Summary
脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为产生胰岛素的细胞（IPC）的MSCs的潜在来源。在该协议中，我们提供了用于分离和表征大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，然后是用于从同一只大鼠Ad-MSC生成IPC的简单，简短的协议。
Abstract
间充质干细胞（MSCs） - 特别是那些从脂肪组织（Ad-MSCs）中分离出来的干细胞 - 作为一种可再生的，丰富的干细胞来源而受到特别关注，不会引起任何伦理问题。然而，目前隔离Ad-MSC的方法并不标准化，并且采用需要特殊设备的复杂协议。我们使用一种简单，可重复的方法从Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪中分离出Ad-MSCs。分离的Ad-MSCs通常在分离后3天内出现，因为贴壁细胞显示成纤维细胞形态。这些细胞在分离后1周内达到80%的汇合度。之后，在第3-5代（P3-5），通过对特征性MSC分化簇（CD）表面标志物（如CD90，CD73和CD105）进行免疫表型分析，以及诱导这些细胞在成骨，脂肪和软骨成因谱系中的分化，对分离的Ad-MSCs进行全面表征。反过来，这意味着分离细胞的多能性。此外，我们通过结合高葡萄糖Dulbecco的改良鹰培养基（HG-DMEM），β-巯基乙醇，烟酰胺和exendin-4，通过简单，相对较短的方案诱导分离的Ad-MSCs向胰岛素产生细胞（IPC）谱系的分化。首先，通过测量特异性β细胞标志物（如MafA，NKX6.1，Pdx-1和Ins1）的表达水平以及生成的IPC的二噻酮染色，对IPCs进行遗传评估。其次，评估也通过葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定在功能上进行。总之，Ad-MSCs可以很容易地分离出来，表现出所有MSC表征标准，并且它们确实可以在实验室中为糖尿病研究提供丰富的可再生IPC来源。
Introduction
间充质干细胞（MSCs），也称为间充质基质细胞，是再生医学中使用最广泛的细胞类型之一1，2。它们被归类为成体干细胞，其特征在于多系分化潜力和自我更新能力3。间充质干细胞可以从各种来源分离和获得，包括脂肪组织，骨髓，外周血，脐带组织和血液，毛囊和牙齿4，5。
从脂肪组织中分离干细胞被认为既有吸引力又有希望，因为它们易于获取， 体外快速扩增和高产量6。脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可以从不同的物种中分离出来，例如人类，牛，小鼠，大鼠以及最近的山羊7。已经证明，Ad-MSCs现在是组织工程和基因/细胞治疗的潜在候选者，甚至可用于开发用于长期修复软组织损伤或缺陷的自体替代品7，8。
国际细胞和基因治疗学会（ISCT）定义了MSC必须展示的三个最低标准，以进行完整的表征9。首先，它们必须是塑料粘附的。其次，间充质干细胞表面标志物（如 CD73、CD90 和 CD105）应表达，且缺乏造血标志物 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α 或 CD19 以及 HLA-DR 的表达。最后，间充质细胞应表现出分化成三种间充质谱系的能力：脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。有趣的是，MSCs也可以分化成其他谱系，如神经元细胞，心肌细胞，肝细胞和上皮细胞10，11。
事实上，间充质干细胞具有独特的性质，使它们能够作为潜在治疗剂应用于不同疾病的再生疗法中。间充质干细胞可以分泌可溶性因子以诱导免疫调节环境，从而提供治疗益处12.此外，间充质干细胞可以向损伤部位和肿瘤微环境迁移以提供靶向治疗;然而，其机制尚未完全阐明13。此外，MSCs具有分泌外泌体的能力，外泌体是纳米级的细胞外囊泡，携带着大量非编码RNA，蛋白质和可溶性因子，最近成为MSCs在各种疾病中治疗潜力的新机制14。
