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Neuroscience

Lokomotorische Bewertung des 6-Hydroxydopamin-induzierten adulten Zebrafisch-basierten Parkinson-Modells

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von adulten Zebrafischen mit neurotoxischem 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) am ventralen Zwischenhirn (Dn) und die Beurteilung der Beeinträchtigung und anschließenden Wiederherstellung der Nachbehandlung des Schwimmverhaltens unter Verwendung des offenen Tanktests, der von einer Analyse mit einer Video-Tracking-Software begleitet wird.

Abstract

Die Einschränkungen der derzeitigen Behandlungen bei der Verzögerung des dopaminergen neuronalen Verlusts bei der Parkinson-Krankheit (PD) erhöhen den Bedarf an alternativen Therapien, die diese Neuronen wiederherstellen können. Derzeit werden große Anstrengungen unternommen, um die Neuroregeneration anhand präklinischer In-vivo-Modelle besser zu verstehen. Diese regenerative Fähigkeit zur Selbstreparatur ist jedoch bei Säugetieren ineffizient. Nicht-Säugetiere, wie Zebrafische, haben sich daher aufgrund ihrer Fähigkeit, sich kontinuierlich selbst zu erneuern und eine enge Gehirnhomologie zum Menschen zu haben, zu einem ausgezeichneten neuroregenerativen Modell entwickelt. Im Rahmen der Bemühungen zur Aufklärung zellulärer Ereignisse, die an der Neuroregeneration in vivo beteiligt sind, haben wir das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-induzierte PD-Modell für erwachsene Zebrafische etabliert. Dies wurde durch die optimierte intrazerebroventrikuläre (ICV) Mikroinjektion von 99,96 mM 6-OHDA erreicht, um dopaminerge Neuronen (DpN) im ventralen Zwischenhirn (Dn) des Zebrafischgehirns spezifisch abzutragen. Immunfluoreszenz zeigte mehr als 85% der DpN-Ablation am dritten Tag nach der Läsion und die vollständige Wiederherstellung von DpN an der Läsionsstelle 30 Tage nach der Läsion. Die vorliegende Studie bestimmte die Beeinträchtigung und anschließende Erholung des Schwimmverhaltens von Zebrafischen nach einer Läsion unter Verwendung des Freifeldtests, durch den zwei Parameter, zurückgelegte Entfernung (cm) und mittlere Geschwindigkeit (cm / s), quantifiziert wurden. Die Fortbewegung wurde durch die Analyse der Aufzeichnungen einzelner Fische jeder Gruppe (n = 6) unter Verwendung einer Video-Tracking-Software bewertet. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante (p < 0,0001) Verringerung der Geschwindigkeit (cm / s) und der zurückgelegten Entfernung (cm) von läsionierten Zebrafischen 3 Tage nach der Schärfe im Vergleich zu Schein. Der mit Läsionen versehene Zebrafisch zeigte 30 Tage nach der Läsion eine vollständige Erholung des Schwimmverhaltens. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass 6-OHDA-läsionierter erwachsener Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell mit reproduzierbarer Qualität ist, um die Untersuchung der Neuroregeneration bei Parkinson zu erleichtern. Zukünftige Studien zu den Mechanismen, die der Neuroregeneration zugrunde liegen, sowie zu intrinsischen und extrinsischen Faktoren, die den Prozess modulieren, können wichtige Einblicke in neue Zellersatzbehandlungsstrategien gegen Parkinson liefern.

Introduction

Die Parkinson-Krankheit (PD), eine Krankheit, die durch Muskelsteifheit, Ruhetremor und Bradykinesie gekennzeichnet ist, ist die am schnellsten wachsende neurologische Erkrankung der Welt1,2. Das Risiko und die Prävalenz von Parkinson nehmen mit zunehmendem Alter rapide zu, insbesondere bei Personen im Alter von 50 Jahren und darüber3. Die Ätiologie und Pathogenese der Parkinson-Krankheit ist bisher kaum verstanden. Dies hat oft dazu geführt, dass der frühe Beginn der PD nicht diagnostiziert wurde. Gegenwärtig sind der Mangel an Dopamin und der Verlust von dopaminergen Neuronen (DpN) bei PD-Patienten stark mit der Manifestation motorischer Symptome verbunden4. Um diese Beziehung zu nutzen, wurden mehrere Behandlungen entwickelt, um entweder direkt als Dopaminersatz (dh Levodopa) zu wirken oder den Verlust von DpN (dh Tiefe Hirnstimulation) zu kompensieren. Obwohl diese Behandlungen symptomatische Vorteile mit sich bringen, verändern sie nicht den sich verschlechternden Krankheitsverlauf5. Angesichts dieser erheblichen Schwäche wurde eine Zellersatztherapie vorgeschlagen. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes ist jedoch angesichts der Herausforderungen der Transplantatvorbereitung, der Zellwachstumskontrolle und der Phänotypinstabilität inkonsistent. Die Zellersatztherapie, die ethische Bedenken aufgeworfen hatte, birgt auch das Risiko, Hirntumore und unerwünschte Immunreaktionen auszulösen6,7.

