Summary
여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
신장의 동적 생리학을 탐구하기 위해 적합한 동물 질병 모델에 새로운 현미경 방법을 적용하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 표면 사구체를 가진 쥐는 생체 내 2 광자 현미경을 사용하여 생리 학적 및 병리 생리 학적 과정을 조사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 사구체 모세 혈관 혈류의 정량화와 약물, 투과성 및 염증에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장은 연구 할 수있는 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 형질전환 래트, 즉 형광 염료 및 기타 분자 바이오마커 접근법으로 표지된 족세포는 단백질-단백질 상호작용 및 특정 분자 변화의 영향을 직접 모니터링하고 정량화하기 위해 증가된 분해능을 제공합니다.
생후 4 주 후에 표면 사구체가 부족한 마우스에서는 몇 주 동안 일방적 인 요관 폐쇄 (UUO)를 사용하여 표면 사구체를 유도했습니다. 이 유도 모델은 기준 연구를 허용하지 않기 때문에 생리학적 조건에서 표면 사구체를 갖는 뮌헨 Wistar Frömter(MWF) 쥐의 UUO 모델에서 사구체 과정에 대한 UUO의 영향을 정량화했습니다. 5 주 이상 동안 UUO 모델은 총 신장 형태, 관상 주위 및 사구체 미세 혈관계, 세뇨관 상피의 구조 및 기능에 상당한 변화를 유도했습니다. 사구체 및 관주위 적혈구(RBC) 흐름이 유의하게 감소했는데(p < 0.01), 아마도 사구체 및 관주위 모세혈관 내에서 백혈구(WBC)의 부착이 크게 증가했기 때문일 것입니다. 알부민의 사구체 체질 계수는 처리되지 않은 MWF에서 0.015± 0.002에서 5 주 된 UUO MWF 쥐에서 0.045 ± 0.05로 증가했습니다. 12주간의 UUO는 알부민에 대한 표면 사구체 밀도와 사구체 체질 계수(GSC)의 추가 증가를 가져왔습니다. 사구체를 가로질러 여과된 형광 알부민은 근위 세뇨관에 의해 재흡수되지 않았다. 이러한 데이터는 UUO를 사용하여 표면 사구체를 유도하면 정상적인 사구체 과정과 질병 변화를 연구하고 해석하는 능력이 제한된다는 것을 시사합니다.
Introduction
사구체 과정, 특히 족세포 생물학을 이해하는 것은 50 년 넘게 목표였습니다. 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar 쥐는 생리학적 및 병리학적 과정의 다양한 측면을 이해하기 위해 미세 천자 연구를 포함한 이러한 연구에서 중심적인 역할을 했습니다1,2,3. 사구체 구성 요소를 생체 내에서 연구하기위한 현미경의 활용은이 독성 노출을 최소화하고 침투 깊이 1,2를 증가시키는 2 광자 현미경의 출현까지 광독성의 영향으로 인해 제한되었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 급속한 발전과 함께, 이것은 단일 설정 1,4,5에서 몇 시간 동안 3 차원 (3D) 및 4 차원 (시간) 연구를 가능하게했습니다.
사구체 모세 혈관 혈류의 정량화, 약물에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장, 투과성 및 투과성 및 염증에 대한 전하의 영향은 연구 된 사구체 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트를 식별 할 수 있으며, S1 및 S2 관상 상피의 거동 차이를 정량화 할 수 있습니다 1,4. 마우스에 대한 연구, 특히 마우스 형질 전환 시설의 보편적 이용 가능성으로 인해 사구체 질환 과정의 분자 생물학에 대한 이해가 급속히 발전했습니다. 개별 단백질은 녹아웃 연구, 특히 단백뇨 6,7,8과 관련하여 사구체 기능 장애를 담당합니다. 그러나 사구체 영상 연구를 위한 마우스 모델의 활용은 연구된 수많은 균주에서 사구체가 표면 아래 100μm 이상이기 때문에 제한적이었습니다9.
이로 인해 연구자들은 마우스 모델을 개발하고 활용하여 연구 할 수있는 표면 사구체를 생성하게되었습니다. 가장 일반적인 모델은 완전한 UUO10,11,12를 사용하는 것입니다. 연장 된 UUO 기간이 끝나면 생쥐 신장에는13,14 번 연구 될 수 있고 연구 된 수많은 표면 사구체가 있습니다. 이러한 마우스 연구에서 사구체 생물학에 대한 연장된 UUO의 효과를 결정하기 위한 기준선 또는 대조 연구는 없었습니다. 이것은 빠른 섬유증과 피질 파괴10,11,12를 초래하는 심각하고 장기간의 손상 모델이기 때문에 사구체 과정과 기능에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 질문에 답하기 위해 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar Fromter (MWF) 쥐를 사용하여 대조군 / 기준선 매개 변수를 연구하고 기준선 결과를 UUO 5 주 후 MWF 쥐의 사구체 연구와 비교했습니다. 우리는 또한 UUO 다음에 표면 사구체가없는 Sprague Dawley (SD) 쥐를 연구했습니다. 연구 결과는 MWF 및 SD 쥐에서 5 주간의 UUO가 실제로 표면 사구체의 수를 증가 시킨다는 것을 나타냅니다. 그러나 이들은 사구체 혈류, 염증, 거대분자 투과성 및 크기의 현저한 변화를 가진 비정상적인 사구체였습니다.
Protocol
모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드를 따랐으며 인디애나 대학교 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. UUO 수술을 위한 뮌헨 Wistar Frömter 또는 SD 쥐 준비
- 이소플루오란(5% 유도, 1.5-2.5% 유지)을 사용하여 쥐를 마취한 다음 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올을 사용하여 수술 부위를 원을 그리며 여러 번 면도, 세척 및 소독합니다. 기관 IACUC 지침에 따라 통증 관리를 위해 지속형/서방성 진통제를 적용합니다.
- 메스를 사용하여 정중선을 따라 절개하십시오. 왼쪽 신장을 찾아 주변 복막 기관에서 제거하십시오.
- 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관으로 구성된 신장 척추를 조심스럽게 찾으십시오. 요관을 다른 구조물과 분리하여 섬세한 구조물을 손상시키지 않도록 예방 조치를 취하십시오.
- 가는 집게를 사용하여 요관 주위에 3-0 봉합사를 조심스럽게 감고 찢어지지 않도록 주의하면서 묶습니다. 첫 번째 매듭의 양쪽에서 이 절차를 몇 밀리미터 반복하여 두 번째 매듭을 묶고 완전히 막히도록 합니다.
- 절차가 완료되면 연속적인 근육층을 조심스럽게 닫으십시오. 최종 층을 닫기 전에 완전히 닫기 전에 따뜻하고 멸균된 0.9% 식염수 2mL를 복부에 추가합니다. 수술용 스테이플로 외부 피부를 닫습니다.
- 통증 관리를 위해 지효성/서방성 진통제를 적용하고 기관 IACUC 지침에 따라 회복을 면밀히 관찰하십시오. 그 후 주기적으로 모니터링하고 5 주 말에 이미징을 준비하십시오.