更重要的是，间充质干细胞通过基因修饰15，16或通过在体外培养基中利用各种外在诱导因子来分化成产生胰岛素的细胞（IPC）的潜力引起了显着的关注17。IPC诱导期差异很大，因为它取决于所使用的诱导方案和利用的外在因素。分化过程可持续数天至数月，需要外源性诱导因子的组合，这些因子必须在不同阶段添加和/或提取。许多用于内分泌胰腺分化的因子是生物活性化合物，已被证明可以促进胰岛素分泌β细胞的增殖或分化/新生和/或增加IPCs的胰岛素含量18，19，20，21。值得注意的是，据报道，间充质干细胞还通过几种机制（包括其分泌组）以及广泛的免疫调节作用对糖尿病及其并发症具有治疗作用22，23，24。
在该协议中，我们提出了一个详细的逐步协议，用于从大鼠附睾脂肪中分离和表征Ad-MSCs，然后是一个简单的，相对较短的协议，用于从Ad-MSC生成IPC。
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Protocol
所有实验均根据批准的指南进行，所有程序均由埃及开罗英国大学药学院伦理委员会批准。Lopez和Spencer采用了Ad-MSC隔离协议，修改了15。
1. 从大鼠附睾脂肪垫中分离Ad-MSCs
- 使用体重不超过1个月（每次隔离两次）的体重为250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。麻醉动物，然后通过宫颈脱位对它们实施安乐死。用70%乙醇喷洒安乐死动物。切除腹部下部的皮肤和肌肉，然后拉出两个睾丸以暴露附睾脂肪垫。
- 轻轻切开附睾脂肪垫，小心不要切开血管。
- 分离附睾周围的脂肪组织，然后将其置于含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。
- 在生物安全柜中，用镊子和手术刀将这些脂肪垫切成小块。将这些切割的脂肪组织块转移到含有10 mL无菌PBS的50 mL离心管中。
- 每次用10毫升PBS清洗切碎的脂肪组织5次，以去除污染血液。必须仔细执行以下洗涤程序。
- 向组织中加入10毫升PBS，彻底混合45秒。然后，通过保持管静置5分钟以分离成两层，让组织通过重力沉降。
- 使用10ml注射器从摄取剂中抽吸PBS，并用新鲜的10mLPBS代替再次洗涤。
- 重复此洗涤步骤4-5次，直到PBS清除血液。这表明大部分（如果不是全部）血液被移除。
- 洗涤后，将脂肪组织重悬于10mL胶原酶溶液（PBS中0.1%胶原酶1型）中。用副膜密封管，然后将其在振荡水浴（37°C，80rpm，45分钟）中孵育，直到组织几乎均匀。
注意：避免组织的完全消化（当溶液变得完全均匀，所有组织残基/片段完全消失时），因为它会对之后的细胞培养产生不利影响。通常，消化需要30-45分钟。 - 一旦胶原酶消化完成，涡旋管15秒，然后以300× g离心5分钟。再次涡旋管10秒，然后再次离心5分钟。然后观察三层。小心地丢弃油层，然后是水层，而不干扰基质血管分数（SVF）沉淀。
注意：除去含有脂肪细胞的上清液和胶原酶溶液。首先，用10mL移液管去除脂肪细胞和随附的油层，以确保完全去除油滴，然后去除下面的水层。 - 将管底部的SVF沉淀重悬于10mL无菌BSA溶液（1%白蛋白，PBS中的牛血清V级分溶液）中，然后将管以300× g离心5分钟。
- 离心后，弃去上清液并将SVF沉淀悬浮在8.5 mL Ad-MSCs的完整培养基中（由Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12 [DMEM / F12]培养基组成，补充有10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺）。
- 在37°C下5%CO2的25cm 2 烧瓶中培养细胞。 第二天，检查附着的细胞，取出悬浮的细胞，并更换培养基。之后，每隔一天更换一次媒体。
- 每5-7天传代一次细胞，当它们使用胰蛋白酶-EDTA汇合80%-90%时。使用传代3-5之间的细胞进行本方案中描述的后续实验。 图1给出了所有隔离步骤的示意图。
注意：通常，Trypisn-EDTA效力可能因不同的供应商而异，因此请尽量缩短胰蛋白酶消化的时间，以避免对细胞的毒性作用。
2. 使用流式细胞术分析通过免疫表型表征Ad-MSCs
- 在第3代，使用胰蛋白酶- EDTA分裂细胞。用PBS洗涤2次，然后用血细胞计数器计数细胞。
- 用小鼠抗大鼠CD90或CD105（间充质标志物）或CD34（造血标志物）用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的单克隆抗体在4°C下在黑暗中孵育100，000个细胞20分钟。
- 洗涤细胞并将其悬浮在500μLFACS缓冲液中。通过流式细胞术分析 25.
