Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Il presente protocollo descrive l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.

Abstract

I limiti degli attuali trattamenti nel ritardare la perdita neuronale dopaminergica nella malattia di Parkinson (PD) aumentano la necessità di terapie alternative in grado di ripristinare questi neuroni. Molti sforzi sono attualmente diretti verso una migliore comprensione della neurorigenerazione utilizzando modelli preclinici in vivo . Questa capacità rigenerativa per l'autoriparazione è, tuttavia, inefficiente nei mammiferi. Gli animali non mammiferi come il pesce zebra sono così emersi come un eccellente modello neurorigenerativo grazie alla sua capacità di auto-rinnovarsi continuamente e di avere una stretta omologia cerebrale per gli esseri umani. Come parte dello sforzo per chiarire gli eventi cellulari coinvolti nella neurorigenerazione in vivo, abbiamo stabilito il modello pd a base di pesce zebra adulto indotto da 6-idrossidopamina (6-OHDA). Ciò è stato ottenuto attraverso la microiniezione intracerebroventricolare (ICV) ottimizzata di 99,96 mM 6-OHDA per ablare specificamente i neuroni dopaminergici (DpN) nel diencefalo ventrale (Dn) del cervello del pesce zebra. L'immunofluorescenza ha indicato oltre l'85% dell'ablazione di DpN al terzo giorno postlesion e il ripristino completo di DpN nel sito lesionato 30 giorni dopo la lesione. Il presente studio ha determinato la compromissione e il successivo recupero del comportamento di nuoto del pesce zebra a seguito della lesione utilizzando il test in campo aperto attraverso il quale sono stati quantificati due parametri, distanza percorsa (cm) e velocità media (cm / s). La locomozione è stata valutata analizzando le registrazioni dei singoli pesci di ciascun gruppo (n = 6) utilizzando un software di tracciamento video. I risultati hanno mostrato una significativa (p < 0,0001) riduzione della velocità (cm/ s) e della distanza percorsa (cm) del pesce zebra lesionato 3 giorni dopo la lesione rispetto allo sham. Il pesce zebra lesionato ha mostrato un pieno recupero del comportamento di nuoto 30 giorni dopo la lesione. I risultati attuali suggeriscono che il pesce zebra adulto lesionato 6-OHDA è un modello eccellente con qualità riproducibile per facilitare lo studio della neurorigenerazione nel PD. Studi futuri sui meccanismi alla base della neurorigenerazione e sui fattori intrinseci ed estrinseci che modulano il processo possono fornire importanti informazioni sulle nuove strategie di trattamento sostitutivo cellulare contro il PD.

Introduction

Il morbo di Parkinson (PD), una malattia caratterizzata in modo distintivo da rigidità muscolare, tremore a riposo e bradicinesia, è la malattia neurologica in più rapida crescita al mondo1,2. Il rischio e la prevalenza di PD aumentano rapidamente con l'età, specialmente negli individui di età pari o superiore a 50 anni3. L'eziologia e la patogenesi del PD finora rimangono poco conosciute. Questo ha spesso lasciato l'insorgenza precoce del PD non diagnosticata. Allo stato attuale, la mancanza di dopamina e la perdita di neuroni dopaminergici (DpN) nei pazienti con PD sono fortemente legate alla manifestazione dei sintomi motori4. Capitalizzando su questa relazione, diversi trattamenti sono stati progettati per agire direttamente come sostituto della dopamina (cioè levodopa) o per compensare la perdita di DpN (cioè la stimolazione cerebrale profonda). Sebbene questi trattamenti portino benefici sintomatici, non modificano il decorso deteriorante della malattia5. In considerazione di questa significativa debolezza, è stata proposta la terapia sostitutiva cellulare. L'efficacia di questo approccio è, tuttavia, incoerente date le sfide della preparazione dell'innesto, del controllo della crescita cellulare e dell'instabilità del fenotipo. La terapia sostitutiva cellulare, che aveva sollevato preoccupazioni etiche, pone anche il rischio di indurre tumori cerebrali e reazioni immunitarie indesiderate6,7.