2. 텍사스 레드 랫 혈청 알부민 (TR-RSA)의 합성
- 쥐혈청알부민 100mg을 칭량하여 50mL 원뿔형 튜브의 pH 8.4에서 0.1M 중탄산나트륨 완충액 6.67mL에 녹입니다.
- 텍사스 레드-X-숙신이미딜 에스테르 5mg이 담긴 바이알에 디메틸 포름아미드(DMF, 고품질) 100μL를 넣고 모든 염료가 녹을 때까지 소용돌이합니다.
- 쥐 혈청 알부민 용액을 저/중 설정의 소용돌이 위에 놓고 용액 부피가 열린 튜브의 상단 아래에서 잘 회전하도록 합니다.
- 튜브가 와류되는 동안 용해된 염료를 추가합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브를 가져다가 호일로 싸서 로커나 롤러에 튜브를 놓고 실온(RT)에서 1시간 동안 천천히 저어줍니다.
- 부드럽게 교반 하에 교반 막대가 있는 0.9% NaCl 5L 버킷에 적합한 50kDa 분자량 차단 투석기(클립이 있는 멤브레인, 밀폐형 멤브레인 튜브 또는 투석 카세트가 모두 적합함)의 멤브레인을 적십니다.
- TR-RSA 용액을 멤브레인 시스템에 로드하고 일반적으로 시스템에 포함된 부유 선광 부착물에 부착합니다. 5L 용기를 0.9% 식염수/TR-RSA와 함께 4°C(차가운 실내)에서 밤새 교반 플레이트에 부드럽게 교반합니다. 다음 36시간 동안 투석액을 최소 3번 교체합니다.
- 멤브레인의 팽창은 이제 투명한 TR-RSA 용액의 부피를 증가시킵니다. 원래 100mg을 부피로 나누어 대략적인 농도를 얻으십시오 : 염료 : 단백질 비율은 1 : 1이됩니다. 적절한 부피로 분취하고 장기 보관을 위해 동결 건조합니다.
3. 도립 현미경에서 2 광자 생체 내 이미징 준비
- 50mm 커버슬립 바닥 접시(커버 슬립 직경 40mm)의 커버를 제거하고 가장자리를 따라 내부 바닥에 오토클레이브 테이프 8개를 놓습니다. 피라미드 모양의 빈 창을 만들고 한 면당 4개를 사용하여 외부화된 신장이 이 공간에 꼭 맞도록 하면서 오토클레이브 테이프와 주변으로 접촉을 유지하여 움직임을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 신장과의 최상의 접촉을 보장하기 위해 쥐의 크기에 따라 간격을 조정하십시오.
- 1mm 커버슬립 바닥 접시의 양쪽에 50개의 열 패드를 놓습니다. 온난화 패드가 스테이지를 덮는지 확인하십시오.
- 0.75x 줌 및 1.5x 줌에서 40x 수중 대물렌즈를 사용하여 각각 30x 및 60x 이미지를 생성하여 저배율 및 고배율 이미지를 허용합니다. 필요한 경우 물방울이 튜브 아래로 떨어지는 것을 방지하기 위해 대물렌즈 상단에 아래쪽 각도로 도달할 수 있는 긴 PE-1 튜브 조각이 있는 200mL 주사기를 사용하여 대물렌즈에 물을 추가합니다.
- 연구 간 이미지의 일관성을 보장하기 위해 파란색, 녹색 및 빨간색 감지기를 미리 결정된 수준으로 설정하여 2% 레이저 투과율을 사용합니다. 참조 레이저에서 여기 파장을 800nm로 설정하면( 재료 표 참조) 이 연구에 사용된 모든 형광단을 효율적으로 여기시킵니다.
- 외부(스캔되지 않은) 검출기를 사용하여 광전자 증배관(PMT)(420-490nm, 이득 950)을 사용하여 청색 방출을 수집합니다.
- Hyd 검출기를 사용하여 녹색 방출 (500-550 nm, 이득 100)을 캡처하십시오.
- Hyd 검출기를 사용하여 적색 방출 (590-660 nm, 이득 200)을 캡처하십시오.
- PMT(파란색 방출)의 오프셋을 조정하여 조직의 빈 영역에 있는 몇 픽셀만 0 값을 갖도록 합니다.
알림: 녹색 및 빨간색 방출에 대한 HyD 감지기에는 자동 오프셋 조정 기능이 있습니다. 게인만 설정할 수 있습니다. - 비트 심도를 12비트로 설정하여 이미지에 흑백 사이의 4,096 강도 배율을 제공합니다.
알림: Bowman의 공간 내에서 저강도 방출을 수집하기 위해 이러한 값을 제외하지 않도록 감지기의 하한(PMT의 오프셋)을 설정해야 합니다. 감도 설정이 너무 낮으면 시각적 경고 마커가 이를 나타냅니다. 이러한 값에는 강도 값 0이 지정됩니다.
- 약 6mg의 Texas-Red-X-Rat 혈청 알부민을 총 부피 1mL로 희석하고 1mL 주사기에 용액을 넣고 9.1단계에서 Hoechst 33342를 주입한 후 4.1단계에서 유치 IV 카테터에 놓습니다.
4. 생체 내 2 광자 이미징을위한 수술 준비
- 내재 정맥 접근 라인 (대퇴골 또는 경정맥)이있는 사전 마취 된 쥐를 측면에 놓고 면도 한 왼쪽 측면이 평평하고 똑바로 테이블을 향하게합니다. 뒷발과 마찬가지로 앞발이 서로 닿도록하십시오.
- 갈비뼈 바로 아래의 왼쪽 옆구리를 부드럽게 촉지하여 신장이 복부의 자연스러운 위치를 결정하는 것을 느낍니다. 필요한 경우 면도 부위를 따라 영구 마커를 사용하여 선을 그리고 신장 센터를 코에서 꼬리 방향으로 이등분합니다.
- 한 쌍의 톱니 집게를 사용하여 피부를 잡고 위로 들어 올려 한 쌍의 지혈제로 영구 마커 라인을 꼬집어 기본 혈관을 부수고 한 쌍의 수술 가위로 절개 할 때 출혈을 방지합니다. 출혈을 최소화하기 위해 얇은 바깥 쪽 근육층에 대해이 작업을 반복하십시오.
- 얇은 내부 복부 근육층을 마지막으로 절개하려면 신장을 다시 촉지하여 크기와 위치를 추정하십시오. 한 쌍의 집게로 내부 근육층을 조심스럽게 들어 올리고 신장 위의 피부를 양분하는 선을 신장의 예상 크기의 약 1/3 인 지혈제로 분쇄하십시오.
- 집게로 근육층을 잡고 마지막 절개를하십시오.
참고: 봉합사로 부분적으로 닫아야 하는 너무 크게 만드는 것보다 더 작은 절개를 하고 필요에 따라 확장하는 것이 좋습니다. - 주변 지방으로 신장을 부드럽게 잡으십시오. 양손에 집게를 들고 양손을 사용하여 신장 지방을 잡고 잡고 아래쪽으로 작업하여 손으로 손으로 잡는 기술을 사용하여 신장의 아래쪽 극에 있는 지방을 잡습니다.
- 한 손으로 신장의 아래쪽 극에있는 지방을 단단히 잡고 지방을 부드럽게 당기고 필요한 경우 절개를 통해 신장을 매우 부드럽게 짜냅니다. 신장이 쉽게 통과하지 않으면 절개 부위를 넓히십시오.
