Summary
Den foreliggende protokol beskriver en metode til at visualisere og måle actinringe og andre komponenter i membranens periodiske skelet af axon-initialsegmentet ved hjælp af dyrkede rotte hippocampale neuroner og 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM).
Abstract
Axon initialsegmentet (AIS) er det sted, hvor aktionspotentialer initierer og udgør et transportfilter og diffusionsbarriere, der bidrager til opretholdelsen af neuronal polaritet ved at sortere somato-dendritisk last. Et membran periodisk skelet (MPS) bestående af periodiske actinringe giver et stillads til forankring af forskellige AIS-proteiner, herunder strukturelle proteiner og forskellige ionkanaler. Selv om de seneste proteomiske tilgange har identificeret et betydeligt antal nye AIS-komponenter, mangler der detaljer om MPS's struktur og de enkelte komponenters roller. Afstanden mellem individuelle actinringe i MPS (~ 190 nm) nødvendiggør anvendelse af superopløsningsmikroskopiteknikker til at løse de strukturelle detaljer i MPS. Denne protokol beskriver en metode til anvendelse af dyrkede rotte hippocampale neuroner til at undersøge den præcise lokalisering af et AIS-protein i MPS i forhold til submembranøse actinringe ved hjælp af 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM). Derudover beskrives også en analytisk tilgang til kvantitativt at vurdere periodiciteten af individuelle komponenter og deres position i forhold til actinringe.
Introduction
Axon-initialsegmentet (AIS) er en kort, unikt specialiseret region af den proksimale axon af hvirveldyrneuroner1. AIS består af et transportfilter og diffusionsbarriere, der er afgørende for at opretholde neuronal polaritet ved at sortere somato-dendritisk last2,3,4,5,6,7. Derudover gør AIS's unikke struktur det muligt at rumme klynger af spændingsgated ionkanaler, der letter dets funktion som stedet for potentiel initiering af handling8. Et meget stabilt strukturelt kompleks ligger til grund for AIS's unikke funktioner. Forskning inden for det sidste årti har afsløret tilstedeværelsen af et membran periodisk skelet (MPS), der indeholder actinringe forbundet med spectrin og giver et stillads til forankring af forskellige AIS-proteiner9,10.
Afstanden mellem actinringe i MPS (~ 190 nm) 9,10 er under opløsningsgrænsen for konventionel lysmikroskopi. Tidlige forsøg på at bruge elektronmikroskopi til at visualisere MPS var ikke vellykkede, da de involverede hårde forberedelsesprocedurer ikke kunne bevare MPS-strukturen. Således har superopløsningsmikroskopiteknikker vist sig uvurderlige til at belyse nogle af de strukturelle detaljer i MPS11. Forståelsen af AIS-strukturkomplekset, identiteten og funktionerne i dets komponenter og dets rumlige tidsmæssige regulering er imidlertid stadig ufuldstændig. Nylige proteomiske undersøgelser lykkedes at skabe en betydelig liste over proteiner, der lokaliserer til AIS tæt på strukturelle komponenter i AIS12,13. Alligevel mangler detaljer om deres funktion og præcise sted i AIS-komplekset. Således tjener superopløsningsmikroskopiteknikker som et vigtigt redskab til at undersøge de nøjagtige positioner af disse proteiner i forhold til andre MPS-komponenter og undersøge deres funktioner. Flere lysmikroskopiteknikker kan opnå opløsninger, der er højere end diffraktionsgrænsen for lys, nogle endda i stand til at lokalisere enkeltmolekyler. Imidlertid kræver mange af disse teknikker typisk specialiserede fluoroforer eller billeddannende buffere, og billedoptagelse er ofte tidskrævende14.
3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM) kræver på grund af sin brugervenlighed og enkle krav til prøveforberedelse ingen specielle reagenser til billeddannelse eller prøveforberedelse, fungerer godt med en bred vifte af fluoroforer og prøver, kan let implementeres i flere farver og er i stand til levende cellebilleddannelse15. Mens den bedst mulige opløsning SIM tilbyder (~ 120 nm) er lav sammenlignet med mange andre superopløsningsteknikker, er det tilstrækkeligt til mange applikationer (for eksempel til løsning af komponenterne i MPS i neuroner). Det er således afgørende at overveje kravet om specifikke applikationer for at afgøre, om SIM er et passende valg, eller om en endnu højere opløsning er nødvendig. Her beskrives en protokol for anvendelse af dyrkede hippocampale neuroner og 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM) til at undersøge positionen og organiseringen af formodede AIS-proteiner i forhold til actinringe i MPS, som implementeret i Abouelezz et al.16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Primære hippocampale neuroner, der blev anvendt i disse eksperimenter, blev høstet16 fra embryonale dag 17 Wistar-rotteembryoner af begge køn under de etiske retningslinjer fra Helsinki Universitet og finsk lov.
1. Prøveforberedelse
- På high-fidelity glasdæksler skal du tillade rotte hippocampale neuroner at vokse under sparsomme kulturforhold (~ 5.000-10.000 celler / cm2) i 14 dage (14 dage in vitro).
BEMÆRK: Brug af sparsomme kulturer reducerer chancerne for overlappende neuritter, hvilket hjælper med at kvantificere MPS. - Fix neuroner ved hjælp af 4% paraformaldehyd i 12 minutter ved stuetemperatur. Vask dæksedlen en gang i 0,2% BSA i PBS (BSA-PBS), og inkuber derefter i 10 minutter i en 1% opløsning af Triton-X i PBS ved stuetemperatur. Vask en gang i BSA-PBS.
- Fortynd anti-ankyrin G-antistoffer (1:200) i BSA-PBS. Tilsæt antistofopløsning til dæksedlen og inkuber natten over ved 4 °C. Eventuelt tilsættes kylling anti-MAP2 antistoffer (se tabel over materialer) til antistofopløsningen for at afgrænse det somato-dendritiske domæne.
- Vask celler en gang i BSA-PBS, efterfulgt af 0,1% Triton-X i PBS, og lav derefter en sidste vask i BSA-PBS.
- Fortynd fluoroformærkede sekundære antistoffer mod mus (1:200) (se materialetabel) i BSA-PBS, tilsæt til dæksedlen og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Vask cellerne en gang i BSA-PBS, en gang i 0,1% Triton-X i PBS og derefter en gang i PBS.
- Forbered en 1 μM opløsning af mærket phalloidin i PBS (se tabel over materialer) og tilsæt det til cellerne. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur. Vask celler en gang i PBS, en gang i 0,1% Triton-X i PBS, derefter en gang i PBS.
BEMÆRK: AlexaFluor488-mærket phalloidin blev brugt her, men andre tags fungerer også. - Til montering af dæksedlen på et glasglas skal du anvende en dråbe monteringsmedier på et glasglas, dyppe dæksedlen i deioniseret vand og duppe ved hjælp af et blødt papirhåndklæde (for at fjerne overskydende vand).
- Placer dæksedlen på glasrutschebanen. Inkuber ved stuetemperatur i 24 timer.
BEMÆRK: Der blev ikke observeret nogen negative virkninger på prøven ved hjælp af hårdt indstillende monteringsmedier (brydningsindeks 1,47 efter hærdning).
- Placer dæksedlen på glasrutschebanen. Inkuber ved stuetemperatur i 24 timer.
2. Billeddannelse
- Hvis det er muligt, skal du rådføre dig med mikroskopifacilitetens personale inden billeddannelse. Brug en nedsænkningsolieberegner (se Materialetabel) til at vælge den nedsænkningsolie, der er egnet til prøven.
- Når prøverne er klar, skal du sørge for, at dækslipsene er rene og fri for rester eller overskydende monteringsmedier. Brug om nødvendigt en bomuldsspids dyppet i vand eller ethanol til rengøring. Placer prøven i et 3D SIM-kompatibelt mikroskop (se Tabel over materialer), og find en celle til billede.
- Juster effekten af de relevante laserlinjer og eksponeringstiderne for at maksimere signal-støj-forholdet uden at blege prøven væsentligt.
BEMÆRK: Et godt signal-støj-forhold viser et klart gitterlignende udseende med fokus på prøven og fører til nøjagtige rekonstruktioner i høj opløsning. 488 nm og 640 nm laserlinjer blev brugt til at visualisere henholdsvis F-actin og ankyrin G. - Indstil de øvre og nedre grænser for prøven i z-dimensionen, og fortsæt med at erhverve en stak.
BEMÆRK: z-trin størrelse på 125 nm blev brugt her. - For en vellykket SIM-rekonstruktion skal du sikre dig, at mikroskopisoftwaren (se materialetabellen) har en optisk overførselsfil (OTF), der er egnet til de anvendte farvestoffer.
BEMÆRK: Disse oprettes og vedligeholdes typisk af specialiseret personale. I mangel af en funktionel OHF er der også open source-værktøjer til rådighed til at udføre rekonstruktioner baseret på skøn17. I dette arbejde blev opdaterede OTF-filer brugt kontrolleret af specialiseret personale. - Kør rekonstruktionsalgoritmen på stakken for at opnå en superopløst rekonstruktion. Kontroller rekonstruktionerne for kendte artefakter, og juster om nødvendigt parametrene for at rette dem.
BEMÆRK: Standardalgoritmeparametrene giver typisk nøjagtige resultater. Mange af disse artefakter involverer nogle gentagne mønstre: stribede linjer sammen med flere retninger på et z-plan, 'ghosting' (gentagne træk, der vises i forskellige z-planer) eller et sekskantet 'bikage' mønster, der opstår i nogle områder. Disse artefakter kan ofte fastgøres med bedre prøveforberedelse, et bedre signal-støj-forhold, justering af parametrene for rekonstruktionsalgoritmen eller sikring af, at brydningsindekset for den valgte nedsænkningsolie er egnet til monteringsmediet og prøven. For en mere detaljeret diskussion af SIM-artefakter og et frit tilgængeligt værktøj til at kontrollere tilstedeværelsen af artefakter, se Ball et al. 18 - Sammenlign SIM-rekonstruktionen med et vidvinkelbillede for at observere forbedringer i opløsningen.
- Når du udfører flerfarvet SIM, skal du bruge justeringsalgoritmen til at justere de forskellige kanaler korrekt, når en tilfredsstillende rekonstruktion er klar.
BEMÆRK: Justeringsalgoritmen bruger en justeringsreferencefil genereret ved hjælp af et mikrosfæreperlepræparat i henhold til mikroskopproducentens instruktion.
3. Billedanalyse
- Actinringe i MPS har et karakteristisk periodisk udseende. Brug billedanalysesoftware (se Tabel over materialer) til at oprette et projektionsbillede med maksimal intensitet ved hjælp af alle de fokusplaner, hvor actinringe er synlige.
- På projektionsbilledet med maksimal intensitet skal du tegne en vinkelret linje på tværs af synlige tilstødende ringe og registrere fluorescensintensiteten sammen med softwarens linjefunktion 'Plot Profile'.
- For at beregne den gennemsnitlige afstand mellem toppe skal du bemærke den lokale maks. i linjeprofilen og måle afstanden mellem individuelle tilstødende fluorescerende intensitetstoppe.
BEMÆRK: Dette kan let beregnes, for eksempel ved hjælp af funktionen 'findpeaks' i MATLAB eller (open source) GNU Octave-platformen. - For at evaluere colokaliseringen af forskellige proteiner med actinringe i MPS skal du køre en colokaliseringsanalyseprocedure19,20,21 på SIM-rekonstruktioner af actin og kandidatproteinet. Tegn manuelt et valg for at definere AIS som en region af interesse for EzColocalization-pluginet i softwareplatformen19, og kør analysen for at beregne Pearsons korrelationskoefficient (PCC) for co-lokalisering19,20,21. En PCC-værdi tæt på 1 indikerer stærk colokalisering.
BEMÆRK: Denne protokol er opsummeret i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af dyrkede rotte hippocampale neuroner og 3D-SIM beskrives en protokol til at visualisere og måle actinringe og andre komponenter i MPS i AIS. Rekonstruktioner af billedstakke viste klar periodicitet af actinringe (figur 2A). I vores hænder var den gennemsnitlige inter-peak afstand af actinringe i MPS, visualiseret ved hjælp af Alexa 488-mærket phalloidin, 190,36 ± 1,7 nm (gennemsnitlig ± SEM). Dette er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede gennemsnitlige afstand på ~ 190 nm mellem actinringe i MPS. Tilsvarende blev et anti-ankyrin G-antistof anvendt til at visualisere ankyrin G (figur 2B). Colokaliseringen af ankyrin G og F-actin blev testet i AIS ved hjælp af en colokaliseringsanalyseprocedure til beregning af PCC for co-lokalisering19,20,21. PCC for colokalisering af ankyrin G og F-actinfluorescens var 0,36 ± 0,03 (gennemsnitlig ± SEM, figur 2B). Da ankyrin G- og actinringe binder βIV-spectrin på forskellige domæner, viser de ikke signifikant colokalisering. Disse data blev tilpasset fra Abouelezz et al.16
Figur 1: Skematisk repræsentation af protokollen til prøveforberedelse til 3D-SIM-billeddannelse. Hippocampale neuroner høstes fra rotteembryoner, dissocieres og får lov til at vokse på glasdæksler i kultur i 14 dage. Celler fastgøres og farves derefter ved hjælp af mærket phalloidin og passende antistoffer og monteres derefter på glasrutschebaner til 3D-SIM-billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 3D-SIM-rekonstruktion af membranens periodiske skelet (MPS) i axon-initialsegmentet (AIS). (A) F-actin (grøn) og ankyrin G (magenta) viser en regelmæssig fordeling i AIS, visualiseret af 3D-SIM. Skalabjælke = 1 μm. (B) Pearsons korrelationskoefficienter (PCC) for colokalisering af ankyrin G med F-actin i MPS i AIS. Den gennemsnitlige PCC af ankyrin G var 0, 36 (sort cirkel). Grå diamanter repræsenterer individuelle celler (n = 16), midterlinjen repræsenterer medianen, fejlbjælker repræsenterer 25. og 75. percentiler. Dataene er tilpasset fra Abouelezz et al.16Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her giver en metode til visualisering og måling af MPS-proteiner ved hjælp af superopløsningsteknikken. Da actinringe og andre MPS-komponenter viser en periodicitet på ~ 190 nm9,10, kan konventionelle diffraktionsbegrænsede billeddannelsesmetoder ikke afsløre detaljerne i MPS. Flere mikroskopiopsætninger kan løse diffraktionsbegrænsede strukturer i superopløsning, og SIM repræsenterer en robust og ukompliceret mulighed. Det er vigtigt, at SIM er kompatibelt med de mest anvendte fluoroforer, hvilket giver betydelig fleksibilitet. Desuden er SIM effektivt til at visualisere potentielt svage strukturer i MPS, såsom actinringe i latrunculinbehandlede neuroner22 såvel som levende neuroner15.
Et væsentligt aspekt for denne protokols succes er at bevare MPS's integritet i første omgang. De mest kritiske trin til vellykket SIM-billeddannelse forekommer under prøveforberedelse. For eksempel giver moderat fiksering (4% PFA i 12 min ved stuetemperatur) og stærk permeabilisering (1% Triton-X i 10 min) de bedste resultater. Det er afgørende at huske på, at hårde behandlinger, der kan være nødvendige for specifikke præparater, kan have en negativ indvirkning på MPS's strukturelle integritet. Derfor er det måske bedst at overveje at ændre sådanne behandlinger for at maksimere bevarelsen af MPS.
Den anden afgørende faktor, der skal overvejes, når man forbereder prøver til billeddannelse, er at maksimere mærkningstætheden. Ideelt set ville hvert molekyle blive mærket og detekteret. For eksempel anvendes anti-ankyrin G-antistoffet, der anvendes i dette eksperiment, almindeligvis til at mærke AIS. Det giver fremragende ydeevne i konventionel fluorescensmikroskopi, selv når det anvendes ved en fortynding på 1:1000 og inkuberes i kun 1 time ved stuetemperatur. For at opnå god mærkningstæthed for superopløsningsmikroskopi er det imidlertid yderst effektivt at anvende 5 gange denne koncentration (1:200) og inkubere antistoffet natten over ved 4 °C. Mens de specifikke krav til hvert antistof eller mærkningsteknik vil variere og skal bestemmes eksperimentelt, er det måske nyttigt at huske dette.
Derudover er det vigtigt at bemærke, at opnåelse af et højt signal-støj-forhold egner sig godt til nøjagtige og vellykkede SIM-rekonstruktioner. En god tommelfingerregel er, at gittermønsteret skal være synligt i de enkelte billeder, når SIM-modaliteten er aktiveret. Dette er dog ikke altid muligt.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at SIM er blandt de svageste superopløsningsteknikker til løsning af strøm14. Selv om det generelt er tilstrækkeligt til at afsløre periodicitet og overordnet organisering af MPS-proteiner, er det således signifikant mindre i stand til at give detaljer om deres interaktioner end stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM)10. Desuden er teknikkens anvendelighed, der er beskrevet her, begrænset til undersøgelsen af proteiner, for hvilke der findes et specifikt, velfungerende antistof. Dette kan dog delvis omgås ved eksogen ekspression af mærkede proteiner15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dr. Pirta Hotulainen er anerkendt for sine kritiske kommentarer, uvurderlige for udarbejdelsen af dette manuskript. Dr. Rimante Minkeviciene er anerkendt for sin hjælp med at forberede de neuronale kulturer, der blev brugt til de oprindelige eksperimenter. Al billeddannelse blev udført i Biomedicum Imaging Unit. Dette arbejde blev støttet af Finlands Akademi (D.M., SA 266351) og Ph.d.-programmet Brain & Mind (AA)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