Die Einschränkungen der derzeitigen therapeutischen Strategien haben dazu geführt, dass die Regeneration von DpN als potenzieller Ansatz bei der Behandlung von Parkinson stärker in den Vordergrund gerückt ist. Die Regeneration von DpN oder Neuroregeneration hat sich als einer der vielversprechenden Durchbrüche in der Behandlung von Parkinson herausgestellt, nicht nur aufgrund ihres Potenzials als neue therapeutische Methode, sondern auch als Mittel zum Verständnis des Mechanismus der Krankheit8. 9. Dieser Ansatz konzentriert sich auf die Wiederherstellung der neuronalen Funktion durch Differenzierung, Migration und Integration bestehender Vorläuferzellen in die läsionierten Schaltkreise10. Um die Neuroregeneration weiter zu erforschen, wurden verschiedene In-vivo-Studien durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass Wirbeltiere wie Säugetiere, Amphibien und Reptilien nach Verletzungen neue Gehirnzellen erzeugen11,12. Unter den Wirbeltieren sind Säugetiere aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen begehrter. Säugetiere weisen jedoch eine begrenzte und schlechte Reparationskapazität im zentralen Nervensystem (ZNS) auf, die nach einer Hirnläsion bis ins Erwachsenenalter andauern kann13. Im Allgemeinen sind Säugetiere als Tiermodelle für das Verständnis der Neuroregeneration ungeeignet, da die geringe Anzahl der produzierten Neuronen nicht ausreicht, um beschädigte neuronale Schaltkreise, die bei PD beobachtet werden, wiederherzustellen. Daher wird das teleostbasierte Modell, insbesondere bei Zebrafischen, aufgrund seiner hohen Proliferativrate, seiner Fähigkeit, sich kontinuierlich selbst zu erneuern, und der engen Gehirnhomologie mit dem Menschen stark bevorzugt14,15.

Zebrafisch wird am häufigsten verwendet, um Bewegungsstörungen bei PD16 zu untersuchen. Das auf Zebrafischen basierende PD-Modell wird normalerweise durch Neurotoxine induziert, zu denen 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)17 gehören. Obwohl MPTP-basierte Modelle den spezifischen Verlust von DpN und die Abnahme des Dopaminspiegels wirksam induzieren, ahmen sie die Bedingungen von PD nicht genau nach, da der DpN-Verlust nicht ausschließlich auf das CNS18 beschränkt ist. Die Unfähigkeit von 6-OHDA, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, schränkte seine Auswirkungen auf zelluläre und funktionelle Veränderungen im Gehirn ein, wenn es intrakraniell verabreicht wird, im Gegensatz zu intramuskulär19. Die periphere Verabreichung von 6-OHDA führte zu einer globalen Senkung des Dopaminspiegels im gesamten Nervensystem20. Während die Verabreichung von 6-OHDA in die Zerebrospinalflüssigkeit eine Ablation von DpN im gesamten ZNS21 verursachte, was nicht den Zustand nachahmt, wie er bei PD beobachtet wird, wobei der Verlust von DpN speziell an der Substantia nigra des menschlichen Gehirns auftritt. Die ICV-Verabreichung von 6-OHDA hingegen induzierte spezifisch eine signifikante Ablation von DpN im Bereich des ventralen Dn im Zebrafischgehirn, die Substantia nigra22 sehr ähnlich war. Interessanterweise wurde eine Erholung von DpN 30 Tage nach der 6-OHDA-induzierten Läsion berichtet und diese Neuronen überlebten im Laufe des Lebens23,24. Die funktionelle Erholung von DpN wurde durch eine lokomotorische Bewertung der zurückgelegten Strecke (cm) und der mittleren Geschwindigkeit (cm/s) unter Verwendung des 6-OHDA-induzierten PD-Modells für erwachsene Zebrafische22 nachgewiesen.

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Protocol

Die vorliegende Studie wurde vom Committee on Animal Research and Ethics (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) genehmigt [Reference No: UiTM CARE 346/2021, datiert vom 7. Mai 2021].

HINWEIS: Die veröffentlichten Protokolle22,25,26 für die Standardhaltung und Wartung des 6-OHDA-läsionierten adulten Zebrafisch-PD-Modells wurden verwendet. Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen Zebrafischen (Danio rerio) im Alter von mehr als fünf Monaten mit einer standardisierten Länge von 3,2-3,7 cm durchgeführt.