5. 이미징을 위한 쥐 위치 지정
- 노출 된 신장을 접시의 가장자리에 조심스럽게 놓고 약간 회전하여 신장의 복부가 커버 슬립에 닿고 등쪽이 가장자리에서 반대쪽을 향하도록합니다.
- 움직임을 더욱 최소화하려면 두 개의 멸균 2 x 2 거즈 패드를 가져다가 식염수로 적신 다음 신장의 등쪽에 포장하여 신장의 복부 쪽과 가장자리의 접촉을 강화하십시오.
- 이중 패스 로다민/FITC 큐브를 사용하여 에피형광 조명 아래에서 현미경 접안렌즈를 통해 살펴보십시오. 움직임이 감지되면 위치를 약간 조정하고 거즈를 조심스럽게 조정하여 신장 아래로 밀리지 않도록하십시오. 움직임을 더 줄이려면 쥐를 약간 굴려 흉부가 접시에서 더 멀어지도록하십시오.
6. 정량 분석을 위한 이미지 획득
- 에피 형광 조명 (5.3 단계)을 사용하여 신장 표면을 스캔하고 전동 스테이지 컨트롤러 (최신 시스템의 기능)와 관련된 소프트웨어를 사용하여 사구체 위치를 표시합니다.
- 2 광자 조명 아래의 각 색상 채널에 대해 표시된 각 사구체의 상단 부분의 얕은 3D 볼륨을 가져 와서 배경 이미지로 사용합니다. 이미징 소프트웨어의 표시 옵션에서 의사 색상 팔레트를 사용하여 사구체 모세관 루프의 배경 형광의 희미한 강도를 더 잘 시각화할 수 있습니다.
- 표재성 혈관을 초점으로 사용하여 형광 알부민을 천천히 주입하여 전신 분포로 인한 형광의 상승과 하강을 관찰 할 시간을 허용합니다. 포화 바로 아래에 있는 관주위 혈관구조 및 모세관 루프의 강도를 달성하기 위해 충분한 TR-RSA를 주입합니다.
알림: 일반적으로 신장 관류가 정상일 때 물질 주입과 혈류에서의 출현 사이에는 5초 지연이 있습니다. - 10단계에서 표시되고 이미징된 모든 사구체에 대해 3D 볼륨(1μm 간격)을 획득하기 전에 약 6.2분 정도 기다립니다.
참고 : Simonsen의 뮌헨 Wistar 쥐는 표면 사구체가 적습니다. 그러나 MW 쥐의 Frömter 균주는 더 많은 수의 표면 사구체를 가지고 있기 때문에 최대 10 개의 사구체를 종종 이미지화 할 수 있습니다. - 연구가 끝날 때 이소 플루 란의 과다 복용을 통해 쥐를 안락사시킵니다. 안락사를 보장하기 위해 이중 기흉을 수행하십시오.
7. 사구체 투과도 계산
- 현미경 시스템과 연결된 이미지 보기 소프트웨어를 사용하여 처리 및 분석을 위해 이미지를 12비트 Raw 이미지로 내보냅니다.
- 배경 3D 볼륨과 순환 형광 알부민이 포함된 원시 3D 볼륨을 로드합니다. 주변 Bowman의 캡슐 가장자리에 충분한 공간이 있는 사구체에서 가장 밝은 표면 모세관 루프가 있는 3D 볼륨의 초점면을 찾습니다.
- 시각적 랜드마크를 사용하여 배경 볼륨에 있는 동일한 초점면을 찾습니다. 모세관 루프의 영역과 Bowman의 공간 내에서 각 영역의 평균 강도 값을 기록하는 영역을 선택합니다. 이러한 강도 값을 배경 값으로 사용합니다.
- 알부민 함유 이미지에서 Bowman의 공간 내의 영역 (최소 20 x 20 픽셀 영역)의 윤곽을 그리고 강도 판독 값을 기록하십시오 (Bowman의 공간 강도를 가장 깨끗하게 측정하려면 모세관 루프 또는 Bowman 캡슐에 인접하지 않은 영역을 선택하십시오). 그려진 영역을 다른 두 영역 위로 이동하여 Bowman의 공간 내의 평균 강도에 대한 평균값을 가져옵니다.
- 모세관 루프 섹션 내에서 가장 밝은 플라즈마 형광 강도를 선택하고 이 영역에 원을 그립니다. 임계값 함수를 사용하여 밝은 값(일반적으로 모세관 루프 벽의 가장자리에 위치)을 강조 표시하고 RBC 그림자가 순환하지 않도록 하고 값을 기록합니다.
참고: 혈액 내의 요인으로 인해 혈장 형광 수준이 과소평가되므로 가장 밝은 영역을 선택하는 것이 중요합니다. - 스프레드시트에 값을 입력하여 식 (1)을 사용하여 GSC를 계산합니다.
GSC =
(1)
(1)8. linecan 함수를 사용하여 표면 사구체 모세관 루프 및 신장 혈관계의 적혈구 흐름 계산
- 적절한 용기 (모세관 루프 또는 관주위 혈관)를 찾으십시오. 참조된 이미지 수집 소프트웨어(재료 표 참조)의 linescan 기능을 사용하려면 용기가 수직이어야 하므로 회전 기능을 사용하여 이미지를 회전합니다.
- 용기가 회전하고 평평하게 놓이면 획득 메뉴에서 XT 기능을 선택합니다. 4,000줄을 스캔하도록 설정합니다. 검사 할 용기를 가로 질러 선을 놓습니다. 초점면이 이미징할 세그먼트의 최대 지름에 있는지 확인합니다.
- 컬러 합성 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 스냅샷 찍기를 선택하여 라인스캔을 촬영한 영역의 참조 이미지를 생성합니다. 즉시 시작 버튼을 클릭하여 선박의 라인 스캔을 캡처합니다.
- RBC 유량을 결정하려면 라인 스캔을 이미지 처리 소프트웨어로 가져옵니다(재료 표 참조). 측정값 드롭다운 메뉴에서 영역 통계 표시 대화 상자를 엽니다. 단일 선 그리기 도구를 선택하고 RBC 그림자의 기울기와 일치하는 선을 그립니다. 너비 및 높이 값을 기록해 둡니다.
알림: 너비에 대해 얻은 픽셀 값은 거리에 해당합니다. 높이의 픽셀은 시간에 해당합니다. - 다음 공식(식 (2))을 사용하여 속도를 계산합니다.
RBC 유량(μm/s) =
(2)
참고: 이는 참조 현미경을 사용한 60x 배율 및 400Hz 스캔 속도에서의 획득 매개변수에 해당합니다( 재료 표 참조).- 최소 5 번의 계산을하고 평균을 구하여 각 라인 스캔의 속도를보고하십시오.
참고: 이러한 매개변수는 현미경 시스템의 픽셀 치수와 획득 속도에 따라 달라집니다.
- 최소 5 번의 계산을하고 평균을 구하여 각 라인 스캔의 속도를보고하십시오.
(2)9. 사구체 모세관 루프의 WBC 폐색 계산
- Hoechst 33342 핵 염색 (~ 8 μg / kg 쥐 무게)을 유치 정맥 접근 라인을 통해 투여하여 모세관 루프에 박힌 WBC를 식별합니다.
