Summary
El presente protocolo describe la canulación aórtica y la perfusión retrógrada del corazón murino neonatal ex vivo . Una estrategia de dos personas, utilizando un microscopio de disección y una aguja de calibre pequeño embotada, permite una canulación confiable. La cuantificación de la tensión contráctil longitudinal se logra utilizando un transductor de fuerza conectado al ápice del ventrículo izquierdo.
Abstract
El uso del corazón perfundido retrógrado ex vivo ha sido durante mucho tiempo una piedra angular de la investigación de la isquemia-reperfusión desde su desarrollo por Oskar Langendorff hace más de un siglo. Aunque esta técnica se ha aplicado a ratones en los últimos 25 años, su uso en esta especie se ha limitado a animales adultos. El desarrollo de un método exitoso para cannular consistentemente la aorta murina neonatal permitiría el estudio sistemático del corazón perfundido retrógrado aislado durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo. La modificación de la preparación de Langendorff permite la canulación y el establecimiento de la reperfusión en el corazón murino neonatal al tiempo que minimiza el tiempo isquémico. La optimización requiere una técnica de dos personas para permitir la canulación exitosa de la aorta de ratón recién nacido utilizando un microscopio de disección y una aguja modificada disponible comercialmente. El uso de este enfoque establecerá de manera confiable la perfusión retrógrada en 3 minutos. Debido a que la fragilidad del corazón del ratón neonatal y el tamaño de la cavidad ventricular impiden la medición directa de la presión intraventricular generada con un balón, es necesario el uso de un transductor de fuerza conectado por una sutura al ápice del ventrículo izquierdo para cuantificar la tensión contráctil longitudinal. Este método permite a los investigadores establecer con éxito una preparación aislada del corazón murino del recién nacido perfundido por flujo constante, lo que permite el estudio de la biología cardíaca del desarrollo de manera ex vivo . Es importante destacar que este modelo será una herramienta poderosa para investigar las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal.
Introduction
Las preparaciones cardíacas ex-vivo han sido un elemento básico de los estudios fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos durante más de un siglo. A partir del trabajo de Elias Cyon en la década de 1860, Oskar Langendorff adaptó el modelo de rana aislada para la perfusión retrógrada, presurizando la raíz aórtica para proporcionar flujo coronario con un perfusato oxigenado1. Usando su adaptación, Langendorff pudo demostrar una correlación entre la circulación coronaria y la función mecánica2. El corazón perfundido retrógrado ex vivo, más tarde apodado epónimo la técnica de Langendorff, ha seguido siendo una piedra angular de la investigación fisiológica, aprovechando su simplicidad para estudiar poderosamente el corazón aislado en ausencia de posibles factores de confusión. La preparación de Langendorff se ha modificado aún más para permitir que el corazón se expulse (el llamado "corazón que funciona") y permitir que el perfusato recircule3. Sin embargo, los criterios de valoración fisiológicos primarios de interés se han mantenido sin cambios. Tales criterios de valoración incluyen medidas de la función contráctil, la conducción eléctrica, el metabolismo cardíaco y la resistencia coronaria4.
Para evaluar la función cardíaca en su preparación original de corazón de rana, Langendorff midió la tensión generada por la contracción ventricular en el eje longitudinal utilizando una sutura conectada entre el ápice del corazón y un transductor de fuerza. 5 La contracción isométrica se cuantificó de esta manera con tensión basal aplicada al corazón en ausencia de llenado ventricular. El refinamiento del abordaje ha llevado a balones llenos de líquido colocados en el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda para evaluar el rendimiento miocárdico durante la contracción isovolumétrica6. Para evaluar el ritmo cardíaco y la frecuencia cardíaca, se pueden colocar cables superficiales en los polos del corazón para permitir a los investigadores registrar el electrocardiograma. Sin embargo, se puede esperar bradicardia relativa, dada la denervación obligatoria. La estimulación extrínseca puede servir para superar esto y eliminar la variabilidad de la frecuencia cardíaca entre experimentos1. Otra medida de resultado, el metabolismo miocárdico, se puede evaluar midiendo el contenido de oxígeno y sustrato metabólico en el perfusato coronario y el efluente y calculando la diferencia entre ellos7. La cuantificación de lactato en el efluente coronario puede ayudar a caracterizar los períodos de metabolismo anaeróbico, como se observa con la hipoxia, la hipoperfusión, la isquemia-reperfusión o las perturbaciones metabólicas7.
