Summary
Il presente lavoro descrive le fasi per la produzione di qPCR pronta all'uso per il rilevamento del DNA di T. cruzi che può essere precaricata sul recipiente di reazione e conservata in frigorifero per diversi mesi.
Abstract
La PCR in tempo reale (qPCR) è una tecnica straordinariamente sensibile e precisa che consente di amplificare piccole quantità di bersagli di acidi nucleici da una moltitudine di campioni. È stato ampiamente utilizzato in molte aree di ricerca e ha raggiunto l'applicazione industriale in campi come la diagnostica umana e la selezione dei tratti nelle colture di colture di organismi geneticamente modificati (OGM). Tuttavia, la qPCR non è una tecnica a prova di errore. La miscelazione di tutti i reagenti in un'unica miscela master successivamente distribuita su 96 pozzetti di una normale piastra qPCR potrebbe portare a errori dell'operatore come una miscelazione errata dei reagenti o un'erogazione imprecisa nei pozzetti. Qui viene presentata una tecnica chiamata gelificazione, in base alla quale la maggior parte dell'acqua presente nella miscela master viene sostituita da reagenti che formano una miscela sol-gel quando viene sottoposta al vuoto. Di conseguenza, i reagenti qPCR vengono efficacemente conservati per alcune settimane a temperatura ambiente o alcuni mesi a 2-8 °C. I dettagli della preparazione di ciascuna soluzione sono mostrati qui insieme all'aspetto atteso di una reazione gelificata progettata per rilevare il DNA satellite di T. cruzi (satDNA). Una procedura simile può essere applicata per rilevare altri organismi. Avviare una qPCR gelificata è semplice come rimuovere la piastra dal frigorifero, aggiungere i campioni ai rispettivi pozzetti e iniziare la corsa, riducendo così il tempo di configurazione di una reazione a piastra intera al tempo necessario per caricare i campioni. Inoltre, le reazioni PCR gelificate possono essere prodotte e controllate per la qualità in lotti, risparmiando tempo ed evitando errori comuni dell'operatore durante l'esecuzione di reazioni PCR di routine.
Introduction
La malattia di Chagas è stata scoperta all'inizio del 20° secolo nelle regioni rurali del Brasile, dove la povertà era diffusa 1,2. Ancora oggi, la malattia continua ad essere collegata ai determinanti sociali ed economici della salute nelle Americhe. La malattia di Chagas è bifasica, comprendente una fase acuta e una cronica. È causata dall'infezione da parte del parassita Trypanosoma cruzi, trasmessa da insetti vettori, trasfusioni di sangue per via congenita o ingestione orale di alimenti contaminati 3,4.
La diagnosi della malattia di Chagas può essere effettuata attraverso l'osservazione dei sintomi clinici (in particolare il segno di Romaña), la microscopia dello striscio di sangue, la sierologia e i test molecolari come la PCR in tempo reale (qPCR) o l'amplificazione isotermica 4,5,6,7,8,9. I sintomi clinici e la microscopia a striscio di sangue sono utilizzati nei casi sospetti di infezioni acute, mentre la ricerca di anticorpi viene utilizzata come strumento di screening nei pazienti asintomatici. A causa della sua sensibilità e specificità, la qPCR è stata suggerita per essere utilizzata come strumento di monitoraggio per i pazienti cronici, per i pazienti acuti sottoposti a trattamento che misura il carico parassitario nel sangue e come marker surrogato di fallimento terapeutico 6,8,10,11,12 . Sebbene più sensibile e specifico dei test attualmente disponibili, la qPCR è effettivamente impedita di essere conosciuta come strumento diagnostico nelle regioni svantaggiate di tutto il mondo a causa della necessità di temperature di congelamento per il trasporto e lo stoccaggio13,14,15.
Per aggirare questo ostacolo, sono state esplorate tecniche di conservazione come la liofilizzazione e la gelificazione16,17. Mentre la liofilizzazione fornisce la conservazione per anni, richiede reagenti appositamente realizzati senza la presenza di glicerolo, che è comunemente usato per la stabilizzazione / conservazione degli enzimi18. Mentre la gelificazione ha dimostrato di fornire conservazione per mesi, consente l'uso di reagenti regolari19. La soluzione di gelificazione comprende quattro componenti, ciascuno con ruoli specifici nel processo: gli zuccheri trealosio e melezitosio proteggono le biomolecole durante il processo di essiccazione riducendo le molecole di acqua libera nella soluzione, il glicogeno produce una matrice protettiva più ampia e l'amminoacido lisina viene utilizzato come scavenger dei radicali liberi per inibire le reazioni ossidanti tra il carbossile della biomolecola, gruppi amminico e fosfato. Questi componenti definiscono una miscela sol-gel che impedisce la perdita della struttura terziaria o quaternaria durante il processo di essiccazione, contribuendo così a mantenere l'attività delle biomolecole dopo la reidratazione19. Una volta stabilizzate all'interno delle provette di reazione, le reazioni possono essere conservate per alcuni mesi a 2-8 °C o alcune settimane a 21-23 °C invece dei normali -20 °C. Questo approccio è già stato incorporato in test progettati per aiutare a diagnosticare malattie come la malattia di Chagas, la malaria, la leishmaniosi, la tubercolosi e la ciclosporiasi13,14,15,20.
Il presente lavoro descrive tutte le fasi per preparare le soluzioni richieste per la procedura di gelificazione, le insidie del processo e l'aspetto finale previsto di una qPCR gelificata pronta all'uso all'interno di strisce a otto tubi. Lo stesso protocollo può essere adattato per tubi singoli o piastre a 96 pozzetti. Infine, la rilevazione del DNA di T. cruzi sarà mostrata come una corsa di controllo.
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Protocol
1. Preparazione di soluzioni madre e miscela di gelificazione
NOTA: Saranno preparate quattro soluzioni madre (400 mg/ml di melezitosio, 400 mg/ml di trealosio, 0,75 mg/ml di lisina e 200 mg/ml di glicogeno) e miscelate secondo la proporzione indicata nella tabella 1 per ottenere la miscela di gelificazione. Sebbene il protocollo descriva 10 ml di produzione di soluzioni stock, può essere adattato per volumi inferiori o superiori.
- Soluzione di melezitosio
- Pesare 4 g di melezitosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità dello strumento fino a solubilizzare la polvere.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume finale a 10 mL con acqua priva di nucleasi. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 4 g di melezitosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità dello strumento fino a solubilizzare la polvere.
- Soluzione di trealosio
- Pesare 4 g di trealosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a solubilizzazione della polvere.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume a 10 mL con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 4 g di trealosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a solubilizzazione della polvere.
- Soluzione di glicogeno
- Pesare 2 g di glicogeno in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Mantenere la soluzione a riposo a 2-8 °C per 8-12 ore perché la solubilizzazione del glicogeno produce molte bolle (Figura 1). Portare il volume a 10 ml con acqua priva di nucleasi. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 2 g di glicogeno in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
- Soluzione di lisina
- Pesare 7,5 mg di lisina in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua senza nucleasi. Vortice alla massima velocità dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume a 10 mL con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm. Trasferire la soluzione in un matraccio ambrato o proteggerlo dalla luce. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 7,5 mg di lisina in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua senza nucleasi. Vortice alla massima velocità dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
- Miscela di gelificazione (GM)
- In un tubo di plastica da 50 ml, mescolare i volumi delle soluzioni madre secondo la Tabella 1.
- Mescolare i reagenti mediante dieci inversioni end-to-end del tubo.
NOTA: non è necessaria una fase di filtrazione se questa fase viene eseguita in una cappa di sicurezza a flusso laminare. Se questo passaggio non viene eseguito in un ambiente pulito, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm prima di trasferirla in un matraccio ambrato. - Trasferire la soluzione in un matraccio ambrato o proteggerlo dalla luce. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 3 mesi.
NOTA: come fase di controllo qualità per la preparazione della miscela di gelificazione, assicurarsi che i valori misurati di pH, conducibilità e densità rientrino nei seguenti intervalli: pH 5,55-6,66; conducibilità 0,630-0,757 mS/cm; e densità 1,08-1,11 g/cm3. Tutte le misurazioni devono essere effettuate a 25 °C.
2. Preparazione della miscela master qPCR per la gelificazione
NOTA: In questa fase, viene preparata la miscela master qPCR per la gelificazione. Quindi, l'acqua non viene aggiunta alla miscela, ma viene aggiunta la miscela di gelificazione (Tabella 2).
- Scongelare i reagenti in un contenitore refrigerato. Mescolare i reagenti in una provetta da 1,5 mL secondo la Tabella 2. Un esempio di reazione con un volume finale di 25 μL contenente 5 μL di campione di DNA è mostrato qui.
NOTA: il campione di DNA non viene aggiunto alla miscela in questa fase; qui viene utilizzato esclusivamente per calcolare i volumi finali di ciascun reagente della miscela master qPCR. I campioni di DNA devono essere aggiunti subito prima di iniziare la corsa (vedere il passaggio 4 di seguito).
3. Gelificazione dei reagenti sui recipienti di reazione
- Moltiplicare opportunamente i volumi indicati nella tabella 2 per la preparazione di una striscia di otto tubi o di una piastra da 96 pozzetti.
- Pipet 18,5 μL della miscela master di gelificazione mostrata nella Tabella 2 su ciascun pozzetto di reazione.
NOTA: Questo volume rappresenta i volumi di miscela oligonucleotidica, tampone PCR e miscela di gelificazione utilizzati per una reazione (secondo la Tabella 2) e varierà a seconda della concentrazione dei reagenti e del volume necessario per una reazione. Il volume finale nella miscela master di gelificazione è diverso dal volume in una miscela master normale perché non viene aggiunta acqua. - Posizionare i tubi/piastre nel supporto termoconduttivo (ad esempio, alluminio) all'interno del forno sottovuoto.
NOTA: Il supporto termoconduttivo è opzionale. L'operatore deve assicurarsi che il fondo dei tubi sia a contatto con il ripiano del forno a vuoto per consentire un rapido equilibrio termico. - Posizionare un sacchetto di argilla bentonitica ogni due piastre da 96 pozzetti.
NOTA: I sacchetti di argilla bentonitica vengono utilizzati per assorbire l'acqua rimossa dalla miscela master di gelificazione dalla pressione differenziale esercitata dal vuoto. I sacchi di argilla di bentonite sono risultati non necessari per meno di due piastre da 96 pozzetti. - Sottoporre i tubi/piastra contenenti la miscela master di gelificazione a tre cicli di vuoto (30 ± 5 mBar) di 30 min ciascuno, alternati al rilascio del vuoto fino al raggiungimento della pressione atmosferica (900-930 mBar), a temperatura controllata (30 °C ± 1 °C) (Figura 2).
NOTA: Lo strumento utilizza un software per controllare i parametri e un esempio del ciclo è mostrato nella Figura 2. L'utente deve creare il profilo per l'esecuzione, indicando i parametri scelti. - Al termine del ciclo, controllare i provette/piastre per una corretta gelificazione dei reagenti assicurandosi che il volume sia visibilmente ridotto (Figura 3) e che i liquidi non si muovano picchiettando i tubi/piastre con le dita.
NOTA: se la gelificazione non si verifica, la soluzione schizza sulle pareti del tubo quando i tubi vengono toccati (Figura 3). - Sigillare e conservare i tubi/piastre a 2-8 °C per 8-12 ore prima dell'uso.
4. Utilizzo di una qPCR gelificata
- Rimuovere la striscia tubiera o la piastra dal frigorifero e aprirla in una workstation per la manipolazione del campione. Aggiungere 15 μL di acqua esente da nucleasi a ciascun recipiente di reazione.
NOTA: Il volume dei reagenti gelificati è considerato di circa 5 μL. Quindi, insieme al volume del campione di DNA (vedi sotto), il volume finale di reazione è di 25 μL. - Aggiungere 5 μL di campione di DNA.
NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi modello di DNA di qualità qPCR. Nel presente lavoro, il DNA è stato estratto da 108epimastigoti di T. cruzi (ceppo Dm28c) ed è stato diluito in serie con un rapporto 1:10 utilizzando tampone TE. - Sigillare i tubi/piastre e procedere all'apparecchiatura scelta. Esegui l'esperimento e procedi all'analisi regolare dei dati.
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Representative Results
Tre dei reagenti che formano la miscela di gelificazione sono facilmente solubilizzati dopo un vigoroso vortice. Tuttavia, il glicogeno richiede un attento vortice per garantire che la polvere sia stata completamente solubilizzata. Sfortunatamente, il vortice vigoroso produce molte bolle, il che rende difficile determinare il volume effettivo della soluzione (Figura 1A-B). Pertanto, è essenziale lasciare riposare la soluzione di glicogeno nel frigorifero fino a quando la maggior parte della soluzione intrappolata all'interno delle bolle non si è spostata verso il corpo principale della soluzione. Considerando i protocolli di produzione e la routine di laboratorio, le piastre gelificate vengono conservate in frigorifero durante la notte (o intorno alle 8-12 ore), con conseguente decantazione della maggior parte delle bolle, rendendo così più facile determinare il volume corretto e adattarsi al volume finale desiderato (Figura 1C). Si noti la differenza nel volume delle bolle tra i tubi di glicogeno nelle figure 1B-C, rispettivamente, subito dopo la solubilizzazione e dopo la decantazione durante la notte.
Una volta aggiunta la miscela di gelificazione alla miscela master qPCR in sostituzione dell'acqua (Tabella 2), le strisce o le piastre tubiere sono pronte per andare al forno sottovuoto. I ripiani del forno sottovuoto contengono un elemento riscaldante Peltier, assicurando che tutti i tubi che sono a contatto con esso rimangano alla stessa temperatura. Nel presente protocollo, la temperatura all'interno della camera è mantenuta costante a 30 °C, mentre la pressione varia tra 910-930 mBar (pressione atmosferica) e 30 mBar (quasi vuoto). La figura 2 mostra queste due variabili tracciate nel tempo, mostrando la temperatura costante (linea verde, pannello superiore) e la variazione di pressione (linea rossa, pannello inferiore). Al termine dei cicli, la miscela principale all'interno del pozzetto diminuisce di volume e diventa gelificata sul fondo, cioè senza muoversi o schizzare quando i tubi vengono picchiettati con le dita (Figura 3). I tubi possono ora essere tappati e conservati a 2-8 °C. Le reazioni non riusciranno a gelificarsi se la miscela di gelificazione (Tabella 1) è preparata in modo errato; la fase di controllo qualità proposta dovrebbe vedere il difetto prima di miscelare la miscela di gelificazione con i reagenti qPCR.
Per essere utilizzati, i reagenti gelificati all'interno delle provette/piastre devono essere risospesi in acqua priva di nucleasi e il campione di DNA diluito di solito in acqua o tampone TE. La risospensione dei reagenti della miscela sol-gel si ottiene durante la prima fase di denaturazione del protocollo termico qPCR (di solito, 5-10 minuti a 95 °C), quindi non è necessario alcun passaggio aggiuntivo. La figura 4A mostra tracce rappresentative della rilevazione qPCR del DNA di T. cruzi utilizzando sequenze oligonucleotidiche pubblicate15. I risultati subottimali includono la perdita di sensibilità, che può essere testata con una curva di diluizione di una soluzione con una concentrazione nota di bersagli genomici e la perdita di specificità, che può essere testata con un pannello di organismi tripanosomatidi correlati. La figura 4B mostra la perdita di sensibilità che potrebbe verificarsi quando il processo di gelificazione non viene eseguito correttamente o quando la reazione perde la sua stabilità dopo essere stata conservata a 2-8 °C per più di 6 mesi.
Figura 1: La solubilizzazione del glicogeno produce molte bolle. Poiché il glicogeno produce troppe bolle durante la solubilizzazione, la soluzione di glicogeno deve essere mantenuta a riposo prima di adattarsi al volume finale. (A) Bolle formate durante il vortice. (B) Tutta la polvere è stata solubilizzata, ma non è possibile determinare il volume finale a causa delle bolle in eccesso. (C) Dopo 12 ore in frigorifero (tubo nel mezzo), il volume delle bolle è ridotto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ciclo del vuoto (pannello inferiore) e controllo della temperatura (pannello superiore). Vengono mostrate tracce rappresentative della variazione di temperatura (pannello superiore) e pressione (pannello inferiore). Le linee nere rappresentano le variazioni programmate, mentre le linee verdi e rosse rappresentano le letture effettive dello strumento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Aspetti della miscela master gelificata all'interno di una striscia di otto tubi . (A) Le miscele master qPCR prima dell'esposizione sotto vuoto. (B) Schizzi di liquido sulle pareti del tubo a causa di gelificazione incompleta (solo un ciclo di vuoto). (C) Reagenti qPCR gelificati con una chiara riduzione visibile del volume. Il liquido non schizza sulle pareti quando i tubi vengono toccati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Tracce rappresentative di master mix gelificati che rilevano DNA da epimastigoti di T. cruzi. Il DNA estratto dagli epimastigoti di T. cruzi (108 cellule) è stato diluito in serie in un rapporto 1:10 e le concentrazioni di DNA comprese tra 104 e 100 cellule sono state sottoposte a rilevamento utilizzando una qPCR gelificata. (A) Il risultato atteso della qPCR correttamente gelificata (B) Rilevazione degli stessi campioni utilizzando una piastra in cui la gelificazione non è stata eseguita correttamente, con conseguente perdita di sensibilità. Si noti che le concentrazioni più basse sono rilevate meno frequentemente nel pannello B. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzione | Concentrazione delle scorte | Volume |
| Melezitosio | 400 mg/ml | 3 ml |
| Tallosio | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lisina | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glicogeno | 200 mg/ml | 3 ml |
| Acqua esente da nucleasi | NA | q.s.p. 20 mL |
Tabella 1: Concentrazioni di materiale madre e volumi di soluzioni utilizzate per produrre 20 ml della miscela di gelificazione. Il volume di ciascuna soluzione madre deve essere regolato proporzionalmente per produrre volumi finali inferiori o superiori della miscela di gelificazione.
| Reagente del mix di reazione | Mastermix regolare | Mastermix di gelificazione |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| Tampone PCR (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Miscela di gelificazione* | - | 5 μL |
| Acqua esente da nucleasi | 6,5 μL | - |
| Campione di DNA* | 5 μL | 5 μL |
| *massimo del 20% del volume finale di reazione | ||
Tabella 2: Volumi di reagenti per produrre miscele master qPCR per reazioni regolari o gelificate. La differenza tra i due master mix è che l'acqua viene aggiunta al master mix normale mentre la miscela di gelificazione viene aggiunta (cioè al posto dell'acqua) alla miscela master di gelificazione.
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Discussion
Gli ultimi anni hanno evidenziato la necessità di trovare tecnologie più sensibili e specifiche per aiutare a diagnosticare le malattie tropicali e trascurate. Sebbene importanti per il controllo epidemiologico, i test parassitologici (microscopia ottica) e sierologici hanno dei limiti, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità e l'applicabilità al punto di cura. Le tecniche di amplificazione del DNA come la PCR, l'amplificazione isotermica e le rispettive variazioni sono state a lungo utilizzate in ambienti di laboratorio, ma ostacoli tecnologici ne impediscono l'utilizzo in ambienti di campo. Uno dei principali ostacoli è la necessità di temperature di -20 °C per il trasporto e lo stoccaggio dei reagenti. Per rimediare a questa situazione, tecniche come la liofilizzazione e la gelificazione sono state utilizzate per conservare le reazioni PCR fuori dal congelatore16,18,19.
Il presente lavoro mostra tutti i passaggi necessari per gelificare una reazione qPCR per rilevare il DNA di T. cruzi all'interno del recipiente di reazione, sia esso tubi, strisce tubiere, chip microfluidici o piastre. Studi preliminari che utilizzano una reazione RT-LAMP suggeriscono che la tecnica di gelificazione può anche essere utilizzata per preservare e schermare altri enzimi di amplificazione e modifica degli acidi nucleici, come descritto da Rosado et al. 19. Sebbene relativamente semplici, le due fasi che causano la maggior parte degli errori dell'operatore nelle routine qPCR sono (a) la preparazione delle soluzioni di glicogeno e melezitosio e (b) il calcolo del volume della miscela di reazione da aggiungere a ciascuna provetta di reazione prima della fase del vuoto. In primo luogo, la soluzione di glicogeno deve essere refrigerata durante la notte prima della regolazione finale del volume e la soluzione di melezitosio deve essere vigorosamente vortexata (possibilmente con lieve riscaldamento a 50 °C) per la completa solubilizzazione. In secondo luogo, il ricercatore che pianifica l'esperimento deve essere consapevole che i volumi dei reagenti calcolati prima del vuoto potrebbero essere irregolari poiché l'acqua non viene aggiunta per arrotondare al volume di reazione. Il volume effettivo della reazione sarà ottenuto quando la reazione gelificata viene risolubilizzata mediante l'aggiunta di campione e acqua, prima di eseguire la PCR.
Il più grande limite del metodo è la stabilità delle reazioni, che è di circa 6-8 mesi a 2-8 °C14,15; È considerevolmente più breve delle reazioni liofilizzate, che possono rimanere stabili per anni18. A seconda della specificità delle sequenze oligonucleotidiche, potrebbero verificarsi legami e amplificazione non specifici, che dovrebbero essere attentamente esaminati dai ricercatori. Ad esempio, Costa e collaboratori riferiscono che la temperatura di ricottura della qPCR gelificata per la rilevazione di C. cayetanensis doveva essere regolata in +1 °C per evitare amplificazioni non specifiche15,21. Allo stesso modo, i ricercatori dovrebbero evitare di utilizzare enzimi che potrebbero essere regolati o utilizzare i componenti della gelificazione come substrati.
La tecnica di gelificazione è particolarmente utile per la sua facilità d'uso nella routine di laboratorio e per l'introduzione in una linea di produzione16,19,22 che consente un controllo qualità regolare; Quest'ultimo a sua volta consente dati solidi e comparabili tra più operatori ed elimina efficacemente gli errori comuni dell'operatore nelle fasi cruciali, con il vantaggio di eliminare i requisiti di temperatura di congelamento durante il trasporto e lo stoccaggio. Studi preliminari suggeriscono che l'eliminazione della catena del freddo comporterebbe una riduzione complessiva dei costi fino al 20% per un test qPCR14. L'eliminazione della catena del freddo rende anche possibile l'implementazione della qPCR come test di conferma per malattie trascurate come la malattia di Chagas nelle regioni sottosviluppate, favorendo così il loro controllo epidemiologico23.
Infine, il protocollo di gelificazione semplifica l'uso dei test qPCR in quanto richiede solo l'aggiunta di acqua e del DNA di T. cruzi estratto, evitando errori durante la manipolazione del reagente e diminuendo il tempo di set-up e la possibilità di contaminazione del reagente. Tali caratteristiche forniscono efficienza per un laboratorio diagnostico di routine, accelerando la consegna dei risultati ai pazienti e aumentando l'affidabilità della diagnosi. Infine, poiché dispensa la necessità di una catena del freddo di -20 °C, è adatto per l'uso diagnostico in ambienti con risorse limitate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine ad Aline Burda Farias per l'assistenza tecnica con il forno a vuoto, nonché all'amministrazione dell'Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasile) per aver permesso l'accesso a tali apparecchiature. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla sovvenzione CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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