알림: 사용 가능한 깊이는 광자 산란 및 헤모글로빈에 의한 흡수, 특히 더 짧은 파장의 청색 방출로 인해 제한됩니다. - 이미징 분야에서 사구체를 중앙에 두고 사구체 표면에서 시작하여 3D 데이터 세트를 취하여 최소 30 내지 35 μm의 데이터를 종료합니다. Z 방향으로 1μm 스텝 크기를 사용합니다.
- 파란색 Hoechst 채널과 텍사스 레드 알부민 채널을 비교하여 WBC를 식별합니다. 모세관 루프에서 적색 염료의 배제와 WBC를 긍정적으로 식별하기 위해 해당 핵 얼룩을 찾으십시오. 백혈구가 3개의 광학 섹션에 걸쳐 정적으로 나타나는 경우 "부착된" 것으로 정의하십시오. 값을 사구체 상단에서 10 μm 간격으로 찍은 발생 / 10 광학 섹션으로 보고합니다.
10. 표면 사구체에서 룰로 형성의 존재 점수 매기기
- 9.3단계와 동일한 지침을 따르고 3D 데이터 세트를 수집합니다. 모세관 루프를 따라 이동할 때 해리에 저항하는 패킷에 쌓인 적혈구로 나타나는 Rouleaux 형성을 찾으십시오. 더 긴 파장의 적색 방출을 위해 더 적은 광자 산란으로 인해 더 깊은 곳에서 구조를 더 잘 시각화하려면 적색 형광단을 사용하십시오. 값을 사구체 상단에서 발생 횟수/25개의 광학 절편으로 보고하고 1μm 간격으로 촬영합니다.
11. 사구체의 분리
- 쥐 사구체15의 순도를 90 %에 가깝게 생성하는 표준 체질 기술을 사용하여 신선한 신장에서 3 그룹의 사구체를 분리합니다.
- 신장 피질을 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)에 넣고 여러 개의 가위 또는 면도날을 사용하여 다집니다.
- 다진 조직을 100μm 멸균 세포 여과기에 넣고 5mL 주사기 플런저와 50-100mL의 차가운 PBS를 사용하여 부드럽게 밀어 넣습니다.
알림: 대부분의 세뇨관은 사구체가 통과하는 동안 유지됩니다. - 농축된 사구체 분획을 70μm 필터에 놓고 차가운 PBS로 광범위하게 세척합니다. 100-200mL의 차가운 PBS로 필터를 세척하여 나머지 세뇨관을 대부분 제거합니다.
- 1-2mL의 차가운 PBS를 사용하여 필터에서 사구체를 수집하고 원심분리기(10,000×g, 2 분, 4°C)하고 RNA 분리가 될 때까지 액체 질소에서 스냅 동결합니다.
참고 : 위상차 현미경으로 측정 된 사구체 순도는 >90 %이며 수율은 2 신장에서 약 10mg입니다.
12. 사구체 RNA 분리
- RNA 분리 시약을 사용하여 400μL의 시약을 첨가하고 200μL 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 분해하여 동결된 사구체 펠릿을 균질화한 다음, RT16에서 짧은 볼텍싱 및 5분 배양합니다.
- 40 μL의 1- 브로 모 -3- 클로로 프로판 (BCP)을 추가하고 15 초 동안 와동시키고 RT에서 15 분 동안 유지합니다.
- 12,000 × g, 15 분, 4 ° C에서 원심 분리. 수성 층을 제거하고 하부 층을 동일한 부피의 70 % 에탄올로 희석 한 다음 스핀 컬럼에 직접 적재합니다 ( 재료 표 참조).
- 세척 후, 각각의 용액을 컬럼에 첨가한 후 12,000 x g, 15 s, 26°C에서 원심분리하는 것으로 구성됨 [총 3개, 먼저 2개의 RPE 500 μL(미량의 염을 제거하기 위해 에탄올을 사용한 독점적인 순한 세척 완충액, 500μL의 80% EtOH로 3차 세척], 15 μL의H2를 첨가하여 RNA를 용리시킨다. O 및 원심 분리기, 세척에 관해서. RNA의 농도와 순도를 확인하고 RNA 샘플을 나노스트링 분석17,18을 위한 핵심 시설로 운반합니다.
참고: 총 RNA 수율은 약 1-2 μg입니다. 여기에서 24개의 샘플에는 30ng/μL에서 200ng의 RNA가 포함되어 있습니다.
13. 나노스트링 분석
참고: Nanostring 기술은 색상 코드 프로브 쌍을 활용하는 표적 분자의 디지털 검출 및 직접 분자 바코드를 기반으로 합니다. 캡처 프로브는 3' 말단에 비오틴 부분을 전달하고 리포터 프로브는 5' 말단에 신호를 전달합니다.
- 나노스트링 유전자 프로브 쌍과 코드 세트를 미시간 주의 게놈 코어 시설로 배송하고 나노스트링의 지시에 따라 사용하십시오.
참고: 색상 코드에는 6개의 위치가 있으며 각 위치는 4가지 색상 중 하나일 수 있으므로 데이터 수집 중에 각각 개별적으로 확인하고 식별할 수 있는 다양한 태그를 사용할 수 있습니다. - 현미경 대물렌즈와 CCD 카메라를 사용하여 시야를 수집하고 바코드 개수를 표로 작성하고 표시하는 독점 Nanostring nCounter Digital 분석기를 사용하여 게놈 코어 시설 직원이 수집한 데이터를 얻습니다.
- 분석을 위해 원시 데이터를 나노스트링의 nSolver 소프트웨어로 가져옵니다. 기본 설정을 사용하여 정규화된 데이터를 정규화하고 설명서에 설명된 대로 그룹 간에 데이터를 비교합니다.
참고 : 목표는 UUO 모델19, 신장 질환 17,20,21,22,23,24,25,26에서 피질 조직에서 변경된 것으로 이전에 나타난 유전자 변화를 모니터링하는 것이 었습니다. 권장 양성 및 음성 대조군을 포함한 총 126 개의 유전자가 각 사구체 그룹 (CONT, SHAM, & UUO)에서 분석되었습니다.
Representative Results
3개의 그룹의 사구체를 표준 체질 기술을 사용하여 분리하였고, 이는 래트 사구체15의 순도를 90%에 가깝게 초래한다. 첫 번째 사구체 그룹은 5 주 동안 왼쪽 신장 요관 클램프를받은 SD 쥐의 왼쪽 신장 인 UUO (남성 5 명, 여성 3 명)에서 나왔습니다. 두 번째 사구체 그룹은 동일한 쥐 CONT (남성 5 명, 여성 3 명)의 반대쪽 대조 신장으로부터 분리되었습니다. 세 번째 그룹의 사구체는 SHAM 수술을받은 SD 래트에서 분리되었고, 왼쪽 신장은 5 주 후 사구체 분리, SHAM (남성 4 명, 여성 4 명)에 사용되었습니다.
