Summary
La demielinizzazione avviene in più malattie del sistema nervoso centrale. Una tecnica affidabile di somministrazione di farmaci in vivo è necessaria per i test antidroga rimielinizzanti. Questo protocollo descrive un metodo basato su pompa osmotica che consente la somministrazione di farmaci a lungo termine direttamente nel parenchima cerebrale e migliora la biodisponibilità del farmaco, con ampia applicazione nella ricerca sulla rimielinizzazione.
Abstract
La demielinizzazione è stata identificata non solo nella sclerosi multipla (SM), ma anche in altre malattie del sistema nervoso centrale come il morbo di Alzheimer e l'autismo. Poiché l'evidenza suggerisce che la rimielinizzazione può migliorare efficacemente i sintomi della malattia, c'è una crescente attenzione allo sviluppo di farmaci per promuovere il processo di rigenerazione della mielina. Pertanto, è necessaria una tecnica di somministrazione di farmaci selezionabile a livello regionale e affidabile in termini di risultati per testare l'efficienza e la specificità di questi farmaci in vivo. Questo protocollo introduce l'impianto della pompa osmotica come un nuovo approccio di somministrazione del farmaco nel modello murino di demielinizzazione indotta da lisolecitina. La pompa osmotica è un piccolo dispositivo impiantabile in grado di bypassare la barriera emato-encefalica (BBB) e fornire farmaci in modo costante e diretto ad aree specifiche del cervello del topo. Può anche migliorare efficacemente la biodisponibilità di farmaci come peptidi e proteine con una breve emivita. Pertanto, questo metodo è di grande valore per il campo della ricerca sulla rigenerazione della mielina del sistema nervoso centrale.
Introduction
La pompa osmotica è un piccolo dispositivo impiantabile per il rilascio di soluzioni. Può essere utilizzato per la consegna sistemica quando impiantato per via sottocutanea o nella cavità addominale. La superficie della pompa osmotica è una membrana semipermeabile e il suo lato interno è uno strato permeabile. La pompa osmotica funziona utilizzando la differenza di pressione osmotica tra lo strato osmotico e l'ambiente tissutale in cui viene impiantata la pompa. L'elevata osmolalità dello strato osmotico fa fluire l'acqua nel tessuto nello strato osmotico attraverso la membrana semipermeabile sulla superficie della pompa. Lo strato osmotico si espande e comprime il serbatoio flessibile all'interno della pompa, spostando così la soluzione dal serbatoio flessibile ad una certa velocità per una lunga durata1. La pompa ha tre diversi volumi di serbatoio, 100 μL, 200 μL e 2 mL, con velocità di mandata variabili da 0,11 μL/h a 10 μL/h. A seconda del tipo di pompa selezionato, il dispositivo può funzionare da 1 giorno a 6 settimane2. In questo protocollo viene utilizzata una pompa osmotica da 100 μL con una velocità di trasferimento di 0,25 μL/h che può funzionare per 14 giorni.
Nel 1970, la pompa osmotica era stata utilizzata nella ricerca neuroscientifica 3,4. Ad esempio, Wei et al. hanno adottato l'approccio della pompa osmotica per iniettare peptidi oppioidi nel ventricolo in uno studio sulla tossicodipendenza3. Dopo il miglioramento continuo, la pompa osmotica è stata ora utilizzata nello studio della somministrazione controllata di migliaia di farmaci, tra cui peptidi, fattori di crescita, farmaci che creano dipendenza, ormoni, steroidi, anticorpi e così via. Inoltre, con cateteri speciali (Brain Infusion Kits) collegati, può essere utilizzato per infusioni mirate a tessuti o organi specifici, tra cui il midollo spinale, il cervello, la milza e il fegato 5,6,7.
Nello studio della rimielinizzazione, molti farmaci hanno dimostrato di promuovere la rigenerazione della mielina in vitro, ma la maggior parte di essi non ha ottenuto effetti significativi in vivo, probabilmente a causa della mancanza di un metodo di somministrazione appropriato. I metodi di somministrazione tradizionali come l'iniezione intraperitoneale, l'iniezione sottocutanea e la somministrazione intragastrica hanno limitazioni nella biodisponibilità dei farmaci. Inoltre, alcuni farmaci hanno una scarsa permeabilità alla barriera emato-encefalica, che mina il loro accesso al parenchima cerebrale. Insieme, queste limitazioni richiedono un nuovo metodo di consegna efficiente. In combinazione con i kit di infusione cerebrale, le pompe osmotiche possono bypassare la barriera emato-encefalica e fornire farmaci direttamente al corpo calloso, il che migliora efficacemente la biodisponibilità dei farmaci, specialmente per alcuni polipeptidi e farmaci proteici con una breve emivita. Pertanto, la pompa osmotica come nuova tecnica di somministrazione di farmaci è di grande valore per il campo della ricerca sulla rigenerazione della mielina del sistema nervoso centrale. L'applicazione di questa tecnica sarà introdotta in dettaglio di seguito.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo linee guida e protocolli istituzionali approvati dal comitato per il benessere degli animali e l'etica della Terza Università Medica Militare.
1. Istituzione del modello murino di demielinizzazione indotta da lisolecitina
- Preparare la soluzione di lysolecitina all'1% (chiamata anche L-α-Lysophosphatidylcholine) con PBS sterile.
- Sterilizzare forbici, pinze, emostato curvo e altri strumenti chirurgici mediante sterilizzazione in autoclave. Sterilizzare l'area chirurgica e stendere fogli sterili. Tutti i materiali e i reagenti utilizzati per la chirurgia devono essere preparati in modo asettico. È importante mantenere l'area chirurgica sterile durante tutta la procedura.
- Anestetizzare un topo C57BL6 del giorno postnatale 56 (P56) come segue.
- Posizionare il mouse nella camera isoflurano della macchina per anestesia di piccoli animali. Regolare il flusso O2 a 300-500 ml/min e l'isoflurano al 3%-4%. Dopo un'anestesia sufficiente, quando il mouse diventa immobile con un respiro lento e stabile, trasferire il mouse all'apparato stereotassico con una piastra riscaldante.
- Commutare l'uscita del gas dalla camera alla maschera di anestesia e regolare l'isoflurano all'1% - 1,5% per mantenere il mouse nello stato di anestesia. Attendere che il topo sia completamente anestetizzato, iniettare ketoprofene (3 – 5 mg / kg) per via intraperitoneale per alleviare il dolore. Prima dell'operazione, pizzicare le dita dei piedi del mouse e controllare la sua reazione per confermare l'anestesia8 riuscita.
- Quando il mouse viene anestetizzato, non può regolare la sua temperatura corporea. Pertanto, monitorare e regolare la temperatura corporea del topo durante l'intervento chirurgico. Per mantenere umidi i bulbi oculari del topo durante l'anestesia, coprire la superficie dei bulbi oculari con unguento oculare all'eritromicina.
- Fissare la testa del mouse nell'apparecchio stereotassico con barra dei denti e barre auricolari. (Figura 1A).
- Usa un rasoio per rimuovere i peli dalla parte superiore della testa. Igienizzare la pelle della testa con tre cicli di betadina e etanolo al 75%. Per motivi etici, coprire il corpo animale ad eccezione del sito chirurgico. Usando un bisturi, fare un'incisione medio-sagittale lunga 1 cm della pelle dalla base del collo a tra gli occhi per esporre il cranio (Figura 1B).
- Pulire delicatamente la superficie del cranio con un batuffolo di cotone sterile contenente il 30% di perossido di idrogeno per visualizzare le suture craniche (Figura 1C). Regolare l'altezza della barra dei denti e delle barre auricolari per posizionare il punto lambda e il punto bregma alla stessa altezza (cioè con le stesse coordinate dell'asse z quando la punta dell'ago tocca i punti), in modo che la sutura sagittale sia orizzontale.
- Posizionare delicatamente la punta dell'ago della siringa microlitri (10 μL, 33 G) nel punto bregma e ripristinare le coordinate x, y e z su 0 (Figura 1D). Spostare la siringa sul sito di iniezione (x: 1,04; y: 1,0, cioè 1,04 mm lateralmente alla linea mediana e 1,0 mm posteriore al punto bregma) secondo il prompt della lettura digitale (Figura 1E).
- Praticare lentamente un piccolo foro di bava attraverso il cranio nel sito di iniezione senza penetrare nella dura con un ago per siringa da 1 mL (26 G, 0,45 mm) (Figura 1F). Inserire lentamente l'ago della siringa del microlitro nel tessuto cerebrale attraverso il foro fino a raggiungere una certa profondità (z = -1,62 mm per la maggior parte dei topi P56) (Figura 1G).
NOTA: Empiricamente, la profondità di inserimento di -1,62 mm consente alla punta dell'ago di raggiungere il centro del corpo calloso della maggior parte dei topi P56 in modo che la lisolecitina possa essere consegnata direttamente nel corpo calloso per indurre demielinizzazione. - Iniettare 1,5 μL di 1% di linfosolecitina ad una velocità di 0,3 μL/min. Dopo l'iniezione, attendere 5 minuti prima di estrarre lentamente la siringa del microlitro per evitare la fuoriuscita di liquido lungo il percorso dell'ago di iniezione.
- Cucire la pelle con suture chirurgiche 5-0 (Figura 1H).
- Posizionare il mouse su una piastra riscaldante per evitare un calo della temperatura corporea. Somministrare un'iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene ogni 24 ore per alleviare il dolore. Applicare l'unguento all'eritromicina sull'incisione ogni giorno per garantire che la ferita guarisca correttamente. Metti il topo che ha subito un intervento chirurgico in una gabbia da solo e nutrilo con cibo umido fino a completo recupero. Monitorare il mouse ogni giorno dopo l'operazione.
Figura 1: Istituzione del modello murino di demielinizzazione indotta dalla lisolecitina. (A) Fissare il mouse nell'apparato stereotassico. (B) Aprire un'incisione medio-sagittale di 1 cm per esporre il cranio. (C) Visualizzare le suture craniche. (D) Reimpostare le coordinate x, y e z su 0 sul punto di Bregma. (E) Spostare la siringa nel sito di iniezione. (F) Praticare un foro nel cranio nel sito di iniezione. (G) Inserire lentamente l'ago nel tessuto cerebrale e iniettare lysolecitina. (H) Cucire la pelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Preparazione della pompa osmotica
NOTA: i componenti chiave della pompa sono mostrati nella Figura 2A.
- Determinare la profondità di inserimento della cannula di infusione cerebrale nel cervello. Assicurarsi che l'ago della cannula per infusione cerebrale utilizzata sia lungo 3 mm e che ogni distanziatore di regolazione della profondità sia di 0,5 mm. Per ottenere una profondità di iniezione di 1,5 mm (vicino al calloso), collegare tre distanziatori di regolazione della profondità all'ago della cannula per infusione cerebrale con adesivo tissutale (Figura 2B, C).
- Per riempire la pompa osmotica, collegare l'ago della siringa fornito con la confezione della pompa a una siringa da 1 mL e aspirare il farmaco. Tenere la pompa in posizione verticale, inserire la siringa nell'apertura nella parte superiore della pompa e iniettare lentamente il farmaco, facendo attenzione a non creare bolle9 (vedere Figura 2D). Quando il liquido fuoriesce dall'apertura, estrarre lentamente la siringa.
- Rimuovere la flangia bianca dal regolatore di flusso con forbici o pinze facendo attenzione a non piegare o schiacciare il moderatore di flusso. Quindi, inserire il moderatore di flusso nella pompa (Figura 2E). Per determinare se ci sono bolle nella pompa osmotica, pesare la pompa osmotica separatamente prima e dopo il riempimento.
- Tagliare il catetere a una certa lunghezza in base alle dimensioni dell'animale (cateteri da 20-25 mm per topi P56 che pesano circa 25 g). Attaccare il catetere alla cannula dell'infusione cerebrale.
- Riempire il catetere con farmaci usando la siringa senza introdurre aria (Figura 2F).
- Collegare il catetere al moderatore del flusso. Dopo il fissaggio, assicurarsi che il catetere copra circa 4 mm del moderatore di flusso esposto (Figura 2G).
- Per garantire che la pompa osmotica possa funzionare immediatamente dopo l'impianto, immergere le pompe riempite in soluzione salina sterile allo 0,9% o PBS a 37 °C per almeno 4-6 ore (preferibilmente estendere fino a notte) per pre-bagnare la membrana semipermeabile sulla superficie della pompa con soluzioni che hanno la stessa pressione osmotica dell'ambiente tissutale (Figura 2H).
- Tutte le soluzioni caricate nelle pompe devono essere sterili. Le pompe ALZET vengono fornite sterili, essendo state esposte ad una dose sterilizzante di 60Co. Tuttavia, se si verifica una contaminazione esterna, la superficie della pompa può essere pulita pulendola con alcool isopropilico (70% in acqua).
Figura 2: Preparazione della pompa osmotica. (A) Componenti chiave della pompa osmotica. (B,C) Attaccare distanziali di regolazione della profondità all'ago della cannula per infusione cerebrale. (D) Riempire la pompa osmotica utilizzando una siringa da 1 mL. (E) Inserire il moderatore di flusso nella pompa. (F) Riempire il catetere usando la siringa. (G) Collegare il catetere al moderatore del flusso. (H) Immergere le pompe riempite in soluzione salina sterile allo 0,9% o PBS a 37 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Impianto della pompa osmotica
- Attendere 3 giorni dopo l'istituzione del modello di demielinizzazione del corpo calloso. Accendere il sistema di anestesia per piccoli animali. Disinfettare forbici, pinzette e pinze emostatiche e immergerle in una soluzione alcolica al 75%. Posare fogli sterili nell'area chirurgica.
- Anestetizzare e fissare nuovamente i topi sull'apparato stereotassico. Coprire la superficie dei bulbi oculari con un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
- Disinfettare la ferita originale con alcol al 75%. Aprire l'incisione chirurgica precedentemente cucita (Figura 3A) ed espandere l'incisione alle scapole (Figura 3B).
- Separare la pelle dal tessuto connettivo sottocutaneo con pinze emostatiche o pinzette alla scapola per aprire una cavità (Figura 3C). Posizionare la pompa osmotica nella cavità (Figura 3D,E).
- Con un batuffolo di cotone, pulire delicatamente ed esporre il foro stenopeico sulla superficie del cranio creato quando si stabilisce il modello di demielinizzazione (vedere il passaggio 1.8). Inserire la cannula per infusione cerebrale attraverso questo foro stenopeico perpendicolarmente e fissarla rapidamente sul cranio con adesivo tissutale (Figura 3F).
- Rimuovere la linguetta rimovibile sopra la cannula per infusione cerebrale con un paio di forbici (Figura 3G, H). In alternativa, rimuovere la linguetta prima di inserire la cannula per evitare di scuotere in questo processo.
- Cucire l'incisione o attaccarla con adesivo tissutale (Figura 3I).
- Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su una piastra riscaldante per evitare un calo della temperatura corporea. Somministrare un'iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene ogni 24 ore per alleviare il dolore. Applicare l'unguento all'eritromicina sull'incisione ogni giorno per garantire che la ferita guarisca correttamente. Metti l'animale in una gabbia da solo e nutriti con cibo umido fino a completo recupero. Monitorare i topi ogni giorno e verificare se la cannula per infusione cerebrale era saldamente attaccata.
- Eutanasia del topo 11 giorni dopo l'intervento chirurgico iniettando 150-200 mg/kg di Pentobarbital sodico per via intraperitoneale seguita da perfondendo transcardialmente con il 4% di formaldeide.
- Per verificare che la soluzione venga erogata normalmente, rimuovere con attenzione la pompa osmotica e misurare il volume residuo nel serbatoio della pompa prima della dissezione cerebrale.
- Per misurare il volume residuo, rimuovere la cannula dell'infusione cerebrale, collegare una siringa da 1 mL al catetere e quindi aspirare la soluzione rimanente per determinarne il volume. Confrontare il volume residuo effettivo con il volume residuo teorico (volume iniziale - velocità media di pompaggio * durata dell'infusione).
NOTA: un volume residuo eccessivo indica un'infusione non riuscita, che potrebbe essere dovuta all'occlusione del catetere o al malfunzionamento della pompa.
- Per misurare il volume residuo, rimuovere la cannula dell'infusione cerebrale, collegare una siringa da 1 mL al catetere e quindi aspirare la soluzione rimanente per determinarne il volume. Confrontare il volume residuo effettivo con il volume residuo teorico (volume iniziale - velocità media di pompaggio * durata dell'infusione).
Figura 3: Impianto della pompa osmotica. (A) Aprire l'incisione chirurgica. (B) Espandere l'incisione alle scapole. (C) Separare la pelle dal tessuto connettivo sottocutaneo per creare una cavità. (D,E) Posizionare la pompa osmotica nella cavità. (F) Inserire la cannula per infusione cerebrale nel foro stenopeico sulla superficie del cranio e fissarla saldamente sul cranio. (G,H) Rimuovere la linguetta rimovibile dalla cannula. (I) Cucire l'incisione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Per verificare l'effetto della pompa osmotica nella ricerca sulla rigenerazione della mielina, è stato creato un modello di demielinizzazione indotta da lisolecitina nei topi P56, seguito dall'impianto di pompe osmotiche contenenti UM206 (1 mg in 1,5 ml 0,9% di soluzione salina), un peptide con una breve emivita e scarsa permeabilità BBB che è stato recentemente segnalato per promuovere la rimielinizzazione10 . Lo 0,9% di soluzione salina è stato utilizzato come controllo. Quattordici giorni dopo la creazione del modello, i topi sono stati perfusi transcardialmente con il 4% di formaldeide per isolare il cervello per il sezionamento, seguiti dall'ibridazione in situ e dalla microscopia elettronica a trasmissione per valutare il livello di rimielinizzazione.
La colorazione di DAPI ha rivelato il foro stenopeico nel tessuto cerebrale appena sopra la sostanza bianca, indicando il successo dell'impianto della cannula di infusione cerebrale della pompa osmotica (Figura 4A). Nell'esperimento di ibridazione in situ, la sonda MAG del marcatore di oligodendrociti maturi è stata utilizzata per etichettare oligodendrociti di nuova differenziazione, come mostrato in studi precedenti 10,11,12. I risultati hanno mostrato che il trattamento UM206 ha prodotto più cellule MAG-positive nella regione demielinizzata rispetto al gruppo di controllo (Figura 4B). La microscopia elettronica a trasmissione della regione demielinizzata ha anche mostrato che il numero di assoni mielinizzati era aumentato nel gruppo di trattamento UM206 rispetto al gruppo di controllo (Figura 4C), suggerendo che UM206 induceva un livello più elevato di rimielinizzazione. Questi risultati mostrano che la pompa osmotica può fornire in modo efficiente farmaci al corpo calloso nella ricerca sulla rimielinizzazione.
Figura 4: Risultati rappresentativi. (A) Immagine rappresentativa della fetta macchiata di DAPI che mostra il foro stenopeico nel tessuto cerebrale. Barra di scala: 1.000 μm. (B) Immagini rappresentative che mostrano l'ibridazione in situ di MAG nella regione demielinizzata come mostrato dalla colorazione DAPI. Il trattamento con UM206 ha aumentato il numero di oligodendrociti marcati con MAG. Barra di scala: 100 μm. (C) Immagini rappresentative al microscopio elettronico a trasmissione della regione demielinizzata. Il trattamento con UM206 ha aumentato il numero di assoni mielinizzati. Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive la pompa osmotica come una nuova tecnica di somministrazione di farmaci per la ricerca sulla rigenerazione della mielina, che può fornire farmaci direttamente al sito di trattamento e consentire la somministrazione costante di farmaci per un periodo prolungato, creando una concentrazione stabile di farmaco nel microambiente del sistema nervoso centrale per l'intera durata sperimentale. Rispetto ad altri metodi di somministrazione del farmaco, la pompa osmotica è più favorevole al mantenimento della concentrazione del farmaco nella lesione demielinizzante13. Ad esempio, per alcuni fattori neurotrofici, i farmaci sistemici non possono ottenere alcun effetto a causa della bassa concentrazione del farmaco nel sito della lesione. Ma se il dosaggio è aumentato, gli effetti collaterali saranno più significativi14. In questi casi, la somministrazione a un sito specifico attraverso una pompa osmotica può ridurre efficacemente gli effetti collaterali periferici15. Inoltre, molti farmaci correlati alla rigenerazione della mielina hanno una scarsa permeabilità alla barriera emato-encefalica (BBB) o mostrano una breve emivita in vivo a causa della suscettibilità alla degradazione proteolitica. Questi problemi potrebbero essere ben affrontati dalle pompe osmotiche.
Tuttavia, il metodo della pompa osmotica non è privo di avvertimenti e limitazioni. In primo luogo, essendo un sistema di somministrazione di farmaci invasivo, provoca inevitabilmente danni al tessuto cerebrale e neuroinfiammazione nel sito di inserimento della cannula per infusione cerebrale, che potrebbe oscurare l'effetto dei farmaci. Pertanto, è necessario istituire un adeguato gruppo di controllo solo solvente. In secondo luogo, alcuni farmaci richiedono solventi come il dimetilsolfossido (DMSO), N-metil-2-pirrolidone (NMP) per dissolversi, ma questi solventi sono incompatibili con il materiale del serbatoio e possono causare un guasto significativo delle pompe. Ad esempio, alte concentrazioni di dimetilsolfossido (DMSO) e PEG400 hanno dimostrato di influenzare negativamente il rilascio della pompa e potrebbero non essere adatte per l'uso in pompe osmotiche 16,17,18. In terzo luogo, i farmaci che sono instabili a 37 °C potrebbero non essere adatti per l'infusione a lungo termine utilizzando la pompa osmotica. Tutti questi problemi sono degni di attenzione se si prevede di applicare la pompa osmotica.
Diversi passaggi in questo protocollo richiedono un'attenzione particolare durante gli esperimenti. Per il normale funzionamento delle pompe osmotiche, i ricercatori devono assicurarsi che la pompa osmotica sia assemblata correttamente e che nessuna bolla venga introdotta nella pompa, il che altrimenti minerebbe notevolmente l'efficienza di infusione. Inoltre, l'occlusione del catetere o il malfunzionamento della pompa osmotica possono causare il fallimento dell'infusione19, che potrebbe essere determinato dalla misurazione del volume residuo nel serbatoio della pompa dopo l'esperimento. Per l'applicazione della pompa osmotica in topi più giovani con dimensioni cerebrali più piccole, si raccomanda un esperimento di prova per garantire un'adeguata profondità di inserimento. Inoltre, la cannula per infusione cerebrale deve essere saldamente fissata sul cranio per ridurre al minimo il suo movimento durante l'infusione.
Allo stato attuale, molti studi in vitro hanno trovato una varietà di farmaci che possono promuovere la rigenerazione della mielina, ma a causa della scarsa permeabilità BBB, della breve emivita e di altri problemi, questi farmaci sono difficili da convalidare con successo in vivo. Pertanto, la pompa osmotica è di grande valore per il campo della ricerca sulla rigenerazione della mielina del sistema nervoso centrale, particolarmente rilevante per quei farmaci con una breve emivita, scarsa permeabilità BBB e evidenti effetti collaterali periferici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Nature Science Foundation of China (NSFC 32070964, 31871045) a J.N. e dalla Shenzhen Basic Research Foundation (JCYJ20210324121214039) a Y.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
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