3. 评估分离的Ad-MSCs在各种间充质谱系中的分化潜力
- 脂肪性分化
- 将细胞重悬于完整的培养基中（如步骤1.9.中所述），然后在24 孔组织培养板中以3.7×10 4细胞/孔的密度培养细胞。在37°C的5%CO 2的加湿气氛中孵育。接下来，每3天更换一次培养基，直到细胞达到几乎100%汇合，这通常需要3天。
- 当细胞达到所需的汇合度时，用脂肪分化培养基（由LG-DMEM培养基组成，补充有10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺与1x脂肪原性补充剂，与间充质干细胞功能鉴定试剂盒一起提供）替换增殖培养基以诱导脂肪发生。然后，每 3 天更换一次培养基（0.5 mL/孔）。小心轻柔地进行培养基更换，以免破坏脂质液泡。
- 21天后，通过显微镜检查脂质液泡外观和油红色染色来评估脂肪分化。
- 通过将30mg油红污渍溶解在10mL异丙醇中来制备油红储备溶液，然后在室温下保持至少20分钟。之后，通过将3份储备溶液与2份双蒸馏水（ddH2O）混合来制备工作溶液，充分混合，并在室温下保持10分钟，然后用滤纸过滤。
- 为了记录脂肪分化，用PBS洗涤细胞2次，然后使用中性缓冲福尔马林10%（0.75ml / well）固定它们15分钟。之后，使用1mL /孔用PBS洗涤细胞2次，每次将细胞孵育5分钟。在添加油红色工作溶液之前，完全吸出PBS非常重要。
- 最后一次洗涤后，将油红色工作溶液加入细胞中，并在37°C下孵育60分钟。 然后，取出污渍溶液，并用PBS轻轻洗涤细胞2次。在显微镜下观察染色的脂滴。
- 成骨分化
- 将7.4×103 细胞/孔（0.5mL培养基/孔）接种在24孔板中，并在37°C的5%CO2 的加湿气氛中孵育3天（如步骤1.9所述）以达到近70%汇合度。
- 用LG-DMEM培养基中用成骨补充剂（随试剂盒提供）诱导细胞，该培养基补充了10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺。
- 继续成骨诱导21天，每3天更换一次分化培养基。
- 将200mg茜素红S染色剂溶解在9mL ddH2O中，然后使用氢氧化铵和HCl调节pH值至4.1-4.3，制备茜素红S染色剂的工作溶液。接下来，将体积按ddH 2 O增加到10mL。在此之后，使用滤纸过滤除去任何沉淀物。
- 用PBS洗涤细胞2次，然后用10%缓冲福尔马林（0.75mL /孔）固定它们15分钟。然后，使用PBS（1 mL /孔）洗涤细胞2次。每次，将细胞孵育5分钟。
- 将固定细胞与制备的2%茜素- 红S溶液在37°C培养箱中孵育30分钟。
- 之后，取出染色液，用ddH 2 O洗涤细胞2次，用PBS洗涤一次，然后观察染色的富含钙的细胞外基质，在显微镜下评估成骨分化。
- 软骨分化
- 将7.4×103 个细胞/孔（0.5mL培养基/孔）接种在24孔板中，并在37°C的5%CO2 的加湿气氛中孵育3天（如步骤1.9中所述）以达到近70%汇合度。
- 当达到所需的汇合度时，用含有胰岛素 - 转铁蛋白硒（ITS），软骨原补充剂（随试剂盒提供），100 U / mL青霉素，100μg / mL链霉素，0.25μg / mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺21的无血清DMEM / F12诱导细胞的软骨分化。
- 将细胞与软骨培养基孵育21天，同时每3天更换一次软骨分化培养基。
- 制备Alcian Blue 8GX污渍的工作溶液如下：首先，在ddH2O中加入3 mL冰醋酸至97 mL ddH2O，制备3%冰醋酸溶液。然后，通过将0.1g与100mL的3%冰酸溶液混合来制备Alcian Blue 8GX污渍的工作溶液，并使用滤纸过滤除去任何沉淀物。
- 用PBS洗涤细胞2次，然后用10%缓冲福尔马林（0.75mL /孔）固定它们15分钟。然后，使用PBS（1 mL /孔）洗涤细胞2次。每次，将细胞孵育5分钟。
- 下一步是将细胞在制备的0.1%Alcian Blue 8GX染色剂中在3%冰醋酸中在37°C下孵育60分钟。 用ddH 2 O洗涤染色的细胞2次，用PBS洗涤一次，然后在显微镜下观察染色的硫酸化蛋白聚糖。
4. 将AD-MSC区分为IPC
- 在第3段中，使用胰蛋白酶-EDTA分离Ad-MSCs。首先，除去培养基，然后在仍然附着在培养瓶中的细胞时用5 mL PBS洗涤细胞。接下来，将5mL胰蛋白酶- EDTA加入75cm2 烧瓶中，并在37°C下孵育3-10分钟。
注意：尝试在早期传代诱导细胞，通常在P3-P5之间，因为晚期传代对细胞的性质和分化能力产生不利影响17，24。 - 之后，检查细胞是否脱离和单细胞悬浮液。向烧瓶中加入5 mL完整的DMEM / F12培养基以抑制胰蛋白酶的作用。收集细胞悬浮液并将其转移到15 mL试管中，然后将另外5 mL完整的DMEM / F12培养基加入试管中。
- 将细胞以300×g离心2分钟以沉淀细胞。
- 用PBS洗涤细胞一次，再次以300×g离心2分钟，然后将细胞沉淀重悬于3-5mL完整的DMEM / F12培养基中。
- 使用台盼蓝排除染料和血细胞计数器计数细胞。
- 然后，将细胞接种在6孔板（1 x 106 细胞/板）和12孔板（用于GSIS测定;1 x 106 细胞/板）中，并在37°C，5%CO2 培养箱中孵育3天，以达到近90%汇合度。
- 在诱导当天，除去培养基，用PBS洗涤细胞，然后通过预诱导介质（DMEM / F12补充10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM烟酰胺[NA]和1mM β-巯基乙醇[β-ME]）预诱导细胞2天。
- 使用高葡萄糖DMEM（HG-DMEM，4.5g / L葡萄糖）再诱导细胞1天，并补充2.5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM NA和1mM β巯基乙醇。在此阶段结束时收集细胞沉淀（在本方案中指定为D3细胞）。
- 将细胞在由HG-DMEM组成的最终分化诱导培养基中再孵育7天，该诱导培养基补充了2.5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM β-巯基乙醇和10nM exendin-4。
- 在指定期限结束时，收集细胞沉淀（在本方案中称为Final），并通过DTZ染色和GSIS测定评估细胞的成功分化，如本方案所示。
- 按照下文第5步和第6步评估生成的IPC。
5. 二噻酮染色
- 制备二硫宗（DTZ）染色储备溶液如下：将25mg DTZ完全溶解在2.5mL二甲基亚砜（DMSO）中，分成等分试样，并在-20°C下在黑暗中储存直至使用。
- 对于染色，通过将储备溶液稀释在完全培养基中（HG-DMEM补充5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺）来制备工作溶液1：100（体积/体积）。然后，通过0.2μm注射器过滤器过滤工作溶液。
- 接下来，对于指定的DTZ染色培养细胞在6孔板中，并在抽吸培养基后，用PBS洗涤细胞一次，然后将2mL DTZ工作溶液加入每个孔中。在CO 2培养箱中在37°C下孵育至少2 小时。
- 用PBS小心地洗涤细胞2次。最后一次洗涤后，向每个孔中加入2 mL PBS。然后，在倒置显微镜下观察深红色染色的IPC。使用最初在完全生长培养基（10% FBS - DMEM/F12）中培养的未诱导的Ad-MSCs作为对照。
6. RT-qPCR对β细胞标记物的基因表达
- 核糖核酸提取
- 分化后，收集细胞沉淀并将其储存在-80°C直至使用。将每个细胞沉淀（来自一个6孔板的六个孔池）悬浮在1mL硫氰酸胍RNA提取试剂中，在1.5mL无核酸酶管中，同时上下移液几次。将裂解的样品在室温下孵育5分钟，以允许核蛋白复合物的完全解离。
- 每1 mL RNA提取试剂加入200μL氯仿，并牢固地盖住管，用手剧烈摇动15秒。接下来，在室温下孵育3分钟。
- 将样品在4°C下以13，800× g 离心15分钟。 这将导致混合物分离成下氯仿相，间相和无色上层水相，RNA保留在水相中。
- 将上层水相放入新管中，同时小心避免接触相间。
- 向水相（1：1体积）中加入600μL100%异丙醇，然后通过倒置25次彻底混合样品，并在室温下孵育10分钟。
- 将样品在4°C下以18，800× g 离心30分钟。 沉淀的RNA在管侧形成一个小的凝胶状沉淀。
- 除去上清液并用1mL 80%冰冷乙醇洗涤沉淀。加入乙醇后，缓慢进行RNA沉淀的多次移液10秒。
- 在4°C下以9，600× g 离心样品5分钟。 弃去上清液，让RNA沉淀风干5-10分钟。
- 干燥后，通过将RNA沉淀上下移液几次，将RNA沉淀溶解在25-100μL无RNase水（根据初始沉淀尺寸）中，直到在1.5mL无核酸酶管中完全溶解。避免RNA沉淀过度干燥。
注意：通常，颗粒在干燥时会变得透明。但是，一旦透明，立即重悬，以避免颗粒过度干燥。 - 通过使用无核酸酶水作为空白，通过测定260nm和280nm处的光密度（OD）来定量RNA。
- 确保样品的OD260/OD280 = 1.8-2.0。
- 中密度脂腺苷酸合成
- 使用cDNA合成试剂盒从分离的总RNA中合成cDNA。
- 根据制造商的说明进行cDNA合成反应。在200μL PCR管中，向 表1所示的反应主混液中加入含有0.5μg总RNA的RNA溶液。
- 将RNA加入预混液后，通过50°C的循环程序进入混合物30分钟，持续一个循环，然后使用热循环仪将95°C的灭活循环2分钟。
- 使用无核酸酶的水将cDNA稀释至终浓度为2ng / μL，储存在-20°C以进行后续RT-qPCR。
- 使用 SYBR 绿色预混液的 RT-qPCR
- 根据 表2所示的反应混合物，使用cDNA模板对每个靶基因进行RT-qPCR反应。一式三份完成所有措施。
- 所用引物组如 表3所示。在冰上执行所有RT-qPCR程序。
- 使用实时荧光定量 PCR 机器在默认程序设置下进行 RT-qPCR 反应。热循环条件包括95°C的初始变性10分钟，然后是45次变性循环（95°C，15秒）和组合退火/延伸（60°C，1分钟）。
- 根据2-ΔΔCt测定Ct值并检测表达水平，β-肌动蛋白作为内部对照。
| cDNA合成预混液 | 体积（μl） |
| 5x cDNA合成缓冲液 | 4 |
| 断续器 | 2 |
| 核糖核酸引物 | 1 |
| 反梭酶混合物 | 1 |
| RT 增强剂 | 1 |
| 无核酸酶水 | 变量 |
| 总核糖核酸 | 变量 |
| 总反应量 | 20 |
表1：cDNA合成预混液体积。
| RT-qPCR 反应混合物 | 体积（μl） | 最终浓度在 10 μL 中 |
| 断续器 | 2 | 2 纳克/孔 |
| RT-qPCR 正向引物 （3 μM） | 1 | 300 海里 |
| RT-qPCR 反向引物 （3 μM） | 1 | 300 海里 |
| 无核酸酶水 | 1 | ------- |
| 2x 海上省绿色预混液 | 5 | 1 倍 |
| 总反应体积 | 10 |
表2：RT-qPCR反应混合物。
| 基因 | 前向引物 | 反向底漆 |
| 狐狸2 | 嘎嘎 | ATGTTGCCGACCACACTG |
| PDX-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCTTCTGCTGGT |
| NKX6.1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| 马法 | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-肌动蛋白 | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
表3：正向和反向引物序列。
7. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌
- 克雷布林格碳酸氢盐（KRB）缓冲液的制备
- 制备克雷布的林格碳酸氢盐（KRB）缓冲溶液，同时使用2mM葡萄糖（低葡萄糖）和20mM葡萄糖（高葡萄糖）浓度进行葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定。用于制备KRB缓冲液的组分如 表4所示。
- 使用1 N HCl将缓冲液的pH值调节至约7.25-7.35（即，比所需pH 7.4低0.1-0.2个单位，因为它在过滤过程中可能会上升）。
- 以0.1%（重量/体积）的浓度新鲜加入牛血清白蛋白（BSA）。
- 之后加入葡萄糖（18mg用于50 mL KRB以制备2 mM低葡萄糖KRB缓冲液，180mg用于50 mL KRB以制备20 mM高葡萄糖KRB缓冲液）。
- 通过0.2μm注射器过滤器过滤，对制备的LG和HG KRB缓冲液进行灭菌，为GSIS测定做好准备。
- GSIS 检测
- 最初在12孔细胞培养板中接种1 x 105 个细胞/孔，并使用完全相同的分化诱导方案诱导这些细胞。
- 在诱导方案结束时，用PBS轻轻清洗生成的IPC（板中）2次，用LG-KRB清洗一次。
- 然后，用300μLLG-KRB /孔孵育IPC1小时，然后丢弃该缓冲液。
- 接下来，将IPC与300μL的2mM（LG）或20mM（HG）KRB缓冲液一起孵育1小时。在潜伏期结束时，收集上清液并储存在-80°C，以便使用商业ELISA试剂盒并按照制造商的说明进行随后的分泌胰岛素测定。
注意：在进行GSIS测定时，在抽吸或添加PBS和KRB缓冲液时，尽量尽可能温和。
| 元件 | 浓度 |
| 氯化镁（无水） | 0.0468克/升 |
| 氯化钾 | 0.34 克/升 |
| 氯化钠 | 7.00 克/升 |
| 磷酸氢钠（无水） | 0.1 克/升 |
| 磷酸钠单碱性（无水） | 0.18 克/升 |
| 碳酸氢钠 | 1.26 克/升 |
| 氯化钙 | 0.2997克/升 |
表4：用于KRB缓冲液制备的组分。
8. 统计分析
- 将所有数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。所有比较都是使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey使用统计软件的事后检验完成的。p 值 **p ≤ 0.01 且 *p ≤ 0.05 的结果被认为具有统计学意义。
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Representative Results
Ad-MSC 的隔离和表征
如图 2所示，从脂肪组织中分离的细胞从分离的第二天开始显示出圆形和成纤维细胞样细胞的异质群体（图2A）。分离后4天，成纤维细胞的数量和大小开始增加，并通过第1代作为同质群体生长（图2B，C）。这些细胞继续作为塑性贴壁的成纤维细胞生长，如图3所示，满足MSC特征的第一个标准（图2D）。这些Ad-MSCs显示出非常好的培养特性，并且发现该方案是一种相关，简单且相对快速的方案，可将Ad-MSCs与附睾脂肪垫分离。
下一步是表征隔离的Ad-MSC。根据 ISCT，间充质干细胞应遵循以下三个标准：塑料依从性、缺乏造血标志物的间充质 CD 的表达以及分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的能力。如图 3A所示，流式细胞术分析显示，这些细胞大多表达CD90和CD105（分别为76.4%和73.6%）。与此同时，它们对CD34几乎为阴性（0.1%）。
此外，在诱导这些细胞分化时，它们显示出分化成脂肪细胞，骨细胞和软骨细胞的能力。如图 3B （上图）所示，与对照组未诱导细胞相比，脂肪细胞显示出脂质液泡的油红色染色。与对照细胞相比，骨细胞表现出特征性的茜素红染色（图3B，中间面板）。最后，与对照非诱导细胞相比，软骨细胞诱导的细胞显示出细胞外基质的蓝色染色（图3B，底图）。
这些数据清楚地表明，从脂肪组织中分离的细胞不仅表现出良好的培养特性，而且还表现出为MSCs提出的所有标准。
将间充质干细胞分化为产生胰岛素的细胞（IPC）
如图4A所示，我们使用了一种相对简单、较短的协议，以便将Ad-MSC区分为IPC。在诱导分化后，以多种方式评估诱导的IPC。诱导细胞显示出明显的形态变化。如图4B（上图）所示，与Ad-MSCs的正常成纤维细胞样形态相比，诱导细胞显示出圆形的簇状形态。有趣的是，在用二硫酮染色时，这些簇显示出深红色染色，这是β细胞染色的锌颗粒的特征（图4B，下图）。
之后，与未诱导的对照细胞相比，对生成的IPC进行遗传评估，以确定特异性β细胞标记物的表达。如图5A-E所示，诱导细胞能够表达各种特异性β细胞标记物，表明它们能够产生IPC。至于FOXA2-一种确定性的内胚层标志物（如图5A所示）-，与对照相比，它在D3分化时表达高度，达到近30倍，然后在最终分化细胞中减少到仅对照的10倍（D3：28.37±0.88;决赛： 12.10 ± 1.27;p < 0.05）。至于Pdx-1（被认为是β细胞的早期标志物），它在D3和最终分化细胞中都升高，与对照非诱导细胞相比达到近20倍（D3：22.39±5.14;决赛： 17.13 ± 0.342;p < 0.05;图 5B）。关于其他β细胞标志物，即NKX6.1，MafA和instin-1（Ins1），它们都显示出从D3开始到最终分化的升高，与对照未诱导细胞相比，分别达到近8倍，12倍和300倍（NKX6.1：D3：1.94±0.86，最终：7.97±1.34，p<0.05;MafA： D3： 6.59 ± 0.4， 决赛： 11.54 ± 2.40， p < 0.05;和 Ins1： D3： 27.29 ± 20.27， 最终： 318.20 ± 76.09， p < 0.05） （图 5C-E）。这表明这些Ad-MSC可以分化成表达β细胞标记物的IPC。
最后，当葡萄糖浓度增加时，评估这些细胞的胰岛素分泌。如图 5F所示，当用20mM葡萄糖挑战时，诱导的IPCs上清液中分泌的胰岛素显着高于用2mM葡萄糖挑战细胞时分泌的胰岛素（HG：390 pg / mL±33 pg / mL;LG： 234 pg/mL ± 32 pg/mL， p < 0.05; 图 5F）
这些数据证实，所使用的协议设法将Ad-MSC区分为IPC，这在遗传和功能上都得到了证实。
图 1：用于隔离和表征 Ad-MSC 的协议步骤示意图。 由 Biorender.com 生成。 请点击此处查看此图的大图。
图2：显示分离的Ad-MSCs的显微照片（A）具有塑料贴壁，成纤维细胞样形态的分离细胞在分离后的第二天开始出现。（B）随着时间的推移，这些粘附的Ad-MSCs（具有成纤维细胞样形态）增殖并增加数量，在（C）P1和（D）P3中达到更均匀的成纤维细胞样群体。请点击此处查看此图的大图。
（A）Ad-MSC的流式细胞术分析显示，这些细胞对CD34（上图）几乎为阴性，而大多数细胞表达CD90和CD105（下图）。Ad-MSCs可以分化成三种间充质谱系，即（B）脂肪细胞（油滴被油红色染色），（C）骨细胞，由茜素红染色，和（D）软骨细胞，由Alcian Blue染色（与对照未诱导细胞相比）。对照：未诱导细胞，差异：分化细胞。请点击此处查看此图的大图。
图4：将Ad-MSC分化为IPC.（A）用于从Ad-MSC生成IPC的分化协议的示意图，以及在诱导分化到IPC的每个阶段的细胞的显微照片。分化时，细胞失去其成纤维细胞形态并倾向于聚集形成簇，其倾向于在悬浮介质中分离和生长。（B）显微照片显示由上述协议生成的对照Ad-MSC和IPC，与未诱导的Ad-MSC的成纤维细胞样形态（左图），未染色（上图）或DTZ染色（下图）相比，显示圆形簇形态变化（右图）。
控制：未诱导细胞;IPC：产生胰岛素的细胞;NA：烟酰胺;β-ME：β-巯基乙醇;D3：在第3天诱导分化至IPC期间诱导细胞;D10：诱导协议结束时的最终差异化IPC;Ex-4：exendin-4。 请点击此处查看此图的大图。
图5：IPC的β细胞标志物和GSIS的相对表达水平。 qRT-PCR对（A）FOXA2，（B）Pdx-1，（C）NKX6.1，（D）MafA和（E）Ins-1的相对表达水平。（F）用2mM葡萄糖（LG）或20mM葡萄糖（HG）挑战生成的IPC时上清液中分泌的胰岛素水平。对照：未诱导的Ad-MSCs，第3天：在D3收集的分化细胞;最终：最终差异化IPC;LG：低血糖;HG：高血糖。a：均值不同于p处的控制<0.05;b：均值与第 3 天不同，p < 0.05;*： LG 的平均值与 p < 0.05 处的 HG 不同;比较是使用独立的样本t检验完成的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在该协议中，我们设法提出了从大鼠附睾脂肪中分离Ad-MSCs的详细方案，并将这些Ad-MSC分化为IPC。事实上，大鼠附睾脂肪是用于获得Ad-MSCs的易于获得的脂肪组织来源，并且不需要任何特殊设备，无论是用于收集还是用于处理15，26，27。分离的Ad-MSCs表现出优异的培养扩增，并表现出所有被定义为MSC的标准。所使用的协议先前进行了轻微的修改15的描述。该协议已被证明是有效且可重复的。这些细胞从分离后的第1天开始显示出成纤维细胞样形态，并继续扩张，直到它们达到同质的群体。有趣的是，我们使用相同的方案从脂质抽吸物中分离出人类Ad-MSCs，其成功率与大鼠组织相当（数据未显示）。该过程的唯一限制是使用胶原酶的化学消化，当与其他方案中的机械消化并排放置时28。这一步也代表了一个关键的措施，因为细胞的化学消化会对其活力产生不利影响29，30。否则，该协议为任何考虑在实验室中启动Ad-MSC研究系列的研究人员提供了一个良好的开端。
使用MSCs治疗糖尿病开辟了新的途径，并为糖尿病的治疗带来了新的希望。然而，从间充质公司产生完全成熟的IPC仍然是一个争论和挑战的问题31。目前，文献中有几种协议可以诱导MSC与IPC的分化。这些协议在不同时间段内利用过多的化合物和生长因子20，32，33。这些因素主要取决于MSC类型和来源，从34，35开始。尽管如此，从间充质干细胞中获得成熟的功能性IPC仍然是该领域争论和研究的问题20.
在所介绍的协议中，我们提供了一种简短，相对简单，有效的方法来从Ad-MSC获得功能IPC。所得细胞在DTZ染色阳性时表现出明显的形态变化，表达大多数β细胞标志物，并且表现出对葡萄糖浓度挑战增加的胰岛素分泌增加。所有这些证据都证实了该协议作为Ad-MSC的β细胞诱导协议的效率。我们在另一种类型的MSC中使用了这种方案，即人类沃顿商学院的果冻MSCs（WJ-MSCs），来自脐带，它实际上显示了类似的结果21，36。这些结果值得尝试我们在其他类型和来源的MSC上的协议，使该程序成为从MSC生成IPC的通用协议。值得注意的是，强调在早期传代（通常在P3-P5之间）诱导细胞的重要性，因为晚期传代会对细胞的性质和分化能力产生不利影响17，24。
如前所述，从MSCs中获得完全成熟的β细胞是一个有争议的问题，远未完全阐明。然而，像这里描述的那些协议提供了一种简单，快速的方法，可以更好地了解Ad-MSC甚至其他类型的MSC分化为IPC的基本机制。添加的化合物诱导Ad-MSCs表达特异性β细胞标记物的能力为研究控制MSCs分化为IPC的遗传和表观遗传因素提供了有用的工具。此外，快速，简单的方案允许研究人员研究可能改善这种分化结果的其他内在因素。这些因素可能代表干细胞辅助治疗，甚至可能提供糖尿病的治疗方式。在我们的实验室中，我们使用类似的方法来证明肥胖素（一种肠道激素）可能是从WJ-MSCs37产生IPC的新的潜在因素。
另外值得一提的是，目前的协议有两个主要的局限性。首先，如前所述，我们使用胶原酶的化学消化，这会对细胞29，30的活力产生不利影响。其次，我们在 体外 采用分化过程，没有研究 体内生成的IPC的预期进一步成熟和分化增强。需要指出的是，将 体外分化的MSCs移植到IPCs中显示出对各种β细胞标志物表达的深刻诱导。这种增加在移植后12-18个月 在体内38个月达到约100倍。因此，未来通过这种简单协议进一步研究生成的IPC的 体内 成熟度的研究将具有良好的价值。
总之，我们为Ad-MSC的隔离和表征提供了详细的协议，然后提供了一个相对简单，快速和高效的协议，用于从Ad-MSC生成IPC。这些方案不仅为启动干细胞治疗系列的研究提供了有效的工具，而且还可以帮助开发不断增长的MSC细胞治疗糖尿病领域。
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Disclosures
所有合著者声明与本作品没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Rawda Samir Mohamed博士，硕士，兽医专家，埃及英国大学（BUE）药学院兽医专家，帮助解剖大鼠。
我们还要感谢埃及英国大学（BUE）大众传播学院为制作和编辑本手稿的视频所做的努力。
我们要感谢埃及英国大学（BUE）英语助理讲师Fatma Masoud小姐，MSc对手稿的修订和英语校对。
这项工作由埃及开罗英国大学药学院药物研究与发展中心（CDRD）部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
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