형태 학적 변화
영상화를 위해 막힌 신장의 외부화는 정상 크기의 약 4배인 심하게 확대된 신장을 나타냈으며, 체액으로 채워진 신장 내부를 통해 얇은 상피가 보입니다. 에피형광 조명과 FITC/로다민 이중 패스 큐브를 사용한 20x 대물렌즈를 통해 가장 뚜렷한 변화는 관상 상피의 얇아짐과 전체 관형 길이에 따른 관형 내강의 균일한 붕괴였습니다. 조직학은 잘 설명되어 있으며 UUO10,11,12의 1 주일까지 심각합니다. MWF 및 SD 쥐의 표면에서 볼 수있는 사구체의 수는 5 주간의 편측성 요관 폐쇄 후에 증가했다. 그림 1A는 UUO 모델을 만드는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 오른쪽 신장은 손대지 않고 쥐에게 적절한 사구체 여과율을 제공합니다. 20x 대물렌즈(363 μm x 363 μm)를 사용하여 필드당 사구체의 수를 계수하고 그림 1B의 그래프에 표시했습니다. MWF 쥐의 표면 사구체 수는 처리되지 않은 쥐의 1.08 ± 0.11 / field에서 5 주 UUO 그룹의 2.97 ± 0.65 / field로 증가했습니다. SD 쥐는 UUO의 5 주 후에 표면 사구체가없는 것에서 2.02 ± 0.37 / 필드로 이동했습니다.
핵 (청록색)을 표지하기 위해 TR-RSA (빨간색), 10 kDa 캐스케이드 블루 덱스트란 (10 kDa-CB) 및 Hoechst 33342를 주사 한 후이 쥐의 생체 내 2- 광자 이미지를 촬영했습니다. 이들은 정상 MWF 래트 (도 1C), UUO 5주 후의 MWF 래트 (도 1D), 및 UUO 5주 후의 SD 래트 (도 1E)에 대해 도시된다. 이 이미지는 관상 상피에서 발생하는 극적인 변화를 강조합니다. 일반적으로 처리되지 않은 MWF 및 SD 쥐에서 작은 점상 주황색 축적인 근위 세뇨관 리소좀은 수축된 관상 세포의 대부분을 채우는 큰 단일 액포 구조가 됩니다. TR-RSA 알부민에 의해 윤곽이 잡힌 바와 같이, 혈관계는 곧게 펴진 것처럼 보였고, 많은 혈관에서 흐르는 적혈구가 없어 스트리밍 플라즈마 만 보였다. 신장을 고정하면 피질이 밀리미터보다 두껍지 않은 섬유질 피부로 얇아졌습니다. 이러한 관찰은이 모델 3,10,11,12를 사용하는 초기 문헌과 일치합니다.
신장 혈관 역학 및 사구체 투과성의 변화
신장 혈류는 처리되지 않은 쥐에 비해 5주 UUO MWF 및 SD 그룹 모두에서 유의하게 감소하였다(도 2). 가짜 조작 MWF 쥐는 관주위 RBC 유속이 885 ± 25μm/s였습니다. 5주 UUO MWF 및 SD 쥐의 관주위 적혈구 흐름은 각각 250 ± 100μm/s 및 200 ± 125μm/s로 감소했습니다. 이 값은 RBC 속도를 계산하기 위해 관주위 혈관을 가로질러 라인 스캔을 수집하여 계산되었습니다. 도 2D 는 이들 데이터의 그래프를 도시한다.
사구체 모세관 루프 내의 RBC 속도는 처리되지 않은 MWF에 비해 5주 UUO MWF 및 SD 래트에서 유의하게 감소하였다(도 3). 많은 경우에, 사구체는 흐르는 적혈구가 전혀없는 모세관 루프를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모세관 루프 RBC 유속은 각각 1,405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± 및 190 ± 200 μm / s 또는 처리되지 않은 MWF, 5 주 UUO MWF 및 5 주 UUO SD 쥐였다 (그림 3D). 5 주 UUO 그룹의 모세관 루프 내에서 적혈구의 느린 흐름은 흐름을 늦추거나 차단하는 부착 된 WBC의 존재를 나타 냈으며, 플라즈마 흐름 만 부분 또는 전체 장애물에서 하류로 시각화되었습니다. 이 관찰을 정량화하기 위해 3D 부피에서 발견되는 부착성 WBC의 수를 계산한 다음 3D 부피 깊이 10μm마다 발생하도록 정규화했습니다. 부착 된 백색 세포의 구조는 Hoechst 33342의 시안 핵 염료 형광을 사용하여 식별 할 수있었습니다. 불행하게도, 청색 방출 빛의 더 큰 광자 산란은 사구체 부피의 1μm 단계에서 취해진 상부로부터 상부 10 개의 광학 섹션으로 핵에 의한 WBC의 신뢰성있는 식별을 제한했다. 처리되지 않은 MWF 쥐는 1 μm 단계 부피에서 채취 한 상부로부터 0.125 ± 0.05 WBC / 10 광학 절편을 가졌으며,이 수는 5 주 UUO MWF 및 5 주 UUO SD 쥐에서 각각 1.5 ± 0.5 및 3.25 ± 0.7로 증가했다 (그림 3E).
5 주 UUO 그룹에서 감소 된 RBC 흐름을 설명 할 수있는 또 다른 혈관 변화는 Rouleaux 형성 ( "스택 동전"구성으로 부착 된 그룹화 된 적혈구, 그림 3F의 삽입 참조)의 규칙적인 출현이었습니다. Rouleaux 형성은 더 천천히 흐르고 부착 된 WBC에 의해 멈출 수 있습니다. 처리되지 않은 WMF 쥐는 사구체 모세 혈관에 룰로 형성이 거의 없으며, 1 μm 단계에서 취한 상단에서 25 개의 광학 섹션 당 0.05 ± 0.05 회 만 발생합니다. 5 주 UUO MWF 및 SD 래트는 각각 1 μm 단계에서 취해진 25 개의 광학 섹션 당 2.27 ± 0.46 및 1.46 ± 0.73의 룰로 형성이 현저하게 증가했다 (그림 3F).
UUO에서 볼 수 있는 사구체 RBC 유속의 감소 외에도 알부민 투과성의 증가가 나타났습니다. 사구체 사이의 알부민 투과성에는 더 큰 이질성이있었습니다. 때때로, Bowman 's Space 내의 알부민 축적은 명확하게 볼 수있을만큼 강렬했습니다 (그림 4B, 별표). 알부민의 사구체 체질 계수는 처리되지 않은 MWF에서 0.015± 0.002에서 5 주 UUO MWF에서 0.045 ± 0.05, 5 주 UUO SD 쥐에서 0.052 ± 0.075로 증가했습니다.
