Summary
Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan vara en potentiell källa till MSC som differentieras till insulinproducerande celler (IPC). I detta protokoll tillhandahåller vi detaljerade steg för isolering och karakterisering av råtta epididymala Ad-MSC, följt av ett enkelt, kort protokoll för generering av IPC från samma råtta Ad-MSCs.
Abstract
Mesenkymala stamceller (MSC) - särskilt de som isoleras från fettvävnad (Ad-MSC) - har fått särskild uppmärksamhet som en förnybar, riklig källa till stamceller som inte utgör några etiska problem. Nuvarande metoder för att isolera Ad-MSC är dock inte standardiserade och använder komplicerade protokoll som kräver specialutrustning. Vi isolerade Ad-MSC från epididymalfettet hos Sprague-Dawley-råttor med en enkel, reproducerbar metod. De isolerade Ad-MSC: erna visas vanligtvis inom 3 dagar efter isolering, eftersom vidhäftande celler visar fibroblastisk morfologi. Dessa celler når 80% sammanflöde inom 1 vecka efter isolering. Därefter, vid passage 3-5 (P3-5), utfördes en fullständig karakterisering för de isolerade Ad-MSC: erna genom immunofenotypning för karakteristiska MSC-kluster av differentiering (CD) ytmarkörer såsom CD90, CD73 och CD105, samt inducera differentiering av dessa celler längs de osteogena, adipogena och kondrogena linjerna. Detta innebär i sin tur multipotensen hos de isolerade cellerna. Dessutom inducerade vi differentieringen av de isolerade Ad-MSC: erna mot de insulinproducerande cellerna (IPC) via ett enkelt, relativt kort protokoll genom att införliva Dulbeccos modifierade Eagle-medium (HG-DMEM) med hög glukos, β-merkaptoetanol, nikotinamid och exendin-4. IPC-differentiering bedömdes genetiskt, först genom att mäta uttrycksnivåerna för specifika β-cellmarkörer såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 och Ins1, samt ditizonfärgning för de genererade IPC: erna. För det andra utfördes bedömningen också funktionellt genom en glukosstimulerad insulinsekretionsanalys (GSIS). Sammanfattningsvis kan Ad-MSC: er enkelt isoleras och uppvisa alla MSC-karakteriseringskriterier, och de kan verkligen ge en riklig, förnybar källa till IPC i laboratoriet för diabetesforskning.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC), även kända som mesenkymala stromaceller, är bland de mest använda celltyperna för regenerativ medicin 1,2. De klassificeras som vuxna stamceller och kännetecknas av multilineage differentieringspotential och självförnyelsekapacitet3. MSC kan isoleras och erhållas från olika källor, inklusive fettvävnad, benmärg, perifert blod, navelsträngsvävnad och blod, hårsäckar och tänder 4,5.
Isoleringen av stamceller från fettvävnad ses som både tilltalande och lovande på grund av deras enkla åtkomst, snabba expansion in vitro och hög avkastning6. Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan isoleras från olika arter som människor, nötkreatur, möss, råttor och, på senare tid, getter7. Det har bevisats att Ad-MSC nu är potentiella kandidater för vävnadsteknik och gen/cellterapi som till och med kan användas för att utveckla ett autologt alternativ för långsiktig reparation av mjukvävnadsskada eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definierat tre minimikriterier som måste uppvisas av MSC för fullständig karakterisering9. Först måste de vara plastanhängande. För det andra bör MSC uttrycka mesenkymala stamcellsytemarkörer som CD73, CD90 och CD105 och sakna uttryck för de hematopoetiska markörerna CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 och HLA-DR. Slutligen bör MSC uppvisa förmågan att differentiera sig till de tre mesenkymala linjerna: adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Intressant nog kan MSC också differentieras till andra släktlinjer såsom neuronala celler, kardiomyocyter, hepatocyter och epitelceller10,11.
Faktum är att MSC har unika egenskaper som gör att de kan tillämpas som potentiella terapeutiska medel i regenerativ terapi för olika sjukdomar. MSC kan utsöndra lösliga faktorer för att inducera en immunmodulerande miljö som ger terapeutiska fördelar12. Dessutom kan MSC migrera mot skadeställen och tumörmikromiljöer för att leverera riktad terapi; mekanismerna är dock inte helt klarlagda13. Dessutom har MSC: er förmågan att utsöndra exosomer, extracellulära vesiklar i nanoskalan som bär en last av icke-kodande RNA, protein och lösliga faktorer, som nyligen framkom som en ny mekanism för MSC: s terapeutiska potential vid olika sjukdomar14.
Ännu viktigare är att MSC har genererat markant uppmärksamhet för deras potential att differentiera till insulinproducerande celler (IPC), antingen genom genetisk modifiering 15,16 eller genom att använda olika yttre inducerande faktorer inom odlingsmediet in vitro17. IPC-induktionsperioden varierar mycket, eftersom det beror på det använda induktionsprotokollet och de använda yttre faktorerna. Differentieringsprocessen kan pågå från dagar till månader, och det kräver en kombination av exogena inducerande faktorer som måste läggas till och / eller dras tillbaka i olika steg. Många av dessa faktorer som har använts för endokrin pankreasdifferentiering är biologiskt aktiva föreningar som har visat sig främja spridning eller differentiering / neogenes av insulinutsöndrande β-celler och / eller öka insulinhalten i IPC 18,19,20,21. Det är anmärkningsvärt här att MSC också har rapporterats ha terapeutiska effekter vid diabetes och dess komplikationer via flera mekanismer, inklusive deras sekretom, liksom ett brett spektrum av immunmodulerande åtgärder 22,23,24.
I detta protokoll presenterar vi ett detaljerat stegvis protokoll för isolering och karakterisering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett, följt av ett enkelt, relativt kort protokoll för generering av IPC från Ad-MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes enligt de godkända riktlinjerna, och alla förfaranden godkändes av den etiska kommittén vid farmaceutiska fakulteten, British University in Egypt (BUE), Kairo, Egypten. Ad-MSC-isoleringsprotokollet antogs från Lopez och Spencer, med ändringar15.
1. Isolering av Ad-MSC från råtta epididymala fettkuddar
- Använd manliga Sprague-Dawley-råttor som väger 250-300 g som inte är mer än 1 månad (två per isolering). Bedöva djuren och avliva dem sedan genom cervikal dislokation. Spraya det avlivade djuret med 70% etanol. Skär ut huden och muskeln i nedre delen av buken och dra sedan ut de två testiklarna för att exponera de epididymala fettkuddarna.
- Skär försiktigt de epididymala fettkuddarna och var försiktig så att du inte skär blodkärlen.
- Isolera fettvävnaden som omger bitestiklarna och lägg den sedan i en petriskål som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Skär dessa fettkuddar i små bitar med pincett och skalpell i biosäkerhetsskåpet. Överför dessa skurna fettvävnadsbitar till ett 50 ml centrifugrör som innehåller 10 ml steril PBS.
- Tvätta de malet fettvävnaderna 5 gånger med 10 ml PBS varje gång för att avlägsna det förorenande blodet. Följande tvättprocedurer måste utföras noggrant.
- Tillsätt 10 ml PBS i vävnaden och blanda noggrant i 45 s. Låt sedan vävnaden sätta sig via tyngdkraften genom att hålla röret stående i 5 minuter för att separera i två lager.
- Aspirera PBS från infranatanten med en 10 ml spruta och ersätt med färsk 10 ml PBS för en annan tvätt.
- Upprepa detta tvättsteg 4-5 gånger tills PBS är fritt från blod. Detta indikerar att det mesta, om inte allt, av blodet tas bort.
- Efter tvättning, återsuspendera fettvävnaden i 10 ml kollagenaslösning (0,1% kollagenas typ 1 i PBS). Försegla röret tätt med parafilm och inkubera det sedan i ett skakvattenbad (37 °C, 80 rpm, i 45 min) tills vävnaden är nästan homogen.
OBS: Undvik fullständig matsmältning av vävnaden (när lösningen blir helt homogen med fullständigt försvinnande av alla vävnadsrester / bitar), eftersom det påverkar odlingen av celler negativt efteråt. Vanligtvis tar matsmältningen 30-45 min. - När kollagenasuppslutningen är klar, virvla röret i 15 s och centrifugera sedan i 5 min vid 300 x g. Virvla röret igen i 10 s, följt av ytterligare 5 min centrifugering. Tre lager kommer då att observeras. Kassera försiktigt oljeskiktet, följt av det vattenhaltiga skiktet, utan att störa den stromala vaskulära fraktionen (SVF) pellet.
OBS: Ta bort supernatanten som innehåller adipocyter och kollagenaslösningen. Ta först bort adipocyterna och det medföljande oljeskiktet med en 10 ml pipett för att säkerställa fullständigt avlägsnande av oljedropparna och ta sedan bort det under vattenhaltiga skiktet. - Resuspendera SVF-pelleten i botten av röret i 10 ml steril BSA-lösning (1% albumin, bovin serumfraktion V-lösning i PBS) och centrifugera sedan röret i 5 minuter vid 300 x g.
- Efter centrifugering, kassera supernatanten och suspendera SVF-pelleten i 8,5 ml komplett media för Ad-MSC (bestående av Dulbeccos modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] media kompletterat med 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B och 2 mM L-glutamin).
- Odla cellerna i en 25 cm2-kolv vid 37 °C under 5 %CO2. Följande dag kontrollerar du de anslutna cellerna, tar bort de suspenderade cellerna och byter ut mediet. Byt sedan media varannan dag.
- Passera cellerna var 5-7 dagar när de är 80% -90% sammanflytande med trypsin-EDTA. Använd celler mellan passagerna 3-5 för de efterföljande experimenten som beskrivs i detta protokoll. En schematisk presentation av alla isoleringssteg finns i figur 1.
OBS: Vanligtvis kan Trypisn-EDTA-styrkan variera mellan olika leverantörer, så försök att minimera tiden för trypsinisering för att undvika toxiska effekter på cellerna.
2. Karakterisering av Ad-MSC genom immunofenotypning med hjälp av flödescytometrianalyser
- Vid passage 3, dela cellerna med trypsin-EDTA. Tvätta med PBS 2 gånger och räkna sedan cellerna med en hemocytometer.
- Inkubera 100 000 celler vid 4 °C i mörkret i 20 minuter med antingen mus-anti-råtta CD90 eller CD105 (mesenkymala markörer) eller CD34 (hematopoietisk markör) monoklonal antikropp märkt med fluorescein-isotiocyanat (FITC).
- Tvätta cellerna och suspendera dem i 500 μl FACS-buffert. Analysera med flödescytometri25.
3. Bedömning av differentieringspotentialen hos isolerade ad-MSC i olika mesenkymala släktlinjer
- Adipogen differentiering
- Återsuspendera cellerna i komplett media (som beskrivs i steg 1.9.) och odla sedan cellerna med en densitet av 3,7 x 104 celler / brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Inkubera vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 %CO2. Därefter byter media var 3: e dag tills cellerna når nästan 100% sammanflöde, vilket vanligtvis tar 3 dagar.
- När cellerna når önskad sammanflöde, ersätt proliferationsmediet med det adipogena differentieringsmediet (bestående av LG-DMEM-media kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B och 2 mM L-glutamin med 1x adipogent tillskott, försedd med Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit) för att inducera adipogenes. Byt sedan media var 3: e dag (0.5 ml / brunn). Var noga med att utföra mediebytet försiktigt för att inte störa lipidvakuolerna.
- Efter 21 dagar, bedöma den adipogena differentieringen genom mikroskopisk undersökning av lipidvakuolernas utseende och genom oljeröd färgning.
- Förbered en stamlösning av Oil Red genom att lösa upp 30 mg Oil Red stain i 10 ml isopropanol och förvara den sedan i minst 20 min vid rumstemperatur. Förbered sedan en arbetslösning genom att blanda 3 delar stamlösning med 2 delar dubbeldestillerat vatten (ddH2O), blanda dem väl och förvara den i 10 minuter vid rumstemperatur och filtrera sedan efteråt med filterpapper.
- För att dokumentera den adipogena differentieringen, tvätta cellerna 2 gånger med PBS och fixera dem sedan med neutralbuffrat formalin 10% (0,75 ml / brunn) i 15 minuter. Tvätta sedan cellerna 2 gånger med PBS med 1 ml / brunn och inkubera cellerna i 5 minuter varje gång. Det är viktigt att helt aspirera PBS innan du lägger till den oljeröda arbetslösningen.
- Efter den sista tvätten, tillsätt den oljeröda arbetslösningen till cellerna och inkubera dem i 60 minuter vid 37 °C. Ta sedan bort fläcklösningen och tvätta försiktigt cellerna 2 gånger med PBS. Observera de färgade lipiddropparna under mikroskopet.
- Osteogen differentiering
- Frö 7,4 x 103 celler/brunn (0,5 ml medium/brunn) i en 24-brunnsplatta och inkubera dem vid 37 °C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 i komplett media (som beskrivs i steg 1.9.) i 3 dagar för att nå nästan 70% sammanflöde.
- Inducera cellerna med det osteogena tillskottet (medföljer satsen) i LG-DMEM-media kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B och 2 mM L-glutamin.
- Fortsätt den osteogena induktionen i 21 dagar och ändra differentieringsmediet var 3: e dag.
- Bered en arbetslösning av Alizarin Red S-fläcken genom att lösa upp 200 mg Alizarin Red S-fläck i 9 mlddH2Ooch justera sedan pH till 4,1-4,3 med ammoniumhydroxid och HCl. Fyll sedan på volymen till 10 ml medddH2O. Ta sedan bort eventuella fällningar genom filtrering med filterpapper.
- Tvätta cellerna 2 gånger med PBS och fixera dem sedan med 10% buffrat formalin (0,75 ml / brunn) i 15 minuter. Tvätta sedan cellerna 2 gånger med PBS (1 ml / brunn). Varje gång inkubera cellerna i 5 minuter.
- Inkubera de fasta cellerna med den beredda 2% Alizarin-Red S-lösningen i 30 minuter i en 37 °C inkubator.
- Ta sedan bort fläcklösningen, tvätta cellerna 2 gånger medddH2Ooch en gång med PBS och observera sedan den färgade kalciumrika extracellulära matrisen för att bedöma osteogen differentiering under mikroskopet.
- Kondrogen differentiering
- Frö 7,4 x 103 celler/brunn (0,5 ml medium/brunn) i en 24-brunnsplatta och inkubera dessa vid 37 °C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 i komplett media (som beskrivs i steg 1.9.) i 3 dagar för att nå nästan 70% sammanflöde.
- När den önskade sammanflödet uppnås, inducera den kondrogena differentieringen av cellerna med serumfri DMEM / F12 innehållande insulin-transferrin selen (ITS), kondrogent tillskott (medföljer satsen), 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B och 2 mM L-glutamin21.
- Inkubera cellerna med det kondrogena mediet i 21 dagar, samtidigt som det kondrogena differentieringsmediet ändras var 3: e dag.
- Förbered en arbetslösning av Alcian Blue 8GX-fläck enligt följande: Förbered först en 3% isättikalösning iddH2Ogenom att tillsätta 3 ml isättika till 97 ml ddH2O. Förbered sedan en arbetslösning av Alcian Blue 8GX-fläck genom att blanda 0,1 g i 100 ml 3% isyralösning och ta bort eventuella utfällningar genom filtrering med filterpapper.
- Tvätta cellerna 2 gånger med PBS och fixera dem sedan med 10% buffrat formalin (0,75 ml / brunn) i 15 minuter. Tvätta sedan cellerna 2 gånger med PBS (1 ml / brunn). Varje gång inkubera cellerna i 5 minuter.
- Nästa steg är att inkubera cellerna i den beredda 0,1% Alcian Blue 8GX fläcken i 3% igelättiksyra i 60 min vid 37 °C. Tvätta de färgade cellerna 2 gånger medddH2Ooch en gång med PBS och observera sedan de färgade sulfaterade proteoglykanerna under mikroskopet.
4. Differentiering av ad-MSC till IPC: er
- Vid avsnitt 3, dela Ad-MSC: erna med Trypsin- EDTA. Ta först bort mediet och tvätta sedan cellerna medan de fortfarande är fästa i odlingskolven med 5 ml PBS. Tillsätt sedan 5 ml trypsin-EDTA till 75 cm2-kolven och inkubera vid 37 °C i 3-10 minuter.
OBS: Försök att inducera cellerna vid tidiga passager, vanligtvis mellan P3-P5, eftersom sena passager påverkar cellernas egenskaper och differentieringsförmåga negativt17,24. - Därefter inspektera cellerna för lossning och för att vara en encellssuspension. Tillsätt 5 ml komplett DMEM/F12-media till kolven för att hämma trypsinverkan. Samla upp cellsuspensionen och överför den till ett 15 ml rör och tillsätt sedan ytterligare 5 ml komplett DMEM/F12-media till röret.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 2 min för att pelletera cellerna.
- Tvätta cellerna en gång med PBS, centrifugera igen vid 300 x g i 2 minuter och återförsuspendera sedan cellpelleten i 3-5 ml komplett DMEM / F12-media.
- Räkna cellerna med trypanblått exkluderingsfärgämne och en hemocytometer.
- Frö sedan cellerna i 6-brunnsplattor (1 x 106 celler / platta) och en 12-brunnsplatta (för GSIS-analys; 1 x 106 celler / platta) och inkubera i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i komplett media (som beskrivs i steg 1.9.) i 3 dagar för att nå nästan 90% sammanflöde.
- På induktionsdagen, ta bort mediet, tvätta cellerna med PBS och förinducera sedan cellerna i 2 dagar med preinduktionsmedia (DMEM / F12 kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM nikotinamid [NA] och 1mM β-merkaptoetanol [β-ME]).
- Inducera cellerna i ytterligare 1 dag med hög glukos DMEM (HG-DMEM, 4,5 g / L glukos) kompletterat med 2,5% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA och 1mM β-merkaptoetanol. Samla cellpellets i slutet av detta steg (utsedda D3-celler i detta protokoll).
- Inkubera cellerna i ytterligare 7 dagar i det slutliga differentieringsinduktionsmediet bestående av HG-DMEM kompletterat med 2,5% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA, 1mM β-merkaptoetanol och 10 nM exendin-4.
- Vid slutet av den angivna perioden samlar du cellpellets (namngiven Final i detta protokoll) och bedömer den framgångsrika differentieringen av cellerna genom DTZ-färgning och GSIS-analys, enligt följande i detta protokoll.
- Utvärdera de genererade IPC:erna genom att följa steg 5 och 6 nedan.
5. Dithizone färgning
- Förbered ditisondo (DTZ) fläcklösning enligt följande: Lös helt upp 25 mg DTZ i 2,5 ml dimetylsulfoxid (DMSO), dela upp i alikvoter och förvara vid −20 °C i mörker tills den används.
- För färgning, förbered en arbetslösning 1:100 (volym /volym) genom att späda stamlösningen i komplett odlingsmedium (HG-DMEM kompletterat med 5% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B och 2 mM L-glutamin). Filtrera sedan arbetslösningen genom ett 0,2 μm sprutfilter.
- Därefter, för de angivna DTZ-färgningsodlingscellerna i en 6-brunnsplatta och, efter aspirering av odlingsmediet, tvätta cellerna en gång med PBS och tillsätt sedan 2 ml DTZ-arbetslösning i varje brunn. Inkubera i minst 2 timmar vid 37 °C iCO2-inkubatorn .
- Tvätta cellerna försiktigt 2 gånger med PBS. Efter den sista tvätten, tillsätt 2 ml PBS i varje brunn. Observera sedan de crimson rödfärgade IPC: erna under ett inverterat mikroskop. Använd oinducerade Ad-MSC: er som ursprungligen odlades i fullständigt tillväxtmedium (10% FBS - DMEM / F12) som en kontroll.
6. Genuttryck av β-cellsmarkörer med RT-qPCR
- RNA-extraktion
- Efter differentiering, samla upp cellpellets och förvara dem vid −80 °C tills de används. Suspendera varje cellpellets (härledd från de sex brunnarna i en 6-brunnsplatta som poolats) i 1 ml guanidiumtiocyanat-RNA-extraktionsreagens i ett 1,5 ml nukleasfritt rör, tillsammans med pipettering upp och ner flera gånger. Inkubera de lyserade proverna vid rumstemperatur i 5 minuter för att möjliggöra fullständig dissociation av nukleoproteinkomplexen.
- Tillsätt 200 μL kloroform per 1 ml RNA-extraktionsreagens och täck säkert rören så att de skakas kraftigt för hand i 15 s. Inkubera sedan i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera proverna vid 13 800 x g i 15 minuter vid 4 °C. Detta kommer att leda till blandningsseparation i en lägre kloroformfas, en interfas och en färglös övre vattenfas, med RNA kvar i vattenfasen.
- Placera den övre vattenfasen i ett nytt rör, samtidigt som du försiktigt undviker att röra vid mellanfasen.
- Tillsätt 600 μL 100% isopropanol till vattenfasen (volym 1:1), blanda sedan proverna noggrant genom inversion 25 gånger och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Centrifugera proverna vid 18 800 x g i 30 minuter vid 4 °C. Det utfällda RNA bildar en liten gelliknande pellet på rörsidan.
- Ta bort supernatanten och tvätta pelletsen med 1 ml 80% iskall etanol. Efter tillsats av etanolen, utför långsamt flera pipettering av RNA-pelleten i 10 s.
- Centrifugera proverna i 5 minuter vid 9 600 x g vid 4 °C. Kassera supernatanten och låt RNA-pelletsen lufttorka i 5-10 minuter.
- Efter torkning löses RNA-pelletsen upp i 25-100 μL RNas-fritt vatten (enligt den ursprungliga pelletsstorleken) genom att pipettera upp och ner flera gånger tills fullständig solubilisering i 1,5 ml nukleasfria rör. Undvik överdriven torkning av RNA-pelleten.
OBS: Vanligtvis blir pelleten transparent när den torkar. Men när det är klart, återställ det omedelbart för att undvika överdriven torrhet i pelleten. - Kvantifiera RNA genom att bestämma de optiska densiteterna (OD) vid 260 nm och 280 nm, med användning av nukleasfritt vatten som blankämne.
- Se till att proverna har OD260 / OD280 = 1,8-2,0.
- cDNA-syntes
- Syntetisera cDNA från det isolerade totala RNA med hjälp av ett cDNA-synteskit.
- Utför cDNA-syntesreaktionen enligt tillverkarens instruktioner. I ett 200 μL PCR-rör, tillsätt en volym RNA-lösning innehållande 0,5 μg totalt RNA till reaktionsmästarblandningen som visas i tabell 1.
- Efter tillsats av RNA till mastermixen, mata in blandningen genom ett cykelprogram på 50 °C i 30 min under en cykel, följt av en inaktiveringscykel på 95 °C i 2 min, med användning av en termisk cykler.
- Späd cDNA med nukleasfritt vatten till en slutlig koncentration av 2 ng/μL. Förvara vid −20 °C för efterföljande RT-qPCR.
- RT-qPCR med SYBR Green Master Mix
- Utför RT-qPCR-reaktionen för varje målgen med hjälp av cDNA-mall enligt reaktionsblandningen som visas i tabell 2. Gör alla åtgärder i tre exemplar.
- De uppsättningar primers som används visas i tabell 3. Utför alla RT-qPCR-procedurer på is.
- Utför RT-qPCR-reaktionen med en PCR-maskin i realtid på standardprograminställningarna. De termiska cykelförhållandena inkluderade initial denaturering på 95 °C i 10 minuter, följt av 45 cykler av denaturering (95 °C, 15 s) och kombinerad glödgning/förlängning (60 °C, 1 min).
- Bestäm Ct-värdena och detektera uttrycksnivåerna i enlighet med 2-ΔΔCt, med β-aktin som en intern kontroll.
| cDNA syntes master mix | Volym (μl) |
| 5x cDNA syntesbuffert | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNA-primer | 1 |
| Verso Enzym Mix | 1 |
| RT-förstärkare | 1 |
| Nukleasfritt vatten | Variabel |
| Totalt RNA | Variabel |
| Total reaktionsvolym | 20 |
Tabell 1: cDNA-syntes mastermixvolymer.
| RT-qPCR reaktion blandning | Volym (μl) | Slutlig koncentration i 10 μl |
| cDNA | 2 | 2 ng/brunn |
| RT-qPCR Framåtriktad primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR Omvänd primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| Nukleasfritt vatten | 1 | ------- |
| 2x SYBR Grön mastermix | 5 | 1x |
| Total reaktionsvolym | 10 |
Tabell 2: RT-qPCR-reaktionsblandning.
| Gen | Framåt grundfärg | Omvänd primer |
| FOXA2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| PDX-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6.1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| MafA | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-aktin | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
Tabell 3: Framåt och bakåt primersekvenser.
7. Glukosstimulerad insulinsekretion
- Beredning av Krebs Ringer bikarbonatbuffert (KRB)
- Förbered Krebs Ringer bikarbonat (KRB) buffertlösning med både 2 mM glukos (låg glukos) och 20 mM glukos (hög glukos) koncentrationer för glukosstimulerad insulinsekretion (GSIS) analys. De komponenter som används för KRB-buffertberedningen anges i tabell 4.
- Justera buffertens pH med 1 N HCl till cirka 7,25-7,35 (dvs 0,1-0,2 enheter under önskat pH 7,4, eftersom det kan stiga under filtrering).
- Tillsätt bovint serumalbumin (BSA) nyligen i en koncentration av 0,1 % (vikt/volym).
- Tillsätt glukos efteråt (18 mg för 50 ml KRB för att förbereda 2 mM låg glukos KRB-buffert och 180 mg för 50 ml KRB för att förbereda 20 mM hög glukos KRB-buffert).
- Sterilisera de beredda LG- och HG KRB-buffertarna genom filtrering genom ett 0,2 μm sprutfilter för att vara redo för GSIS-analysen.
- GSIS-analys
- Frö initialt 1 x 105 celler / brunn i en 12-brunns cellodlingsplatta och inducera dessa celler genom att använda exakt samma differentieringsinduktionsprotokoll.
- I slutet av induktionsprotokollet, tvätta försiktigt de genererade IPC: erna (i plattan) 2 gånger med PBS och en gång med LG-KRB.
- Inkubera sedan IPC: erna med 300 μL LG-KRB / brunn i 1 timme och kassera sedan denna buffert.
- Inkubera sedan IPC: erna med 300 μL antingen 2 mM (LG) eller 20 mM (HG) KRB-buffert i ytterligare 1 h. Vid slutet av inkubationsperioden ska supernatanten samlas upp och förvaras vid −80 °C för den efterföljande utsöndrade insulinanalysen med hjälp av ett kommersiellt ELISA-kit och enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Försök att vara så försiktig som möjligt när du aspirerar eller lägger till PBS- och KRB-bufferten när du utför GSIS-analysen.
| Komponent | Koncentration |
| Magnesiumklorid (vattenfri) | 0,0468 g/l |
| Kaliumklorid | 0,34 g/l |
| Koksalt | 7,00 g/l |
| Natriumfosfat dibasisk (vattenfri) | 0,1 g/l |
| Natriumfosfatmonobasiskt (vattenfritt) | 0,18 g/l |
| Bikarbonat | 1,26 g/l |
| Kalciumklorid | 0,2997 g/l |
Tabell 4: De komponenter som används för KRB-buffertberedningen.
8. Statistisk analys
- Uttryck alla data som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Alla jämförelser gjordes med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA) och Tukeys post hoc-test med hjälp av statistisk programvara. Resultat med p-värden **p ≤ 0,01 och *p ≤ 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering och karakterisering av Ad-MSC
Som visas i figur 2 visade de isolerade cellerna från fettvävnad en heterogen population av rundade och fibroblastliknande celler från och med nästa isoleringsdag (figur 2A). 4 dagar efter isoleringen började fibroblastcellerna öka i antal och storlek och växa som en homogen population genom passage 1 (figur 2B,C). Dessa celler fortsatte att växa som plastanhängande, fibroblastiska celler som visas fram till passage 3 och uppfyllde det första kriteriet för MSC-egenskaper (figur 2D). Dessa Ad-MSC visade mycket goda odlingsegenskaper, och detta protokoll visade sig vara ett relevant, enkelt och relativt snabbt protokoll för att isolera Ad-MSC från bitestikala fettkuddar.
Nästa steg var att karakterisera de isolerade Ad-MSC: erna. Enligt ISCT bör MSC följa de tre kriterierna för plastföljsamhet, uttryck av mesenkymala CD-skivor med brist på hematopoetiska markörer och förmågan att differentiera till adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Som visas i figur 3A visade flödescytometrianalysen att de flesta av dessa celler uttryckte CD90 och CD105 (76,4% respektive 73,6%). Samtidigt var de nästan negativa för CD34 (0,1%).
Vidare visade de vid induktion av differentiering av dessa celler förmågan att differentiera till adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Som visas i figur 3B (övre panelen) visade adipocyterna oljeröd färgning av lipidvakuoler jämfört med kontrolloinducerade celler. Osteocyterna visade karakteristisk Alizarin Röd färgning (Figur 3B, mittpanel) jämfört med kontrollceller. Slutligen visade kondrocytinducerade celler blå färgning av den extracellulära matrisen jämfört med kontrolloinducerade celler (figur 3B, nedre panelen).
Dessa data visar tydligt att isolerade celler från fettvävnad inte bara uppvisar goda odlingsegenskaper utan också uppvisar alla de kriterier som föreslås för MSC.
Differentiering av Ad-MSC till insulinproducerande celler (IPC)
Som visas i figur 4A använde vi ett relativt enkelt, kort protokoll för att skilja Ad-MSC till IPC. Efter induktionen av differentiering bedömdes de inducerade IPC: erna på flera sätt. De inducerade cellerna visade markanta morfologiska förändringar. Som visas i figur 4B (övre panelen) visade de inducerade cellerna rundad, klusterliknande morfologi jämfört med den normala fibroblastiska morfologin hos Ad-MSC. Intressant nog, vid färgning med dithizon, visade dessa kluster en crimson fläck, vilket är ett kännetecken för zinkgranuler av β-cellfläck (Figur 4B, nedre panelen).
Därefter bedömdes de genererade IPC: erna genetiskt för uttrycket av de specifika β-cellmarkörerna jämfört med de oinducerade kontrollcellerna. Som visas i figur 5A-E kunde de inducerade cellerna uttrycka olika specifika β-cellmarkörer, vilket indikerar deras förmåga att generera IPC. När det gäller FOXA2 - en definitiv endodermmarkör (som visas i figur 5A) - uttrycktes den starkt vid D3-differentiering jämfört med kontroll, nådde nästan 30 gånger och minskade sedan till endast 10 gånger kontrollen i de slutliga differentierade cellerna (D3: 28,37 ± 0,88; Final: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). När det gäller Pdx-1 (som anses vara en tidig markör för β-celler) var den förhöjd i både D3 och slutliga differentierade celler och nådde nästan 20 gånger jämfört med kontrolloinducerade celler (D3: 22,39 ± 5,14; Final: 17,13 ± 0,342; p < 0,05; Figur 5B). När det gäller de andra β cellmarkörerna, nämligen NKX6.1, MafA och insulin-1 (Ins1), visade de alla höjd från D3 till slutlig differentiering och nådde nästan 8 gånger, 12 gånger respektive 300 gånger jämfört med kontrolloinducerade celler (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, Final: 7.97 ± 1.34, s<0.05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Final: 11,54 ± 2,40, s < 0,05; och Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, Final: 318.20 ± 76.09, s < 0.05) (Figur 5C-E). Detta indikerar att dessa Ad-MSC: er kan differentieras till IPC: er som uttrycker β-cellmarkörer.
Slutligen bedömdes dessa celler för utsöndring av insulin när de utmanades med ökande koncentrationer av glukos. Som visas i figur 5F var insulinet som utsöndrades i supernatanten hos de inducerade IPC: erna när det utmanades med 20 mM glukos signifikant högre än det som utsöndrades när cellerna utmanades med 2 mM glukos (HG: 390 pg / ml ± 33 pg / ml; LG: 234 pg / ml ± 32 pg / ml, s < 0,05; Figur 5F)
Dessa data bekräftade att det använda protokollet lyckades skilja Ad-MSC: erna till IPC: er, vilket var genetiskt och funktionellt bekräftat.
Bild 1: En schematisk presentation av stegen i protokollet som används för isolering och karakterisering av Ad-MSC. Genereras av Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fotomikrografer som visar de isolerade Ad-MSC: erna. (A) Isolerade celler som uppvisar plastanhängande, fibroblastliknande morfologi börjar dyka upp dagen efter isoleringen. (B) Med tiden sprider sig dessa vidhäftande Ad-MSC (med fibroblastliknande morfologi) och ökar i antal och når en mer homogen fibroblastliknande population i (C) P1 och (D) P3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Flödescytometrisk analys av Ad-MSC visar att dessa celler är nästan negativa för CD34 (övre panelen), medan majoriteten av cellerna uttrycker CD90 och CD105 (nedre panelen). Ad-MSC kan differentieras i de tre mesenkymala linjerna, nämligen (B) adipocyter (där oljedroppar färgas av olja röd), (C) osteocyter, färgade av alizarinrött och (D) kondrocyter, färgade av Alcian Blue (jämfört med kontroll oinducerade celler). Kontroll: oinducerade celler, Diff: differentierade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Differentiering av Ad-MSC i IPC: er (A) Schematisk presentation av differentieringsprotokollet som används för att generera IPC från Ad-MSC, tillsammans med fotomikrografer för cellerna i varje steg under induktionen av differentiering mot IPC. Vid differentiering förlorar celler sin fibroblastiska morfologi och tenderar att aggregera bildande kluster, som tenderar att lossna och växa i suspensionsmedier. (B) Fotomikrografer visar kontroll Ad-MSC och IPC som genereras av ovanstående protokoll som visar runda klustermorfologiska förändringar (höger panel) jämfört med den fibroblastliknande morfologin för de icke-inducerade Ad-MSC: erna (vänster panel), antingen oskadade (övre panelen) eller DTZ-färgade (nedre panelen).
Kontroll: oinducerade celler; IPC: insulinproducerande celler; NA: nikotinamid; β-ME: betamerkaptoetanol. D3: Inducerade celler vid dag 3 under induktionen av differentiering mot IPC; D10: Slutliga differentierade IPC:er i slutet av induktionsprotokollet. Ex-4: exendin-4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Relativa uttrycksnivåer för β-cellsmarkörer och GSIS för IPC: er. Relativa uttrycksnivåer med qRT-PCR för (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA och (E) Ins-1. (F) Nivåer av utsöndrat insulin i supernatanten vid utmaning av de genererade IPC: erna med 2mM glukos (LG) eller 20mM glukos (HG). Kontroll: oinducerade Ad-MSC, Dag-3: differentierade celler uppsamlade vid D3; Slutlig: slutliga differentierade IPC; LG: låg glukos; HG: hög glukos. a: medelvärdet skiljer sig från kontrollen vid p < 0,05; b: medelvärdet skiljer sig från dag-3 vid p < 0,05; *: medelvärdet av LG skiljer sig från HG vid p < 0,05; jämförelsen gjordes med hjälp av ett oberoende t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll lyckades vi presentera ett detaljerat protokoll för isolering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett och differentieringen av dessa Ad-MSCs till IPC. Faktum är att epidydimalt fett från råtta är en lätt att uppnå källa till fettvävnad för att erhålla Ad-MSC och kräver ingen speciell utrustning, varken för insamling eller för bearbetning av 15,26,27. De isolerade Ad-MSC: erna visade utmärkt kulturutvidgning och uppvisade alla kriterier som ska definieras som MSC. Det använda protokollet beskrevs tidigare med små modifieringar15. Detta protokoll har visat sig vara effektivt och reproducerbart. Cellerna visade fibroblastisk-liknande morfologi från dag 1 efter isolering och fortsatte att expandera tills de nådde en homogen population. Intressant nog använde vi samma protokoll för att isolera humana Ad-MSC från lipo-aspirate med jämförbar framgång med råttvävnad (data visas inte). Den enda begränsningen av denna process är den kemiska matsmältningen med kollagenas när den sätts sida vid sida med mekanisk matsmältning i andra protokoll28. Detta steg representerar också en kritisk åtgärd, eftersom den kemiska matsmältningen av cellerna kan påverka deras livskraftnegativt 29,30. Annars erbjuder detta protokoll en bra start för alla forskare som skulle överväga att starta en Ad-MSC-forskningslinje i sitt laboratorium.
Användningen av MSC vid behandling av diabetes har öppnat nya vägar och gett nya förhoppningar för behandling av diabetes. Genereringen av fullt mogna IPC från MSC är dock fortfarande en fråga om debatt och utmaning31. För närvarande finns det flera protokoll för att inducera differentieringen av MSC: er mot IPC: er i litteraturen. Dessa protokoll använder en uppsjö av kemiska föreningar och tillväxtfaktorer under olika tidsperioder 20,32,33. Dessa faktorer beror främst på MSC-typen och källan till att börja med34,35. Att få mogna funktionella IPC från MSC är dock fortfarande en fråga om debatt och forskning på området20.
I det presenterade protokollet tillhandahåller vi ett kort, relativt enkelt och effektivt sätt att få funktionella IPC: er från Ad-MSC. De resulterande cellerna visade markanta morfologiska förändringar med positiv DTZ-färgning, uttryckte de flesta av de β cellmarkörerna och visade ökad insulinsekretion som svar på ökad glukoskoncentrationsutmaning. Alla dessa bevis bekräftar effektiviteten hos detta protokoll som ett β-cellinduktionsprotokoll från Ad-MSC. Vi använde detta protokoll i en annan typ av MSC, nämligen human whartons gelé-MSC (WJ-MSC), härledd från navelsträngen, och det visade faktiskt liknande resultat21,36. Dessa resultat motiverar att vi försöker vårt protokoll på andra typer och källor till MSC, vilket gör proceduren till ett universellt protokoll för generering av IPC från MSC. Det är anmärkningsvärt att lyfta fram vikten av att inducera cellerna vid tidiga passager, vanligtvis mellan P3-P5, eftersom sena passager påverkar cellernas egenskaper och differentieringsförmåga negativt17,24.
Som tidigare nämnts är det en fråga om debatt och långt ifrån fullständig belysning att uppnå fullt mogna β-celler från MSC. Sådana protokoll som de som beskrivs här ger dock ett enkelt, snabbt sätt att bättre förstå de underliggande mekanismerna för differentiering av Ad-MSC, eller till och med andra typer av MSC, till IPC. Förmågan hos de tillsatta föreningarna för induktion av Ad-MSC: er att uttrycka specifika β-cellmarkörer ger ett användbart verktyg för att studera de genetiska och epigenetiska faktorer som styr differentieringen av MSC till IPC. Dessutom tillåter det snabba, enkla protokollet forskare att studera andra inneboende faktorer som kan förbättra resultatet av sådan differentiering. Dessa faktorer kan representera antingen en adjuvansbehandling med stamceller eller till och med kan ge en terapeutisk modalitet för diabetes. I vårt laboratorium använde vi ett liknande tillvägagångssätt för att bevisa att obestatin, ett tarmhormon, kan vara en ny potentiell faktor för generering av IPC från WJ-MSC37.
Det är också värt att nämna att det nuvarande protokollet har två huvudbegränsningar. Först, som tidigare nämnts, använde vi kemisk matsmältning med kollagenas, vilket kan påverka cellernas livskraft29,30 negativt. För det andra använde vi differentieringsprocessen in vitro och undersökte inte den förväntade ytterligare mognads- och differentieringsförbättringen av de genererade IPC: erna in vivo. Det är viktigt att påpeka att transplantationen av in vitro-differentierade MSC till IPC visade en djupgående induktion av uttrycket av olika β-cellsmarkörer. Denna ökning nådde cirka 100 gånger 12-18 månader efter transplantation in vivo38. Således kommer framtida studier för att ytterligare undersöka in vivo-mognad av genererade IPC: er med detta enkla protokoll att vara av gott värde.
Sammanfattningsvis tillhandahöll vi ett detaljerat protokoll för isolering och karakterisering av Ad-MSC: er, följt av ett relativt enkelt, snabbt och effektivt protokoll för generering av IPC: er från Ad-MSC. Dessa protokoll ger inte bara ett effektivt verktyg för att initiera en stamcellsterapilinje utan kan också bidra till att utveckla det ständigt växande området MSC-cellterapi för diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla medförfattare förklarar ingen intressekonflikt i samband med detta arbete.
Acknowledgments
Vi erkänner Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinärspecialist, farmaceutiska fakulteten, British University of Egypt (BUE) för att ha hjälpt till med dissektion av råttorna.
Vi vill också erkänna och uppskatta ansträngningarna från fakulteten för masskommunikation, British University in Egypt (BUE) för produktion och redigering av videon av detta manuskript.
Vi vill tacka Fröken Fatma Masoud, MSc, biträdande lektor i engelska, British University in Egypt (BUE) för revisionen och engelskspråkig korrekturläsning av manuskriptet.
Detta arbete finansierades delvis av Center for Drug Research and Development (CDRD), Farmaceutiska fakulteten, British University in Egypt (BUE), Kairo, Egypten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S.
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