1. Zebrafischpflege und Prä-ICV-Mikroinjektionspräparate

  1. Halten Sie die Fische in einem belüfteten Wassertank unter einer kontrollierten Temperatur von 28 ± 1,0 ° C. Verwenden Sie für die Haltung und Pflege von Zebrafischen während des gesamten Experiments destilliertes Wasser, das mit kommerziellem Meersalz (1 g/L) mineralisiert ist27.
  2. Unterbringen Sie maximal 25 Fische pro 45 l Tank oder einen Fisch pro 1,8 l Wasser und setzen Sie sie einem Zeitplan von 14 h hellem und 10 h dunkler Photoperiode aus. Füttern Sie die Fische mindestens zweimal täglich mit Futterpellets, die mit gefriergetrockneten Würmern ergänzt werden.
  3. Es wird eine konzentrierte Stammlösung von Tricainmethansulfonat (MS-222) hergestellt, indem 2,5 g MS-222 und 5 g Natriumbicarbonat in 250 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Verdünnen Sie 2 ml Stammlösung, um 200 ml Arbeitsanästhesielösung herzustellen.
  4. Herstellen Sie 99,96 mM 6-OHDA, indem Sie zuerst 0,2 mg Ascorbinsäure in 1 ml 0,9% w/v sterilfiltriertem NaCl auflösen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-Mikron-Filter, bevor Sie 25 mg 6-OHDA in Pulverform in die Lösung geben. Bereiten Sie die Lösung vor jeder Injektion frisch vor und lagern Sie sie bei Dunkelheit bei 4 °C.
    VORSICHT: Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Laborkittel und Gesichtsmaske) und praktizieren Sie beim Umgang mit den Chemikalien gute Laborpraktiken. Alle Handhabungen der Chemikalien sollten innerhalb einer Biosicherheitskabine erfolgen.

2. Anästhesie und ICV-Injektion von Zebrafischen

  1. Fasten Sie den Fisch für 24 h, um ein Aufstoßen während der Anästhesie zu vermeiden. Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für ca. 1 min oder bis zur Einstellung aller sichtbaren Muskelbewegungen in einen Behälter mit 0,01% w/v MS-222-Lösung tauchen.
  2. Positionieren Sie den betäubten Fisch auf einem wassergetränkten Schwamm unter einem Stereomikroskop und befeuchten Sie den Fisch regelmäßig.
  3. Identifizieren Sie die Position für die Injektion basierend auf dem Schnittpunkt zwischen der metopischen Naht (MS), der koronalen Naht (CS) und der sagittalen Naht (SS), die den frontalen und parietalen Schädel des Zebrafischgehirns verbindet.
  4. Machen Sie ein kleines Loch mit einer Fläche von 1,0 mm2 mit einer scharfen 27-G-Nadel im Schädel, die von der spezifischen anatomischen Position auf dem Zebrafischschädel geleitet wird (Abbildung 1A, B).
  5. Senken Sie den Mikrokapillarinjektor in einem Winkel von 60° ab, bis er eine Tiefe von 1.200 μm vom Schädeldach des Zebrafischschädels erreicht (Abbildung 1C). Drücken Sie die Z-Grenze, um die Position zu fixieren.
  6. Stellen Sie den anfänglichen Einspritzdruck auf 4000 hPa und den Kompensationsdruck auf 10 hPa ein. Stellen Sie die Dauer der Injektion auf 0,3 s ein. Verringern Sie die Intensität der Injektion mit jeder nachfolgenden Injektion.
  7. Injizieren Sie 0,5 μL 99,96 mM Neurotoxin 6-OHDA (oder 0,9% w/v Kochsalzlösung für Scheinkontrollgruppe) und lassen Sie die Mikrokapillare für 20 s ruhen. Befeuchten Sie den Fisch während des gesamten Injektionsprozesses weiterhin mit destilliertem Wasser, um ein Austrocknen zu verhindern.
  8. Entfernen Sie langsam die Mikrokapillare und beleben Sie den Fisch unter fließendem destilliertem Wasser. Legen Sie den Fisch in ein isoliertes Auffangbecken und entfernen Sie alle Ablenkungen, die den Genesungsprozess stören können.
  9. Spülen Sie die Mikrokapillare vor der nächsten Injektion, um die Blockade zu beseitigen und sicherzustellen, dass die Intensität der Injektion ausreicht, um das gewünschte Volumen von 0,5 μL 6-OHDA zu erhalten.

Figure 1
Abbildung 1: Injektionsstelle des Neurotoxins, 6-OHDA. (A) Der Punkt des mikrokapillaren Eintritts wird durch den Schnittpunkt zwischen der metopischen Naht (MS), der koronalen Naht (CS) und der sagittalen Naht (SS) geleitet, die den frontalen und parietalen Schädel des Zebrafischgehirns verbindet (Draufsicht). (B) Eine schematische Zeichnung (Draufsicht) des Zebrafischschädels und des Gehirns zeigt die Mikrokapillare, die direkt über der Habenula (Hab) abgesenkt ist, und ihren Eintrittspunkt an der Kreuzung zwischen den Hemisphären. (C) Eine schematische Zeichnung (sagittaler Schnitt) des Zebrafischgehirns zeigt den Injektionswinkel und die Eindringtiefe. Der schwarze Punkt stellt die läsionierte Stelle dar, die sich über dem Zielbereich, dem ventralen Zwischenhirn, befindet. Abkürzungen: 6-OHDA: 6-Hydroxydopamin, CS: koronale Naht, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: metopische Naht, OB: Riechkolben, POA: präoptischer Bereich, PT: posteriores Tuberculum, SS: sagittale Naht, Tectum, und Tel: Telencephalon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Beurteilung des Bewegungsapparates

HINWEIS: Die lokomotorische Beurteilung von Zebrafischen (n = sechs / Gruppe; Schein vs. Läsion) wurde individuell über den offenen Tanktest unter Verwendung der etablierten Protokolle28,29 am dritten Tag und am Tag 30 nach der 6-OHDA-Läsion beurteilt.

  1. Videoaufzeichnung
    1. Stellen Sie den Versuchstank (Länge 20 cm, Breite 11,5 cm, Höhe 13 cm) mit seinen mit weißem Papier bedeckten Wänden auf eine erhöhte Plattform (Abbildung 2A).
    2. Beleuchten Sie den Tank von unten mit einer Lichtquelle. Füllen Sie den Tank mit destilliertem Wasser (80% -90% voll) und halten Sie die Temperatur bei 28 ± 1,0 ° C. Messen Sie die Temperatur mit einem Thermometer und regulieren Sie sie mit einer handelsüblichen Aquarienheizung.
    3. Zeichnen Sie nach mindestens 2 Minuten Akklimatisierung das Schwimmverhalten der Fische aus einer Draufsicht auf der 2-dimensionalen (2D) Ebene der Versuchsarena mit einer Videokamera für 5 Minuten auf (Abbildung 2B). Um Inkonsistenzen im Schwimmverhalten der früheren und letzten Charge von Aufnahmen zu vermeiden, überschreiten Sie die Akklimatisierung nicht um 10 min30.
    4. Analysieren Sie die Videos mit einer Video-Tracking-Software mit dem Open-Tank-Protokoll zur Erfassung der zurückgelegten Strecke (cm) und der mittleren Geschwindigkeit (cm / s) jedes Motivs.

Figure 2
Abbildung 2: Versuchsaufbau eines offenen Tanktests zur Beurteilung des Bewegungsmotorverhaltens von Zebrafischen . (A) Der Versuchstank (Vorderansicht) befindet sich auf einer erhöhten Plattform, die von unten beleuchtet wird. Die vier Wände des Tanks sind mit weißem Papier bedeckt und die Aufnahmen werden axial erfasst. Die Temperatur wird mit einem Thermometer gemessen und mit einer handelsüblichen Aquarienheizung bei 28 ± 1,0 °C geregelt. (B) Screenshot (Draufsicht) der Videoaufzeichnung, die mit dem Setup aufgenommen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Datenanalyse
    1. Doppelklicken Sie auf das Symbol, um die Video-Tracking-Software zu öffnen. Klicken Sie auf die Registerkarte Datei und wählen Sie Neues leeres Experiment erstellen aus. Dies ermöglicht es dem Benutzer, die Experimentparameter entsprechend den Zielen der Untersuchung anzupassen.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Protokoll , wählen Sie Videoquellen und klicken Sie auf Neue Videoquelle hinzufügen. Klicken Sie auf die verfügbare Dropdown-Liste und wählen Sie die Option Videodatei . Dadurch wird das Popup-Fenster zum Durchsuchen der Datei angezeigt, aus dem die gewünschten Videoaufzeichnungen ausgewählt werden können.
    3. Klicken Sie auf die Unterregisterkarte Gerät und wählen Sie das rechteckige Symbol, um das Gerät einzurichten. Ziehen Sie das rechteckige Symbol, um die gesamte experimentelle Arena abzudecken. Stellen Sie den Maßstabsbalken entsprechend ein und geben Sie den numerischen Wert der Skalenmessung ein, die in der Länge des Linealabschnitts verwendet wird. Das vorliegende Experiment verwendete eine 10-mm-Skala für den offenen Tanktest.
    4. Legen Sie die Tierfarbe fest, indem Sie Die Tiere sind dunkler als der Gerätehintergrund auswählen. Behalten Sie die anderen verfügbaren Optionen in der Nachverfolgung den voreingestellten Standardeinstellungen bei.
    5. Klicken Sie auf der Unterregisterkarte Zonen auf das zuvor gezeichnete Gerät. Diese Zone wird als Standardzone festgelegt, deren Position für alle Tests gleich ist.
    6. Wählen Sie unter Testplanung und Testdatenbericht die folgenden Optionen aus: Testdauer, Gesamtzurückgelegte Strecke und Durchschnittsgeschwindigkeit. Andere verfügbare Tests auf der Liste sind optional und hängen vom Untersuchungsinteresse des Forschers ab.
    7. Weisen Sie auf der Registerkarte Versuch die Tiere entsprechend ihrer Testgruppe zu, indem Sie den Gruppennamen im Abschnitt Name und die Anzahl der Tiere pro Gruppe im Abschnitt Anzahl der Tiere eingeben.
    8. Wechseln Sie zur Registerkarte Tests , um den Test auszuführen. Klicken Sie auf das Symbol Test starten und warten Sie, bis alle Videos analysiert sind.
    9. Klicken Sie auf der Registerkarte Ergebnisse auf das Symbol Bericht anzeigen , um die Bewegungsdaten im Textberichtsformular anzuzeigen.

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Representative Results

Das vorliegende Experiment untersuchte die Veränderungen des Schwimmverhaltens erwachsener Zebrafische nach ICV-Mikroinjektion mit 6-OHDA. Der Grund für die Verwendung von 6-OHDA als Neurotoxin der Wahl lag in seiner Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, was zu einer spezifischen und gezielten Ablation von DpN im Bereich des interventralen Zwischenhirns (Dn)16 führte. Die DpN-Subpopulation hat hier anatomische Ähnlichkeit mit der DpN-Subpopulation in der Substantia nigra pars compacta31 des Menschen.

Gemäß unserer früheren Arbeit22 wurde die zelluläre Wirkung der 6-OHDA-ICV-Mikroinjektion gegen DpN von erwachsenen Zebrafischen durch Immunhistostaining von DpN-Marker-Tyrosin-Hydroxylase (TH) bestätigt. Die Haupthirnregion von Interesse war das Dn, bestehend aus dem präoptischen Bereich (POA), dem hinteren Tuberkulum (PT) und dem Hypothalamus (Hyp). Es wurde festgestellt, dass 99,96 mM 6-OHDA zu einer 100%igen Überlebensrate des erwachsenen Zebrafisches mit der niedrigsten Anzahl von TH-immunreaktiv (TH-ir) in Dn führten. Es wurde auch festgestellt, dass mehr als 85% (p < 0,01) der TH-ir DpN im Dn am dritten Tag nach der Läsion abgetragen wurden. Die Anzahl der TH-ir DpN stieg dann am Tag 14 der Postlesion um mehr als 50%, bevor die vollständige Regeneration 30 Tage nach der Läsion erreicht wurde (Abbildung 3). Diese Daten unterstützen die Regenerationsfähigkeit der DpN-Subpopulation in Dn von erwachsenen Zebrafischen nach Ablation32.

Figure 3
Abbildung 3: Regeneration von DpN im Dn-Bereich von Zebrafischläsionen, die durch 99,96 mM 6-OHDA harmonisiert werden. (A) Die Anzahl der TH-ir DpN in drei Hauptbereichen der Dn-Region, POA, PT und Hyp, über vier Datenpunkte: Schein, 3, 14 und 30 Tage nach der Läsion durch 99,96 mM 6-OHDA-Neurotoxin. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SD von n = 6 unabhängigen Experimenten; *p < 0,05. (B) Repräsentative konfokale Mikroskopbilder von sagittal geschnittenen Zebrafischgehirn von Scheinfischen (I, I' und I''), 3 Tage nach der Läsion (II, II' und II''), 14 Tage nach der Läsion (III, III' und III'') und 30 Tage nach der Läsion (IV, IV' und IV''), gefärbt mit TH (DpN; grün) und DAPI (Kerne; blau). Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen - DAPI: 4′, 6-Diamidino-2-phenylindol, 6-OHDA: 6-Hydroxydopamin, Dn: Zwischenhirn, DpN: dopaminerge Neuronen, Hyp: Hypothalamus, POA: präoptischer Bereich, PT: hinteres Tuberkulum, SD: Standardabweichung und TH-ir: Tyrosinhydroxylase immunoreaktiv. Adaptiert von Vijayanathan et al.22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Wir führten dann eine lokomotorische Beurteilung mit dem offenen Tanktest durch, um Änderungen der zurückgelegten Entfernung (cm) und der mittleren Geschwindigkeit (cm / s) von erwachsenen Zebrafischen nach ICV-Mikroinjektion von 6-OHDA und Schein zu untersuchen. Experimentelle Fische wurden dann am dritten Tag der Postlesion (geringste Anzahl von TH-ir DpN beobachtet) und am Tag 30 nach der Postlesion (vollständig wiederhergestellte DpN, die an der Läsionsstelle gemeldet wurde) untersucht. Die Analyse des Schwimmverhaltens von Zebrafischen mit einer Video-Tracking-Software ergab, dass sowohl die mittlere Geschwindigkeit (cm/s) als auch die zurückgelegte Strecke (cm) der läsionierten Gruppe am dritten Tag nach der Läsion signifikant reduziert waren (p < 0,001) auf <45% im Vergleich zu Schein (Abbildung 4). Die läsionierte Gruppe zeigte eine Wiederherstellung der motorischen Funktion 30 Tage nach der Läsion ohne signifikanten Unterschied sowohl der mittleren Geschwindigkeit (cm / s) als auch der zurückgelegten Strecke (cm) im Vergleich zur Täuschung.