변경된 근위 세뇨관 기능
흥미롭게도, 여과된 알부민은 UUO 다음의 근위 세뇨관 세포에서 검출될 수 없었다. S1 세그먼트는 일반적으로 치료되지 않은 MWF 쥐의 생리학적 조건에서 여기에 표시된 바와 같이 다량의 알부민27,28,29,30을 엔도사이토시스합니다(그림 5A). 이 동일한 흡수는 UUO의 5 주 후에 MWF 또는 SD PT에서 볼 수 없었습니다 (그림 5B, C). TR-RSA 주입 후 45분에서 60분 사이에 영상화된 사구체를 둘러싼 근위 세뇨관은 알부민의 존재(1) 또는 부재(0)에 대해 점수를 매겼습니다. 생리 학적 조건에서 S1 세그먼트는 알부민이 원위 세뇨관에 도달하거나 덕트를 수집하는 것이 거의 또는 전혀없이 알부민을 열렬히 결합하고 내재화한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 후위의 근위 세뇨관 분절에는 알부민이 포함되어 있지 않아 알부민 흡수에 대한 분수 양성률이 1.0 미만인 것이 합리적입니다. 도 5D는 근위 세뇨관 알부민 흡수로부터의 스코어링 결과와 함께 그래프를 도시한다. 처리되지 않은 MWF는 0.556 ± 0.126의 근위 세뇨관 분획 흡수 값을 가졌다. 5주 UUO MWF 및 SD 래트 모두 각각 0.049 ± 0.126 및 0.00 ±0.00의 유의하게 낮은 값을 가졌다.
연구는 또한 12주 UUO MWF 래트에서 완료되었다(표 1). UUO의 12주는 표면 사구체를 유도하기 위해 마우스 연구에 사용되는 표준 시간입니다. 3 마리의 UUO 수컷 쥐가 이미징되었고, 사구체 밀도는이 쥐에서 20x 필드 당 6.16 ± 1.83 사구체로 더 증가했습니다. RBC 유속은 293 ± 67 μm / s, WBC 접착력은 1.47 ± 1.12로 모두 5 주 UUO 데이터와 유사했습니다. 알부민의 GSC도 5 주 UUO 쥐에 비해 0.109 ± 0.04로 증가했습니다.
만성 UUO에 의해 유도 된 사구체 mRNA 변화
표 2 는 모든 유전자(프로브)를 이들의 그룹화된 발현 및 표준편차 값과 함께 나타낸다. 참고로, 유전자는 프로토콜 섹션 13의 메모에 설명된 대로 UUO를 포함하여 신장 질환의 변경에 대한 이전 문서를 기반으로 분석을 위해 선택되었습니다. 도 6 은 대조군 또는 가짜 사구체와 비교하여 UUO 사구체에서 대부분의 유전자에 대한 유전자 발현의 극적인 변화를 강조하는 데이터의 히트 맵이다.
그림 1 : MWF 쥐에서 5 주 UUO 후 SD 쥐에서 표면 사구체 수의 증가 및 표면 사구체 유도. (A) 외과 봉합사를 사용하여 두 개의 넥타이로 폐색하기 전에 신장 동맥과 정맥에서 조심스럽게 분리 된 왼쪽 신장의 요관의 수술 다이어그램. (B) 일반적으로 표면 사구체가 없는 SD 래트에서 표면 사구체의 수와 함께 UUO 이전 및 5주 후에 MWF 래트에 존재하는 표면 사구체의 수의 증가를 나타내는 그래프. MWF 쥐의 표면 사구체 수는 처리되지 않은 쥐의 1.08 ± 0.11 / 밭에서 5 주 UUO 그룹의 2.97 ± 0.65 / 밭으로 증가했습니다. SD 쥐는 표면 사구체가없는 것에서 2.02 ± 0.37 / 필드로 이동했습니다. 3차원 재구성 이미지는 치료되지 않은 MWF(C), 5주 UUO 후 MWF(D) 및 5주 UUO 후 SD(E)에 대한 신장 표면을 보여줍니다. 작은 개별 리소좀에서 큰 비정상 체로 합쳐진 크고 주황색 액포 구조의 출현에 주목하십시오. SD 쥐의 5주 UUO는 C에서 볼 수 있고 부분적으로 D에서 보이는 정상 관상 상피와 유사한 영역을 초래하지 않았습니다. 혈관계는 일부 지역에서 곧게 펴진 것처럼 보였고 많은 지역에서 혈장은 흐르지만 적혈구는 흐르지 않는 부분 폐색이 있었습니다. (n = 그룹당 수컷 래트 3마리) 스케일 바 = 40 μm. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; G = 사구체; 적혈구 = 적혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 5주 UUO 후 표재성 관주위 혈관계 내 적혈구 흐름 감소. RBC 유속을 μm/s 단위로 결정하기 위해 관주위 혈관에서 라인스캔을 수집했습니다. 간단히 말해서, A, B, C에 표시된 빨간색 기준선은 동일한 픽셀 와이드 영역을 반복적으로 스캔한 작은 영역을 나타내며, 이미지는 현미경이 획득할 수 있는 것보다 빠르게 이동하는 흐르는 적혈구로 인한 왜곡을 시각화하기 위해 열에 쌓여 있습니다. 참조 그림에 인접한 열은 RBC 왜곡의 기울기가 속도(x축 = 거리 및 y축 = 시간)를 계산하는 데 사용되는 라인스캔입니다. 여기서 점진적으로 가파른 경사는 라인스캔 영역에서 더 오래 유지되므로 더 느린 RBC 속도에 해당합니다. MWF (B) 및 SD (C) 래트에 대한 5주 UUO 이미지와 비교하여 처리되지 않은 MWF 래트(A)에서 적혈구의 출현의 차이를 주목한다. 3개의 래트 그룹에 대한 RBC 유속은 D에 나타내었다. 처리되지 않은 MWF의 관주위 적혈구 흐름은 평균 885 ± μm/s였습니다. 이 값은 MWF 및 SD 쥐에서 UUO 후 5 주 후에 각각 250 ± 100 μm / s 및 200 ± 125 μm / s로 크게 떨어졌습니다. 스케일 바 = 20 μm, n = 그룹당 수컷 래트 3마리. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; 적혈구 = 적혈구; WBC = 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 사구체 모세관 루프 RBC 흐름의 현저한 감소 및 5주 UUO에 의한 WBC 접착의 유도된 활성화. 관주위 적혈구 혈류를 결정하는 데 사용된 것과 동일한 라인스캔 접근법을 사용하여 사구체 모세혈관 혈류의 변화를 조사했습니다. 패널 A, B 및 C 는 그림 2 와 유사한 레이아웃을 나타내며 각각 가짜 작동 MWF, 5주 UUO MWF 및 5주 UUO SD의 사구체에 초점을 맞춥니다. (D) 5주 UUO MWF 및 5주 UUO SD 쥐의 경우 각각 평균 1,405 ± 425 μm/s± 250 220 μm/s 및 190 ± 200 μm/s±로 감소한 가짜 조작 MWF 쥐의 모세관 루프에서 생리학적으로 높은 RBC 유속을 나타내는 그래프. 사구체 모세관 루프를 검사할 때 부착된 WBC는 사구체를 통해 초점을 맞추면서 쉽게 볼 수 있었습니다. 개별 사구체의 3차원 광학 섹션을 취하고, 1μm 떨어진 처음 10개의 광학 섹션을 사용하여 부착성 WBC의 수를 측정했습니다. 처리되지 않은 MWF 쥐는 부피에 눈에 보이는 WBC가 거의 없었으며, 1μm 단계에서 채취한 상단에서 평균 0.125 ± 0.05 WBC/10 광학 섹션 미만이었습니다. 5 주 UUO MWF 및 SD 쥐에서이 수치는 각각 1 μm 단계에서 취해진 0.5 ± 0.5 및 3.25 ± 0.7 WBC / 10 광학 섹션으로 증가했습니다. 