I limiti delle attuali strategie terapeutiche hanno portato a una maggiore enfasi sulla rigenerazione del DpN come potenziale approccio nel trattamento della PD. La rigenerazione del DpN o della neurorigenerazione è emersa come una delle promettenti scoperte nella gestione del PD, non solo per il suo potenziale come nuovo metodo terapeutico, ma anche come mezzo per comprendere il meccanismo della malattia8, 9. Questo approccio si concentra sul ripristino della funzione neuronale attraverso la differenziazione, la migrazione e l'integrazione delle cellule progenitrici esistenti nei circuiti lesionati10. Al fine di esplorare ulteriormente la neurorigenerazione, sono stati intrapresi vari studi in vivo. È stato scoperto che vertebrati come mammiferi, anfibi e rettili generano nuove cellule cerebrali a seguito di lesioni11,12. Tra i vertebrati, gli animali di mammifero sono più ricercati data la loro somiglianza genetica con gli esseri umani. I mammiferi, tuttavia, mostrano una limitata e scarsa capacità riparativa nel sistema nervoso centrale (SNC) che può durare fino all'età adulta a seguito di una lesione cerebrale13. In generale, i mammiferi non sono adatti come modelli animali per comprendere la neurorigenerazione dato che il basso numero di neuroni prodotti non sarà sufficiente a ripristinare i circuiti neurali danneggiati osservati nel PD. Come tale, il modello basato sul teleosteo, in particolare nel pesce zebra, è molto favorito per il suo alto tasso proliferativo, la capacità di auto-rinnovarsi continuamente e l'omologia cerebrale ravvicinata con gli esseri umani14,15.

Zebrafish è più comunemente usato per studiare il movimento disordinato in PD16. Il modello di PD a base di zebrafish è solitamente indotto da neurotossine, che includono 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) e 6-idrossidopamina (6-OHDA)17. Sebbene efficaci nell'indurre la perdita specifica di DpN e la diminuzione dei livelli di dopamina, i modelli basati su MPTP non imitano da vicino le condizioni del PD poiché la perdita di DpN non è limitata esclusivamente al CNS18. L'incapacità del 6-OHDA di attraversare la barriera emato-encefalica ha limitato i suoi effetti sui cambiamenti cellulari e funzionali all'interno del cervello quando viene somministrato intracranicamente rispetto a quello intramuscolare19. La somministrazione periferica di 6-OHDA ha causato una riduzione globale dei livelli di dopamina in tutto il sistema nervoso20. Mentre la somministrazione di 6-OHDA nel liquido cerebrospinale ha causato l'ablazione di DpN in tutto il CNS21, che non imita la condizione come visto nel PD per cui la perdita di DpN si verifica specificamente alla substantia nigra del cervello umano. La somministrazione ICV di 6-OHDA, al contrario, ha specificamente indotto un'ablazione significativa di DpN nell'area del Dn ventrale nel cervello del pesce zebra, che assomigliava molto alla substantia nigra22. È interessante notare che il recupero di DpN è stato riportato 30 giorni dopo la lesione indotta da 6-OHDA e questi neuroni sono sopravvissuti nel corso della vita23,24. Il recupero funzionale di DpN è stato dimostrato attraverso una valutazione locomotoria della distanza percorsa (cm) e della velocità media (cm/s) utilizzando il modello PD adulto a base di zebrafish indotto da 6-OHDA22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Il presente studio è stato approvato dal Committee on Animal Research and Ethics (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Numero di riferimento: UiTM CARE 346/2021, datato 7 maggio 2021].

NOTA: Sono stati utilizzati i protocolli pubblicati22,25,26 per l'allevamento standard e il mantenimento del modello PD di zebrafish adulto 6-OHDA-lesionato. Gli esperimenti sono stati condotti con pesci zebra maschi adulti (Danio rerio) di età superiore ai cinque mesi con una lunghezza standardizzata di 3,2-3,7 cm.