El trabajo original de Langendorff permitió el estudio del corazón de mamífero ex vivo, utilizando gatos como tema principal5. La evaluación del corazón de rata aislado ganó popularidad a mediados de la década de 1900 con Howard Morgan, quien detalló el modelo de rata de "corazón de trabajo" en 19675. El uso de ratones comenzó hace solo 25 años debido a la complejidad técnica, la fragilidad del tejido y el tamaño relativamente pequeño del corazón murino. A pesar de los desafíos asociados con el estudio con ratones, los menores costos y la facilidad de la manipulación genética han aumentado el atractivo y la demanda de tales preparaciones murinas ex-vivo. Desafortunadamente, la aplicación de la técnica se ha limitado a animales adultos, siendo ratones juveniles de 4 semanas de edad los sujetos más jóvenes utilizados para el estudio ex vivo hasta hace muypoco 8,9. Si bien los ratones juveniles son "relativamente inmaduros" en comparación con los adultos, su utilidad como sujetos para los estudios de biología del desarrollo es limitada porque, en general, se han destetado de su presa de nacimiento y pronto comenzarán la pubertad10. La adolescencia ocurre mucho más allá de la transición postnatal en la utilización del sustrato miocárdico de glucosa y lactato a ácidos grasos11. Por lo tanto, la mayor parte de la información sobre los cambios metabólicos en el corazón neonatal ha resultado históricamente del trabajo ex vivo en especies más grandes como conejos y conejillos de indias11.
De hecho, existen enfoques alternativos a la preparación de Langendorff. Estos incluyen la experimentación in vitro, que carece de datos funcionales y contexto de todo el órgano, o estudios in vivo. Esto puede ser técnicamente desafiante y complicado al confundir variables como los efectos cardiovasculares y respiratorios de un agente anestésico requerido, la influencia de la entrada neurohumoral, las consecuencias de la temperatura central, el estado nutricional del animal y la disponibilidad de sustrato12,13. Debido a que el enfoque de Langendorff permite el estudio del corazón perfundido aislado de una manera ex-vivo de una manera más controlada en ausencia de tales factores de confusión, ha sido y sigue siendo considerado una poderosa herramienta de investigación. Por lo tanto, la técnica presentada aquí ofrece a los investigadores un enfoque experimental para el estudio ex vivo del corazón murino recién nacido y limita el tiempo de reperfusión.
Investigar el corazón durante los períodos de desarrollo es una consideración importante dadas las amplias transiciones bioquímicas, fisiológicas y anatómicas que ocurren durante la maduración del miocardio. Los cambios del metabolismo anaeróbico a la fosforilación oxidativa, los cambios en la utilización del sustrato y la progresión de la proliferación celular a la hipertrofia son procesos dinámicos que ocurren de manera única en el corazón inmaduro11,14. Otro aspecto crítico del corazón en desarrollo es que los factores estresantes que se encuentran durante los períodos necesarios pueden producir respuestas aumentadas en el corazón del recién nacido y alterar la susceptibilidad futura a los insultos en la edad adulta15. Aunque trabajos anteriores han utilizado ratas, corderos y conejos recién nacidos para estudiar el corazón neonatal perfundido por Langendorff, los avances que permiten el uso de ratones son necesarios dada la importancia de esta especie para la investigación de la biología del desarrollo16. Para abordar esta necesidad, recientemente se estableció el primer modelo de corazón neonatal murino perfundido por Langendorff utilizando animales de 10 díasde edad 6. Aquí se presenta un método para permitir la canulación aórtica exitosa y establecer la perfusión retrógrada del corazón murino recién nacido aislado. Este enfoque se puede utilizar para estudios de farmacología, isquemia-reperfusión o metabolismo centrados en la función de todo el órgano o se puede adaptar para el aislamiento de cardiomiocitos.
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Protocol
Se obtuvieron las aprobaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Columbia para todos los métodos descritos. Para el estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57Bl / 6 postnatal del día 10.
1. Preparación del aparato de Langendorff
- Para minimizar la complejidad, utilice perfusato oxigenado no recirculante dentro del aparato de Langendorff (consulte la Tabla de materiales) a través de flujo constante o presión constante.
- Utilice el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que contiene 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO4, 1,2 mmol/L de KH2PO4, 1,25 mmol/L de CaCl2, 25 mmol/L de NaHCO3 y 11 mmol/L de glucosa a pH 7,4 (véase la Tabla de Materiales), equilibre con el 95% de O2 y el 5% de CO2 dentro del aparato de Langendorff y manténgalo a 37 °C.
- Para el enfoque de flujo constante, mantenga un caudal continuo a ~2.5 mL∙min-1.
NOTA: Este caudal se aproximará al flujo coronario de ~75-80 mL/g∙min, dado que el peso promedio de un corazón de ratón de 10 días de edad (P10) es de ~30 mg17,18.
2. Fabricación de cánula aórtica
- Fabrique la cánula aórtica de ratón recién nacido a partir de una aguja de acero inoxidable de 26 G (consulte la Tabla de materiales). Usando tijeras afiladas, corte la punta de la aguja para embotar el extremo. Tenga cuidado de no engarzar o restringir el diámetro de la luz de la aguja. Alise el borde cortado y retire las fresas raspando suavemente el extremo embotado en la mesa de trabajo del laboratorio con un movimiento de ida y vuelta.
NOTA: Se deben eliminar las fresas microscópicas y los bordes afilados porque pueden desgarrar la aorta del ratón recién nacido y dañar la válvula aórtica. Alternativamente, use papel de lija de grano fino. - Conecte la cánula fabricada al aparato de Langendorff y evalúe el flujo y la resistencia. Mida los caudales a través de la cánula recolectando y midiendo la cantidad de amortiguación durante un período de tiempo conocido. Asegúrese de que el flujo real sea igual al caudal establecido de 2,5 ml min-1.
- Cuantifique el diferencial de presión a través de la cánula con KHB fluyendo siguiendo los pasos a continuación.
- Mida la presión en el sistema con y sin la cánula fabricada conectada.
- Divida el diferencial de presión a través de la cánula por el caudal para obtener resistencia a la cánula según la ley de Ohm15.
- Asegúrese de que la resistencia de la cánula fabricada comprenda ~ 16.0 ± 1.9 mmHg ∙min∙mL-1 de la resistencia total6. La resistencia excesiva sugiere una luz de cánula potencialmente comprometida.
NOTA: Cálculo de la muestra: Pcon cánula - P sin cánula = ΔP. Si Pcon = 48 y Psin = 8 entonces ΔP = 40. A un caudal (Q) de 2,5 mL min-1 y ΔP de 40 cánulas la resistencia es igual a 16 mmHg∙min∙mL-1 usando R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
- Retire la cánula de 26 G y conecte el tubo de alta presión (consulte la Tabla de materiales) al sitio de canulación en el aparato de Langendorff. Fije la cánula aórtica al extremo distal del tubo. Desairear el tubo y la cánula con tampón oxigenado, asegurando que se eliminen todas las burbujas.
NOTA: El uso de tubos de alta presión de esta manera permite que la cánula se extienda a una posición más remota. Esto es necesario para permitir la canulación aórtica con un microscopio de disección adyacente a la configuración (Figura 1).
3. Sustracción de órganos
- Ratones anticoagulados mediante inyección intraperitoneal (IP) de heparina (10 kU/kg) (ver Tabla de Materiales) para prevenir la formación de microtrombis coronarios utilizando una aguja de 26 G en una jeringa de 1 ml. Espere varios minutos para que la heparina circule antes de proceder con la inyección de cualquier anestésico.
- Anestesiar al animal con una inyección IP utilizando una aguja de 26 G en una jeringa de 1 ml.
NOTA: Es esencial controlar cuidadosamente al animal después de la inyección anestésica para evitar la apnea y la hipoxia posterior. El pentobarbital (70 mg/kg) es una opción fiable de anestésico, ya que permite la aparición rápida de la sedación sin inducir apnea 19,20. Se pueden utilizar otros agentes anestésicos, siempre que las dosis utilizadas no causen apnea21. Los investigadores deben considerar los efectos de los sedantes-hipnóticos alternativos sobre la función cardíaca22,23. La dislocación cervical como modo primario de eutanasia puede prolongar la hipoxia y la isquemia previas a la canulación. - Coloque el ratón en posición supina y asegure las extremidades inmediatamente después de la pérdida del conocimiento. Use agujas hipodérmicas de calibre pequeño para asegurar cada extremidad. Comience a cosechar tan pronto como el animal no responda al pellizco del dedo del pie; el animal debe respirar espontáneamente durante la disección inicial.
- Haga una incisión subxifoidea transversal a través del ancho del animal para exponer la cavidad abdominal usando tijeras de disección rectas (ver Tabla de Materiales).
NOTA: La técnica estéril no es necesaria dado que el procedimiento representa una cirugía no sobreviviente.- Identifique el diafragma superiormente e incite la porción anterior por completo. Corte la caja torácica bilateralmente a lo largo de la línea axilar media en dirección cefálica. Pídale a un asistente que agarre el proceso xifoideo con fórceps y refleje el esternón y las costillas cranealmente para exponer los órganos torácicos.
- Identificar la vena cava inferior infradiafragmática (CIV) por encima del hígado. Transecte el IVC con una tijera de iris curva mientras mantiene una ligera tensión anterior y cefálica en el segmento proximal con pinzas de iris (ver Tabla de Materiales).
- Corte posteriormente a lo largo de la superficie anterior de la columna vertebral con tijeras de iris curvadas mientras tira de la IVC hacia arriba y fuera de la cavidad torácica. A medida que el corazón se moviliza, incline las tijeras hacia arriba y corte los grandes vasos de manera superior para eliminar completamente el corazón y los pulmones.
NOTA: Este método permite la explantación rápida del corazón y los pulmones en bloque.
- Corte posteriormente a lo largo de la superficie anterior de la columna vertebral con tijeras de iris curvadas mientras tira de la IVC hacia arriba y fuera de la cavidad torácica. A medida que el corazón se moviliza, incline las tijeras hacia arriba y corte los grandes vasos de manera superior para eliminar completamente el corazón y los pulmones.
- Sumerja inmediatamente la muestra en KHB o solución salina helada. El corazón debe dejar de latir en cuestión de segundos.
4. Canulación
- Corte un trozo de toalla de papel y colóquelo en el fondo de una placa de Petri poco profunda para proporcionar fricción para estabilizar el corazón durante la canulación. Humedezca con KHB helado para evitar que el corazón se adhiera a él.
- Coloque la placa de Petri preparada bajo el microscopio de disección y ajuste el foco. Coloque la cánula aórtica unida al tubo de extensión de alta presión bajo el microscopio de disección junto con una sutura de seda 5-0 atada libremente alrededor de su cubo (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Se debe tener cuidado de limitar la cantidad de líquido en la placa de Petri porque los pulmones llenos de aire pueden flotar y hacer que los órganos extirpados se muevan.
- Coloque la placa de Petri preparada bajo el microscopio de disección y ajuste el foco. Coloque la cánula aórtica unida al tubo de extensión de alta presión bajo el microscopio de disección junto con una sutura de seda 5-0 atada libremente alrededor de su cubo (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque los órganos torácicos extirpados en la placa de Petri. Bajo el microscopio, identifique el timo por su brillo blanco y dos lóbulos y oriente el espécimen de tal manera que el timo sea anterior y superior24. Esto asegurará la orientación adecuada del corazón.
- Usando fórceps, separe sin rodeos los lóbulos del timo para exponer los grandes vasos. Identifique la aorta localizando las características ramificadas distintivas del arco aórtico.
NOTA: Un tono púrpura oscuro a menudo demarca el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. La aorta ascendente se encuentra entre la arteria pulmonar principal y la aurícula derecha. - Transecte la aorta con tijeras finas y afiladas (ver Tabla de Materiales) justo proximal al despegue de la arteria subclavia.
NOTA: Si la aorta se transecta demasiado cerca de la válvula aórtica, no habrá suficiente tejido aórtico para permitir que la cánula se asegure. Alternativamente, si la aorta se transecta demasiado alto, el perfusato puede filtrarse de una o más ramas aórticas (como la arteria subclavia). - Agarre suavemente la aorta transectada con pinzas curvas finas de estilo joyero (consulte la Tabla de materiales). Cannulate cuidadosamente la aorta con una aguja roma de 26 G, teniendo cuidado de no dañar la válvula aórtica. Manténgase en su lugar agarrando la aorta con las finas pinzas curvas alrededor de la cánula. Una vez establecido el control de la aorta, iniciar la perfusión retrógrada para limitar el tiempo isquémico.
NOTA: El corazón debe comenzar a latir y se pálida a medida que la sangre se drena del miocardio y KHB perfunde las arterias coronarias. La falta de latidos espontáneos, la presencia de congestión ventricular o la falta de cambio de color del corazón indican una cánula mal posicionada. - Pídale al asistente que agarre los extremos de la sutura poco atada y que enganche cuidadosamente la aorta alrededor de la cánula. Cinch la sutura por encima o por debajo de los fórceps finos curvos (manteniendo la cánula en su lugar), dependiendo de la cantidad de tejido aórtico y las consideraciones anatómicas. Apriete la sutura y confirme la adecuación del flujo coronario.
- Desconecte el tubo de alta presión del aparato de Langendorff. Agarre el cubo de la cánula y desconecte la aguja roma del tubo de extensión de alta presión. Conecte rápidamente el cubo de la cánula al aparato.
NOTA: Se debe tener cuidado de no desalojar el corazón o arrastrar aire hacia la cánula. - Una vez que el corazón esté colgado en el aparato de Langendorff en la posición habitual, y se confirme la perfusión adecuada, recorte cuidadosamente el pulmón, el timo y el exceso de tejido. Incise la aurícula derecha para permitir que el efluente del seno coronario gotee libremente.
5. Medición funcional
- Haga un pequeño nudo al final de una sutura de seda 5-0 (unida a una aguja curva). Perfore un pequeño trozo de película de parafina (2-3 mm x 2-3 mm) con la aguja y deslice la parafina hasta el extremo anudado. Pase cuidadosamente la aguja a través del ápice del ventrículo y tire de la sutura a través del corazón hasta que la película de parafina se ajuste contra la pared lateral del ventrículo.
NOTA: La película de parafina ayuda a evitar que el nudo desgarre el corazón y tire a través del ventrículo. - Pase la aguja a través de la abertura de la camisa de calentamiento llena de agua del aparato de Langendorff. El corazón ahora puede ser encerrado y calentado.
- Conecte la aguja al transductor de fuerza (consulte la Tabla de materiales) de tal manera que evite el goteo del seno coronario. Ajuste la sutura para aplicar 1-2 g de tensión basal, según lo indicado por la tensión diastólica o nadir en el rastreo de tensión.
NOTA: Evite arrancar el corazón de la cánula o torcer la aorta, comprometiendo así la perfusión coronaria. - Coloque electrodos de superficie en los polos superior e inferior del corazón para registrar el electrocardiograma.
NOTA: Use alambre de estimulación epicárdica temporal pediátrico con la aguja extraída para electrodo de superficie flexible conectado a Bio Amp (consulte la Tabla de materiales). - Muestree el efluente del seno coronario para su análisis utilizando un catéter 24 G IV (ver Tabla de Materiales).
- Reste la resistencia de la cánula de la resistencia total del sistema para obtener resistencia coronaria según la ley25 de Kirchhoff.
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Representative Results
Se utilizaron ratones P10 para modelar un punto de tiempo en la infancia humana26,27. Quince corazones de ratón recién nacidos C57Bl/6 aislados fueron cosechados y canulados con éxito. Los corazones fueron perfundidos con un flujo continuo de 2.5 mL min-1 de KHB oxigenado calentado. Se midieron los parámetros metabólicos, incluida la extracción de glucosa, el consumo de oxígeno, la producción de lactato y los parámetros fisiológicos como la frecuencia cardíaca, la presión de perfusión y la resistencia coronaria. Se utilizaron electrodos de superficie para registrar un electrocardiograma continuo, lo que permitió determinar la velocidad y el ritmo intrínsecos (Figura 2). La fuerza contráctil en el eje longitudinal se determinó utilizando el método descrito por Langendorff 28.
La evaluación metabólica se realizó para evaluar la adecuación de la perfusión. El porcentaje de extracción de oxígeno se calculó restando el contenido de oxígeno en el efluente coronario del perfusato. El consumo de oxígeno miocárdico se determinó multiplicando el caudal coronario por la diferencia en el contenido de oxígeno entre el perfusato y el efluente coronario multiplicado por la solubilidad del oxígeno (suponiendo 24 μL/mL de H2O a 37 °C y 760 mmHg)29,30. Utilizando estos cálculos, se determinó que esta estrategia de perfusión satisfacía las necesidades metabólicas del corazón de ratón recién nacido, dada la insignificante producción de lactato y el bajo porcentaje de extracción de oxígeno y consumo de glucosa (Tabla 1).
Todos los corazones laten espontáneamente en ritmo sinusal (Figura 2). Sin embargo, como era de esperar, la frecuencia cardíaca intrínseca denervada media fue más lenta que la frecuencia cardíaca murina neonatal reportada in vivo31. Las presiones medias de perfusión aórtica observadas se correlacionaron bien con las presiones arteriales medias descritas en ratones neonatales32. Se registraron y calcularon otras medias variables fisiológicas (Tabla 2).
Sobre la base de los datos observacionales, se deben considerar criterios de exclusión para garantizar la consistencia de la preparación neonatal (Tabla 3). Un factor que es crítico para la robustez de la preparación es el tiempo requerido para iniciar la reperfusión. La canulación es, con mucho, el paso más desafiante del procedimiento, dado el tamaño minúsculo y la fragilidad de la aorta neonatal del ratón. Un retraso prolongado en el establecimiento de la canulación o el inicio de la reperfusión dañará el corazón sano o incluso precondicionará el miocardio1. Por lo tanto, se sugiere minimizar el tiempo isquémico a menos de 4 minutos (de acuerdo con las pautas para el corazón de roedor adulto)1. Después de una canulación exitosa, la evaluación de la adecuación de la perfusión es primordial. Los signos de perfusión miocárdica inadecuada incluyen arritmias prolongadas, frecuencia cardíaca extrema o presión de perfusión aórtica extrema.
Figura 1: Configuración de la canulación aórtica. (A) El extremo proximal de los tubos de alta presión está unido al sitio de posición de la cánula "habitual" (que se muestra en B). La cánula está unida al extremo distal del tubo (magnificado en C). (B) Posición "habitual" de la cánula en el aparato. (C) La cánula está unida al extremo de la "punta deslizante" del tubo de alta presión para facilitar la extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El corazón de ratón neonatal perfundido retrógrado ex-vivo . Imagen de un corazón de ratón postnatal de 10 días después de una canulación aórtica exitosa con una aguja roma de 26 G. Se puede ver el efluente coronario goteando del corazón a través de una incisión en la aurícula derecha. Se colocaron electrodos de superficie de acero inoxidable en los polos para medir el electrocardiograma continuamente. El trazado representativo del ECG se muestra a la derecha en verde, demostrando un ritmo sinusal y una tasa de 194 latidos min-1. No se muestra la sutura conectada entre el ápice del corazón y el transductor de fuerza, lo que permite la medición de la fuerza contráctil ventricular (forma de onda representada en rojo a la derecha). Adaptado con permiso de la Referencia6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro metabólico | Abundante | Efluente | Consumo | Extracción |
| Glucosa, mg·dL−1 | 194,3 ± 3,8 | 193,0 ± 5,5 | 1,4 ± 0,8 mg·dL−1 | |
| Lactato, mmol· L−1 | < 0,3 ± 0,0 | < 0,3 ± 0,0 | ||
| P02, mmHg | 641 ± 7,9 | 295 ± 18,4 | 28,2 ± 1,3 μL·min−1 | 55,7 ± 2,3% |
Tabla 1: Parámetros metabólicos de corazones murinos recién nacidos perfundidos aislados. Los valores son medias ± SE. Se muestrearon efluentes ricos y coronarios, y se midió PO2 (presión parcial de oxígeno), glucosa y lactato. Se calculó la absorción de glucosa, la extracción de oxígeno y el consumo. La diferencia entre afluentes y efluentes determina la extracción. El consumo se calcula como solubilidad de flujo coronario x (PaO2- PvO2) x O2 a 760 mmHg (suponiendo 24 μL/mL de H2O a 37 °C y 760 mmHg).
| Parámetro fisiológico | Significar |
| Presión de perfusión aórtica, mmHg | 47,9 ± 6,9 |
| Resistencia coronaria, mmHg·min·mL−1 | 19,2 ± 2,8 |
| Frecuencia cardíaca, latidos·min−1 | 226 ± 8,9 |
| Fuerza contráctil ventricular, g | 7.2 ± 1.2 |
Tabla 2: Parámetros fisiológicos de corazones murinos recién nacidos perfundidos aislados. Los valores son medios ± SE. La resistencia coronaria se calculó en función del caudal coronario de 2,5 ml min-1 y la presión aórtica utilizando la ley de Ohm. De acuerdo con la ley de resistencia en serie de Kirchoff, la presión aórtica se calculó como presión por encima de la resistencia basal en el sistema. La frecuencia cardíaca se midió a través del electrodo de superficie, y la fuerza contráctil se midió a través de una sutura que conecta el ápice del corazón a un transductor de fuerza. Esta tabla se ha reimpreso con permiso de la Referencia6.
| Parámetro fisiológico | Umbral de exclusión |
| Tiempo de reperfusión, min | >4 |
| Presión de perfusión aórtica, mmHg | <20 o >75 |
| Frecuencia cardíaca, latidos·min−1 | <150 o >300 |
| Duración de la arritmia, min | >3 |
Tabla 3: Criterios de exclusión propuestos para los preparados de Langendorff de corazón murino neonatal. Esta tabla se ha reimpreso con permiso de la Referencia6.
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Discussion
El presente trabajo describe la canulación aórtica exitosa y la perfusión retrógrada en el corazón aislado de ratón recién nacido. Es importante destacar que permite a los investigadores superar las barreras que la edad murina joven y el pequeño tamaño del corazón presentaban anteriormente8. Si bien no es complejo en diseño, el enfoque requiere un grado significativo de habilidad técnica. Los pasos clave que inevitablemente desafiarán incluso a los investigadores más competentes técnicamente serán la canulación de la aorta y asegurar la cánula en su lugar. La dificultad con la canulación neonatal no se debe únicamente al pequeño tamaño de la luz aórtica. La longitud relativamente corta de la aorta ascendente (tejido aórtico entre la válvula aórtica y el despegue subclavio derecho) puede desafiar a los investigadores a controlar con precisión la cánula aórtica y requerir una coordinación cuidadosa entre los compañeros de equipo. No posicionar y asegurar adecuadamente la cánula dentro de esta región puede arruinar la preparación. Por ejemplo, avanzar la cánula demasiado profundo puede dañar la válvula aórtica o provocar la canulación intraventricular. Colocar la cánula demasiado poco profunda dentro del arco aórtico puede provocar una fuga de perfusato de una de las ramas, como la arteria subclavia. Además, la canulación contundente puede desgarrar la aorta. Tales consecuencias de la canulación inartusa se manifestarán con altas tasas de flujo o bajas presiones de perfusión1. Alternativamente, los caudales bajos o las altas presiones de perfusión pueden indicar la presencia de trombos, émbolos de aire, oclusión de cánulas u obstrucción coronaria1. Las arritmias, la bradicardia o la taquicardia son signos de perfusión inadecuada independientemente de la etiología 1,33.
Inicialmente se debe elegir una estrategia de perfusión común y directa; flujo constante utilizando perfusato cristaloide tamponado con glucosa como sustrato en un corazón que late espontáneamente1. Las adaptaciones a este enfoque deberán evaluarse en trabajos futuros y deben incluir una evaluación del efecto de los diferentes enfoques de perfusión y estrategias alternativas de perfusato y sustrato. Si bien se demostró que la perfusión miocárdica en esta preparación es adecuada para los corazones P10, la tasa de flujo elegida podría exceder las necesidades del corazón del recién nacido. Esto se debe a que el gasto cardíaco en ratones de 10 días de edad es de aproximadamente 5,3 ml min-1 31. Por lo tanto, el trabajo futuro debe investigar el efecto de los diferentes caudales y evaluar las estrategias de presión constante.
Los enfoques de presión constante pueden implicar mecanismos de ajuste de flujo en tiempo real o una válvula de arranque para limitar la presión máxima5. Esto puede ser particularmente importante cuando se estudia la lesión por isquemia-reperfusión, dada la importancia de evaluar la autorregulación coronaria en este contexto5. Además, si bien la frecuencia cardíaca intrínseca se puede utilizar como un biomarcador para la adecuación de la perfusión, es probable que las estrategias de estimulación sean factibles y deban investigarse en el futuro. Finalmente, el trabajo futuro también debe evaluar sustratos de energía alternativa en el perfusato oxigenado. Esto se debe a que el corazón del recién nacido pasa de usar glucosa y lactato a consumir ácidos grasos en el período neonatal11,14. Por lo tanto, los sustratos metabólicos alternativos pueden ser más relevantes fisiológicamente en este período crítico de desarrollo.
Continúan surgiendo avances metodológicos para evaluar la función cardíaca murina. Aunque el número total de estudios de investigación que utilizan la preparación de Langendorff se ha mantenido constante cada año desde la década de 1990, el porcentaje de trabajo que utiliza prácticas ex vivo específicas de murino ha aumentado constantemente5. Así, la importancia del corazón murino aislado como modelo científico ha aumentado con el tiempo. Las innovaciones, como el método descrito aquí, ahora permiten que el campo amplíe el enfoque del corazón de ratón recién nacido. Además de su utilidad en la investigación de isquemia-reperfusión, dicho método también podría servir como complemento de otros tipos de técnicas de investigación. Por ejemplo, la canulación exitosa del corazón de ratón recién nacido podría facilitar el aislamiento de cardiomiocitos. Hasta la fecha, solo se han dispuesto de métodos de digestión en trozos con rendimientos más bajos para aislar cardiomiocitos de ratón reciénnacidos 34. Por lo tanto, el uso de la preparación de Langendorff neonatal con una infusión retrógrada de agentes enzimáticos puede mejorar el rendimiento y la calidad de los cardiomiocitos aislados35.
La respuesta neonatal a la lesión isquémica no es igual a la del adulto, y el corazón inmaduro sufre varias transiciones durante el períodoneonatal 15,36. Sin embargo, es necesaria una mejor comprensión de la biología del desarrollo del corazón neonatal en la salud y la enfermedad. Los efectos diferenciales de la hipoxia, la isquemia y la reperfusión entre los corazones neonatales y adultos se han investigado desde la década de 1970. Sin embargo, estos trabajos previos se han limitado al uso de especies animales más grandes que el ratón37. La capacidad de generar mutantes transgénicos para estudiar vías específicas y proteínas de interés requiere el establecimiento de una preparación murina ex vivo para recién nacidos. El método detallado aquí permite una canulación aórtica exitosa para establecer la perfusión retrógrada del corazón murino recién nacido aislado. Usando este enfoque, los investigadores podrán estudiar la isquemia-reperfusión en relación con el ratón neonatal. Dicha investigación nos ayudará a comprender mejor los mecanismos de protección específicos neonatales durante la isquemia, la respuesta del recién nacido a la hipoxia y los cambios en el desarrollo anatómico y metabólico en el corazón inmaduro durante los estados de salud y enfermedad 36,38,39. Por lo tanto, el modelo de corazón neonatal perfundido aislado demostrará ser una herramienta poderosa para la investigación de la biología cardíaca del desarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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