이러한 결과는 패널 E의 그래프에 표시되며 색상 삽입물은 WBC가 모세관 루프를 폐색하는 것을 보여줍니다. Rouleaux 형성 (화살표, 패널 F에 삽입)은 혈류의 난기류에서도 번들 그룹을 크게 유지하는 "스택 동전"구성으로 단단히 결합 된 적혈구로 나타납니다. 이러한 병리학 적 구조는 사구체 내의 더 깊은 곳에서 쉽게 식별 할 수있었습니다. 가짜 조작 MWF 쥐는 이러한 구조가 거의 없었으며, 사구체 부피의 1 μm 단계에서 취한 상단에서 25 개의 광학 절편 인 0.05 ± 0.05 회에 불과했습니다. 대조적으로, MWF와 SD 쥐 모두에서 5 주 UUO는 각각 1 μm 단계에서 취해진 상단에서 2.27± 0.46 및 1.46 ± 0.73/25 광학 섹션의 발생으로 룰로 형성이 현저하게 증가했다. 스케일 바 = 20 μm, n = 그룹당 수컷 쥐 3 마리. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; 적혈구 = 적혈구; WBC = 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 5주 UUO 후 사구체 모세관 알부민 투과성의 유의미한 증가. 패널 A, B 및 C 는 각각 미처리 MWF, 5주 UUO MWF 및 5주 UUO SD 래트에서 래트 혈청 알부민 채널에 대한 3D 부피의 유사색 이미지를 나타낸다. 이미지는 의사 색상 팔레트로 표시되어 Bowman의 공간, 특히 패널 B (별표)에서 볼 수있는 필터링 된 알부민의 상당한 양을 강조합니다. (A) Bowman의 공간 (별표)은 눈으로 식별 할 수없는 처리되지 않은 MWF 쥐에서 일반적으로 볼 수있는 정상 수준의 알부민을 보여줍니다. 사구체의 이미지는 알부민 투여 후 찍은 것에서 배경 형광 값을 빼기 위해 알부민 주입 전에 촬영되었습니다. (d) 0.015 ±내지 0.002의 값을 갖는 미처리 MWF 래트에서의 알부민에 대한 사구체 체질 계수를 갖는 그래프. 이 값은 5 주 UUO MWF 쥐에서 0.045± 0.05, 5 주 UUO SD 쥐에서 0.052 ± 0.075로 크게 증가했습니다. 이 매개 변수는 Bowman 's Space의 형광 강도를 플라즈마 값으로 나눈 비율 값이며 관련 측정 단위가 없습니다. 스케일 바 = 20 μm, n = 그룹당 수컷 래트 3마리. 의사 색상 강도 척도는 패널 D 아래에 있습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; 적혈구 = 적혈구; WBC = 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5주 UUO 후 근위 세뇨관의 기능 감소. (A) TR-RSA와 캐스케이드 블루 덱스트란을 주입한 후 40분 후에 촬영한 정상 뮌헨 Wistar Frömter 쥐의 표면 사구체 및 S1 세그먼트 이미지. TR-RSA의 내재화는 S1 세그먼트와 근위 세뇨관에서 볼 수 있습니다. 대조적으로, MWF 쥐 (B)와 SD 쥐 (C)는 5 주 UUO를 투여 받았고, TR-RSA의 흡수를 최소화하거나 전혀받지 않고 심하게 변형 된 근위 세뇨관을 나타낸다. 일반적으로 작고 점상자가 형광 리소좀 (A)은 크고 액포 황색-주황색 구조가되며, 종종 3 차원 데이터 세트에서 찾을 수없는 관형 내강이 완전히 붕괴됩니다. (C) 일반적으로 어떤 형태의 자가형광도 없는 원위 세뇨관은 이제 자가형광 축적을 포함합니다. 알부민 흡수를 위해 주입 후 45-60 분 동안 촬영 한 유사한 이미지에서 사구체를 둘러싼 근위 세뇨관을 채점하면 가짜 작동 MWF 그룹과 5 주 UUO 그룹 사이에 유의 한 차이가 나타났습니다. 처리되지 않은 MWF 래트는 근위 세뇨관 분획 흡수 값이 0.556 ± 0.126이었다. 5주 UUO MWF 및 SD 래트 모두 각각 0.049 ± 0.126 및 0.00 ±0.00의 유의하게 낮은 값을 가졌다. 스케일 바 = 20 μm, n = 그룹당 수컷 쥐 3 마리. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; 적혈구 = 적혈구; WBC = 백혈구; TR-RSA = 텍사스 레드 랫 혈청 알부민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: UUO를 사용한 유전자 발현 변화 . (A) 데이터의 히트 맵. (B) 산점도의 모든 데이터에 대한 정규화 된 유전자 변화. 대조군 신장에서 유전자의 발현은 낮은 발현에서 높은 발현으로 플롯되었고, SHAM 및 UUO 신장의 유전자는 대조군 발현 수준과 비교되었다. 대조 유전자 대각선 값에 근접하는 유전자 데이터 포인트는 두 그룹 모두에 대해 유사한 발현 수준을 나타내는 반면, 대각선 위 또는 아래의 데이터 포인트는 각각 더 높거나 낮은 발현 수준을 나타낸다. SHAM 유전자는 더 가변적 인 UUO 유전자보다 제어 대각선 발현에 더 가깝습니다. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : UUO의 5 주에서 12 주까지의 부상 진행. 각 시점에서 3 마리의 수컷 MWF 쥐와 3 마리의 SD 수컷 쥐에서 5 주 및 12 주 UUO 영상 매개 변수 비교. 5주 데이터는 이전 수치와 동일합니다. UUO가 지속되는 알부민에 대한 사구체 밀도와 GSC의 증가에 주목하십시오. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 스프라그-돌리; MWF = 뮌헨 비스타르 프룀터; GSC = 사구체 체질 계수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: UUO 및 대조군 래트의 사구체에서 염증 마커 분석. 유전자 프로브 쌍과 코드 세트는 NanoString의 지시에 따라 설계되고 사용되었습니다. 100개 이상의 유전자와 Nanostring이 지정한 양성 및 음성 대조군을 분석했습니다. 이들의 그룹화된 발현 및 SD 값을 갖는 모든 유전자(probe)가 표에 도시되어 있다. 도 6A 는 데이터의 히트 맵이고, 도 6B 는 산점도에서 모든 데이터에 대한 유전자 변화를 제시한다. 대조군과 SHAM 사이의 유사점과 UUO의 대부분의 유전자에 대한 뚜렷한 변화에 주목하십시오. 약어 : UUO = 일방적 인 요관 폐쇄; SD = 표준 편차. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
사구체 생리학에 대한 연구는 다양한 접근법, 특히 미세 천자의 사용, 분리 된 사구체의 관류 및 현미경 검사를 보았습니다. 뮌헨 Wistar 래트, Fromter 및 Simonsen 균주에서 표면 사구체의 가용성은 생체 내 동적 연구를 허용했습니다. 이 기술을 채택하는 연구자에게 한 가지 중요한 참고 사항은 연구 간에 일관된 이미지를 유지하기 위해 획득 매개변수를 설정해야 하므로 조직의 자가형광이 일관되게 유지된다는 것입니다. 이중 패스 플루오레세인/로다민 에피형광 큐브를 활용하고 게인 설정을 녹색 및 적색 방출 채널로 조정하여 접안렌즈를 통해 보이는 것을 컴퓨터 화면에서 모방하면 서로 다른 현미경 시스템 간에도 자가형광에서 일관된 색상 서명을 보장할 수 있습니다.
Fromter 균주는 총 사구체 수가 감소하고 ~75%가 정상이며 수컷은 약 12주령에 자발적으로 고혈압이 발생하여 진행성 단백뇨 및 후속 국소 사구체 경화증과 함께 결국 신부전으로 사망하기 때문에 광범위하게 사용되었습니다12. 이 쥐의 사용과 광독성 감소, 침투 깊이 개선 및 여러 형광 프로브를 동시에 볼 수있는 능력을 갖춘 2 광자 현미경의 추가는 새로운 발견 1,4,5를위한 길을 열었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 개발로 정량적 데이터는 이제 모든 2 광자 실험실의 표준이되었습니다. 여러 정량적 기술이 개발되어 생리학적 및 질병 상태 1,4,5,27,28,29,30 하에서 사구체, 근위 세뇨관, 혈관 및 간질 과정에 적용되었습니다.
트랜스제닉 마우스 생성 시설은 신장 생리학 및 병리학 연구에 새로운 차원을 추가했으며, 이를 2광자 현미경과 결합하여 신장 구조 및 기능에서 특정 유전자 산물의 중요성을 더욱 설명할 때까지는 시간 문제였습니다. 그러나, 마우스 사구체는, 아주 어린 마우스를 제외하고, 신장의 표면으로부터 100 μm 이상 위치한다9. 2광자 현미경은 분해능으로 20μm에서 50μm 사이의 깊이에서 수행하는 것이 가장 좋으며, 방출된 빛의 산란 및 헤모글로빈과의 상호 작용으로 인한 흡수로 인해 형광 강도가 급격히 감소합니다. 따라서, 표면 사구체를 유도할 필요가 있었다. 일반적으로 사용되는 접근법은 12 주 동안 장기간 일방적 인 방해 모델입니다. 이러한 모델은 기준선 결정을 허용하지 않기 때문에 연구중인 프로세스에서 UUO의 효과를 분리 할 수 없습니다.
MWF 쥐를 사용하여 기준선 사구체 기능을 UUO 이후의 기능과 비교할 수 있습니다. 이 UUO 모델은 염증과 빠른 섬유증 속도를 유도하는 것으로 알려져 있으며 CKD 및 섬유증10,11,12를 연구하는 데 사용되었습니다. 예상대로, MWF와 SD 래트 모두에서 표면 사구체가 증가했다. 더욱이, MWF 및 SD 래트에 대한 UUO 이후에 얻어진 정량적 결과는 매우 유사했다. 여기에 기록된 혈류의 감소는 UUO 이후의 현미경 데이터와 미세 천자 데이터3을 비교한 적이 있습니다. 또한 관상 및 간질 조직학이 현저하게 변경되고 PT는 여기에보고 된 바와 같이 알부민 세포 내 이입이 부족하여 대부분 기능하지 않는다는 것이 잘 알려져 있습니다. 그림 2와 그림 3의 연구는 사구체 및 관주위 모세혈관에서 RBC 유속의 극적인 감소와 향상된 WBC 접착력을 보여줍니다. 흐름의 감소는 WBC 접착 및 룰로 형성으로 인한 모세관 막힘으로 인한 것일 수 있습니다.
염증을 더 평가하기 위해 알부민 투과성을 정량화하고 10 배 증가하는 것으로 나타났습니다. 추가로, 단리된 사구체는 다양한 신장 질환 상태에서 신장 염증에서 증가하는 것으로 이전에 알려진 많은 유전자에 대해 mRNA 발현이 증가한다는 것을 보여주었다 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . 사구체 표면 밀도와 알부민 투과성의 증가는 12 주 UUO 데이터에서 볼 수 있듯이 점진적이었습니다. 본 데이터는 사구체가 UUO 모델에서 상당한 구조적 손상, 염증 및 분자 변화를 겪는다는 것을 직접 보여주는 최초의 데이터입니다. 결과는 UUO 후 양 신장 생검을 분석 한 전체 신장 조직에 대한 초기 연구와 일치하여 여러 염증 마커가19 상승한 것으로 나타났습니다. 본 결과는 이전에 피질 조직에 대해서만 알려진 사구체 내에 현저한 염증이 존재함을 나타냅니다.
본 데이터는 12주 수신과 정상 사구체 사이의 접착 분자 발현, 보체 침착 및 호중구 침윤에서 변화가 발견되지 않은 마우스의 이전 연구와 다릅니다31. 또한 Hickey 실험실은 12 주 UUO 모델을 사용하여 생쥐의 사구체에서 면역 반응을 연구했습니다. 그들은 4 주 된 마우스 사구체와 폐쇄 후 사구체32,33 사이의 호중구 침윤에 차이가 없음을 발견했습니다. 이 후기 연구는 막힌 신장의 골반에서 소변을 배출 한 후에 수행되었습니다. 우리는 UUO가 사구체 기능에 미치는 영향을 인위적으로 제거하지 않고 생체 내에서 사구체 기능에 미치는 영향을 결정하고 싶었 기 때문에이를 수행하지 않았습니다. 마지막으로, 마우스에서 UUO의 사용은 표면 아래 100 μm 이상에서 사구체를 이미징하는 것으로 대체되고 있습니다. 가능한 한, 해상도와 강도의 절충이 있으며, 둘 다 50 μm34를 초과함에 따라 크게 감소합니다.
제시된 결과는 조직 학적 변화, 무관 사구체의 형성, 염증, 섬유증, 혈역학10,11,12에 관한 기존 문헌의 데이터를 함께 모으는 것은 놀라운 일이 아닙니다. WBC 접착, 룰로 형성, 사구체 분자 염증 마커 및 알부민 투과성 증가를 포함하여 제시된 데이터는 이 UUO 모델에서 5주에도 진행 중이며 12주에도 존재하는 광범위한 염증을 추가로 나타냅니다. 분명히, 만성 UUO는 생리적 상태가 아니며, 표면 사구체를 유도하기 위해 UUO를 사용하는 것은 손상 모델을 나타냅니다. 생리적 조건 하에서 표면 사구체를 갖는 MWF 쥐는 손상이 발생할 때 종단적으로 연구될 수 있다. 형질 전환 쥐를 생성하는 것이 가능하며 수많은 연구자들이 특정 질문을하기 위해 바이오 센서로 쥐를 만들고 있습니다. 특히, 위스콘신 의과 대학은 현재 MWF 쥐의 식민지를 가지고 있으며 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 사구체 과정을 연구 할 목적으로 형질 전환 쥐를 만들었습니다. 이 MWF 쥐는 정상, 질병 및 유 전적으로 변형 된 쥐의 사구체 과정을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 RO1DK091623 및 P30DK079312(BAM에)의 지원을 받았습니다. 나노스트링 분석을 수행한 미시간 주립 대학의 연구 기술 지원 시설(RTSF)의 유전체학 핵심 시설 직원에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
| Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
| MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
| Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
| RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
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