Figure 4
Abbildung 4: Veränderungen des Schwimmverhaltens nach intrazerebroventrikulärer Injektion durch 6-OHDA. Das Schwimmverhalten von erwachsenen Zebrafischen wurde vor der Läsion beurteilt, am dritten Tag und am Tag 30 nach der Läsion mit 99,96 mM 6-OHDA. Zu den Parametern, die bewertet wurden, gehörten: (A) mittlere Geschwindigkeit (cm/s) und (B) zurückgelegte Strecke (cm). Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SD von sechs Fischen; p < 0,0001 (Student t-Test). Abkürzungen: 6-OHDA: 6-Hydroxydopamin, SD: Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die vorliegende Arbeit demonstrierte erfolgreich die lokomotorische Beurteilung des etablierten 6-OHDA-induzierten, adulten Zebrafisch-basierten PD-Modells. Das gesamte Experiment umfasste drei Hauptschritte: Prä-ICV-Mikroinjektionspräparate, ICV-Mikroinjektion von Zebrafischen und lokomotorische Bewertung. Um die gesunde Erholung von erwachsenen Zebrafischen nach dem ICV-Mikroinjektionsverfahren und gute experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten, wurden in der vorliegenden Studie einige gute Praktiken für jeden Schritt empfohlen.

Vorbereitung vor der ICV-Mikroinjektion: Die Tierselektion wurde am besten am Tag vor dem Experiment durchgeführt. Das Geschlecht wurde identifiziert und die Länge des Fisches gemessen. Männliche erwachsene Zebrafische mit einer standardisierten Länge von 3,2-3,7 cm wurden in einem separaten Versuchsbecken platziert. Zusätzlich sollten die Fische eine 24-stündige Fastenzeit durchlaufen, um ein Aufstoßen während der Narkose zu vermeiden33. Ein Aquarium (mit seinen vier Wänden, die mit weißem Papier bedeckt sind) mit einem stehenden Wassertank sollte vor dem Experiment vorbereitet werden, um die äußere Belastung zu verringern und den Erholungsprozess des Zebrafisches zu unterstützen. Alle Chemikalien wurden vor Beginn jedes Experiments frisch zubereitet, da sie sich im Laufe der Zeit schnell verschlechtern und bei Raumtemperatur instabil werden konnten34,35.

Mikroinjektion von 6-OHDA: Eine saubere und schonende Handhabung von Zebrafischen sollte während des gesamten Prozesses durchgeführt werden, um die Einführung unnötiger Verletzungen und Infektionen des Fisches zu verhindern. Der Fisch sollte auf einen nassen Schwamm gelegt und in feuchtem Zustand gehalten werden, um ein Austrocknen zu vermeiden36. Ein kleiner Schnitt wurde mit einer sterilen Nadel mit fester und angemessener Kraft gemacht, um zusätzlichen Druck zu vermeiden, der den Zebrafischschädel knacken könnte. Dieser Schnitt sollte den Eintritt der Mikrokapillare in die Gehirnhöhle ermöglichen. Die Mikrokapillare wurde dann bis zu einer Tiefe von 1.200 μm vom Eintrittspunkt abgesenkt, der sich zwischen zwei Hemisphären befindet - dem Telencephalon und dem Tectum (Abbildung 1B, C). Der Eintrittspunkt wurde zwischen diesen Hemisphären gewählt, um eine zusätzliche Platzwunde von Neuronen zu verhindern37. Diese Technik beinhaltete die Verwendung eines Mikroinjektors, der Druck und der Zeitpunkt der Abgabe sollten kalibriert werden, um die Abgabe von 0,5 μL Neurotoxin sicherzustellen. Diese Kalibrierung kann durchgeführt werden, indem die Größe des auf dem Filterpapier gebildeten Tröpfchens gemessen wird38. Unsere Praxis beinhaltete in der Regel die anschließende Festlegung programmierbarer Parameter, wobei die Intensität der Injektion mit jeder nachfolgenden Injektion gesenkt wurde (Einspritzdruck: 4000 hPa, Dauer der Injektion: 0,3 s und Kompensationsdruck: 10 hPa). Um zu verhindern, dass das Neurotoxin aus der Gehirnhöhle austritt, wurde ein 20-Sekunden-Intervall zwischen Injektion und Entzug der Mikrokapillare angewendet35. Aufgrund der geringen Größe der Kapillare kann die Mikrokapillare nach jeder Injektion blockiert werden. Daher sollte die Mikrokapillare vor der nächsten Injektion im Wesentlichen gespült werden, um die Blockade zu beseitigen und sicherzustellen, dass die Intensität der Injektion ausreicht, um das gewünschte Volumen von 0,5 μL 6-OHDA zu erhalten. Die Fische würden dann in ein Auffangbecken gebracht, das bei 28 ± 1,0 °C gehalten wird. Wenn sich der Fisch nicht innerhalb von 30 s erholt, spülen Sie seine Kieme und sein Maul mit destilliertem Wasser aus, bis die Muskelbewegungen vollständig wiederhergestellt sind.

Lokomotorische Bewertung: Um eine gute lokomotorische Beurteilung an 6-OHDA-induzierten erwachsenen Zebrafischen zu gewährleisten, sollte die Verhaltensstudie innerhalb des gleichen Zeitrahmens für jeden Zeitpunkt durchgeführt werden. Jede Verhaltensstudie sollte eine Eingewöhnungszeit von mindestens 2 Minuten vorsehen und innerhalb von 4 h39 durchgeführt werden. Das vorliegende Experiment wurde am frühen Morgen zwischen 8.00 und 12.00 Uhr durchgeführt, da Zebrafische in dieser Zeit aktiver waren40. Eine längere Akklimatisierungsphase ist notwendig, wenn Zebrafische ein abnormales Verhalten mit deutlichen Anzeichen von Stress und Angst (Einfrieren und unregelmäßiges Verhalten) zeigen41. Um jedoch Inkonsistenzen im Schwimmverhalten der früheren und der letzten Charge von Aufzeichnungen zu vermeiden, sollte die Akklimatisierung 10 min30 nicht überschreiten. Für den Freifeldtest könnte ein experimenteller Tank jeder Größe, Farbe, Form und Textur für Aufnahmen verwendet werden, die von mindestens 5 bis 30 min42,43 reichen. Das Verhalten von Zebrafischen wird stark von der Temperatur seiner Umgebung beeinflusst. Kleine Schwankungen von mehr als 4 °C könnten die Schwimmgeschwindigkeit stark beeinflussen44. Daher sollte die Temperatur des Wassers im Versuchstank unter einer kontrollierten Temperatur von 28 ± 1,0 ° C mit einer kommerziellen Heizung streng gehalten werden, und der Wasserstand wurde während des gesamten Experiments etwa 12 cm tief gehalten. Die Wände des Tanks wurden mit weißem Papier bedeckt, um einen Kontrast zwischen der Testperson und der Versuchsarena zu schaffen und externe Reize zu reduzieren, die eine unaufgeforderte Reaktion der Probanden hervorrufen können45. Die Fische aus jeder Gruppe wurden einzeln in Übereinstimmung mit der aktuellen Standardpraxis für die Neuroverhaltensforschung von Zebrafischen getestet23,37,46. Angesichts der Neigung der Zebrafische zu sozialen Interaktionen besteht die Befürchtung, dass sich die Isolation während des Testzeitraums auf ihr Verhalten auswirken könnte47. Der derzeitige Versuchsaufbau war jedoch auf maximal 10 Minuten pro Versuch begrenzt, und es wurde festgestellt, dass diese kurze Isolationszeit keinen Einfluss auf die lokomotorische Aktivität von erwachsenen Zebrafischen hatte48. Um eine genaue Datenerhebung für die Verhaltensstudie zu ermöglichen, wurde die Bewertung durchgeführt, indem der Zebrafisch während des Tests des offenen Tanks nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen experimentellen Gruppen ausgewählt wurde (d. h. abwechselnd zwei Zebrafische aus der Schein- und 6-OHDA-Läsionsgruppe bis n = 6). Die aufgenommenen Videos wurden mit einem Video-Tracking-System analysiert, das üblicherweise für die Verhaltensverfolgung von Nagetieren verwendet wird. Da es sich bei Zebrafischen um ein aufstrebendes Tiermodell handelt, werden die mit Zebrafischen durchgeführten Verhaltenstests in der Regel aus der etablierten wissenschaftlichen Literatur über Nagetiere übernommen50. Hier demonstrierten wir die Fähigkeit der Video-Tracking-Software, Zebrafische im Versuchsbereich automatisch zu verfolgen und die gewünschten Parameter effektiv zu berechnen. Die Video-Tracking-Software hob sich von der anderen verfügbaren Software durch die Vielfalt der von der Software unterstützten Videodateien, regelmäßige Update-Paketversionen und Unterstützung für verschiedene Betriebssysteme ab51.

Eine der Einschränkungen bestehender tierbasierter PD-Modelle ist der Mangel an mechanistischen Ähnlichkeiten, die die motorische Beeinträchtigung nachahmen, wie sie nach dopaminergen neuronalen Verlusten in der Substantia nigra pars compacta des menschlichen Gehirns beobachtet wurde52. Das Aufkommen des auf erwachsenen Zebrafischen basierenden PD-Modells kann jedoch diese besondere Einschränkung beheben. Wie in der vorliegenden Studie beobachtet, entsprach die reduzierte Schwimmgeschwindigkeit unseren früheren zellulären Ergebnissen, wobei mehr als 85% dopaminerger neuronaler Verlust im ventralen Zwischenhirn von 6-OHDA-induzierten adulten Zebrafischen drei Tage nach der Läsion modellieren22. Es scheint, dass eine spezifische Ablation von dopaminergen Neuronen in diesem Interessenbereich erforderlich ist, um die absteigende motorische Signalgebung aus dem Gehirn zu stören, was zu einer Langsamkeit der Bewegung führt53. L. J. Caldwell, et al.23, die beispielsweise eine ICV-Injektion von 6-OHDA am optischen Tectum (Point of Entry) durchführten, beobachteten nur Veränderungen im Schwarm- und Paarungsverhalten von Zebrafischen. Die Ablation von DpN im ventralen Dn ist von entscheidender Bedeutung, da die Population von DpN im Dn erwachsener Zebrafische als einzige Dopaminquelle für Zebrafisch-Motoneuronen fungiert. Dies ist analog zur menschlichen substantia nigra54. Die vorliegende Studie beobachtete auch eine schnellere Schwimmgeschwindigkeit und eine längere Strecke, die von läsionierten Zebrafischen in späteren Zeitpunkten nach der Läsion zurückgelegt wurde, was auf eine fortgesetzte und letztendlich vollständige Wiederherstellung der Dopaminsignalisierung hinweist, die das Schwimmverhalten von Zebrafischen steuert. Diese Ergebnisse bestätigten somit die Fähigkeit neu regenerierter dopaminerger Neuronen, ihre funktionellen Aktivitäten in läsionierten erwachsenen Zebrafischen wiederzuerlangen.

Der aktuelle Anwendungsweg von 6-OHDA beinhaltete ein leicht invasives Injektionsparadigma, das die Insertion von Mikrokapillaren tief in das Gehirn in Richtung des Läsionsbereichs des ventralen Dn erforderte. Diese Methode ist im Vergleich zur peripheren Injektion etwas mühsam und muss innerhalb von 3 Minuten pro Fisch durchgeführt werden, um das Mortalitätsrisiko nach der Injektion zu verringern. Daher ist eine vorherige Praxis der ICV-Injektion erforderlich, um sicherzustellen, dass die Methode innerhalb der kritischen Dauer im Zielbereich (Dn) durchgeführt werden kann. Um eine valide lokomotorische Beurteilung von erwachsenen Zebrafischen zu erreichen, ist der offene Tanktest auf nur 4 h Untersuchungszeitraum pro Tag begrenzt. Daher ist eine vorherige Planung in einem Versuchsrahmen erforderlich, der eine große Anzahl von Tieren umfasst, wobei zusätzliche Zeit zugewiesen werden sollte, um sicherzustellen, dass der Aufbau die Mindestanforderungen für jede Aufzeichnung (z. B. Temperatur und Wassertiefe) erfüllt. Diese Planung ist besonders bei zeitbasierten Experimenten wie dem der aktuellen Studie von entscheidender Bedeutung, da jede Aufzeichnung zum vorgesehenen Zeitpunkt durchgeführt werden muss. Der vorliegende Versuchsaufbau beschränkte sich auf die Untersuchung von zwei Schwimmparametern, die speziell die motorische Funktion von Zebrafischen bewerteten. Andere Verhaltensparameter wie Untiefe und angstähnliches Verhalten erforderten jedoch andere Versuchsaufbauten und andere analytische Methoden. Zusammenfassend ist dies eine reproduzierbare und nützliche Methode, um den DpN-Neuroregenerationsprozess in 6-OHDA-induzierten adulten Zebrafischen zu untersuchen, die wichtige Einblicke in Zellersatzbehandlungsstrategien gegen PD liefern können.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)] unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

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Neuroscience Ausgabe 178
Lokomotorische Bewertung des 6-Hydroxydopamin-induzierten adulten Zebrafisch-basierten Parkinson-Modells
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Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

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