन करें, 6 एमएल न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और पाउडर घुलनशील होने तक उपकरण की अधिकतम गति से भंवर जोड़ें।
      नोट: घुलनशीलता की सुविधा के लिए अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, इस बात का ध्यान रखते हुए कि अंतिम मात्रा से अधिक न हो (नीचे देखें)।
    2. न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ अंतिम मात्रा 10 एमएल तक बनाएं। लेबल करें और 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. ट्रेहलोस का घोल
    1. 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 4 ग्राम ट्रेहलोस का वजन करें, 6 एमएल न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और पाउडर घुलनशील होने तक उपकरण की अधिकतम गति पर भंवर जोड़ें।
      नोट: घुलनशीलता की सुविधा के लिए अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, इस बात का ध्यान रखते हुए कि अंतिम मात्रा से अधिक न हो (नीचे देखें)।
    2. न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 एमएल तक बनाएं और 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। लेबल करें और 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ग्लाइकोजन समाधान
    1. 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 2 ग्राम ग्लाइकोजन का वजन करें, 6 एमएल न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और पाउडर घुलनशील होने तक उपकरण की अधिकतम गति से भंवर जोड़ें।
      नोट: घुलनशीलता की सुविधा के लिए अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, इस बात का ध्यान रखते हुए कि अंतिम मात्रा से अधिक न हो (नीचे देखें)।
    2. 8-12 घंटे के लिए समाधान को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर आराम से रखें क्योंकि ग्लाइकोजन का घुलनशीलता बहुत सारे बुलबुले पैदा करता है (चित्रा 1)। न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 एमएल तक बनाएं। लेबल करें और 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. लाइसिन समाधान
    1. 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 7.5 मिलीग्राम लाइसिन का वजन करें, 6 एमएल न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें। उपकरण की अधिकतम गति पर भंवर जब तक पाउडर घुलनशील न हो जाए।
      नोट: घुलनशीलता की सुविधा के लिए अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, इस बात का ध्यान रखते हुए कि अंतिम मात्रा से अधिक न हो (नीचे देखें)।
    2. न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 एमएल तक बनाएं और 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। घोल को एम्बर फ्लास्क में स्थानांतरित करें या इसे प्रकाश से बचाएं। लेबल करें और 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस डिग्री पर स्टोर करें।
  5. गेलिफिकेशन मिश्रण (जीएम)
    1. 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में, तालिका 1 के अनुसार स्टॉक समाधान की मात्रा को मिलाएं।
    2. ट्यूब के दस एंड-टू-एंड इनवर्शन द्वारा अभिकर्मकों को मिलाएं।
      नोट: यदि यह चरण लैमिनार प्रवाह सुरक्षा हुड में किया जाता है तो निस्पंदन चरण की कोई आवश्यकता नहीं है। यदि यह चरण स्वच्छ वातावरण में नहीं किया जाता है, तो समाधान को एम्बर फ्लास्क में स्थानांतरित करने से पहले 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. घोल को एम्बर फ्लास्क में स्थानांतरित करें या इसे प्रकाश से बचाएं। लेबल करें और 3 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: गेलिफिकेशन मिश्रण तैयार करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में, सुनिश्चित करें कि मापा पीएच, चालकता और घनत्व मान निम्नलिखित श्रेणियों के भीतर हैं: पीएच 5.55-6.66; चालकता 0.630-0.757 mS / सेमी; और घनत्व 1.08-1.11 ग्राम / सेमी3। सभी माप 25 डिग्री सेल्सियस पर लिया जाना चाहिए।

2. गेलिफिकेशन के लिए क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स की तैयारी

नोट: इस चरण में, गेलिफिकेशन के लिए क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार किया जाता है। इसलिए, मिश्रण में पानी नहीं मिलाया जाता है, बल्कि इसके बजाय, गेलिफिकेशन मिश्रण जोड़ा जाता है (तालिका 2)।

  1. अभिकर्मकों को एक प्रशीतित कंटेनर में पिघलाएं। तालिका 2 के अनुसार अभिकर्मकों को 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं। डीएनए नमूने के 5 μL युक्त 25 μL की अंतिम मात्रा के साथ प्रतिक्रिया का एक उदाहरण यहां दिखाया गया है।
    नोट: इस चरण में मिश्रण में डीएनए नमूना नहीं जोड़ा जाता है; इसका उपयोग यहां केवल क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के प्रत्येक अभिकर्मक के अंतिम संस्करणों की गणना करने के लिए किया जाता है। रन शुरू करने से ठीक पहले डीएनए नमूने जोड़े जाने चाहिए (नीचे चरण 4 देखें)।

3. प्रतिक्रिया वाहिकाओं पर अभिकर्मकों का गेलिफिकेशन

  1. आठ-ट्यूब पट्टी या 96-वेल प्लेट की तैयारी के लिए तालिका 2 में दिखाए गए वॉल्यूम को उचित रूप से गुणा करें।
  2. प्रत्येक प्रतिक्रिया पर तालिका 2 में दिखाए गए गेलिफिकेशन मास्टर मिश्रण का 18.5 μL।
    नोट: यह मात्रा एक प्रतिक्रिया ( तालिका 2 के अनुसार) के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड मिश्रण, पीसीआर बफर और गेलिफिकेशन मिश्रण की मात्रा का प्रतिनिधित्व करती है और अभिकर्मकों की एकाग्रता और एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा के आधार पर भिन्न होगी। गेलिफिकेशन मास्टर मिश्रण में अंतिम मात्रा एक नियमित मास्टर मिश्रण में मात्रा से अलग है क्योंकि पानी नहीं जोड़ा जाता है।
  3. प्लेट को वैक्यूम ओवन के अंदर गर्मी-प्रवाहकीय समर्थन (जैसे, एल्यूमीनियम) में रखें।
    नोट: गर्मी-प्रवाहकीय समर्थन वैकल्पिक है। ऑपरेटर को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ट्यूबों का निचला हिस्सा तेजी से थर्मल संतुलन की अनुमति देने के लिए वैक्यूम ओवन शेल्फ के संपर्क में है।
  4. प्रत्येक दो 96-वेल प्लेटों के लिए एक बेंटोनाइट क्ले बैग रखें।
    नोट: बेंटोनाइट क्ले बैग का उपयोग वैक्यूम द्वारा लगाए गए अंतर दबाव द्वारा गेलिफिकेशन मास्टर मिश्रण से हटाए गए पानी को अवशोषित करने के लिए किया जाता है। बेंटोनाइट मिट्टी के बैग दो से कम 96-वेल प्लेटों के लिए अनावश्यक पाए गए।
  5. गेलिफिकेशन मास्टर मिश्रण वाली ट्यूबों/प्लेट को 30 मिनट के तीन वैक्यूम चक्रों (30 ± 5 मीटरबार) के अधीन करें, नियंत्रित तापमान (30 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस) के तहत वायुमंडलीय दबाव (900-930 मीटरबार) प्राप्त होने तक वैक्यूम रिलीज के साथ बारी-बारी से।
    नोट: उपकरण मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है, और चक्र का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। उपयोगकर्ता को चुने गए मापदंडों को इंगित करते हुए, रन के लिए प्रोफ़ाइल बनाना होगा।
  6. जब चक्र पूरा हो जाता है, तो अभिकर्मकों के उचित गेलिफिकेशन के लिए ट्यूबों / प्लेटों की जांच करें, यह सुनिश्चित करके कि मात्रा स्पष्ट रूप से कम हो गई है (चित्रा 3) और यह कि तरल पदार्थ उंगलियों से ट्यूबों / प्लेटों को टैप करने पर आगे नहीं बढ़ते हैं।
    नोट: यदि गेलिफिकेशन नहीं हुआ, तो ट्यूबों को टैप किए जाने पर समाधान ट्यूब की दीवारों पर बिखर जाएगा (चित्रा 3)।
  7. उपयोग करने से पहले ट्यूबों / प्लेटों को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 8-12 घंटे के लिए सील और स्टोर करें।

4. एक गेलिफाइड क्यूपीसीआर का उपयोग करना

  1. रेफ्रिजरेटर से ट्यूब स्ट्रिप या प्लेट निकालें और नमूना हेरफेर के लिए इसे वर्कस्टेशन में खोलें। प्रत्येक प्रतिक्रिया पोत में 15 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें।
    नोट: जेलिफाइड अभिकर्मकों की मात्रा लगभग 5 μL मानी जाती है। इसलिए, डीएनए नमूना मात्रा (नीचे देखें) के साथ, अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 25 μL है।
  2. डीएनए नमूने के 5 μL जोड़ें।
    नोट: किसी भी QPCR-गुणवत्ता डीएनए टेम्पलेट का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान कार्य में, डीएनए को 108टी क्रूज़ी एपिमेस्टिगोट्स (स्ट्रेन डीएम 28 सी) से निकाला गया था और टीई बफर का उपयोग करके 1: 10 अनुपात में क्रमिक रूप से पतला किया गया था।
  3. प्लेटों को सील करें और पसंद के उपकरणों के लिए आगे बढ़ें। प्रयोग चलाएं और नियमित डेटा विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

गेलिफिकेशन मिश्रण बनाने वाले अभिकर्मकों में से तीन जोरदार भंवर पर आसानी से घुलनशील हो जाते हैं। हालांकि, ग्लाइकोजन को यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक भंवर की आवश्यकता होती है कि पाउडर पूरी तरह से घुलनशील हो गया है। दुर्भाग्य से, जोरदार भंवर बहुत सारे बुलबुले पैदा करता है, जिससे समाधान की वास्तविक मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है (चित्रा 1 ए-बी)। इसलिए, ग्लाइकोजन समाधान को रेफ्रिजरेटर में आराम करने देना आवश्यक है जब तक कि बुलबुले के भीतर फंसे अधिकांश समाधान मुख्य समाधान शरीर में स्थानांतरित नहीं हो जाते। उत्पादन प्रोटोकॉल और प्रयोगशाला दिनचर्या को ध्यान में रखते हुए, जेलिफाइड प्लेटों को रात भर (या लगभग 8-12 घंटे) रेफ्रिजरेटर में रखा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश बुलबुले का निपटान होता है, इस प्रकार सही मात्रा निर्धारित करना और वांछित अंतिम मात्रा में समायोजित करना आसान हो जाता है (चित्रा 1 सी)। क्रमशः आंकड़े 1 बी-सी में ग्लाइकोजन ट्यूबों के बीच बुलबुले की मात्रा में अंतर पर ध्यान दें, घुलनशीलता के ठीक बाद और रात भर बसने के बाद।

एक बार जब गेलिफिकेशन मिश्रण को पानी के प्रतिस्थापन में क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है (तालिका 2), ट्यूब स्ट्रिप्स या प्लेटें वैक्यूम ओवन में जाने के लिए तैयार होती हैं। वैक्यूम ओवन की अलमारियों में एक पेल्टियर हीटिंग तत्व होता है, यह सुनिश्चित करता है कि इसके संपर्क में आने वाली कोई भी ट्यूब एक ही तापमान पर रहती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, कक्ष के अंदर का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा जाता है, जबकि दबाव 910-930 मीटरबार (वायुमंडलीय दबाव) और 30 मीटरबार (निकट-वैक्यूम) के बीच भिन्न होता है। चित्रा 2 समय के साथ प्लॉट किए गए इन दो चरों को दिखाता है, जो निरंतर तापमान (हरी रेखा, ऊपरी पैनल) और दबाव की भिन्नता (लाल रेखा, निचला पैनल) दिखाता है। चक्र समाप्त होने के बाद, कुएं के अंदर मास्टर मिश्रण मात्रा में कम हो जाता है और नीचे की ओर जेलीकृत हो जाता है, यानी, जब ट्यूबों को उंगलियों से टैप किया जाता है तो बिना हिले या छींटे पड़ते हैं (चित्रा 3)। ट्यूबों को अब 2-8 डिग्री सेल्सियस पर कैप और संग्रहीत किया जा सकता है। यदि गेलिफिकेशन मिश्रण (तालिका 1) गलत तरीके से तैयार किया जाता है तो प्रतिक्रियाएं जेलिफाई करने में विफल रहेंगी; प्रस्तावित गुणवत्ता नियंत्रण चरण को क्यूपीसीआर अभिकर्मकों के साथ गेलिफिकेशन मिश्रण को मिलाने से पहले दोष देखना चाहिए।

प्लेटों के अंदर जेलिफाइड अभिकर्मकों को न्यूक्लियस मुक्त पानी में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए और डीएनए नमूना आमतौर पर पानी या टीई बफर में पतला किया जाना चाहिए। सोल-जेल मिश्रण के अभिकर्मकों का पुन: निलंबन क्यूपीसीआर थर्मल प्रोटोकॉल (आमतौर पर, 95 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट) के विकृतीकरण के पहले चरण के दौरान प्राप्त किया जाता है, इसलिए कोई अतिरिक्त कदम की आवश्यकता नहीं होती है। चित्रा 4 ए प्रकाशित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम15 का उपयोग करके टी क्रूज़ी डीएनए के क्यूपीसीआर का पता लगाने के प्रतिनिधि निशान दिखाता है। उप-मानक परिणामों में संवेदनशीलता का नुकसान शामिल है, जिसे जीनोमिक लक्ष्यों की ज्ञात एकाग्रता और विशिष्टता के नुकसान के साथ समाधान के कमजोर पड़ने के वक्र के साथ परीक्षण किया जा सकता है, जिसे संबंधित ट्रिपैनोसोमेटेड जीवों के एक पैनल के साथ परीक्षण किया जा सकता है। चित्रा 4 बी संवेदनशीलता के नुकसान को दर्शाता है जो तब उत्पन्न हो सकता है जब गेलिफिकेशन प्रक्रिया सही ढंग से निष्पादित नहीं होती है या जब प्रतिक्रिया 6 महीने से अधिक समय तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने के बाद अपनी स्थिरता खो देती है।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लाइकोजन का घुलनशीलीकरण बहुत सारे बुलबुले पैदा करता है। क्योंकि ग्लाइकोजन घुलनशीलता के दौरान बहुत सारे बुलबुले पैदा करता है, अंतिम मात्रा में समायोजित करने से पहले ग्लाइकोजन समाधान को आराम से रखा जाना चाहिए। (ए) भंवर के दौरान बुलबुले बनते हैं। (बी) सभी पाउडर घुलनशील थे, लेकिन अतिरिक्त बुलबुले के कारण अंतिम मात्रा निर्धारित करना संभव नहीं है। (C) रेफ्रिजरेटर (बीच में ट्यूब) में 12 घंटे के बाद, बुलबुले की मात्रा कम हो जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वैक्यूम साइकिलिंग (निचला पैनल) और तापमान नियंत्रण (ऊपरी पैनल)। तापमान (ऊपरी पैनल) और दबाव (निचला पैनल) भिन्नता के प्रतिनिधि निशान दिखाए गए हैं। काली रेखाएं प्रोग्राम की गई विविधताओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, जबकि हरी और लाल रेखाएं उपकरण की वास्तविक रीडिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: आठ-ट्यूब पट्टी के अंदर जेलिफाइड मास्टर मिश्रण के पहलू। (A) QPCR मास्टर वैक्यूम एक्सपोजर से पहले मिश्रण करता है। (बी) अपूर्ण जेलिफिकेशन (केवल एक वैक्यूम चक्र) के कारण ट्यूब की दीवारों पर तरल छींटे पड़ते हैं। (सी) मात्रा में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली कमी के साथ गेलिफाइड क्यूपीसीआर अभिकर्मक। ट्यूबों को टैप करने पर तरल दीवारों पर नहीं बिखरता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: टी क्रूज़ी एपिमेस्टिगोट्स से डीएनए का पता लगाने वाले जेलिफाइड मास्टर मिक्स के प्रतिनिधि निशान। टी क्रूज़ी एपिमेस्टिगोट्स (108 कोशिकाओं) से निकाले गए डीएनए को 1: 10 अनुपात में क्रमिक रूप से पतला किया गया था, और 104 और 100 कोशिकाओं के बीच डीएनए सांद्रता को एक गेलिफाइड क्यूपीसीआर का उपयोग करके पता लगाने के अधीन किया गया था। (ए) सही ढंग से गेलिफाइड क्यूपीसीआर (बी) एक प्लेट का उपयोग करके उन्हीं नमूनों का पता लगाने का अपेक्षित परिणाम जहां गेलिफिकेशन ठीक से निष्पादित नहीं किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप संवेदनशीलता का नुकसान हुआ। ध्यान दें कि पैनल बी में कम सांद्रता का कम बार पता लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घोल स्टॉक एकाग्रता आयतन
Melezitose 400 mg/mL 3 mL
Treahlose 400 mg/mL 6 mL
लाइसिन 0.75 मिलीग्राम / 3 mL
ग्लाइकोजन 200 मिलीग्राम / 3 mL
न्यूक्लियस मुक्त पानी ना q.s.p. 20 mL

तालिका 1: 20 एमएल जेलिफिकेशन मिश्रण का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों की स्टॉक सांद्रता और मात्रा। प्रत्येक स्टॉक समाधान की मात्रा को आनुपातिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए ताकि जेलिफिकेशन मिश्रण के कम या उच्च अंतिम वॉल्यूम का उत्पादन किया जा सके।

अभिक्रिया मिश्रण अभिकर्मक नियमित मास्टरमिक्स गेलिफिकेशन मास्टरमिक्स
ऑलिगोमिक्स (25X) 1 μL 1 μL
पीसीआर बफर (2X) 12.5 μL 12.5 μL
गेलिफिकेशन मिश्रण * - 5 μL
न्यूक्लियस मुक्त पानी 6.5 μL -
डीएनए नमूना * 5 μL 5 μL
* अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का अधिकतम 20%

तालिका 2: नियमित या जेलिफाइड प्रतिक्रियाओं के लिए क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स का उत्पादन करने के लिए अभिकर्मकों की मात्रा। दो मास्टर मिश्रणों के बीच का अंतर यह है कि पानी को नियमित मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है जबकि जेलिफिकेशन मिश्रण को जेलिफिकेशन मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है (यानी, पानी के बजाय)।

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Discussion

हाल के वर्षों ने उष्णकटिबंधीय और उपेक्षित रोगों के निदान में मदद करने के लिए अधिक संवेदनशील और विशिष्ट प्रौद्योगिकियों को खोजने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला है। हालांकि महामारी विज्ञान नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है, परजीवी (ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी) और सीरोलॉजिकल परीक्षणों की सीमाएं हैं, विशेष रूप से संवेदनशीलता और पॉइंट-ऑफ-केयर प्रयोज्यता के बारे में। पीसीआर, इज़ोटेर्मल प्रवर्धन और संबंधित विविधताओं जैसी डीएनए प्रवर्धन तकनीकों का उपयोग लंबे समय से प्रयोगशाला सेटिंग्स में किया गया है, लेकिन तकनीकी बाधाएं इसे क्षेत्र सेटिंग्स में उपयोग करने से रोकती हैं। मुख्य बाधाओं में से एक अभिकर्मकों के परिवहन और भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के तापमान की आवश्यकता है। इस स्थिति को हल करने के लिए, फ्रीजर16,18,19 से पीसीआर प्रतिक्रियाओं को स्टोर करने के लिए लियोफिलाइजेशन और गेलिफिकेशन जैसी तकनीकों का उपयोग किया गया है।

वर्तमान कार्य प्रतिक्रिया पोत के अंदर टी क्रूज़ी डीएनए का पता लगाने के लिए एक क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया को जेल करने के लिए आवश्यक सभी चरणों को दिखाता है, चाहे वह ट्यूब, ट्यूब स्ट्रिप्स, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स या प्लेटें हों। आरटी-एलएएमपी प्रतिक्रिया का उपयोग करने वाले प्रारंभिक अध्ययनों से पता चलता है कि गेलिफिकेशन तकनीक का उपयोग अन्य न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन और संशोधन एंजाइमों को संरक्षित और ढालने के लिए भी किया जा सकता है, जैसा कि रोसाडो एट अल द्वारा वर्णित है। 19. हालांकि अपेक्षाकृत सरल, दो चरण जो क्यूपीसीआर दिनचर्या में अधिकांश ऑपरेटर गलतियों का कारण बनते हैं, वे हैं (ए) ग्लाइकोजन और मेलेज़िटोज समाधान की तैयारी और (बी) वैक्यूम चरण से पहले प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़े जाने वाले प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा की गणना। सबसे पहले, ग्लाइकोजन समाधान को अंतिम मात्रा समायोजन से पहले रात भर प्रशीतित किया जाना चाहिए, और मेलेज़िटोज समाधान को पूर्ण घुलनशीलता के लिए सख्ती से भंवर (संभवतः 50 डिग्री सेल्सियस पर हल्के हीटिंग के साथ) किया जाना चाहिए। दूसरा, प्रयोग की योजना बनाने वाले शोधकर्ता को पता होना चाहिए कि पूर्व-वैक्यूम की गणना की गई अभिकर्मकों की मात्रा असमान हो सकती है क्योंकि प्रतिक्रिया की मात्रा में पानी को गोल करने के लिए नहीं जोड़ा जाता है। पीसीआर चलाने से पहले, नमूना और पानी को जोड़कर जेलिफाइड प्रतिक्रिया को फिर से व्यवस्थित करने पर वास्तविक प्रतिक्रिया की मात्रा प्राप्त की जाएगी।

विधि की सबसे बड़ी सीमा प्रतिक्रियाओं की स्थिरता है, जो 2-8 डिग्री सेल्सियस14,15 पर लगभग 6-8 महीने है; यह लियोफिलाइज्ड प्रतिक्रियाओं की तुलना में काफी कम है, जो18 साल तक स्थिर रह सकता है। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की विशिष्टता के आधार पर, अस्पष्ट बंधन और प्रवर्धन हो सकता है, जिसे शोधकर्ताओं द्वारा सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, कोस्टा और सहयोगियों की रिपोर्ट है कि सी. केयेटेनेंसिस का पता लगाने के लिए गेलिफाइड क्यूपीसीआर के एनीलिंग तापमान को15,21 के विशिष्ट प्रवर्धन से बचने के लिए +1 डिग्री सेल्सियस में समायोजित किया जाना था। इसी तरह, शोधकर्ताओं को उन एंजाइमों का उपयोग करने से बचना चाहिए जिन्हें सब्सट्रेट के रूप में गेलिफिकेशन घटकों द्वारा विनियमित या उपयोग किया जा सकता है।

गेलिफिकेशन तकनीक विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि प्रयोगशाला की दिनचर्या में उपयोग में आसानी के साथ-साथ उत्पादन लाइन 16,19,22 में एक परिचय सुचारू गुणवत्ता नियंत्रण की अनुमति देता है; उत्तरार्द्ध बदले में कई ऑपरेटरों में मजबूत और तुलनीय डेटा सक्षम बनाता है और परिवहन और भंडारण के दौरान ठंड तापमान आवश्यकताओं को समाप्त करने के बोनस के साथ महत्वपूर्ण चरणों में आम ऑपरेटर गलतियों को प्रभावी ढंग से समाप्त करता है। प्रारंभिक अध्ययनों से पता चलता है कि कोल्ड चेन को खत्म करने से क्यूपीसीआर टेस्ट 14 के लिए लागत में 20% तक की समग्र कमीआएगी। शीत श्रृंखला के उन्मूलन से अविकसित क्षेत्रों में चगास रोग जैसी उपेक्षित बीमारियों के लिए एक पुष्टिकरण परीक्षण के रूप में क्यूपीसीआर को लागू करना भी संभव हो जाता है, इस प्रकार उनके महामारी विज्ञान नियंत्रण का पक्षलिया जाता है।

अंत में, गेलिफिकेशन प्रोटोकॉल क्यूपीसीआर परीक्षणों के उपयोग को सुव्यवस्थित करता है क्योंकि इसके लिए केवल उपयोगकर्ता को पानी और निकाले गए टी क्रूज़ी डीएनए को जोड़ने की आवश्यकता होती है, अभिकर्मक हैंडलिंग के दौरान त्रुटियों से बचना, और सेट-अप समय के साथ-साथ अभिकर्मक के संदूषण की संभावना को कम करना। ऐसी विशेषताएं एक नियमित नैदानिक प्रयोगशाला के लिए दक्षता प्रदान करती हैं, रोगियों को परिणामों के वितरण में तेजी लाती हैं और निदान की विश्वसनीयता बढ़ाती हैं। अंत में, क्योंकि यह -20 डिग्री सेल्सियस कोल्ड चेन की आवश्यकता को दूर करता है, यह कम संसाधन वातावरण में नैदानिक उपयोग के लिए उपयुक्त है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक वैक्यूम ओवन के साथ तकनीकी सहायता के लिए एलिन बर्दा फारियास के साथ-साथ उक्त उपकरण तक पहुंच की अनुमति देने के लिए इंस्टीट्यूटो डी बायोलोगिया मॉलिक्यूलर डो पराना (आईबीएमपी, क्यूरिटिबा, ब्राजील) के प्रशासन के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं। इस काम को आंशिक रूप से अनुदान सीएनपीक्यू 445954/2020-5 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bentonite clay bags (activated) Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) 026157/STD Not to be confused with silica gel packs
Glycogen Amersham Bioscience Cat# US16445
Lysine Acros Organic Cat# 365650250
Melezitoze Sigma-Aldrich Cat# 63620
Nuclease-free water preferred vendor
Oligonucleotides preferred vendor
PCR mastermix preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) Chagas NAT kit
PCR thermocycler preferred vendor
software for vacuum oven Memmert Gmbh Celsius v10.0
Trehalose Sigma-Aldrich Cat# T9531
Trypanosoma cruzi DNA from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC
Vacuum oven Memmert Gmbh VO-400

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References

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जैव रसायन अंक 179 उपयोग के लिए तैयार पीसीआर निदान ट्रिपैनोसोमा प्रयोगशाला दिनचर्या उपेक्षित रोग उष्णकटिबंधीय रोग
<em>ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी</em> या अन्य रोगजनक जीवों से डीएनए का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करने के लिए तैयार
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Costa, A. D. T., Amadei, S. S., Bertão-Santos, A., Rodrigues, T. Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms. J. Vis. Exp. (179), e63316, doi:10.3791/63316 (2022).

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