Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruk av 2-fotonmikroskopi for å kvantifisere effekten av kronisk ensidig ureteral obstruksjon på glomerulære prosesser

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Nephrology, Indiana University School of Medicine

Summary

Her presenterer vi en protokoll ved hjelp av 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter rotter med overflate glomeruli for å kvantifisere effekten av langvarig ureteral obstruksjon på glomerulær dynamikk og funksjon.

Abstract

Å bruke nye mikroskopimetoder til egnede dyresykdomsmodeller for å utforske nyrens dynamiske fysiologi er fortsatt en utfordring. Rotter med overflateglomeruli gir en unik mulighet til å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser ved hjelp av intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantifisering av glomerulær kapillær blodstrøm og vasokonstriksjon og dilatasjon som respons på narkotika, permeabilitet og betennelse er bare noen av prosessene som kan studeres. I tillegg gir transgene rotter, dvs. podocytter merket med fluorescerende fargestoffer og andre molekylære biomarkørtilnærminger, økt oppløsning for direkte å overvåke og kvantifisere protein-protein-interaksjoner og effekten av spesifikke molekylære endringer.

Hos mus, som mangler overflateglomeruli etter fire ukers alder, har unilateral ureteral obstruksjon (UUO) i flere uker blitt brukt til å indusere overflateglomeruli. Siden denne induksjonsmodellen ikke tillater baselinestudier, kvantifiserte vi effekten av UUO på glomerulære prosesser i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) rotter, som har overflateglomeruli under fysiologiske forhold. UUO-modellen i fem uker eller mer induserte signifikante endringer i brutto nyremorfologi, peritubulær og glomerulær mikrovaskulatur, samt struktur og funksjon av tubulær epitel. Glomerulær og peritubulær røde blodcellestrøm (RBC) ble signifikant redusert (p < 0,01), sannsynligvis på grunn av signifikant økning i etterlevelsen av hvite blodlegemer (WBC) i glomerulære og peritubulære kapillærer. Den glomerulære siktkoeffisienten for albumin økte fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWFer til 0,045 ± 0,05 hos 5 uker gamle UUO MWF-rotter. Tolv uker med UUO resulterte i ytterligere økning i overflateglomerulær tetthet og glomerulær siktkoeffisient (GSC) for albumin. Fluorescerende albumin filtrert over glomeruli ble ikke reabsorbert av de proksimale tubuli. Disse dataene antyder at bruk av UUO for å indusere overflateglomeruli begrenser evnen til å studere og tolke normale glomerulære prosesser og sykdomsendringer.

Introduction

Å forstå glomerulære prosesser, spesielt podocytbiologi, har vært et mål i over 50 år. München Wistar-rotter med overflateglomeruli har spilt en sentral rolle i disse studiene, inkludert mikropunkturstudier, for å forstå mange aspekter av fysiologiske og patologiske prosesser 1,2,3. Bruken av mikroskopi for å studere glomerulære komponenter intravitalt var begrenset på grunn av effekten av fototoksisitet til fremkomsten av 2-fotonmikroskopi som minimerte denne giftige eksponeringen og økte penetrasjonsdybden 1,2. Sammen med raske fremskritt innen maskinvare og programvare, har dette gitt mulighet for tredimensjonale (3D) og firedimensjonale (tid) studier i flere timer i en enkelt innstilling 1,4,5.

Kvantifiseringen av glomerulær kapillær blodstrøm, vasokonstriksjon og dilatasjon som respons på medisiner, permeabilitet og effekten av ladning på permeabilitet og betennelse er bare noen av de glomerulære prosessene som har blitt studert. I tillegg er S1-segmentet av den proksimale tubuli identifiserbar, og forskjellene i oppførselen til S1 og S2 rørformet epitel kan kvantifiseres 1,4. Studier på mus, spesielt med universell tilgjengelighet av mustransgene fasiliteter, har ført til raske fremskritt i forståelsen av molekylærbiologien til glomerulære sykdomsprosesser. Individuelle proteiner er ansvarlige for glomerulær dysfunksjon i knockoutstudier, spesielt med hensyn til proteinuri 6,7,8. Imidlertid har bruken av musemodeller for glomerulære avbildningsstudier vært begrenset, da glomeruli er mer enn 100 μm under overflaten i de mange stammene som er studert9.

Dette har ført til at forskere har utviklet og brukt musemodeller som resulterer i overflateglomeruli som kan studeres. Den vanligste modellen er bruken av komplett UUO10,11,12. På slutten av den utvidede UUO-perioden er det mange overflateglomeruli i mus nyrer som kan være og har blitt studert13,14. Det har ikke vært noen baseline- eller kontrollstudie i disse musestudiene for å bestemme effekten av langvarig UUO på glomerulær biologi. Siden dette er en alvorlig og langvarig skademodell som resulterer i rask fibrose og kortikal destruksjon10,11,12, antok vi at det ville være effekter på glomerulære prosesser og funksjon. For å svare på dette spørsmålet ble München Wistar Fromter (MWF) rotter med overflateglomeruli brukt til å studere kontroll/baseline-parametere, og baseline-funnet ble sammenlignet med glomerulære studier på MWF-rotter etter fem uker med UUO. Vi studerte også Sprague Dawley (SD) rotter som ikke har overflate glomeruli etter UUO. Funnene indikerer at 5 uker med UUO i MWF og SD-rotter faktisk øker antall overflateglomeruli. Disse var imidlertid unormale glomeruli med markerte endringer i glomerulær blodstrøm, inflammasjon og makromolekylpermeabilitet og størrelse.

Protocol

Alle eksperimenter fulgte veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr og ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Indiana University School of Medicine.

1. Forbereder München Wistar Frömter eller SD rotte for UUO kirurgi

  1. Bedøv rotten ved hjelp av isofluoran (5% induksjon, 1,5-2,5% vedlikehold), barber, vask og desinfiser det kirurgiske området flere ganger i en sirkulær bevegelse med både jodbasert eller klorhexidinbasert skrubb og alkohol. Påfør langtidsvirkende / slow-release smertestillende for smertebehandling i henhold til de institusjonelle IACUC-retningslinjene.
  2. Gjør et snitt langs midtlinjen ved hjelp av en skalpell; Finn venstre nyre og frigjør den fra de omkringliggende peritoneale organene.
  3. Finn nyrepedikelen nøye, som består av nyrearterien, nyrevenen og urineren. Separat urineren fra de andre strukturene, ta forholdsregler for ikke å skade den delikate strukturen.
  4. Bruk fine tang, sløyfe forsiktig en 3-0 sutur rundt urineren og bind den av, vær forsiktig så du ikke den. Gjenta denne prosedyren noen få millimeter på hver side av den første knuten for å knytte en andre knute og sikre fullstendig hindring.
  5. Når prosedyren er fullført, lukk forsiktig de påfølgende muskellagene. Før du lukker det siste laget, tilsett 2 ml varmt, sterilt 0,9% saltvann i magen før du lukker det helt. Lukk den ytre huden med kirurgiske stifter.
  6. Påfør langtidsvirkende / slow-release smertestillende for smertebehandling og observere utvinning nøye i henhold til de institusjonelle IACUC retningslinjene. Overvåk deretter regelmessig og forbered deg på bildebehandling i slutten av den femte uken.