1. Manutenzione del pesce zebra e preparazioni per la microiniezione pre-ICV

  1. Mantenere il pesce in un serbatoio di acqua aerata a una temperatura controllata di 28 ± 1,0 °C. Per l'allevamento e la manutenzione del pesce zebra, utilizzare acqua distillata mineralizzata con sale marino commerciale (1 g/L) durante l'esperimento27.
  2. Ospitare un massimo di 25 pesci per vasca da 45 L o un pesce per 1,8 L di acqua ed esporli a un programma di 14 ore di luce e 10 ore di fotoperiodo scuro. Nutrire il pesce almeno due volte al giorno con pellet alimentari integrati con vermi liofilizzati.
  3. Preparare una soluzione madre concentrata di tricaina metanosolfonato (MS-222) sciogliendo 2,5 g di MS-222 e 5 g di bicarbonato di sodio in 250 ml di acqua distillata. Diluire 2 mL di soluzione madre per produrre 200 mL di soluzione di anestesia di lavoro.
  4. Preparare 99,96 mM di 6-OHDA sciogliendo prima 0,2 mg di acido ascorbico in 1 mL di NaCl filtrato sterile allo 0,9% p/v. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron prima di aggiungere 25 mg di 6-OHDA in polvere nella soluzione. Preparare la soluzione fresca prima di ogni iniezione e conservarla al buio a 4 °C.
    ATTENZIONE: indossare dispositivi di protezione individuale appropriati (ad esempio, guanti, cappotto da laboratorio e maschera facciale) e praticare buone pratiche di laboratorio quando si maneggiano le sostanze chimiche. Tutte le manipolazioni delle sostanze chimiche devono essere effettuate all'interno di un armadio di biosicurezza.

2. Anestesizzazione e iniezione ICV di zebrafish

  1. Digiuna il pesce per 24 ore per evitare il rigurgito durante l'anestesia. Anestetizzare il pesce immergendolo in un contenitore contenente lo 0,01% p/v di soluzione di MS-222 per circa 1 minuto o fino a quando tutti i movimenti muscolari visibili cessano.
  2. Posizionare il pesce anestetizzato su una spugna imbevuta d'acqua posta sotto uno stereomicroscopio e bagnare regolarmente il pesce.
  3. Identificare la posizione per l'iniezione in base all'intersezione tra la sutura metopica (SM), la sutura coronale (CS) e la sutura sagittale (SS) che collega il cranio frontale e parietale del cervello del pesce zebra.
  4. Fai un piccolo foro di 1,0 mm2 di area usando un ago affilato da 27 G nel cranio guidato dalla posizione anatomica specifica sul cranio del pesce zebra (Figura 1A, B).
  5. Abbassare l'iniettore microcapillare con un angolo di 60° fino a raggiungere una profondità di 1.200 μm dal tetto cranico del cranio del pesce zebra (Figura 1C). Premere il limite Z per fissare la posizione.
  6. Impostare la pressione di iniezione iniziale a 4000 hPa e la pressione di compensazione a 10 hPa. Impostare la durata dell'iniezione a 0,3 s. Abbassare l'intensità dell'iniezione con ogni successiva iniezione.
  7. Iniettare 0,5 μL di 99,96 mM di neurotossina 6-OHDA (o 0,9% p/v di soluzione salina per il gruppo di controllo fittizio) e lasciare riposare la microcapillare per 20 s. Continuare a bagnare il pesce con acqua distillata durante tutto il processo di iniezione per evitare l'essiccazione.
  8. Rimuovere lentamente il microcapillare e rianimare il pesce sotto l'acqua distillata corrente. Metti il pesce in una vasca di recupero isolata e rimuovi eventuali distrazioni che possono potenzialmente disturbare il processo di recupero.
  9. Lavare il microcapillare prima dell'iniezione successiva per eliminare il blocco e assicurarsi che l'intensità dell'iniezione sia sufficiente per produrre il volume desiderato di 0,5 μL di 6-OHDA.

Figure 1
Figura 1: Sito di iniezione della neurotossina, 6-OHDA. (A) Il punto di ingresso microcapillare è guidato dall'intersezione tra la sutura metopica (SM), la sutura coronale (CS) e la sutura sagittale (SS) che collega il cranio frontale e parietale del cervello del pesce zebra (plan view). (B) Un disegno schematico (planimetria) del cranio e del cervello del pesce zebra mostra il microcapillare, che è abbassato direttamente sopra l'habenula (Hab), e il suo punto di ingresso all'intersezione tra gli emisferi. (C) Un disegno schematico (sezione sagittale) del cervello del pesce zebra mostra l'angolo di iniezione e la profondità di penetrazione. Il punto nero rappresenta il sito lesionato che si trova sopra l'area bersaglio, il diencefalo ventrale. Abbreviazioni: 6-OHDA: 6-idrossidopamina, CS: sutura coronale, Dn: diencefalo, Hab: habenula, Hyp: ipotalamo, MS: sutura metopica, OB: bulbo olfattivo, POA: area preottica, PT: tubercolo posteriore, SS: sutura sagittale, Tec: tectum e Tel: telencefalo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione locomotoria

NOTA: La valutazione locomotoria del pesce zebra (n = sei / gruppo; sham vs lesionato) è stata valutata individualmente tramite il test in vasca aperta utilizzando protocolli stabiliti28,29 al terzo giorno e al giorno 30 della lesione post-6-OHDA.

  1. Registrazione video
    1. Posizionare il serbatoio sperimentale (lunghezza 20 cm, larghezza 11,5 cm, altezza 13 cm) con le pareti ricoperte di carta bianca su una piattaforma rialzata (Figura 2A).
    2. Illuminare il serbatoio dal basso usando una fonte di luce. Riempire il serbatoio con acqua distillata (80%-90% pieno) e mantenere la temperatura a 28 ± 1,0 °C. Misurare la temperatura utilizzando un termometro e regolarla utilizzando un riscaldatore per acquari commerciale.
    3. Dopo un minimo di 2 minuti di acclimatazione, registrare il comportamento di nuoto del pesce da una vista del piano sul piano bidimensionale (2D) dell'arena sperimentale utilizzando una videocamera per 5 minuti (Figura 2B). Per evitare incongruenze nel comportamento di nuoto del precedente e dell'ultimo lotto di registrazioni, non superare l'acclimatazione di 10 min30.
    4. Analizza i video utilizzando un software di video tracking con il protocollo open-tank per l'acquisizione della distanza percorsa (cm) e della velocità media (cm/s) di ciascun soggetto.

Figure 2
Figura 2: Configurazione sperimentale di un test in vasca aperta per la valutazione del comportamento locomotore del pesce zebra. (A) Il serbatoio sperimentale (vista frontale) è posizionato su una piattaforma rialzata illuminata dal basso. Le quattro pareti del serbatoio sono ricoperte di carta bianca e le registrazioni vengono catturate assialmente. La temperatura viene misurata utilizzando un termometro e regolata a 28 ± 1,0 °C utilizzando un riscaldatore per acquari commerciale. (B) Screenshot (vista piano) della registrazione video acquisita utilizzando la configurazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Analisi dei dati
    1. Fare doppio clic sull'icona per aprire il software di tracciamento video. Fare clic sulla scheda File e selezionare Crea nuovo esperimento vuoto. Ciò consentirà all'utente di personalizzare i parametri dell'esperimento in base agli obiettivi dell'indagine.
    2. Fare clic sulla scheda Protocollo , selezionare Sorgenti video e fare clic su Aggiungi nuova sorgente video. Fare clic sull'elenco a discesa disponibile e selezionare l'opzione File video . Ciò richiederà il pop-up di navigazione dei file da cui è possibile selezionare le registrazioni video di interesse.
    3. Fare clic sulla sottoscheda Apparato e selezionare l'icona Rettangolare per configurare l'apparecchio. Trascina l'icona rettangolare per coprire l'intera arena sperimentale. Impostare la barra di scala di conseguenza e immettere il valore numerico della misurazione della scala utilizzata nella lunghezza della sezione righello. Il presente esperimento ha utilizzato una scala di 10 mm per il test del serbatoio aperto.
    4. Imposta il colore dell'animale selezionando Gli animali sono più scuri di Lo sfondo dell'apparato. Lascia le altre opzioni disponibili in Monitoraggio alle impostazioni predefinite preimpostate.
    5. Nella sottoscheda Zone , fare clic sull'apparecchio disegnato in precedenza. Questa zona è impostata come zona standard la cui posizione è la stessa per tutti i test.
    6. Selezionare le seguenti opzioni in Pianificazione test e report dati test: Durata test, Distanza totale percorsa e Velocità media. Altri test disponibili nell'elenco sono facoltativi e dipendono dall'interesse investigativo del ricercatore.
    7. Nella scheda Esperimento , assegna gli animali in base al loro gruppo di test digitando il nome del gruppo nella sezione Nome e il numero di animali per gruppo nella sezione Numero di animali .
    8. Passare alla scheda Test per eseguire l'esperimento. Fai clic sull'icona Avvia test e attendi fino a quando tutti i video non vengono analizzati.
    9. Nella scheda Risultati , fare clic sull'icona Visualizza il report per visualizzare i dati locomotori nel modulo di report di testo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il presente esperimento ha valutato i cambiamenti nel comportamento di nuoto del pesce zebra adulto dopo la microiniezione ICV con 6-OHDA. La ragione per l'utilizzo di 6-OHDA come neurotossina di scelta era dovuta alla sua incapacità di attraversare la barriera emato-encefalica, che produceva un'ablazione specifica e mirata di DpN nell'area di interesse-diencefalo ventrale (Dn)16. La sottopopolazione DpN qui ha una somiglianza anatomica con la sottopopolazione DpN nella substantia nigra pars compacta dell'uomo31.

Secondo il nostro precedente lavoro22, l'effetto cellulare della microiniezione 6-OHDA ICV contro DpN di zebrafish adulto è stato confermato attraverso l'immunoistocolorazione del marcatore DpN-tirosina idrossilasi (TH). La principale regione cerebrale di interesse era il Dn, costituito dall'area preottica (POA), dal tubercolo posteriore (PT) e dall'ipotalamo (Hyp). È stato riscontrato che 99,96 mM 6-OHDA hanno determinato un tasso di sopravvivenza del 100% del pesce zebra adulto con il più basso numero di TH-immunoreattivi (TH-ir) in Dn. È stato anche riscontrato che oltre l'85% (p < 0,01) di TH-ir DpN nel Dn è stato ablato il terzo giorno dopo la lesione. Il numero di TH-ir DpN è poi aumentato di oltre il 50% al giorno 14 post-solsione prima di raggiungere la rigenerazione completa 30 giorni dopo la lesione (Figura 3). Questi dati supportano le capacità rigenerative della sottopopolazione DpN in Dn di pesci zebra adulti dopo l'ablazione32.

Figure 3
Figura 3: Rigenerazione di DpN nella regione Dn di zebrafish lesionato di 99,96 mM 6-OHDA. (A) Il numero di TH-ir DpN in tre aree principali della regione Dn, POA, PT e Hyp, su quattro punti dati: sham, 3, 14 e 30 giorni dopo la lesione di 99,96 mM 6-OHDA neurotossina. Ogni barra rappresenta la media ± SD di n = 6 esperimenti indipendenti; *p < 0,05. (B) Immagini rappresentative al microscopio confocale del cervello di pesce zebra di sham (I, I', e I''), 3 giorni dopo la lesione (II, II', e II''), 14 giorni dopo la lesione (III, III', e III''), e 30 giorni dopo la lesione (IV, IV', e IV'') colorati con TH (DpN; verde) e DAPI (nuclei; blu). Barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo, 6-OHDA: 6-idrossidopamina, Dn: diencefalo, DpN: neuroni dopaminergici, Hyp: ipotalamo, POA: area preottica, PT: tubercolo posteriore, SD: deviazione standard e TH-ir: tirosina idrossilasi immunoreattiva. Adattato da Vijayanathan et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Abbiamo quindi eseguito la valutazione locomotoria utilizzando il test in vasca aperta per studiare i cambiamenti nella distanza percorsa (cm) e nella velocità media (cm / s) del pesce zebra adulto dopo la microiniezione ICV di 6-OHDA e sham. I pesci sperimentali sono stati quindi valutati il terzo giorno dopo la lesione (il minor numero di TH-ir DpN osservati) e il giorno 30 dopo la lesione (DpN completamente ripristinato riportato nel sito della lesione). L'analisi del comportamento di nuoto del pesce zebra utilizzando un software di tracciamento video ha indicato che sia la velocità media (cm / s) che la distanza percorsa (cm) del gruppo lesionato il terzo giorno successivo alla lesione sono state significativamente ridotte (p < 0,001) a <45% rispetto a sham (Figura 4). Il gruppo lesionato ha mostrato un recupero della funzione motoria 30 giorni dopo la lesione senza differenze significative sia della velocità media (cm/s) che della distanza percorsa (cm) rispetto alla sham.

Figure 4
Figura 4: Cambiamenti nel comportamento di nuoto dopo iniezione intracerebroventricolare da parte di 6-OHDA. Il comportamento di nuoto del pesce zebra adulto è stato valutato prima della lesione, il terzo giorno e il giorno 30 dopo la lesione di 99,96 mM 6-OHDA. I parametri valutati includevano: (A) velocità media (cm/s) e (B) distanza percorsa (cm). Ogni barra rappresenta ± SD media di sei pesci; p < 0,0001 (Student t-test). Abbreviazioni: 6-OHDA: 6-idrossidopamina, SD: deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il presente lavoro ha dimostrato con successo la valutazione locomotoria del modello di PD adulto a base di pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA. L'intero esperimento ha coinvolto tre fasi principali: preparazioni di microiniezione pre-ICV, microiniezione ICV di zebrafish e valutazione locomotoria. Per garantire il sano recupero del pesce zebra adulto seguendo la procedura di microiniezione ICV e un buon risultato sperimentale, nel presente studio sono state raccomandate alcune buone pratiche per ogni fase.

Preparazione alla microiniezione pre-ICV: la selezione degli animali è stata eseguita al meglio il giorno prima dell'esperimento. Il sesso è stato identificato e la lunghezza del pesce è stata misurata. I pesci zebra adulti maschi con una lunghezza standardizzata di 3,2-3,7 cm sono stati collocati in un serbatoio sperimentale separato. Inoltre, il pesce dovrebbe sottoporsi a un periodo di digiuno di 24 ore per evitare il rigurgito durante l'anestesia33. Un acquario (con le sue quattro pareti ricoperte di carta bianca) con un serbatoio di acqua stagnante dovrebbe essere preparato prima dell'esperimento per ridurre lo stress esterno e aiutare il processo di recupero del pesce zebra. Tutte le sostanze chimiche sono state preparate fresche prima dell'inizio di ogni esperimento in quanto potrebbero deteriorarsi rapidamente nel tempo e diventare instabili a temperatura ambiente34,35.

Microiniezione di 6-OHDA: la manipolazione pulita e delicata del pesce zebra deve essere eseguita durante tutto il processo per prevenire l'introduzione di lesioni e infezioni inutili al pesce. Il pesce deve essere posto sopra una spugna bagnata e mantenuto in condizioni umide per evitare di seccarsi36. Una piccola incisione è stata fatta usando un ago sterile con una forza ferma e appropriata per evitare una pressione extra che potrebbe rompere il cranio del pesce zebra. Questa incisione dovrebbe consentire l'ingresso del microcapillare nella cavità cerebrale. Il microcapillare è stato quindi abbassato fino a una profondità di 1.200 μm dal punto di ingresso, che si trova tra due emisferi: il telencefalo e il tectum (Figura 1B,C). Il punto di ingresso è stato scelto tra questi emisferi per prevenire qualsiasi ulteriore lacerazione dei neuroni37. Questa tecnica prevedeva l'uso di un microiniettore, la pressione e la tempistica della somministrazione dovevano essere calibrate per garantire la consegna di 0,5 μL di neurotossina. Questa calibrazione può essere eseguita misurando la dimensione della goccia formata sulla carta da filtro38. La nostra pratica di solito prevedeva la seguente impostazione di parametri programmabili in base ai quali l'intensità dell'iniezione veniva abbassata ad ogni iniezione successiva (pressione di iniezione: 4000 hPa, durata dell'iniezione: 0,3 s e pressione di compensazione: 10 hPa). Al fine di evitare che la neurotossina fuoriesca dalla cavità cerebrale, è stato applicato un intervallo di 20 s tra l'iniezione e il ritiro del microcapillare35. A causa delle piccole dimensioni del capillare, il microcapillare può essere bloccato dopo ogni iniezione. Pertanto, il microcapillare deve essere essenzialmente lavato prima dell'iniezione successiva in modo da eliminare il blocco e garantire che l'intensità dell'iniezione sia sufficiente a produrre il volume desiderato di 0,5 μL di 6-OHDA. Il pesce verrebbe quindi trasferito in una vasca di recupero mantenuta a 28 ± 1,0 °C. Se il pesce non riesce a recuperare entro 30 s, sciacquare la branchia e la bocca con acqua distillata fino al completo recupero dei movimenti muscolari.

Valutazione locomotoria: per garantire una buona valutazione locomotoria sul pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA, lo studio comportamentale deve essere condotto entro lo stesso lasso di tempo per ogni punto temporale. Ogni studio comportamentale dovrebbe consentire un periodo di acclimatazione minimo di 2 minuti e dovrebbe essere eseguito entro 4 h39. Il presente esperimento è stato condotto al mattino presto tra le 8:00 e le 12:00 poiché i pesci zebra erano più attivi durante questo periodo40. Un periodo di acclimatazione più lungo è necessario se i pesci zebra mostrano un comportamento anormale con chiari segni di stress e ansia (congelamento e comportamento irregolare)41. Tuttavia, per evitare incoerenze nel comportamento di nuoto del precedente e dell'ultimo lotto di registrazioni, l'acclimatazione non deve superare i 10 min30. Per il test in campo aperto, un serbatoio sperimentale di qualsiasi dimensione, colore, forma e consistenza potrebbe essere utilizzato per registrazioni che vanno da un minimo di 5 a 30 min42,43. Il comportamento del pesce zebra è fortemente influenzato dalla temperatura dell'ambiente circostante. Piccole fluttuazioni superiori a 4 °C potrebbero influire notevolmente sulla velocità di nuoto44. Pertanto, la temperatura dell'acqua nel serbatoio sperimentale dovrebbe essere rigorosamente mantenuta a una temperatura controllata di 28 ± 1,0 ° C utilizzando un riscaldatore commerciale e il livello dell'acqua è stato mantenuto a circa 12 cm di profondità durante l'esperimento. Le pareti del serbatoio sono state ricoperte di carta bianca per creare contrasto tra il soggetto del test e l'arena sperimentale, nonché per ridurre gli stimoli esterni che possono causare una reazione non sollecitata dai soggetti del test45. I pesci di ciascun gruppo sono stati testati individualmente in conformità con l'attuale pratica standard per la ricerca neurocomportamentale zebrafish23,37,46. Data la propensione dei pesci zebra alle interazioni sociali, si teme che l'isolamento durante il periodo di prova possa influire sul loro comportamento47. Tuttavia, l'attuale configurazione sperimentale è stata limitata a un massimo di 10 minuti per prova e questo breve periodo di isolamento non ha avuto alcun effetto sull'attività locomotoria del pesce zebra adulto48. Al fine di fornire una raccolta accurata dei dati per lo studio comportamentale, la valutazione è stata eseguita selezionando casualmente il pesce zebra da diversi gruppi sperimentali (cioè alternando due pesci zebra dal gruppo lesionato sham e 6-OHDA fino a n = 6) durante il test in vasca aperta49. I video registrati sono stati analizzati utilizzando un sistema di tracciamento video comunemente utilizzato per il monitoraggio comportamentale dei roditori. Poiché il pesce zebra è un modello animale emergente, i test comportamentali condotti utilizzando il pesce zebra sono solitamente adattati dalla letteratura scientifica consolidata sui roditori50. Qui, abbiamo dimostrato la capacità del software di tracciamento video di tracciare automaticamente il pesce zebra nell'arena sperimentale e calcolare efficacemente i parametri desiderati. Il software di tracciamento video si distingueva dagli altri software disponibili per la varietà di file video supportati dal software, le versioni regolari dei pacchetti di aggiornamento e il supporto fornito per diversi sistemi operativi51.

Uno dei limiti dei modelli di PD esistenti basati su animali è la mancanza di somiglianze meccanicistiche che imitano la compromissione motoria osservata dopo la perdita neuronale dopaminergica nella substantia nigra pars compacta del cervello umano52. L'emergere del modello PD basato su zebrafish adulto può, tuttavia, affrontare questa particolare limitazione. Come osservato nel presente studio, la ridotta velocità di nuoto corrispondeva ai nostri precedenti risultati cellulari per cui oltre l'85% di perdita neuronale dopaminergica nel diencefalo ventrale del modello di zebrafish adulto indotto da 6-OHDA tre giorni dopo la lesione22. Sembra che sia necessaria un'ablazione specifica dei neuroni dopaminergici in quest'area di interesse per interrompere la segnalazione motoria discendente dal cervello, causando lentezza nei movimenti53. L. J. Caldwell, et al.23 che hanno eseguito l'iniezione ICV di 6-OHDA al tectum ottico (punto di ingresso), ad esempio, hanno osservato solo cambiamenti nel comportamento di shoaling e accoppiamento dei pesci zebra. L'ablazione di DpN nel Dn ventrale è cruciale in quanto la popolazione di DpN nel Dn del pesce zebra adulto agisce come unica fonte di dopamina per i motoneuroni zebrafish. Questo è analogo alla substantia nigra54 umana. Il presente studio ha anche osservato una velocità di nuoto più elevata e una distanza più lunga percorsa dal pesce zebra lesionato nei successivi punti temporali post-lesione, indicando un ripristino continuo e, in definitiva, completo della segnalazione della dopamina che governa il comportamento di nuoto del pesce zebra. Questi risultati hanno quindi convalidato la capacità dei neuroni dopaminergici appena rigenerati di riacquistare le loro attività funzionali nel pesce zebra adulto lesionato.

L'attuale via di applicazione di 6-OHDA ha coinvolto un paradigma di iniezione leggermente invasivo che ha richiesto l'inserimento di microcapillari in profondità nel cervello, verso l'area della lesione del Dn ventrale. Questo metodo è leggermente laborioso rispetto all'iniezione periferica e deve essere eseguito entro 3 minuti per pesce per ridurre il rischio di mortalità dopo l'iniezione. Pertanto, è necessaria una precedente pratica di iniezione di ICV per garantire che il metodo possa essere eseguito entro la durata critica nell'area target (Dn). Al fine di ottenere una valida valutazione locomotoria del pesce zebra adulto, il test in vasca aperta è limitato a sole 4 ore di periodo di valutazione al giorno. Pertanto, è necessaria una pianificazione preventiva in un quadro sperimentale che coinvolge un gran numero di animali in cui è necessario assegnare un tempo supplementare per garantire che la configurazione soddisfi i requisiti minimi per ogni registrazione (ad esempio, temperatura e profondità dell'acqua). Questa pianificazione è particolarmente cruciale negli esperimenti basati sul tempo come quello dello studio corrente, poiché ogni registrazione deve essere eseguita sul punto temporale previsto. L'attuale configurazione sperimentale si è limitata allo studio di due parametri di nuoto che hanno valutato specificamente la funzione motoria del pesce zebra. Altri parametri comportamentali come il shoaling e il comportamento ansioso, tuttavia, richiedevano altre configurazioni sperimentali e diversi metodi analitici. In sintesi, questo è un metodo riproducibile e utile per studiare il processo di neurorigenerazione DpN nel pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA che può fornire importanti informazioni sulle strategie di trattamento di sostituzione cellulare contro il PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

Tags

Neuroscienze Numero 178
Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter