Summary
डिमाइलिनेशन कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों में होता है। विवो दवा वितरण तकनीक में एक विश्वसनीय दवा परीक्षण remyelinating के लिए आवश्यक है. यह प्रोटोकॉल एक आसमाटिक पंप-आधारित विधि का वर्णन करता है जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा में सीधे दीर्घकालिक दवा वितरण की अनुमति देता है और दवा जैव उपलब्धता में सुधार करता है, जिसमें रिमाइलिनेशन अनुसंधान में व्यापक आवेदन होता है।
Abstract
डिमाइलिनेशन की पहचान न केवल मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) में की गई है, बल्कि अल्जाइमर रोग और आत्मकेंद्रित जैसे अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों में भी की गई है। जैसा कि सबूत बताते हैं कि रिमाइलिनेशन रोग के लक्षणों को प्रभावी ढंग से सुधार सकता है, माइलिन पुनर्जनन प्रक्रिया को बढ़ावा देने के लिए दवा के विकास पर ध्यान केंद्रित किया जा रहा है। इस प्रकार, विवो में इन दवाओं की दक्षता और विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए एक क्षेत्र-चयन योग्य और परिणाम-विश्वसनीय दवा वितरण तकनीक की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल लाइसोलेसिथिन-प्रेरित डिमाइलिनेशन माउस मॉडल में एक नई दवा वितरण दृष्टिकोण के रूप में आसमाटिक पंप प्रत्यारोपण का परिचय देता है। आसमाटिक पंप एक छोटा प्रत्यारोपण योग्य उपकरण है जो रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को बाईपास कर सकता है और माउस मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में लगातार और सीधे दवाओं को वितरित कर सकता है। यह एक छोटे से आधे जीवन के साथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन जैसी दवाओं की जैव उपलब्धता में भी प्रभावी ढंग से सुधार कर सकता है। इसलिए, यह विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र माइलिन पुनर्जनन अनुसंधान के क्षेत्र के लिए बहुत मूल्यवान है।
Introduction
आसमाटिक पंप एक छोटा प्रत्यारोपण योग्य समाधान-रिलीजिंग डिवाइस है। इसका उपयोग प्रणालीगत प्रसव के लिए किया जा सकता है जब चमड़े के नीचे या पेट की गुहा में प्रत्यारोपित किया जाता है। आसमाटिक पंप की सतह एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली है, और इसका आंतरिक पक्ष एक पारगम्य परत है। आसमाटिक पंप आसमाटिक परत और ऊतक वातावरण के बीच आसमाटिक दबाव अंतर का उपयोग करके संचालित होता है जहां पंप प्रत्यारोपित किया जाता है। आसमाटिक परत की उच्च आसमाओरलता पंप की सतह पर अर्ध-पारगम्य झिल्ली के माध्यम से ऊतक में पानी को आसमाटिक परत में प्रवाहित करती है। आसमाटिक परत पंप के अंदर लचीले जलाशय का विस्तार और संकुचित करती है, जिससे लंबे समय तक एक निश्चित दर पर लचीले जलाशय से समाधान को विस्थापित कियाजाता है। पंप में तीन अलग-अलग जलाशय वॉल्यूम, 100 μL, 200 μL और 2 mL हैं, उनकी डिलीवरी दर 0.11 μL / h से 10 μL / h तक भिन्न होती है। चयनित पंप प्रकार के आधार पर, डिवाइस 1 दिन से 6 सप्ताह 2 तक काम कर सकताहै। इस प्रोटोकॉल में, 0.25 μL / h की हस्तांतरण दर के साथ एक 100 μL आसमाटिक पंप का उपयोग किया जाता है जो 14 दिनों के लिए काम कर सकता है।
1 9 70 के दशक में, आसमाटिक पंप का उपयोग तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान 3,4 में किया गया था। उदाहरण के लिए, वेई एट अल ने नशीली दवाओं की लत3 के अध्ययन में वेंट्रिकल में ओपिओइड पेप्टाइड्स को इंजेक्ट करने के लिए आसमाटिक पंप दृष्टिकोण को अपनाया। निरंतर सुधार के बाद, आसमाटिक पंप का उपयोग अब पेप्टाइड्स, विकास कारकों, नशे की लत दवाओं, हार्मोन, स्टेरॉयड, एंटीबॉडी, और इसी तरह सहित हजारों दवाओं के नियंत्रित वितरण के अध्ययन में किया गया है। इसके अलावा, विशेष कैथेटर (ब्रेन इन्फ्यूश़न किट) के साथ, इसका उपयोग रीढ़ की हड्डी, मस्तिष्क, प्लीहा और यकृत 5,6,7 सहित विशिष्ट ऊतकों या अंगों के लिए लक्षित जलसेक के लिए किया जा सकता है।
रेमाइलिनेशन के अध्ययन में, कई दवाओं को विट्रो में माइलिन पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, लेकिन उनमें से अधिकांश ने विवो में महत्वपूर्ण प्रभाव हासिल नहीं किया है, संभवतः एक उपयुक्त प्रशासन विधि की कमी के कारण। पारंपरिक प्रशासन विधियों जैसे कि इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, चमड़े के नीचे इंजेक्शन, और इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन की दवाओं की जैव उपलब्धता में सीमाएं हैं। इसके अलावा, कुछ दवाओं में खराब रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता होती है, जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक उनकी पहुंच को कम करती है। साथ में, ये सीमाएं एक उपन्यास कुशल वितरण विधि के लिए कॉल करती हैं। मस्तिष्क जलसेक किट के साथ संयोजन में, आसमाटिक पंप रक्त-मस्तिष्क बाधा को बाईपास कर सकते हैं और सीधे कॉर्पस कैलोसम को दवाओं को वितरित कर सकते हैं, जो प्रभावी रूप से दवाओं की जैव उपलब्धता में सुधार करता है, विशेष रूप से कुछ पॉलीपेप्टाइड और प्रोटीन दवाओं के लिए एक छोटे से आधे जीवन के साथ। इसलिए, एक नई दवा वितरण तकनीक के रूप में आसमाटिक पंप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र माइलिन पुनर्जनन अनुसंधान के क्षेत्र में बहुत मूल्यवान है। इस तकनीक के आवेदन को नीचे विस्तार से पेश किया जाएगा।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की पशु कल्याण और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया था।
1. lysolecithin प्रेरित demyelination माउस मॉडल की स्थापना
- बाँझ पीबीएस के साथ 1% लाइसोलेसिथिन (जिसे एल-α-लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलीन भी कहा जाता है) समाधान तैयार करें।
- कैंची, संदंश, घुमावदार हेमोस्टैट, और अन्य सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव नसबंदी द्वारा निष्फल करें। सर्जिकल क्षेत्र को निष्फल करें और बाँझ चादरें बिछाएं। सर्जरी के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और अभिकर्मकों को एसेप्टिक रूप से तैयार किया जाना चाहिए। पूरी प्रक्रिया के दौरान सर्जिकल क्षेत्र को बाँझ रखना महत्वपूर्ण है।
- एक प्रसवोत्तर दिन 56 (P56) C57BL6 माउस निम्नानुसार एनेस्थेटिक करें।
- माउस को छोटे पशु संज्ञाहरण मशीन के आइसोफ्लुरेन कक्ष में रखें। O2 प्रवाह को 300-500 mL/min और isoflurane को 3%-4% तक समायोजित करें। पर्याप्त संज्ञाहरण के बाद, जब माउस धीमी और स्थिर सांस के साथ स्थिर हो जाता है, तो माउस को हीटिंग पैड के साथ स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में स्थानांतरित करें।
- एनेस्थीसिया मास्क के लिए कक्ष से गैस आउटपुट स्विच करें और संज्ञाहरण राज्य में माउस को बनाए रखने के लिए 1% - 1.5% तक आइसोफ्लुरेन को समायोजित करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि माउस पूरी तरह से संवेदनाहारी न हो जाए, दर्द से राहत पाने के लिए केटोप्रोफेन (3 - 5 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। ऑपरेशन से पहले, माउस के पैर की उंगलियों को चुटकी लें और सफल संज्ञाहरण8 की पुष्टि करने के लिए इसकी प्रतिक्रिया की जांच करें।
- जब माउस anesthetized है, तो यह अपने शरीर के तापमान को विनियमित नहीं कर सकता है। इसलिए, सर्जरी के दौरान माउस के शरीर के तापमान की निगरानी और विनियमन करें। संज्ञाहरण के तहत रहते हुए माउस की आंखों को नम रखने के लिए, एरिथ्रोमाइसिन आंख मरहम के साथ आंखों की छतरी की सतह को कवर करें।
- दाँत पट्टी और कान सलाखों के साथ stereotaxic उपकरण में माउस सिर सुरक्षित. (चित्र 1A)।
- सिर के ऊपर से बालों को हटाने के लिए रेजर का उपयोग करें। बीटाडीन के तीन चक्रों और 75% इथेनॉल के साथ सिर की त्वचा को साफ करें। नैतिक चिंताओं के लिए, सर्जरी साइट को छोड़कर पशु शरीर को कवर करें। एक स्केलपेल का उपयोग करके, खोपड़ी को उजागर करने के लिए गर्दन के आधार से आंखों के बीच में त्वचा का 1 सेमी लंबा मध्य-सैगिटल चीरा बनाएं (चित्रा 1 बी)।
- कपाल टांके की कल्पना करने के लिए 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी की सतह को धीरे से पोंछें (चित्रा 1 सी)। लैम्ब्डा बिंदु और ब्रेग्मा बिंदु को एक ही ऊंचाई पर रखने के लिए टूथ बार और कान की सलाखों की ऊंचाई को समायोजित करें (यानी, सुई की नोक बिंदुओं को छूने पर एक ही जेड-अक्ष निर्देशांक के साथ), ताकि सैगिटल सीवन क्षैतिज हो।
- धीरे से माइक्रोलीटर सिरिंज सुई (10 μL, 33 जी) की नोक को ब्रेग्मा बिंदु पर रखें और x, y और z निर्देशांक को 0 (चित्रा 1 D) पर रीसेट करें। सिरिंज को इंजेक्शन साइट पर ले जाएँ (x: 1.04; y: 1.0, यानी, 1.04 मिमी मध्यरेखा के पार्श्व और 1.0 मिमी ब्रैग्मा बिंदु के पीछे) डिजिटल रीडआउट (चित्रा 1E) के संकेत के अनुसार।
- धीरे-धीरे इंजेक्शन साइट पर खोपड़ी के माध्यम से एक छोटे से छेद को ड्रिल करें, बिना 1 एमएल सिरिंज सुई (26 जी, 0.45 मिमी) (चित्रा 1 एफ) के साथ ड्यूरा को भेदने के बिना। धीरे-धीरे छेद के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों में माइक्रोलीटर सिरिंज सुई डालें जब तक कि एक निश्चित गहराई तक नहीं पहुंच जाता है (अधिकांश P56 चूहों के लिए z = -1.62 मिमी) (चित्रा 1 G)।
नोट: अनुभवजन्य रूप से, -1.62 मिमी की सम्मिलन गहराई सुई की नोक को अधिकांश P56 चूहों के कॉर्पस कैलोसम के बीच तक पहुंचने की अनुमति देती है ताकि लाइसोलेसिथिन को सीधे कॉर्पस कैलोसम में वितरित किया जा सके ताकि डिमाइलिनेशन को प्रेरित किया जा सके। - 0.3 μL / मिनट की गति से 1% लाइसोलेसिथिन के 1.5 μL इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन सुई पथ के साथ तरल के रिसाव को रोकने के लिए माइक्रोलीटर सिरिंज को धीरे-धीरे बाहर निकालने से पहले 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- 5-0 सर्जिकल टांके के साथ त्वचा सिलाई (चित्रा 1H).
- शरीर के तापमान में गिरावट से बचने के लिए माउस को हीटिंग पैड पर रखें। दर्द से राहत पाने के लिए हर 24 घंटे में 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन का एक चमड़े के नीचे का इंजेक्शन लगाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि घाव ठीक से ठीक हो जाए, चीरा के लिए हर दिन एरिथ्रोमाइसिन मरहम लागू करें। उस माउस को अकेले पिंजरे में रखें और पूरी तरह से ठीक होने तक इसे नम भोजन के साथ खिलाएं। ऑपरेशन के बाद माउस दैनिक मॉनिटर करें।
चित्र 1: लाइसोलेसिथिन-प्रेरित डिमाइलिनेशन माउस मॉडल की स्थापना। (A) स्टीरियोटेक्सिक उपकरण में माउस को सुरक्षित करें। (बी) खोपड़ी को उजागर करने के लिए एक 1 सेमी मध्य-सैगिटल चीरा खोलें। (c) कपाल टांके की कल्पना करें। (D) Bregma बिंदु पर x, y, और z निर्देशांक को 0 पर रीसेट करें। (ई) सिरिंज को इंजेक्शन साइट पर ले जाएं। (च) इंजेक्शन साइट पर खोपड़ी में एक छेद ड्रिल करें। (जी) मस्तिष्क के ऊतकों में धीरे-धीरे सुई डालें और लाइसोलेसिथिन इंजेक्ट करें। (ज) त्वचा सिलाई. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2. आसमाटिक पंप की तैयारी
नोट:: पंप के प्रमुख घटकों चित्र 2A में दिखाए गए हैं।
- मस्तिष्क में मस्तिष्क जलसेक कैनुला के सम्मिलन की गहराई निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले मस्तिष्क जलसेक कैनुला की सुई 3 मिमी लंबी है और प्रत्येक गहराई-समायोजन स्पेसर 0.5 मिमी है। 1.5 मिमी (कैलोसम के करीब) की इंजेक्शन गहराई प्राप्त करने के लिए, ऊतक चिपकने वाले (चित्रा 2 बी, सी) के साथ मस्तिष्क जलसेक कैनुला की सुई के लिए तीन गहराई-समायोजन स्पेसर्स संलग्न करें।
- आसमाटिक पंप को भरने के लिए, सिरिंज सुई संलग्न करें जो पंप पैकेज के साथ 1 एमएल सिरिंज के साथ आती है और दवा को एस्पिरेट करती है। पंप को सीधा रखें, पंप के शीर्ष पर उद्घाटन में सिरिंज डालें, और धीरे-धीरे दवा को इंजेक्ट करें, बुलबुले9 बनाने के लिए सावधान न रहें ( चित्रा 2 डी देखें)। जब तरल उद्घाटन से बाहर बहता है, तो धीरे-धीरे सिरिंज को बाहर निकालें।
- कैंची या प्लायर के साथ प्रवाह नियामक से सफेद निकला हुआ किनारा निकालें, जो प्रवाह मॉडरेटर को मोड़ने या कुचलने के लिए सावधान नहीं है। उसके बाद, प्रवाह मॉडरेटर को पंप में डालें (चित्रा 2E)। यह निर्धारित करने के लिए कि आसमाटिक पंप में बुलबुले हैं या नहीं, भरने से पहले और बाद में आसमाटिक पंप को अलग से तौलें।
- कैथेटर को जानवर के आकार के अनुसार एक निश्चित लंबाई तक ट्रिम करें (P56 चूहों के लिए 20-25 मिमी कैथेटर जिनका वजन लगभग 25 ग्राम है)। कैथेटर को मस्तिष्क जलसेक कैनुला से जोड़ें।
- हवा को पेश किए बिना सिरिंज का उपयोग करके दवाओं के साथ कैथेटर को भरें (चित्रा 2 एफ)।
- कैथेटर को प्रवाह मॉडरेटर से कनेक्ट करें। अनुलग्नक के बाद, सुनिश्चित करें कि कैथेटर उजागर प्रवाह मॉडरेटर (चित्रा 2 जी) के बारे में 4 मिमी को कवर करता है।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि आसमाटिक पंप आरोपण के तुरंत बाद काम कर सकता है, कम से कम 4 से 6 ज (अधिमानतः रात भर तक विस्तारित) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 0.9% खारा या पीबीएस में भरे हुए पंपों को विसर्जित करें ताकि पंप की सतह पर अर्ध-पारगम्य झिल्ली को पूर्व-गीला किया जा सके, जिसमें ऊतक पर्यावरण के समान आसमाटिक दबाव होता है (चित्रा 2 एच)।
- पंपों में लोड किए गए सभी समाधान बाँझ होने चाहिए। ALZET पंपों बाँझ की आपूर्ति कर रहे हैं, 60Co की एक sterilizing खुराक के संपर्क में किया गया है. हालांकि, यदि बाहरी संदूषण होता है, तो पंप की सतह को आइसोप्रोपिल अल्कोहल (पानी में 70%) के साथ पोंछकर साफ किया जा सकता है।
चित्रा 2: आसमाटिक पंप की तैयारी। (ए) आसमाटिक पंप के प्रमुख घटक। (B, C) मस्तिष्क जलसेक प्रवेशनी की सुई के लिए गहराई-समायोजन स्पेसर संलग्न करें। (डी) एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके आसमाटिक पंप भरें। (ई) प्रवाह मॉडरेटर को पंप में डालें। (एफ) सिरिंज का उपयोग करके कैथेटर को भरें। (जी) कैथेटर को प्रवाह मॉडरेटर से कनेक्ट करें। (एच) 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 0.9% खारा या पीबीएस में भरे हुए पंपों को विसर्जित करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. आसमाटिक पंप का आरोपण
- कॉर्पस कैलोसम डिमाइलिनेशन मॉडल की स्थापना के बाद 3 दिनों तक प्रतीक्षा करें। छोटे पशु संज्ञाहरण प्रणाली को चालू करें। कैंची, चिमटी, और हेमोस्टैटिक प्लायर को कीटाणुरहित करें और उन्हें 75% अल्कोहल समाधान में भिगोएं। सर्जिकल क्षेत्र में बाँझ चादरें बिछाएं।
- Anesthetize और स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर चूहों को फिर से सुरक्षित. सूखापन को रोकने के लिए आंखों के मरहम के साथ नेत्रगोलक की सतह को कवर करें।
- 75% अल्कोहल के साथ मूल घाव कीटाणुरहित करें। सर्जिकल चीरा खोलें जिसे पहले सिला गया था (चित्रा 3 ए) और कंधे के ब्लेड (चित्रा 3 बी) में चीरा का विस्तार करें।
- एक गुहा खोलने के लिए स्कैपुला में हेमोस्टेटिक प्लायर या चिमटी के साथ चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक से त्वचा को अलग करें (चित्रा 3 सी)। आसमाटिक पंप को गुहा में रखें (चित्रा 3 डी, ई)।
- एक कपास झाड़ू के साथ, धीरे से पोंछें और खोपड़ी की सतह पर पिनहोल को उजागर करें जब डिमाइलिनेशन मॉडल की स्थापना करते समय बनाई गई (चरण 1.8 देखें)। इस पिनहोल के माध्यम से मस्तिष्क जलसेक कैनुला को लंबवत रूप से डालें और इसे ऊतक चिपकने वाले (चित्रा 3 एफ) के साथ खोपड़ी पर जल्दी से सुरक्षित करें।
- कैंची की एक जोड़ी के साथ मस्तिष्क जलसेक कैनुला के ऊपर हटाने योग्य टैब को हटा दें (चित्रा 3 जी, एच)। वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया में मिलाने से बचने के लिए कैनुला डालने से पहले टैब को पहले हटा दें।
- चीरा सिलाई या ऊतक चिपकने वाला (चित्रा 3I) के साथ इसे संलग्न करें।
- सर्जरी के बाद, शरीर के तापमान में गिरावट से बचने के लिए माउस को हीटिंग पैड पर रखें। दर्द से राहत पाने के लिए हर 24 घंटे में 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन का एक चमड़े के नीचे का इंजेक्शन लगाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि घाव ठीक से ठीक हो जाए, चीरा के लिए हर दिन एरिथ्रोमाइसिन मरहम लागू करें। जानवर को अकेले पिंजरे में रखें और पूरी तरह से ठीक होने तक नम भोजन के साथ खिलाएं। हर दिन चूहों की निगरानी करें और जांचें कि मस्तिष्क जलसेक कैनुला दृढ़ता से जुड़ा हुआ था या नहीं।
- सर्जरी के 11 दिनों के बाद माउस को 150-200 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल सोडियम इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करके माउस को यूथेनाइज़ करें, इसके बाद 4% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से परफ्यूजिंग किया जाता है।
- यह सत्यापित करने के लिए कि समाधान सामान्य रूप से वितरित किया जाता है, आसमाटिक पंप को ध्यान से हटा दें और मस्तिष्क विच्छेदन से पहले पंप जलाशय में अवशिष्ट मात्रा को मापें।
- अवशिष्ट मात्रा को मापने के लिए, मस्तिष्क जलसेक कैनुला को हटा दें, कैथेटर में 1 एमएल सिरिंज संलग्न करें, और फिर इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए शेष समाधान को एस्पिरेट करें। सैद्धांतिक अवशिष्ट मात्रा के लिए वास्तविक अवशिष्ट मात्रा की तुलना करें (प्रारंभिक मात्रा - मतलब पंपिंग दर * जलसेक अवधि)।
नोट: अत्यधिक अवशिष्ट मात्रा असफल जलसेक को इंगित करती है, जो कैथेटर रोड़ा या पंप खराबी के कारण हो सकती है।
- अवशिष्ट मात्रा को मापने के लिए, मस्तिष्क जलसेक कैनुला को हटा दें, कैथेटर में 1 एमएल सिरिंज संलग्न करें, और फिर इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए शेष समाधान को एस्पिरेट करें। सैद्धांतिक अवशिष्ट मात्रा के लिए वास्तविक अवशिष्ट मात्रा की तुलना करें (प्रारंभिक मात्रा - मतलब पंपिंग दर * जलसेक अवधि)।
चित्रा 3: आसमाटिक पंप का आरोपण। (ए) सर्जिकल चीरा खोलें। (बी) कंधे ब्लेड के लिए चीरा का विस्तार करें। (सी) एक गुहा बनाने के लिए चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक से त्वचा को अलग करें। (D,E) आसमाटिक पंप को गुहा में रखें। (एफ) खोपड़ी की सतह पर पिनहोल में मस्तिष्क जलसेक कैनुला डालें और इसे खोपड़ी पर दृढ़ता से सुरक्षित करें। (G,H) हटाने योग्य टैब को कैनुला से निकालें. (I) चीरा सिलाई. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Representative Results
माइलिन पुनर्जनन अनुसंधान में आसमाटिक पंप के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, P56 चूहों में एक लाइसोलेसिथिन-प्रेरित डिमाइलिनेशन मॉडल बनाया गया था, जिसके बाद यूएम 206 (1.5 मिलीलीटर 0.9% खारा में 1 मिलीग्राम) वाले आसमाटिक पंपों का आरोपण किया गया था, एक छोटे से आधे जीवन और खराब बीबीबी पारगम्यता के साथ एक पेप्टाइड जिसे हाल ही में रिमाइलिनेशन10 को बढ़ावा देने के लिए रिपोर्ट किया गया है। . 0.9% खारा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। मॉडल स्थापना के चौदह दिनों के बाद, चूहों को सेक्शनिंग के लिए दिमाग को अलग करने के लिए 4% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से परफ्यूज किया गया था, इसके बाद रिमाइलिनेशन स्तर का मूल्यांकन करने के लिए सीटू संकरण और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में।
DAPI के दाग ने सफेद पदार्थ के ठीक ऊपर मस्तिष्क के ऊतकों में पिनहोल का खुलासा किया, जो आसमाटिक पंप (चित्रा 4 ए) के मस्तिष्क जलसेक कैनुला के सफल आरोपण का संकेत देता है। इन-सीटू संकरण प्रयोग में, परिपक्व ओलिगोडेंड्रोसाइट्स मार्कर एमएजी जांच का उपयोग नए विभेदित ओलिगोडेंड्रोसाइट्स को लेबल करने के लिए किया गया था जैसा कि पिछले अध्ययनों10,11,12 में दिखाया गया है। परिणामों से पता चला है कि UM206 उपचार ने नियंत्रण समूह (चित्रा 4B) की तुलना में डिमाइलिनेटेड क्षेत्र में अधिक MAG-सकारात्मक कोशिकाओं को उत्पन्न किया। डिमाइलिनेटेड क्षेत्र के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से यह भी पता चला है कि नियंत्रण समूह (चित्रा 4 सी) की तुलना में यूएम 206 उपचार समूह में माइलिनेटेड अक्षतंतुओं की संख्या में वृद्धि हुई थी, यह सुझाव देते हुए कि यूएम 206 ने उच्च स्तर के रिमाइलिनेशन को प्रेरित किया। इन परिणामों से पता चलता है कि आसमाटिक पंप कुशलतापूर्वक remyelination अनुसंधान में कॉर्पस callosum करने के लिए दवाओं को वितरित कर सकते हैं।
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम. (ए) DAPI-सना हुआ टुकड़ा की प्रतिनिधि छवि मस्तिष्क के ऊतकों में पिनहोल दिखा रही है। स्केल बार: 1,000 μm. (बी) प्रतिनिधि छवियों demyelinated क्षेत्र में MAG के सीटू संकरण में दिखा के रूप में DAPI धुंधला द्वारा दिखाया गया है. UM206 उपचार ने MAG-लेबल वाले oligodendrocytes की संख्या में वृद्धि की। स्केल बार: 100 μm. (C) demyelinated क्षेत्र के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों. UM206 उपचार माइलिनेटेड अक्षतंतुओं की संख्या में वृद्धि हुई। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल माइलिन पुनर्जनन अनुसंधान के लिए एक उपन्यास दवा वितरण तकनीक के रूप में आसमाटिक पंप का वर्णन करता है, जो सीधे उपचार स्थल पर दवाओं को वितरित कर सकता है और लंबे समय तक लगातार दवा वितरण की अनुमति दे सकता है, जिससे पूरे प्रयोगात्मक अवधि में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सूक्ष्म वातावरण में एक स्थिर दवा एकाग्रता पैदा हो सकती है। अन्य दवा वितरण विधियों की तुलना में, आसमाटिक पंप डिमाइलिनेशन घाव13 में दवा की एकाग्रता को बनाए रखने के लिए अधिक अनुकूल है। उदाहरण के लिए, कुछ न्यूरोट्रॉफिक कारकों के लिए, घाव स्थल पर दवा की कम एकाग्रता के कारण प्रणालीगत दवा कोई प्रभाव प्राप्त नहीं कर सकती है। लेकिन अगर खुराक में वृद्धि हुई है, तो दुष्प्रभाव अधिक महत्वपूर्णहोंगे 14। ऐसे मामलों में, एक आसमाटिक पंप के माध्यम से एक विशिष्ट साइट को प्रशासित करने से परिधीय दुष्प्रभावों को प्रभावी ढंग से कम किया जा सकताहै। इसके अलावा, कई माइलिन पुनर्जनन से संबंधित दवाओं में खराब रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) पारगम्यता होती है या प्रोटियोलिटिक गिरावट की संवेदनशीलता के कारण विवो आधे जीवन में एक छोटा सा प्रदर्शन होता है। इन समस्याओं को आसमाटिक पंपों द्वारा अच्छी तरह से संबोधित किया जा सकता है।
हालांकि, आसमाटिक पंप विधि चेतावनी और सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले, एक आक्रामक दवा वितरण प्रणाली होने के नाते, यह अनिवार्य रूप से मस्तिष्क के ऊतकों की क्षति और मस्तिष्क जलसेक कैनुला सम्मिलन साइट पर न्यूरोइन्फ्लेमेशन का कारण बनता है, जो दवाओं के प्रभाव को अस्पष्ट कर सकता है। इस प्रकार, एक उचित विलायक-केवल नियंत्रण समूह स्थापित किया जाना चाहिए। दूसरा, कुछ दवाओं को भंग करने के लिए डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), एन-मिथाइल -2-पाइरोलिडोन (एनएमपी) जैसे सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है, लेकिन ये सॉल्वैंट्स जलाशय सामग्री के साथ असंगत हैं और पंपों की महत्वपूर्ण विफलता का कारण बन सकते हैं। उदाहरण के लिए, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) और PEG400 की उच्च सांद्रता को पंप रिलीज को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और आसमाटिक पंपों16,17,18 में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। तीसरा, दवाएं जो 37 डिग्री सेल्सियस पर अस्थिर हैं, आसमाटिक पंप का उपयोग करके दीर्घकालिक जलसेक के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। इन सभी मुद्दों पर ध्यान देने योग्य हैं यदि आसमाटिक पंप को लागू करने की योजना बना रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल में कई चरणों को प्रयोगों के दौरान अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है। आसमाटिक पंपों के सामान्य संचालन के लिए, शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि आसमाटिक पंप को सही ढंग से इकट्ठा किया गया है और पंप में कोई बुलबुला पेश नहीं किया गया है, जो अन्यथा जलसेक दक्षता को बहुत कमजोर कर देगा। इसके अलावा, कैथेटर रोड़ा या आसमाटिक पंप की खराबी जलसेक विफलता19 का कारण बन सकती है, जिसे प्रयोग के बाद पंप जलाशय में अवशिष्ट मात्रा के माप द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। छोटे मस्तिष्क के आकार के साथ छोटे चूहों में आसमाटिक पंप के आवेदन के लिए, सम्मिलन की एक उपयुक्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण प्रयोग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, मस्तिष्क जलसेक कैनुला को जलसेक के दौरान अपने आंदोलन को कम करने के लिए खोपड़ी पर दृढ़ता से सुरक्षित किया जाना चाहिए।
वर्तमान में, कई इन विट्रो अध्ययनों में विभिन्न प्रकार की दवाएं पाई गई हैं जो माइलिन पुनर्जनन को बढ़ावा दे सकती हैं, लेकिन खराब बीबीबी पारगम्यता, कम आधे जीवन और अन्य समस्याओं के कारण, इन दवाओं को विवो में सफलतापूर्वक मान्य करना मुश्किल है। इसलिए, आसमाटिक पंप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र माइलिन पुनर्जनन अनुसंधान के क्षेत्र में बहुत मूल्यवान है, विशेष रूप से उन दवाओं के लिए एक छोटे से आधे जीवन, खराब बीबीबी पारगम्यता और स्पष्ट परिधीय दुष्प्रभावों के साथ प्रासंगिक है।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (NSFC 32070964, 31871045) से जे.एन. और शेन्ज़ेन बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (JCYJ20210324121214039) से वाई.एस. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
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