2. Syntese av Texas Red rotte serum albumin (TR-RSA)

  1. Vei ut 100 mg rotteserumalbumin og oppløs det i 6,67 ml 0,1 M natriumbikarbonatbuffer ved pH 8,4 i et 50 ml konisk rør.
  2. Til et hetteglass med 5 mg Texas Red-X-succinimidylester, tilsett 100 μL dimetylformamid (DMF, høy kvalitet) og virvel til alt fargestoffet er oppløst.
  3. Plasser albuminoppløsningen fra rotter på en virvel ved lav/middels innstilling, slik at løsningsvolumet spinner godt under toppen av det åpne røret.
  4. Tilsett oppløst fargestoff mens røret blir virvlet.
  5. Ta det 50 ml koniske røret, pakk det inn i folie, legg røret på en hvilken som helst rocker eller rulle, og rør sakte i 1 time ved romtemperatur (RT).
  6. I en 5 L bøtte på 0,9% NaCl med rørestang under forsiktig omrøring, våt membranene til en passende 50 kDa molekylvekt cut-off dialyzer (en membran med klips, lukkede membranrør eller dialysekassetter er alle egnet).
  7. Last TR-RSA-løsningen i membransystemet og fest den til flytefestene som vanligvis følger med systemet. Plasser beholderen på 5 liter med 0,9 % saltoppløsning/TR-RSA over natten ved 4 °C (i et kjølerom) med skånsom omrøring på en røreplate. Bytt dialyseoppløsning minst tre ganger i løpet av de neste 36 timene.
  8. Hevelse i membranen vil øke volumet av den nå klare TR-RSA-løsningen. Del de opprinnelige 100 mg med volumet for å oppnå en omtrentlig konsentrasjon: forholdet mellom fargestoff og protein vil være 1: 1. Aliquot i passende volumer og lyofilisere for langtidsoppbevaring.

3. Forberedelse for 2-foton intravital avbildning på et omvendt mikroskop

  1. Fjern dekselet på en 50 mm coverslip bunnskål (med 40 mm coverslip diameter) og legg 8 stykker autoklavtape på den indre bunnen langs kanten. Lag et pyramideformet, tomt vindu, ved hjelp av 4 stykker per side for å la den utvendige nyren passe godt inn i dette rommet, samtidig som kontakten perifert opprettholdes med autoklavbåndet, og bidrar dermed til å minimere bevegelse. Juster avstanden i henhold til rottestørrelsen for å sikre best mulig kontakt med nyrene.
  2. Plasser 1 termisk pute på hver side av bunnskålen på 50 mm. Forsikre deg om at varmeputen dekker scenen.
  3. Bruk et 40x vann nedsenkingsmål ved 0,75x zoom og 1,5x zoom for å generere henholdsvis 30x og 60x bilder, noe som gir lavere og høyere forstørrelsesbilder. Tilsett om nødvendig vann til målet ved hjelp av en 1 ml sprøyte med et langt stykke PE-200-rør som kan nå toppen av målet i en nedadgående vinkel for å forhindre transport av vanndråpen ned i slangen.
  4. Bruk 2% lasertransmissivitet, med blå, grønne og røde detektorer satt til forhåndsbestemte nivåer for å sikre konsistens i bildene mellom studiene. Sett eksitasjonsbølgelengden til 800 nm på den refererte laseren (se materialtabellen), som effektivt vil opphisse alle fluoroforene som brukes i denne studien.
    1. Bruk eksterne (ikke-skannede) detektorer til å samle inn blå utslipp ved hjelp av et fotomultiplikatorrør (PMT) (420-490 nm, gevinst 950).
    2. Bruk en Hyd-detektor for å fange opp grønne utslipp (500-550 nm, gevinst 100).
    3. Bruk en Hyd-detektor for å fange røde utslipp (590-660 nm, gevinst 200).
    4. Juster forskyvningen i PMT (blå utslipp) slik at bare noen få piksler i de tomme områdene av vevet har en verdi på null.
      MERK: HyD-detektorene for de grønne og røde utslippene har automatisk kompenseringsjustering; bare gevinsten kan settes.
    5. Sett bitdybden til 12-biters for å gi bildene en skala med 4 096 intensitet mellom svart og hvitt.
      MERK: Det er nødvendig å sette de nedre grensene for detektorene (offset i PMT) for ikke å utelukke disse verdiene for å sikre innsamling av lavintensitetsutslippene i Bowmans rom. Hvis følsomhetsinnstillingen er for lav, vil de visuelle advarselsmarkørene indikere dette; Disse verdiene er gitt en intensitetsverdi på null.
  5. Fortynn ca. 6 mg Texas-Red-X-Rat Serumalbumin til et totalt volum på 1 ml, fyll oppløsningen i en 1 ml sprøyte og plasser det inneliggende i.v. kateteret i trinn 4.1 etter infusjon av Hoechst 33342 i trinn 9.1.

4. Kirurgisk forberedelse for intravital 2-foton avbildning

  1. Plasser den forbedøvede rotten med en inneliggende venøs tilgangslinje (lårben eller jugular) på siden med den barberte venstre flanken vendt opp flatt og rett på bordet. Sørg for at de fremre potene berører hverandre, som de bakre potene.
  2. Palpere forsiktig venstre flanke like under ribbeina for å føle for nyrene for å bestemme den naturlige posisjonen i magen. Tegn om nødvendig en linje ved hjelp av en permanent markør langs det barberte området, og skjær nyresenteret i nese-til-hale-orientering.
  3. Bruk et par tannede tang, ta tak i huden og løft den oppover for å lette klemming av den permanente markørlinjen med et par hemostater for å knuse den underliggende vaskulaturen og forhindre blødning når du gjør snittet med et par kirurgisk saks. Gjenta dette for det tynne ytre muskellaget for å minimere blødning.
  4. For å gjøre det endelige snittet av det tynne indre bukmuskellaget, repalpere nyrene for å estimere størrelsen og posisjonen. Løft forsiktig det indre muskellaget med et par tang og knus en linje som skjærer huden over nyrene med hemostatene som er omtrent 1/3rd den estimerte størrelsen på nyrene.
  5. Opprettholde grepet på muskellaget med tang, gjør det endelige snittet.
    MERK: Det er bedre å lage et mindre snitt og utvide etter behov enn å gjøre det for stort, noe som vil kreve delvis lukking med en sutur.
  6. Ta forsiktig tak i nyrene ved det omkringliggende fettet. Bruk begge hender med tang i hver hånd, arbeid for å gripe fettet på den nedre polen av nyrene ved å bruke en hånd-over-hånd teknikk for å gripe og holde nyrefettet, arbeider nedover.
  7. Å ha et fast grep om fettet på den nedre polen av nyrene med den ene hånden, trekk forsiktig fettet og, om nødvendig, klem forsiktig nyrene gjennom snittet. Hvis nyrene ikke passerer lett, utvider du snittet.

5. Posisjonering av rotta for avbildning

  1. Plasser forsiktig den eksponerte nyren mot kanten av parabolen, med en liten rotasjon slik at buksiden av nyrene kommer i kontakt med dekselet og dorsalsiden vender bort fra kanten.
  2. For ytterligere å minimere bevegelse, ta to sterile 2 x 2 gasbind, fukt dem med saltvann og pakk dem mot dorsalsiden av nyrene, og forsterk kontakten til buksiden av nyrene til kanten.
  3. Se gjennom mikroskopokularet under epifluorescensbelysning ved hjelp av en dual-pass Rhodamin / FITC-kube. Hvis bevegelse oppdages, må du gjøre mindre justeringer i posisjonen og justere gasbindet forsiktig, og sørg for at det ikke skyver under nyrene. For å redusere bevegelsen ytterligere, rull rotta litt over, slik at thoraxen er lenger unna parabolen.

6. Bildeoppkjøp for kvantitativ analyse

  1. Skann overflaten av nyrene ved hjelp av epifluorescensbelysning (trinn 5.3) og merk glomeruliposisjonen (e) ved hjelp av programvaren tilknyttet den motoriserte scenekontrolleren (en funksjon i moderne systemer).
  2. For hver fargekanal under 2-fotonbelysning, ta et grunt 3D-volum av den øvre delen av hver merket glomerulus, som vil fungere som bakgrunnsbilder. Bruk en pseudofargepalett i visningsalternativet til bildebehandlingsprogramvaren for bedre å visualisere de svake intensitetene i bakgrunnsfluorescensen til de glomerulære kapillærløkkene.
  3. Ved å bruke et overfladisk blodkar som fokuspunkt, fyll sakte fluorescerende albumin, noe som gir tid til å observere økning og fall av fluorescens på grunn av systemisk fordeling. Tilfør nok TR-RSA for å oppnå en intensitet i peritubulær vaskulatur og kapillærsløyfer som er like under metning.
    MERK: Det er vanligvis en 5 s forsinkelse mellom infusjon av materiale og dets utseende i blodet når renal perfusjon er normal.
  4. Vent ca. 10 min før du anskaffer 3D-volumer (1 μm intervaller) for alle merkede og avbildede glomeruli fra trinn 6.2.
    MERK: Simonsens München Wistar-rotter har færre overflateglomeruli. Men siden Frömter-stammen til MW-rotter har et større antall overflateglomeruli, kan opptil 10 glomeruli ofte avbildes.
  5. Avliv rotten via en overdose isofluran på slutten av studien. Utfør en dobbel pneumothoracotamy for å sikre eutanasi.

7. Beregning av glomerulær permeabilitet

  1. Bruk bildevisningsprogramvaren som er tilknyttet mikroskopsystemet, eksporter bildene til 12-biters råbilder for behandling og analyse.
  2. Last inn 3D-bakgrunnsvolumene og det rå 3D-volumet som inneholder sirkulerende fluorescerende albumin. Finn fokalplanet i 3D-volumet med den lyseste overfladiske kapillærsløyfen i glomeruli med nok plass til kanten av den omkringliggende Bowman-kapselen.
  3. Bruk visuelle landemerker til å finne det samme fokalplanet som finnes i bakgrunnsvolumet. Velg en region i kapillærsløyfen og en innenfor Bowmans rom som noterer gjennomsnittlige intensitetsverdier for hver enkelt. Bruk disse intensitetsverdiene som bakgrunnsverdier.
  4. Omriss et område (minst 20 x 20 piksler i området) i Bowmans område i det albuminholdige bildet, og noter intensitetsavlesningen (velg et område som ikke ligger ved siden av en kapillærløkke eller Bowmans kapsel for å sikre den reneste målingen av Bowmans romintensiteter). Flytt tegnet område over to andre områder for å ta en gjennomsnittsverdi for den gjennomsnittlige intensiteten i Bowman's Space.
  5. Velg den lyseste plasmafluorescerende intensiteten i kapillærsløyfeseksjonen og sirkle denne regionen. Bruk terskelfunksjonen til å utheve de lyse verdiene (vanligvis plassert i kantene på kapillærløkkeveggene), unngå å sirkulere RBC-skygger og registrere verdien.
    MERK: Ettersom faktorer i blodet vil føre til en underestimering av plasmafluorescensnivåer, er det viktig å velge de lyseste områdene.
  6. Skriv inn verdiene i et regneark for å beregne GSC ved hjelp av Eq (1):
    GSC = Equation 1 (1)

8. Beregning av røde blodlegemer i overflate glomerulære kapillære sløyfer og nyrevaskulatur ved hjelp av en linescan funksjon

  1. Finn et passende fartøy (enten en kapillærsløyfe eller et peritubulært fartøy). Siden linjene kan fungere i den refererte bildeinnsamlingsprogramvaren (se materialtabellen) krever at fartøyet er vinkelrett, roterer du bildet ved hjelp av rotasjonsfunksjonen .
  2. Når fartøyet er rotert og ligger flatt, velger du XT-funksjonen på anskaffelsesmenyen . Sett opp til å skanne 4 000 linjer. Plasser linjen over fartøyet som skal undersøkes; Forsikre deg om at fokalplanet har maksimal diameter på segmentet som skal avbildes.
  3. Venstreklikk på det sammensatte fargebildet og velg Ta øyeblikksbilde for å generere et referansebilde av området der linjeskanningen ble tatt. Klikk umiddelbart på Start-knappen for å fange fartøyets linjer.
  4. For å bestemme RBC-strømningshastigheten, importer du linescans til bildebehandlingsprogramvaren (se materialtabellen). Åpne dialogboksen Vis områdestatistikk på rullegardinmenyen Mål . Velg tegneverktøyet med én linje, og tegn en linje som samsvarer med helningen til RBC-skyggene. Legg merke til bredde- og høydeverdiene.
    MERK: Pikselverdiene som er oppnådd for bredde, tilsvarer avstanden; pikslene for høyde tilsvarer tid.
  5. Bruk følgende formel (Eq (2)) for å beregne hastighet.
    RBC strømningshastighet i μm/s = Equation 2 (2)
    MERK: Dette tilsvarer anskaffelsesparametere ved 60x forstørrelse og en 400 Hz skannehastighet med det refererte mikroskopet (se materialtabellen).
    1. Gjør minst fem beregninger og gjennomsnitt dem for å rapportere hastigheten for hver linescan.
      MERK: Disse parametrene vil være avhengig av pikseldimensjonen og anskaffelseshastigheten til mikroskopsystemet.

9. Beregning av WBC-okklusjon i glomerulære kapillærsløyfer

  1. Administrer Hoechst 33342 kjernefysisk flekk (ved ~ 8 μg / kg rottevekt) via en inneliggende venøs tilgangslinje for å identifisere WBC-er som ligger i kapillærløkkene.
    MERK: Den brukbare dybden vil være begrenset på grunn av fotonspredning og absorpsjon av hemoglobin, spesielt for kortere bølgelengde blå utslipp.
  2. Sentrer en glomerulus i bildefeltet og ta et 3D-datasett som starter på den glomerulære overflaten og avslutt dataene minst 30 til 35 μm. Bruk en trinnstørrelse på 1 μm i Z-retningen.
  3. Identifiser WBC-er ved å sammenligne den blå Hoechst-kanalen med Texas Red albumin-kanalen; se etter utelukkelse av rødt fargestoff i kapillærsløyfen og en tilsvarende kjernefysisk flekk for å identifisere WBC-ene positivt. Rapporter verdiene som forekomst/10 optiske seksjoner fra toppen av glomerulus, tatt med 1 μm intervaller.

10. Scoring tilstedeværelsen av Rouleaux-formasjoner i overflate glomeruli

  1. Følg de samme instruksjonene for trinn 9.3, og skaff deg et 3D-datasett. Se etter Rouleaux-formasjoner som vises som RBC-er stablet i pakker som motstår dissosiasjon når de beveger seg langs kapillærløkkene. Bruk en rød fluorofor for bedre visualisering av struktur på større dybder på grunn av mindre fotonspredning for lengre bølgelengde røde utslipp. Rapporter verdiene som forekomst/25 optiske seksjoner fra toppen av glomerulus, tatt med 1 μm intervaller.

11. Isolering av glomeruli

  1. Isoler tre grupper glomeruli fra friske nyrer ved hjelp av en standard sikteteknikk som resulterer i nær 90% renhet av rotte glomeruli15.
    1. Plasser nyrebarken i kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) og hakk den ved hjelp av flere fine saks eller barberblad.
    2. Tilsett hakket vev til en 100 μm steril cellesil og skyv den forsiktig gjennom med et 5 ml sprøytestempel og 50-100 ml kald PBS.
      MERK: De fleste rørene beholdes mens glomeruli passerer gjennom.
    3. Plasser den berikede glomerulifraksjonen på et 70 μm filter og vask dem grundig med kald PBS. Vask filteret med 100-200 ml kald PBS for å fjerne de fleste gjenværende tubuli.
    4. Samle glomeruli fra filteret ved hjelp av 1-2 ml kald PBS, sentrifuge (10.000 × g, 2 min, 4 ° C) og snap-fryse dem i flytende nitrogen til RNA-isolasjon.
      MERK: Glomerulær renhet bestemt ved fasekontrastmikroskopi er >90%, og utbyttet er ca. 10 mg fra 2 nyrer.

12. Glomerulær RNA-isolasjon

  1. Homogeniser den frosne glomerulipelleten ved hjelp av RNA-isolasjonsreagenset ved å tilsette 400 μL av reagenset og bryte opp pelleten ved hjelp av en 200 μL pipetspiss, etterfulgt av kort vortexing og 5 minutters inkubasjon ved RT16.
  2. Tilsett 40 μL 1-brom-3-klorpropan (BCP), virvel i 15 s, og hold ved RT i 15 min.
  3. Sentrifuge ved 12 000 × g, 15 min, 4 °C. Fjern det vandige laget, fortynn det nedre laget med et likt volum på 70% etanol, og legg det direkte på en spinnkolonne (se materialtabellen).
  4. Etter vask består hver av å tilsette den respektive løsningen i kolonnen etterfulgt av sentrifugering ved 12 000 x g, 15 s, 26 °C [3 totalt, første 2 med 500 μL RPE (proprietær mild vaskebuffer med etanol for å fjerne spor av salter, 3rd vask med 500 μL 80% EtOH], eluer RNA ved tilsetning av 15 μL H2 O og sentrifuge, som for vaskene. Kontroller konsentrasjonen og renheten til RNA og transporter RNA-prøvene til kjernefasiliteten for Nanostring-analyse17,18.
    MERK: Totalt RNA-utbytte er ca. 1-2 μg. Her inneholdt de 24 prøvene 200 ng RNA ved 30 ng/μL.

13. Nanostring analyse

MERK: Nanostring-teknologi er basert på digital deteksjon og direkte molekylær strekkoding av målmolekyler som bruker fargekodede sondepar. Capture-sonden bærer en biotindel på 3'-enden, og Reporter-sonden bærer signalet på slutten av 5'.

  1. Send Nanostring-gensondeparene og CodeSets til Michigan State's Genomic Core Facility og bruk som anvist av NanoString.
    MERK: Det er seks posisjoner for fargekodene, og hver posisjon kan være en av fire farger, noe som muliggjør et stort mangfold av koder som hver kan løses individuelt og identifiseres under datainnsamlingen.
  2. Få dataene som samles inn av Genomic Core-anleggets ansatte ved hjelp av den proprietære Nanostring nCounter Digital analysatoren, som samler synsfelt ved hjelp av et mikroskopmål og CCD-kamera og tabulerer og viser strekkodetellingene.
  3. Importer rådataene til Nanostrings nSolver-programvare for analyse. Normaliser dataene som er normalisert ved hjelp av standardinnstillingene, og sammenlign data mellom grupper som beskrevet i håndboken.
    MERK: Målet var å overvåke genendringer som tidligere ble vist å være endret i kortikalt vev fra en UUO-modell19, nyresykdom 17,20,21,22,23,24,25,26. Totalt 126 gener, inkludert de anbefalte positive og negative kontrollene, ble analysert i hver glomeruligruppe (CONT, SHAM, & UUO).

Representative Results

Tre grupper av glomeruli ble isolert ved hjelp av en standard siktteknikk som resulterer i nær 90% renhet av rotte glomeruli15. Den første glomeruligruppen var fra venstre nyre av SD-rotter som gjennomgikk en venstre nyre ureter klemme i 5 uker, UUO (5 menn, 3 kvinner). Den andre glomeruligruppen ble isolert fra kontralateral kontrollnyre fra samme rotte, CONT (5 hanner, 3 hunner). Den tredje gruppen av glomeruli ble isolert fra SD-rotter som gjennomgikk SHAM-kirurgi, og venstre nyre ble brukt til glomeruli-isolasjon etter 5 uker, SHAM (4 menn, 4 kvinner).

Morfologiske endringer
Eksternalisering av den blokkerte nyren for avbildning viste en grovt forstørret nyre, omtrent fire ganger normal størrelse, med tynn epitel synlig gjennom det væskefylte nyreinteriøret. Gjennom et 20x mål, ved bruk av epifluorescensbelysning og en FITC / Rhodamin dual-pass kube, var den mest åpenbare endringen tynningen av det rørformede epitelet og den ensartede kollapsen av rørformede lumen langs hele rørlengden. Histologien er godt beskrevet og er alvorlig med en uke med UUO10,11,12. Antall glomeruli synlig på overflaten i MWF og SD-rotter økte etter fem uker med ensidig ureterobstruksjon. Figur 1A viser metoden som ble brukt til å lage UUO-modellen. Høyre nyre er urørt og gir en tilstrekkelig glomerulær filtreringshastighet for rotta. Antall glomeruli per felt ved bruk av et 20x mål (363 μm x 363 μm) ble talt og vist i en graf i figur 1B. Antall overflateglomeruli hos MWF-rotter økte fra 1,08 ± 0,11/felt hos ubehandlede rotter til 2,97 ± 0,65/felt i den fem uker lange UUO-gruppen. SD-rotter gikk fra å ikke ha noen overflateglomeruli til 2,02 ± 0,37/felt etter 5 uker med UUO.

Intravitale 2-fotonbilder ble tatt av disse rottene etter injeksjon med TR-RSA (rød), en 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) og Hoechst 33342 for å merke kjernene (cyan). Disse er vist for normale MWF-rotter (figur 1C), MWF-rotter etter fem uker med UUO (figur 1D) og SD-rotter etter fem uker med UUO (figur 1E). Disse bildene fremhever dramatiske endringer som skjer i rørformet epitel. Proksimale tubuli lysosomer, som normalt er små punkterte oransjefargede akkumuleringer i ubehandlede MWF- og SD-rotter, blir store singulære vakuolære strukturer som fyller flertallet av de krympede rørformede cellene. Som skissert av TR-RSA-albuminet, virket vaskulaturen rettet, og i mange kar, blottet for flytende RBC, som bare viste streaming plasma. Fiksering av nyrene viste at cortex hadde tynnet ut i en fibrøs hud ikke tykkere enn en millimeter. Disse observasjonene stemmer overens med tidlig litteratur ved bruk av denne modellen 3,10,11,12.

Endringer i renal vaskulær dynamikk og glomerulær permeabilitet
Nyreblodstrømmen var signifikant redusert i både femukers UUO MWF- og SD-gruppene sammenlignet med ubehandlede rotter (figur 2). Sham-opererte MWF-rotter hadde en peritubulær RBC-strømningshastighet på 885 ± 25 μm / s. Peritubulær RBC-strømning hos fem ukers UUO MWF- og SD-rotter ble redusert til henholdsvis 250 ± 100 μm/s og 200 ± 125 μm/s. Disse verdiene ble beregnet ved å samle linjeskanninger over peritubulære fartøy for å beregne RBC-hastighet. Figur 2D viser en graf over disse dataene.

RBC-hastigheten i de glomerulære kapillærsløyfene var signifikant redusert hos de fem ukers UUO MWF- og SD-rottene sammenlignet med ubehandlet MWF (figur 3). I mange tilfeller ble glomeruli funnet å ha kapillærsløyfer helt uten flytende RBC. Kapillærsløyfe RBC-strømningshastigheter var henholdsvis 1,405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± og 190 ± 200 μm / s eller ubehandlet MWF, fem ukers UUO MWF og fem ukers UUO SD-rotter (figur 3D). Innenfor kapillærsløyfene til de fem ukers UUO-gruppene avslørte den svake strømmen av RBC-ene tilstedeværelsen av adherent WBC, enten bremsende strømning eller blokkering av den, med bare plasmastrøm visualisert nedstrøms fra delvis eller total obstruksjon. For å kvantifisere denne observasjonen ble antall adherent WBC funnet i et 3D-volum talt og deretter normalisert til forekomst per hver 10 μm 3D-volumdybde. Strukturen til den vedlagte hvite cellen kunne skjelnes ved hjelp av cyan nukleær fargestofffluorescens fra Hoechst 33342. Dessverre begrenset den større fotonspredningen av blåemitterende lys pålitelig identifisering av WBC-er med kjernene deres til de øvre 10 optiske seksjonene fra toppen, tatt ved 1μm trinn med glomerulært volum. Ubehandlede MWF-rotter hadde mindre enn 0,125 ± 0,05 WBC / 10 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved 1 μm trinnvolum mens dette tallet økte til henholdsvis 1,5 ± 0,5 og 3,25 ± 0,7 hos 5-ukers UUO MWF og 5-ukers UUO SD-rotter (figur 3E).

En annen vaskulær endring som også kan forklare redusert RBC-strømning i 5-ukers UUO-gruppene var det vanlige utseendet til Rouleaux-formasjoner (grupperte RBC-er som er festet i en "stablet mynt" -konfigurasjon, se innfelt i figur 3F). Rouleaux-formasjoner flyter saktere og kan stoppes av en tilhenger WBC. Ubehandlede WMF-rotter har praktisk talt ingen Rouleaux-formasjoner i sine glomerulære kapillærer, og har bare 0, 05 ± 0, 05 forekomster per 25 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved 1 μm trinn . De fem ukers UUO MWF- og SD-rottene hadde en markant økning i Rouleaux-formasjonene 2,27 ± 0,46 og 1,46 ± 0,73 per 25 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved henholdsvis 1 μm trinn (figur 3F).

I tillegg til reduksjonen i glomerulære RBC-strømningshastigheter sett med UUO, ble det sett en økning i albuminpermeabilitet. Det var større heterogenitet i albuminpermeabilitet mellom glomeruli. Av og til var albuminakkumuleringen i Bowman's Space intens nok til å bli tydelig sett (figur 4B, stjerne). Den glomerulære siktkoeffisienten for albumin økte fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWFer, til 0,045 ± 0,05 i 5-ukers UUO MWF og 0,052 ± 0,075 hos fem ukers UUO SD-rotter.

Endret proksimal tubulifunksjon
Interessant nok kunne det filtrerte albuminet ikke påvises i proksimale tubulære celler etter UUO. S1-segmentet endocytoser normalt store mengder albumin27,28,29,30, som vist her under fysiologiske forhold hos ubehandlede MWF-rotter (figur 5A). Det samme opptaket kunne ikke sees i MWF eller SD PT etter 5 uker med UUO (figur 5B, C). Proksimale tubuli rundt glomeruli avbildet mellom 45 og 60 minutter etter TR-RSA-infusjon ble skåret for enten tilstedeværelse (1) eller fravær (0) av albumin. Det er viktig å merke seg at S1-segmentet under fysiologiske forhold binder og internaliserer albumin med liten eller ingen albumin som når distale tubuli eller samlekanaler. Derfor er det rimelig at de sistnevnte proksimale tubulisegmentene kanskje ikke inneholder albumin, noe som resulterer i en fraksjonell positivitet for albuminopptak på mindre enn 1,0. Figur 5D viser en graf med resultatene fra skåring av proksimalt tubuli albuminopptak. Ubehandlet MWF hadde en proksimal tubulifraksjonell opptaksverdi på 0,556 ± 0,126. Både fem ukers UUO MWF og SD-rotter hadde signifikant lavere verdier på henholdsvis 0,049 ± 0,126 og 0,00 ±0,00.

Studier ble også fullført på 12-ukers UUO MWF rotter (tabell 1). Tolv uker med UUO er standardtiden som brukes til musestudier for å indusere overflate glomeruli. Tre UUO hannrotter ble avbildet, og den glomerulære tettheten økte ytterligere til 6,16 ± 1,83 glomeruli per 20x felt hos disse rottene. RBC-strømningshastigheten var 293 ± 67 μm / s, WBC-vedheft var 1,47 ± 1,12, begge tilsvarende 5-ukers UUO-data. GSC av albumin økte også sammenlignet med 5-ukers UUO-rotter til 0,109 ± 0,04.

Glomerulære mRNA-endringer indusert av kronisk UUO
Tabell 2 viser alle gener (prober) med deres grupperte uttrykk og standardavviksverdier. Merk at gener ble valgt for analyse basert på tidligere dokumentasjon av endring i nyresykdom, inkludert UUO som beskrevet i protokoll seksjon 13s notat. Figur 6 er et varmekart over dataene som fremhever de dramatiske endringene i genuttrykk for de fleste gener i UUO glomeruli sammenlignet med enten kontroll eller humbug glomeruli.

Figure 1
Figur 1: Økning i antall overflateglomeruli og induksjon av overflateglomeruli hos SD-rotter etter 5-ukers UUO hos MWF-rotter . (A) Et kirurgisk diagram av urinlederen på venstre nyre forsiktig frigjort fra nyrearterien og venen før den ble okkludert med to bånd ved hjelp av kirurgisk sutur. (B) En graf som indikerer økningen i antall overflateglomeruli tilstede i MWF-rotter før og fem uker etter UUO sammen med antall overflateglomeruli hos SD-rotter, som normalt ikke har overflateglomeruli. Antall overflateglomeruli hos MWF-rotter økte fra 1,08 ± 0,11/felt hos ubehandlede rotter til 2,97 ± 0,65/felt i 5-ukers UUO-gruppen. SD-rotter gikk fra å ikke ha noen overflateglomeruli til 2,02 ± 0,37/felt. Tredimensjonale rekonstruerte bilder viser nyreoverflaten for ubehandlet MWF (C), MWF etter 5 ukers UUO (D) og SD etter fem ukers UUO (E). Legg merke til utseendet på store, oransje vakuolære strukturer som har samlet seg fra små individuelle lysosomer til store unormale kropper. 5-ukers UUO hos SD-rotter resulterte ikke i områder som lignet normalt tubulært epitel sett i C og delvis i D. Vaskulaturen syntes rettet i noen regioner og hadde i mange partielle okklusjoner som tillot plasma, men ikke RBC å strømme. (n =3 hannrotter per gruppe) Skala barer = 40 μm. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; G = glomerulus; RBC = røde blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Reduksjon i RBC-flow i overfladisk peritubulær vaskulatur etter 5 ukers UUO. Linescans ble samlet i peritubulære blodkar for å bestemme RBC strømningshastighet i μm / s. Kort fortalt representerer de røde referanselinjene vist i A, B og C et lite område der det samme pikselbrede området ble skannet gjentatte ganger, og bildene stablet i en kolonne for å visualisere forvrengningen forårsaket av de flytende RBC-ene, som beveger seg raskere enn mikroskopet kan skaffe dem. Kolonnen ved siden av referansefiguren er linjeskanningen, med hellingen til RBC-forvrengningen som brukes til å beregne hastighet (x-akse = avstand og y-akse = tid). Her tilsvarer gradvis brattere bakker langsommere RBC-hastigheter ettersom de forblir lengre i linjeområdet. Legg merke til forskjellen i utseendet til RBC-ene hos ubehandlede MWF-rotter (A) sammenlignet med de fem ukers UUO-bildene for MWF (B) og SD (C) rotter. RBC-strømningshastighetene for de tre rottegruppene er vist i D. Peritubulær RBC-strømning i ubehandlede MWFer var i gjennomsnitt 885 ± μm / s. Disse verdiene falt signifikant fem uker etter UUO i MWF og SD-rotter til henholdsvis 250 ± 100 μm / s og 200 ± 125 μm / s. Skala bar = 20 μm, n = 3 hannrotter per gruppe. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvite blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Signifikant reduksjon i glomerulær kapillærsløyfe RBC-strømning og indusert aktivering av WBC-adhesjon ved 5-ukers UUO. Den samme linescan-tilnærmingen som ble brukt til å bestemme peritubulær RBC-strømning, ble brukt til å undersøke endringer i glomerulær kapillær blodstrøm. Paneler A, B og C viser en lignende layout som figur 2 og fokuserer på en glomerulus i henholdsvis humbug-opererte MWF, fem ukers UUO MWF og fem ukers UUO SDer. (D) En graf som viser den fysiologisk høye RBC-strømningshastigheten i kapillærsløyfene fra humbugopererte MWF-rotter i gjennomsnitt 1,405 ± 425 μm / s ± 425, redusert til henholdsvis 250 ± 220 μm / s og 190 ± 200 μm / s for 5-ukers UUO MWF og 5-ukers UUO SD-rotter. Ved undersøkelse av de glomerulære kapillærløkkene var adherent WBC lett synlig mens de fokuserte gjennom glomerulus. Tredimensjonale optiske seksjoner av individuelle glomeruli ble tatt, og de første 10 optiske seksjonene, 1 μm fra hverandre, ble brukt til å måle antall adherent WBCs. Ubehandlede MWF-rotter hadde praktisk talt ingen synlige WBC-er i volumene, i gjennomsnitt mindre enn 0,125 ± 0,05 WBC / 10 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved 1μm trinn. I 5-ukers UUO MWF og SD-rotter økte disse tallene til 1,5 ± 0,5 og 3,25 ± 0,7 WBC / 10 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved henholdsvis 1 μm trinn. Disse resultatene vises i grafen i panel E, med fargeinnsatser som viser WBC-er som okkluderer kapillærløkker. Rouleaux-formasjoner (piler, innfelt i panel F) vises som RBC-er tett bundet sammen i en "stablet mynt" -konfigurasjon som i stor grad beholder sin buntede gruppering selv i turbulensen i blodstrømmen. Disse patologiske strukturene var lett synlige på større dyp i glomerulus. Sham-opererte MWF-rotter var i stor grad blottet for disse strukturene, og hadde bare 0,05 ± 0,05 forekomster 25 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved 1 μm trinn med glomerulært volum. I motsetning til dette hadde 5-ukers UUO i både MWF- og SD-rotter en markert økning i Rouleaux-formasjoner med forekomster på henholdsvis 2,27± 0,46 og 1,46 ± 0,73/25 optiske seksjoner fra toppen, tatt ved henholdsvis 1 μm trinn. Skala barer = 20 μm, n = 3 hannrotter per gruppe. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvite blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Signifikant økning i glomerulær kapillær albuminpermeabilitet etter 5-ukers UUO. Paneler A, B og C viser pseudofargebilder av et 3D-volum for rotteserumalbuminkanal i henholdsvis ubehandlet MWF, 5-ukers UUO MWF og fem ukers UUO SD-rotter. Bildene presenteres i en pseudofargepalett for å fremheve den betydelige mengden filtrert albumin sett i Bowmans rom, spesielt i panel B (stjerne). (A) Bowmans rom (stjerne) viser det normale nivået av albumin som vanligvis ses hos ubehandlede MWF-rotter, umerkelig for øyet. Bilder av glomeruli ble tatt før infusjon av albumin for å trekke bakgrunnsfluorescensverdier fra de som ble tatt etter albuminadministrasjon. (D) En graf med glomerulær siktkoeffisient for albumin hos ubehandlede MWF-rotter, med en verdi på 0,015 ± 0,002. Denne verdien økte betydelig til 0,045± 0,05 hos 5-ukers UUO MWF-rotter og 0,052 ± 0,075 hos fem ukers UUO SD-rotter. Denne parameteren er en forholdsmessig verdi av fluorescerende intensiteter av Bowman's Space dividert med plasmaverdien og har ingen tilknyttet måleenhet. Skala bar = 20 μm, n = 3 hannrotter per gruppe. Pseudocolor intensitetsskala er plassert under panel D. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvite blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Redusert funksjon i proksimale tubuli etter 5-ukers UUO. (A) Et bilde av en overfladisk glomerulus og S1-segmentet fra en vanlig München Wistar Frömter rotte tatt 40 min etter infusjon av TR-RSA og Cascade Blue dextran. Internalisering av TR-RSA kan ses i S1-segmentet og den proksimale tubuli. I skarp kontrast viser MWF-rotter (B) og SD-rotter (C), utsatt for 5-ukers UUO, alvorlig endrede proksimale tubuli med minimal eller ingen opptak av TR-RSA. De normalt små, punkterte autofluorescerende lysosomene (A) blir store og vakuolære gul-oransje strukturer, ofte med en fullstendig kollaps av det rørformede lumenet, som ikke finnes i de tredimensjonale datasettene. (C) Distale tubuli som normalt er blottet for noen form for autofluorescens, inneholder nå autofluorescerende akkumuleringer. Skåring av proksimale tubuli rundt glomeruli på lignende bilder tatt 45-60 min etter infusjon, for albuminopptak, viste en signifikant forskjell mellom den humbugopererte MWF-gruppen og begge 5-ukers UUO-gruppene. Ubehandlede MWF-rotter hadde en proksimal tubulifraksjonell opptaksverdi på 0,556 ± 0,126. Både fem ukers UUO MWF og SD-rotter hadde signifikant lavere verdier på henholdsvis 0,049 ± 0,126 og 0,00 ±0,00. Skala bar = 20 μm, n = 3 hannrotter per gruppe. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = røde blodlegemer; WBC = hvite blodlegemer; TR-RSA = Texas Red rotte serumalbumin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Genuttrykksendringer med UUO . (A) Et varmekart over dataene. (B) Normaliserte genendringer for alle data i et spredningsplott. Ekspresjon av gener i kontrollnyrene ble plottet fra lavt til høyt uttrykk, og genene fra både SHAM- og UUO-nyrene ble sammenlignet med kontrolluttrykksnivåene. Gendatapunkter som faller nær kontrollgenenes diagonale verdi indikerer lignende uttrykksnivåer for begge gruppene, mens datapunkter over eller under diagonalen indikerer henholdsvis høyere eller lavere uttrykksnivåer. Legg merke til at SHAM-genene klynger seg nærmere kontrolldiagonaluttrykket enn UUO-genene, som er mer variable. Forkortelse: UUO = ensidig ureteral obstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Progresjon av skade fra 5 til 12 uker med UUO. Sammenligning av 5- og 12-ukers UUO-bildeparametere hos tre mannlige MWF-rotter og tre SD-hannrotter ved hvert tidspunkt. Fem ukers data er de samme som i de forrige tallene. Legg merke til økningen i glomerulær tetthet og GSC for albumin med fortsatt UUO. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; GSC = glomerulær siktkoeffisient. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Analyse av inflammasjonsmarkører i glomeruli fra UUO og kontrollrotter. Gensondepar og CodeSets ble designet og brukt som anvist av NanoString. Over 100 gener ble analysert, pluss positive og negative kontroller som spesifisert av Nanostring. Alle gener (prober) med sitt grupperte uttrykk og SD-verdier er vist i tabellen. Figur 6A er et varmekart over dataene, mens figur 6B viser genendringene for alle data i et spredningsplott. Legg merke til likhetene mellom kontroller og SHAM og tydelige endringer for de fleste gener i UUO. Forkortelser: UUO = ensidig ureteral obstruksjon; SD = standardavvik. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Studien av glomerulær fysiologi har sett mange forskjellige tilnærminger, særlig bruk av mikropunktering, perfusjon av isolert glomeruli og mikroskopi. Tilgjengeligheten av overflate glomeruli i München Wistar rotter, Fromter og Simonsen stammer, har tillatt in vivo dynamiske studier. Et viktig notat til etterforskere som vedtar denne teknologien, er behovet for å sette oppkjøpsparametere for å opprettholde konsistente bilder mellom studier, slik at autofluorescensen i vev forblir konsistent. Ved å bruke en dual-pass fluorescein / rhodamin epifluorescenskube og justere forsterkningsinnstillingene til de grønne og røde utslippskanalene for å etterligne på dataskjermen, vil det som ses gjennom okularene, sikre en konsistent fargesignatur i autofluorescensen selv mellom forskjellige mikroskopsystemer.

Fromter-stammen har blitt brukt mye da den har et redusert antall totale glomeruli, ~ 75% normal, og mennene utvikler spontant hypertensjon ved rundt 12 ukers alder, med progressiv proteinuri og påfølgende fokal glomerulær sklerose, og dør til slutt av nyresvikt12. Bruken av disse rottene og tilsetningen av 2-fotonmikroskopi med redusert fototoksisitet, forbedret penetrasjonsdybde og evnen til å se flere fluorescerende sonder samtidig banet vei for nye funn 1,4,5. Med utviklingen av maskinvare og programvare er kvantitative data nå standarden for alle 2-fotonlaboratorier. Flere kvantitative teknikker er utviklet og anvendt på glomerulære, proksimale tubuli, vaskulære og interstitielle prosesser under fysiologiske og sykdomstilstander 1,4,5,27,28,29,30.

Transgene musegenererende anlegg ga en ny dimensjon til studiet av nyrefysiologi og patologi, og det var bare et spørsmål om tid før dette ble kombinert med 2-fotonmikroskopi for ytterligere å avgrense betydningen av spesifikke genprodukter i nyrestruktur og funksjon. Imidlertid ligger museglomeruli, unntatt hos svært unge mus, over 100 μm fra overflaten av nyrene9. To-fotonmikroskopi utføres best på en dybde på mellom 20 og 50 μm som oppløsning, og fluorescensintensiteten avtar raskt deretter på grunn av lysspredning av utsendt lys og absorpsjon fra interaksjon med hemoglobin. Derfor var det nødvendig å indusere overflate glomeruli. Tilnærmingen som vanligvis brukes er en langvarig ensidig obstruksjonsmodell i 12 uker. Siden disse modellene ikke tillater baselinebestemmelser, er det ikke mulig å skille effektene av UUO fra prosessen som studeres.

Ved hjelp av MWF-rotter kan man sammenligne baseline glomerulær funksjon med den følgende UUO. Denne UUO-modellen er kjent for å indusere betennelse og en rask fibrosefrekvens og har blitt brukt til å studere CKD og fibrose10,11,12. Som forventet var det en økning i overflateglomeruli hos både MWF- og SD-rotter. Videre var de kvantitative resultatene oppnådd etter UUO for MWF- og SD-rotter svært sammenlignbare. Reduksjonen i blodstrømmen registrert her var tidligere rapportert å sammenligne mikroskopiske data etter UUO med mikropunksjonsdata3. Det var også velkjent at tubulær og interstitiell histologi er markant endret, og PT-ene er for det meste ikke-funksjonelle, som rapportert her, med mangel på albumin endocytose. Studiene i figur 2 og figur 3 viser en dramatisk reduksjon i RBC-strømningshastighet i glomerulære og peritubulære kapillærer og forbedret WBC-adhesjon. Reduksjonene i strømning skyldes sannsynligvis kapillærblokkering fra WBC-adhesjons- og rouleauxformasjoner.

For ytterligere å evaluere betennelse, kvantifiserte vi albuminpermeabilitet og viste at den økte ti ganger. I tillegg viste isolerte glomeruli at mRNA-ekspresjon økte for mange gener som tidligere var kjent for å være økt i nyrebetennelse i en rekke nyresykdomstilstander 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Økningene i glomerulær overflatetetthet og albuminpermeabilitet var progressive, som vist av 12-ukers UUO-data. De foreliggende dataene er de første som direkte viser at glomeruli gjennomgår betydelig strukturell skade, betennelse og molekylære endringer i UUO-modellen. Resultatene er i samsvar med en tidligere studie av hele nyrevev som analyserte sauenyrebiopsier etter UUO, og fant flere betennelsesmarkører forhøyet19. De foreliggende resultatene indikerer at det eksisterer markert betennelse i glomeruli, tidligere bare kjent for kortikalt vev.

De foreliggende dataene skiller seg fra tidligere studier hos mus hvor det ikke ble funnet endringer i adhesjonsmolekyluttrykk, komplementavsetning og nøytrofil infiltrasjon mellom 12-ukers posthydronefrotisk og normal glomeruli31. I tillegg brukte Hickey-laboratoriet 12-ukers UUO-modellen for å studere immunreaksjoner i glomeruli hos mus. De fant ingen forskjeller i nøytrofil infiltrasjon mellom fire uker gamle museglomeruli og postobstruktiv glomeruli32,33. Disse senere studiene ble utført etter at bekkenet til den blokkerte nyren ble drenert av urin. Vi gjorde ikke dette da vi ønsket å bestemme effekten av UUO på glomerulær funksjon som det ville være in vivo, uten kunstig å fjerne væsken som forårsaker obstruksjonen. Endelig blir bruken av UUO hos mus erstattet av imaging glomeruli på mer enn 100 μm under overflaten. Selv om det er mulig, er det en avveining mellom oppløsning og intensitet, begge reduseres betydelig når man går over 50 μm34.

Resultatene som presenteres er ikke overraskende hvis man setter sammen dataene fra eksisterende litteratur om histologiske endringer, dannelse av atubulær glomeruli, betennelse, fibrose, hemodynamikk10,11,12. Dataene som presenteres, inkludert WBC-adhesjon, rouleaux-formasjoner, glomerulære molekylære betennelsesmarkører og økt albuminpermeabilitet, indikerer ytterligere den omfattende betennelsen som pågår i denne UUO-modellen selv etter fem uker og også tilstede ved tolv uker. Det er klart at kronisk UUO ikke er en fysiologisk tilstand, og bruken av UUO for å indusere overflateglomeruli representerer en skademodell. MWF-rottene, som har overflateglomeruli under fysiologiske forhold, kan studeres i lengderetningen etter hvert som skade oppstår. Det er mulig å generere transgene rotter, og mange etterforskere lager dem med biosensorer for å stille spesifikke spørsmål. Spesielt har Medical College of Wisconsin nå en koloni av MWF-rotter og har laget transgene rotter med det formål å studere glomerulære prosesser under fysiologiske og patologiske forhold. Disse MWF-rottene gir en flott mulighet til å studere glomerulære prosesser hos normale, syke og genetisk endrede rotter.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 og P30DK079312 (til BAM). Vi takker de ansatte ved Genomics Core Facility of Research Technology Support Facility (RTSF) ved Michigan State University for å utføre Nanostring-analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm sterile cell strainer Corning #421751
100 µm sterile cell strainer Corning #421752
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Electric heating pad Sunbeam Kroger
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope Leica Microsystems Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser Spectra-Physics NA
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Cat# 78266-04
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit Invitrogen/ThermoFisher Q33140
Reptitherm Undertank Heater Zoomed Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) Qiagen 74204
RPE buffer Qiagen 1018013
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
TRI Reagent Sigma T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Tags

Medisin Betennelse glomerulær kapillær blodstrøm kortikal ødeleggelse München Wistar Fromter rotter
Bruk av 2-fotonmikroskopi for å kvantifisere effekten av kronisk ensidig ureteral obstruksjon på glomerulære prosesser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M. C., Sandoval, R. M.,… More

Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes. J. Vis. Exp. (181), e63329, doi:10.3791/63329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter