Summary
Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en avgjørende rolle som cytoskjelettkomponent i eukaryote celler og er kjent for sin dynamiske ustabilitet. Denne studien utviklet en metode for fraksjonering av mikrotubuli for å skille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin for å evaluere stabiliteten til mikrotubuli i forskjellige musevev.
Abstract
Mikrotubuli, sammensatt av α/β-tubulindimerer, er en avgjørende komponent i cytoskjelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerene utviser dynamisk ustabilitet da tubulinheterodimerunderenheter gjennomgår repeterende polymerisering og depolymerisering. Nøyaktig kontroll av mikrotubuli stabilitet og dynamikk, oppnådd gjennom tubulin posttranslasjonelle modifikasjoner og mikrotubuli-assosierte proteiner, er avgjørende for ulike cellulære funksjoner. Dysfunksjoner i mikrotubuli er sterkt involvert i patogenesen, inkludert nevrodegenerative lidelser. Pågående forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler som modulerer stabilitet, og tilbyr potensielle behandlingsalternativer for disse sykdommene og kreftene. Følgelig er forståelse av den dynamiske tilstanden til mikrotubuli avgjørende for å vurdere sykdomsprogresjon og terapeutiske effekter.
Tradisjonelt har mikrotubulidynamikk blitt vurdert in vitro eller i dyrkede celler gjennom grov fraksjonering eller immunoassay, ved bruk av antistoffer rettet mot posttranslasjonelle modifikasjoner av tubulin. Det er imidlertid utfordringer å analysere tubulinstatus i vev nøyaktig ved hjelp av slike prosedyrer. I denne studien utviklet vi en enkel og innovativ fraksjoneringsmetode for mikrotubuli for å skille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin i musevev.
Prosedyren involverte homogenisering av dissekerte musevev i en mikrotubuli-stabiliserende buffer ved et volumforhold på 19: 1. Homogenatene ble deretter fraksjonert gjennom en to-trinns ultrasentrifugeringsprosess etter innledende langsom sentrifugering (2,400 × g) for å fjerne rusk. Det første ultrasentrifugeringstrinnet (100 000 × g) utfelte stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatanten ble utsatt for et andre ultrasentrifugeringstrinn (500 000 × g) for å fraksjonere labile mikrotubuli og oppløselige tubulindimerer. Denne metoden bestemte proporsjonene av tubulin som utgjør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. I tillegg ble det observert forskjellige vevsvariasjoner i mikrotubulistabilitet som korrelerte med den proliferative kapasiteten til bestanddeler. Disse funnene fremhever det betydelige potensialet i denne nye metoden for å analysere mikrotubuli stabilitet i fysiologiske og patologiske forhold.
Introduction
Mikrotubuli (MT) er langstrakte rørformede strukturer som består av protofilamenter bestående av α/β-tubulin heterodimer underenheter. De spiller viktige roller i ulike cellulære prosesser som celledeling, motilitet, formvedlikehold og intracellulær transport, noe som gjør dem til integrerte komponenter i det eukaryote cytoskelettet1. Minus-enden av MT, hvor α-tubulin-subenheten er eksponert, er relativt stabil, mens plussenden, hvor β-tubulin-underenheten eksponeres, gjennomgår dynamisk depolymerisering og polymerisering2. Denne kontinuerlige syklusen av tubulindimeraddisjon og dissosiasjon i plussenden, referert til som dynamisk ustabilitet, resulterer i en repeterende prosess med redning og katastrofe3. MTs viser fokusdomener med lokaliserte variasjoner i dynamisk ustabilitet, inkludert stabile og labile domener4.
Nøyaktig kontroll av MTs dynamiske ustabilitet er avgjørende for mange cellulære funksjoner, spesielt i nevroner preget av intrikate morfologier. Tilpasningsevnen og holdbarheten til MTs spiller en viktig rolle i utviklingen og riktig funksjon av nerveceller 5,6,7. Den dynamiske ustabiliteten til MT har vist seg å være forbundet med forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) av tubulin, slik som acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoksidasjon og polyglyylering. I tillegg fungerer bindingen av mikrotubuli-assosierte proteiner (MAPs) som en reguleringsmekanisme8. PTM, unntatt acetylering, forekommer hovedsakelig i det tubulinkarboksyterminale området som ligger på den ytre overflaten av MT. Disse modifikasjonene skaper forskjellige overflateforhold på MT-er, påvirker deres interaksjon med MAP-er og styrer til slutt MT-stabilitet9. Tilstedeværelsen av en karboksy-terminal tyrosinrest i α-tubulin indikerer dynamiske MT-er, som raskt erstattes av det frie tubulinbassenget. Omvendt betyr detyrosinering av karboksyterminalen og acetylering av Lys40 stabile MT-er med redusert dynamisk ustabilitet 9,10.
PTM av tubulin har blitt mye brukt i eksperimenter for å vurdere dynamikken og stabiliteten til MTs 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel, i cellekulturstudier, kan tubuliner deles inn i to bassenger: det frie tubulinbassenget og MT-bassenget. Dette oppnås ved å frigjøre fritt tubulin gjennom cellepermeabilisering før fiksering av de resterende MTene 15,16,17,18,19. Biokjemiske metoder innebærer bruk av kjemiske MT-stabilisatorer som beskytter MT mot katastrofe, noe som muliggjør separasjon av MT og fritt tubulin gjennom sentrifugering20,21,22. Imidlertid skiller disse prosedyrene ikke mellom stabile og mindre stabile (labile) MTs, og gjør det dermed umulig å kvantifisere MTs eller løselig tubulin i vev som hjernen. Følgelig har evaluering av MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist seg å være utfordrende. For å løse denne eksperimentelle begrensningen har vi utviklet en ny teknikk for nøyaktig separering av MT og fritt tubulin i musevev23.
Denne unike MT-fraksjoneringsmetoden involverer vevshomogenisering under forhold som opprettholder tubulinstatus i vev og to-trinns sentrifugering for å skille stabile MT-er, labile MT-er og fritt tubulin. Denne enkle prosedyren kan brukes på brede studier, inkludert grunnleggende forskning på MTs og MAPs i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser av helse og sykdommer forbundet med MT-stabilitet, og utvikling av medisiner og andre terapeutiske midler som retter seg mot MT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MT fraksjoneringsmetode
MERK: Alle eksperimenter utført i denne studien ble godkjent av Animal Ethics Committee of Doshisha University. C57BL/6J mus av begge kjønn, 3-4 måneder, ble brukt her. I denne protokollen ble dissekerte vev, for eksempel hjerne, lever eller thymus, umiddelbart homogenisert i iskald mikrotubuli stabiliserende buffer (MSB), som inneholdt Taxol (MT-stabilisator) i en konsentrasjon som forhindret ikke bare depolymerisering, men også repolymerisering av MT. Homogenatet ble separert i tre fraksjoner ved en totrinns ultrasentrifugeringsprosess (figur 1). Alle trinnene i denne protokollen ble fullført uten avbrudd i et kjølig temperaturmiljø, og vev og fraksjoner ble ikke frosset før de ble oppløst i natriumdodecylsulfat (SDS)-prøvebuffer.
- Fremstilling av MSB og mikrorør
- For å forberede MSB, bland følgende reagenser: 0,1 M 2- (N-morfolino)etansulfonsyre (MES), pH 6,8 (nøytralisert av KOH), 10% glyserol, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, fosfatasehemmere (1 mM NaF, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mMNa3VO 4, 0,5 μM okadainsyre), 1x proteaseinhibitorcocktail, og proteasehemmere (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml pepstatin, 1 μg/ml antismerte, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 50 μg/ml TLCK) (se materialfortegnelse) og betegnes som MSB(-).
- Like før vevsdisseksjon tilsettes 10 μM Taxol og 2 mM GTP (se materialfortegnelse) til MSB(-). Denne bufferen betegnes som MSB(+). Forbered bufferen på bruksdagen og hold den på is.
- Forbered mikrorørene for prøvetaking. Tøm 2,0 ml mikrorør for homogenatlagring; tom 1,5 ml mikrorør for supernatant1 (S1) lysat, utfelling2 (P2) prøvetaking, og utfelling3 (P3) prøvelagring; 1,5 ml mikrorør med 1 ml iskald fosfatbufret saltvann (PBS) for dissekert vevslagring; 1,5 ml mikrorør med 200 μL 2x SDS-prøvebuffer (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glyserol; 2% 2-merkaptoetanol; 4% SDS) for S1-prøve og supernatant3 (S3) prøvelagring; og sentrifugeringsmikrorør for TLA55 og TLA120.2 sentrifugerotorer (se materialfortegnelse). Merk alle rør og legg dem på is.
- Mus vev homogenisering
- Forbered et kjølt bord for vevsdisseksjon. Fyll først en boks med knust is og legg to petriskåler på is, en med innersiden opp og den andre med yttersiden. Fyll iskald PBS i en tallerken for forbigående vask og lagring av dissekert vev. Legg filterpapir fuktet med PBS på en annen tallerken vendt.
- For å ofre en mus, utfør cervikal dislokasjon under dyp anestesi med en blandet bedøvelse av butorfanol, midazolam og medetomidin. Deretter dissekerer du umiddelbart vevet, for eksempel hjerne, lever eller thymus, og vasker dem med iskald PBS i en petriskål.
MERK: Enhver type bløtvev kan analyseres ved denne metoden. Imidlertid er størrelsen på vevet begrenset av det anbefalte volumområdet for homogenisatoren som brukes. For eksempel, hvis et 2 ml volum homogenisator brukes, anbefales 50-100 mg vev. - Etter veiing av 1,5 ml mikrorør fylt med PBS for dissekert vevslagring, kutt ut og lagre vev inne i mikrorørene, og vei hvert mikrorør på nytt. Hvert vevs våtvekt kan beregnes ved å trekke vekten av røret før og etter at vevet er tilsatt.
- Homogeniser vevet umiddelbart i iskald MSB(+) med en kjølt homogenisator (se materialfortegnelse). Volumet av MSB(+) var 19 ganger (μL) vevets våtvekt (mg). Utfør homogenisering med 20 slag til vevstykkene forsvinner.
MERK: For eksempel brukes 1,900 μL MSB (+) til 100 mg vev. Siden volumet av MSB(+) som skal tilsettes må justeres for hver våtvekt av de analyserte vevsstykkene, er det nødvendig å veie hvert vevstykke nøyaktig.
- Sentrifugering av musevevshomogenatene
- Flytt hele homogenatet til et 2 ml mikrorør med en Pasteur-pipette og sentrifuge ved 2 400 × g i 3 minutter ved 2 °C for å fjerne rusk via nedbør.
- Overfør hele supernatanten (fraksjonen S1) til et nytt 1,5 ml mikrorør og virvel. Deretter aliquot 200 μL S1 fraksjon i et sentrifugering mikrorør og sentrifuge ved 100.000 × g ved hjelp av en TLA-55 rotor i 20 minutter ved 2 ° C for å oppnå de relativt store molekylvekt proteiner som et bunnfall (P2 fraksjon).
MERK: Volumet av prøven utsatt for ultrasentrifugeringstrinnene påvirker sentrifugeringsradiusen og molekylenes nedbørseffektivitet. Hold prøvevolumet på 200 μL eller mindre etter dette trinnet for å forhindre unøyaktig fraksjonering. - Videre sentrifugerer alle resulterende supernatanter (S2-fraksjon) ved 500 000 × g ved bruk av en TLA-120.2-rotor i 60 minutter ved 2 °C for å skille de uoppløselige proteinkompleksene i bunnfallet (P3-fraksjonen) fra løselige proteiner i supernatanten (S3-fraksjonen).
- Tilsett 400 μL 1x SDS-prøvebuffer (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glyserol; 1% 2-merkaptoetanol; 2% SDS) til P2 og P3 fraksjonsrørene og kort sonikert for å oppløse bunnfallet. Overfør disse fraksjonsprøvene til et tomt 1,5 ml mikrorør.
- Oppløs den totale S3-fraksjonen i 200 μL med 2x SDS-prøvebuffer.
- Bland de resterende S1-fraksjonene med et likt volum på 2x SDS-prøvebuffer for bruk som standardkurve for vestlig blotting.
- Kok alle disse prøvene ved 100 °C i 3 min. Etter at prøvene er avkjølt til romtemperatur, oppbevares prøvene ved -20 °C.
- Kvantifisering av proteiner i hver fraksjon
- Kvantifiser proteiner i P2-, P3- og S3-fraksjonene ved vestlig blotting. Bruk først 10% SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) for å skille proteiner fra riktig fortynnet P2-, P3- og S3-fraksjonene, og serielt fortynnet S1-prøve fra ethvert individ som en standardkurve. Deretter elektroblett prøvene på polyvinylidenfluoridmembraner (se materialtabell).
MERK: Fortynningsforholdet for hver fraksjon avhenger av konsentrasjonen av et objektivt protein og reaktiviteten til antistoffet. (f.eks. α-tubulin, TUBB3, β-badekar og tyrosinert tubulin i hjernevev: S3 = 1/400, P3 = 1/2000, P2 = 1/2000, S1 = 1/50,50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; acetylert tubulin i hjernevev: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000; α-tubulin i leveren: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; α-tubulin i tymus: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 fortynning av vevskonsentrasjon). - Blokker membranen med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) med 0,1% Tween 20 (TBS-T) i over 30 minutter.
- Dypp membranen i TBS-T som inneholder primær antistoff (se materialtabell) i over 2 timer. Deretter vaskes membranen med TBS-T i 3 minutter (3 ganger).
- Merk primær antistoff ved hjelp av HRP-konjugerte sekundære antistoffer (se tabell over materialer) i TBS-T i over 1 time. Deretter vaskes membranen med TBS-T i 3 minutter (3 ganger).
- Utvikle membranene med forbedret kjemiluminescensreagens. Deretter analyserer du båndene av interesse med en selvlysende bildeanalysator (se Materialfortegnelse).
- Kvantifisere proteinbåndintensitetene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (se materialtabell) og lage en standardkurve ved å plotte fortynningsenhetene til de fortynnede S1-prøvene som brukes til standardkurven langs X-aksen og båndintensitetene langs Y-aksen.
- Les av proteinkonsentrasjonen (enheten) som tilsvarer de fortynnede fraksjonsprøvene. Multipliser konsentrasjonen som leses med prøvefortynningsfaktoren for å oppnå en proteinenhet i hver fraksjon. Del den målte enheten for hver fraksjon med den totale proteinenheten (P2 + P3 + S3) for å oppnå en prosentandel.
- Kvantifiser proteiner i P2-, P3- og S3-fraksjonene ved vestlig blotting. Bruk først 10% SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) for å skille proteiner fra riktig fortynnet P2-, P3- og S3-fraksjonene, og serielt fortynnet S1-prøve fra ethvert individ som en standardkurve. Deretter elektroblett prøvene på polyvinylidenfluoridmembraner (se materialtabell).
2. Evaluering av egenskapene til tubulin i hver fraksjon
MERK: Denne biokjemiske metoden gir tre grupper av tubulinkomplekser definert av sedimenteringsegenskaper. Her ble statusen for tubulinkomplekser oppnådd i disse fraksjonene identifisert basert på størrelsen på komplekset og tubulin-PTM. Fullfør alle trinnene i denne protokollen uten avbrudd i et miljø med kjølig temperatur, men ikke frys fraksjonsprøvene før de er oppløst i SDS-prøvebufferen.
- Filtrer overlappingsanalyse
- Filtrer S2- og S3-fraksjonene (500 μL hver) ved hjelp av en 300 kDa ultrafiltreringsspinnkolonne (se materialfortegnelse). Utfør 14 000 × g sentrifugering ved 2 °C til hele supernatanten filtreres, eluerte proteiner samles i mottakerrør og fangede proteiner forblir på filteret i reservoarrørene.
- Oversett hele filtratene (ca. 500 μL) i mottakerrør til nye 1,5 ml mikrorør og oppløs dem i 500 μL 2x SDS-prøvebuffer.
- Oppløselig restene på filteret av reservoarrør i 1000 μL 1x SDS-prøvebuffer ved pipettering og overføring av prøvene til et nytt 1,5 ml mikrorør.
- Kok prøvene ved 100 °C i 3 min. Etter at prøvene er avkjølt til romtemperatur, oppbevares prøvene ved -20 °C.
- Analyser mengden tubulin ved vestlig blotting med DM1A (anti-α-tubulin antistoff, se materialtabell).
- Størrelse-ekskludering kromatografi
- Klargjør bærerbufferen (0,1 M MES, pH 6,8, 10 % glyserol, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, 0,1 mM DTT) supplert med 1/10 konsentrasjon av protease- og fosfatasehemmere som beskrevet i trinn 1.1.1. Deretter filtrerer du løsningen og oppbevarer den i et kaldt miljø.
- Klargjør en kolonne med gelfiltreringskromatografi utstyrt med et preparativt væskekromatografisystem i et kromatografikammer (se materialtabell) ved 4 °C.
- Før du injiserer prøver på kolonnen, strømmer du 180 ml av bærerbufferen for å vaske kolonnen. Strømningshastigheten er 1 ml/min i 3 timer.
- Injiser kommersielt tilgjengelig renset svinetulin (se materialfortegnelse) som en kontroll eller S3-fraksjonen fra musehjerner (500 μL hver) på kolonnen.
- Elute med en strømningshastighet på 1,0 ml/min med bærerbuffer. Samle 1,5 ml fraksjonene i 120 minutter. Overvåk eluerte proteiner ved absorbans ved 280 nm. Hold maksimalt trykk under 0,3 MPa.
- Etter vortexing av de innsamlede fraksjonene, bland 50 μL av dem med 50 μL 2x SDS-prøvebuffer i et 1,5 ml mikrorør. Kok alle prøvene ved 100 °C i 3 min. Etter at prøvene er avkjølt til romtemperatur, oppbevares prøvene ved -20 °C.
- Analyser mengden tubulin ved vestlig blotting med DM1A, anti-α-tubulin antistoff og KMX-1, anti-β-tubulin antistoff (se materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifisering av tubulin i P2-, P3- og S3-fraksjonene fra musehjerne ved hjelp av MT-fraksjoneringsmetoden
Tubulin i musevev ble separert i P2-, P3- og S3-fraksjonene ved MT-fraksjoneringsmetoden og kvantifisert ved vestlig blotting (figur 1A). Bunnfallet av MT som forble i P2-fraksjonen ved ultrasentrifugering ved 100 000 × g i 20 minutter utgjorde 34,86% ± 1,68% av total tubulin i en musehjerne. Supernatanten (S2) ble videre sentrifugert ved 500 000 × g i 60 minutter. Et bunnfall (P3-fraksjon) og en supernatant (S3-fraksjon) ble oppnådd, som utgjorde henholdsvis 56,13 % ± 2,12 % eller 9,01 % ± 0,68 % av totalt tubulin i musehjernen (figur 1B).
Hjernebarken som brukes i denne studien inneholder nevrale og ikke-nevronale celler, som glia. For selektivt å vurdere MT-stabilitet i nevronene i musehjerner, kvantifiserte vi TUBB3, en tubulin-subtype utelukkende uttrykt i nevroner i det sentrale og perifere nervesystemet, ved vestlig blotting med Tuj1 (anti-TUBB3-antistoff). Prosentandelen av TUBB3 i P2-, P3- eller S3-fraksjonen var henholdsvis 32,65 % ± 2,20 %, 59,31 % ± 2,61 % eller 8,04 % ± 0,74 %. De var ikke signifikant forskjellige fra α-tubulin (figur 1B). Disse resultatene antydet at nevroner og gliaceller utviser lignende MT-stabilitet eller at nevroner inneholder mye høyere mengder tubulin enn gliaceller in vivo.
Kjennetegn ved tubulin gjenvunnet i hver fraksjon
Her ble musevevshomogenatet separert i tre fraksjoner ved to-trinns ultrasentrifugering med forskjellige gravitasjonsakselerasjoner; Derfor var sedimentasjonskoeffisientene blant proteiner eller deres komplekser i hver fraksjon forskjellig. Selv om tubulin utfelt ved 100 000 × g ultrasentrifugering ble ansett som konvensjonell MT, bør det avklares hvordan den nylig oppnådde tubulinen i P3-fraksjonen her skiller seg fra tubulin i P2- og S3-fraksjonene.
For å karakterisere S3-tubulin ble fraksjonen S2 (P3 + S3) eller S3 utsatt for ultrafiltrering og størrelseseksklusjonskromatografi. Tubulinkompleksene i S3-fraksjonen kunne passere fullstendig gjennom en 300 kDa ultrafiltreringsspinnkolonne, mens nesten all tubulin i S2-fraksjonen ble fanget på filteret (figur 2A). Videre ble molekylvekten av tubulinkomplekser i S3-fraksjonen målt ved størrelseseksklusjonskromatografi. S3 tubulin eluert på en topp tilsvarende 100 kDa, som er lik den for kommersielt tilgjengelige rensede tubulindimerer (figur 2B,C). I tillegg var proporsjonene av α- og β-tubulin gjenfunnet i hver fraksjon ved MT-fraksjoneringsmetoden lik (figur 2D). Faktisk har det vist seg at α- og β-tubulin kan eksistere litt som monomerer i levende celler24. Imidlertid, bedømt fra den estimerte kD-verdien (nM-orden) som er rapportert, og konsentrasjonen av tubulin gjenfunnet i S3-fraksjonen (~11 μM), antas de fleste (> 98%) tubulin å eksistere som α/β-dimerer. Derfor er tubulin i S3-fraksjonen primært en løselig α/β-tubulindimer.
Tubulinpolymerene ble separert i to fraksjoner, P2 og P3, basert på deres posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM). For å skille mellom disse fraksjonene ble vestlig blotting utført ved bruk av spesifikke antistoffer. Det antiacetylerte α-tubulinantistoffet, som fungerer som markør for stabil MT, viste at P2-fraksjonen var signifikant anriket med 97,40 % ± 0,52 % acetylert α-tubulin (figur 2E), mens total α-tubulin ble gjenfunnet i P3- og S3-fraksjonene (figur 1B). Omvendt viste det antityrosinerte α-tubulinantistoffet, som indikerer labil MT, at 75,43 % ± 2,69 % av tyrosinerte α-tubulin var tilstede i P3-fraksjonen (figur 2F). Disse funnene bekrefter at P2-fraksjonen primært inneholder tubulin i stabile MT-er, mens P3-fraksjonen består av tubulin i labile MT-er.
Vurdering av MT-stabilitet under fryse- og nocodazolbehandling
Effekten av frysing og nokodazolbehandling på stabiliteten til intracerebral MT hos mus ble analysert for å avgjøre om forbigående endringer i stabiliteten til MT kunne skjelnes ved hjelp av MT-fraksjoneringsmetoden. MT-er demonteres vanligvis ved lave temperaturer, men noen MT-er forblir stabile i kulde. Etter hjerneveiing ble de frosset ned i flytende nitrogen og plassert ved -80 °C i 30 minutter. Den forbigående frosne hjernen og rå hjernen som kontroll ble homogenisert og fraksjonert i P2-, P3- og S3-fraksjonene. Deretter ble andelen tubulin inneholdt i de tre fraksjonene kvantifisert ved vestlig blotting. Når hjernen var frosset ned før homogeniseringen, sank α-tubulin i P2-fraksjonen, og den i P3-fraksjonen økte i forhold til den i rå hjerne (figur 3A). Flekker med 6-11B1 (acetylert α-tubulin) eller 1A2 (tyrosinert α-tubulin) viste også at hjernefrysing reduserte acetyleringsnivået (figur 3B) og økte tyrosinasjonsnivået (figur 3C) av α-tubulin i P2-fraksjonen.
Nokodazol er et mikrotubuli-målrettingsmiddel (MTA) som forhindrer MT-polymerisering ved binding til β-tubulin og fremmer MT-depolymerisering. Musehjerner ble homogenisert i taksolfri MSB(+) med eller uten 10 μM nocodazol og plassert ved 4 °C i 20 min. Det ikke-behandlede eller nokodazolbehandlede homogenatet ble tilsatt til 10 μM Taxol, rehomogenisert og fraksjonert i P2-, P3- og S3-fraksjonene. Deretter ble andelen tubulin inneholdt i de tre fraksjonene kvantifisert ved vestlig blotting. Flekker med DM1A (α-tubulin) viste at α-tubulin i P2-fraksjonen avtok, og at det i P3-fraksjonen tenderte til økning med nokodazolbehandling (figur 3D). Disse resultatene indikerer at P2-tubulin ble destabilisert som respons på lav temperatur eller nocodazol, og at P2-fraksjonen inneholdt robuste MTs som motsto de eksperimentelle forholdene. I motsetning til frysing påvirket ikke nokodazol tubulin PTM (figur 3E,F). Basert på resultatene og ovennevnte data, kan depolymeriseringen av MTs som ikke kan detekteres ved PTM-analyse evalueres ved denne metoden.
Sammenligning av forholdet mellom stabile MT, labile MT og fritt tubulin i vev
Stabiliteten til MTs varierer mellom forskjellige vev, avhengig av den proliferative kapasiteten til cellene i disse vevene. Spesielt er stabile MT mer rikelig i nervesystemet, som hovedsakelig består av ikke-proliferative nevroner, sammenlignet med andre vev4. For å vurdere evnen til den utviklede MT-fraksjoneringsmetoden til å skjelne forskjeller i MT-stabilitet på tvers av forskjellige vev, ble lever og timian hos mus fraksjonert, og det gjenvunnede tubulinet i hver fraksjon ble kvantifisert. Resultatene viste at i sammenligning med andre vev viste hjernen et signifikant høyere nivå av P2-tubuliner, mens P3-tubuliner var spesielt anriket i vev som inneholdt proliferative celler (figur 4). I tillegg bekreftet Western blotting ved bruk av 6-11B1 og 1A2 antistoffer tilstedeværelsen av høyere MT-stabilitet i nervesystemet. De distinkte distribusjonsmønstrene til tubulin PTM indikerte tydelig at P2-tubulinet som spesifikt ble funnet i nervesystemet, stammet fra stabile MTs (figur 4). Disse funnene støtter videre oppfatningen om at P2- og P3-fraksjonene tilsvarer henholdsvis stabile og labile MT-er.
Figur 1: Kvantifisering av tubulin i musevev ved bruk av MT-fraksjoneringsmetoden. (A) Sammendrag av MT-fraksjoneringsmetoden for vev. Stabile MT (P2-fraksjon), labile MT-er (P3-fraksjon) og fritt tubulin (S3-fraksjon) i vev kan separeres ved 2-trinns ultrasentrifugering under forhold som undertrykker MT-polymerisering og depolymerisering under fremstilling. (B) MT i musebarken ble utfelt av konvensjonell 100 000 × g ultrasentrifugering etterfulgt av 500 000 × g ultrasentrifugering. Deretter ble tubuliner separert i P2-, P3- og S3-fraksjonene kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin) og anti-Tuj1 (TUBB3). Andelen proteiner i hver fraksjon (P2, P3 eller S3) til totalfraksjonen (P2 + P3 + S3) ble beregnet som beskrevet i protokollavsnittet (gjennomsnitt ± SD, n = 4). Denne figuren er modifisert fra Hagita et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MT-fraksjoneringsmetoden muliggjør separasjon av stabile MT-er, labile MT-er og fritt tubulin i hjernebarken hos mus. (A) S2- eller S3-fraksjonene (inngang) ble analysert ved hjelp av filterfelleanalysen ved hjelp av en 300 kDa ultrafiltreringsspinnkolonne. Tubuliner oppnådd ved filtrering (mottaker) og fangst (reservoar) ble kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin). (B) Rensede svinetubuliner ble utsatt for MT-fraksjoneringsmetoden og ble funnet å være hovedsakelig samlet i S3-fraksjonen. (C) Molekulær størrelse av tubulin i S3-fraksjonen. S3-fraksjonen ble separert ved størrelseseksklusjonskromatografi ved bruk av en gelfiltreringskromatografikolonne. Proteiner i hver fraksjon ble kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin) og KMX-1 (β-tubulin). Den teoretiske molekylvekten vises øverst på panelene. (D) Andelen av α-tubulin og β-tubulin i hver fraksjon var lik. Tubuliner separert i P2-, P3- og S3-fraksjonene ble kvantifisert ved vestlig blotting med KMX-1 (β-tubulin). Kvantifisering av andelen α-tubulin og β-tubulin i hver fraksjon i forhold til summen av totalfraksjonen (gjennomsnitt ± SD, n = 4). Statistiske analyser ble utført med Student t-test. (E,F) Modifikasjonene av α-tubulin i P2-, P3- og S3-fraksjonene ble verifisert ved vestlig blotting med 6-11B1 (acetylert α-tubulin: E) og 1A2 (tyrosinert α-tubulin: F). Kvantifisering av andelen tyrosinert eller acetylert α-tubulin i hver fraksjon i forhold til totalfraksjonen (gjennomsnitt ± SD, n = 4). (A-C) er modifisert fra Hagita et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av MT-depolymerisering indusert ved frysing eller MTA. (A-C) Stabiliteten til MT etter 30 minutters frysing ved -80 °C ble evaluert. Proporsjonene av tubulin inneholdt i de tre fraksjonene av den rå og frosne hjernen ble kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin: A), 1A2 (tyrosinert α-tubulin: B) og 6-11B1 (acetylert α-tubulin: C). (D-F) Effekten av nokodazol på MT-stabilitet ble evaluert. Andelen tubulin i de tre fraksjonene av ubehandlet eller behandlet hjerne med nocodazol ble kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin: D), 1A2 (tyrosinert α-tubulin: E) og 6-11B1 (acetylert α-tubulin: F). Representative relative nivåer av tyrosinering (B,E) eller acetylering (C,F) ble normalisert til mengden av totalt α-tubulin (A,D ) (betyr ± SD, n = 4). Statistiske analyser ble utført med Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Andeler av stabil MT, labil MT og fritt tubulin i hjerne, lever og thymus hos mus. Hjernen, leveren og timian hos mus ble dissekert og utsatt for MT-fraksjoneringsmetoden. Proteiner separert i hver fraksjon ble kvantifisert ved vestlig blotting med DM1A (α-tubulin), 6-11B1 (acetylert α-tubulin) og 1A2 (tyrosinert α-tubulin). Andelen proteiner i hver fraksjon (P2, P3 eller S3) til totalfraksjonen (P2 + P3 + S3) ble beregnet som beskrevet i protokollavsnittet (gjennomsnitt ± SD, n = 4). Statistiske analyser ble utført av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste oppgaven når man undersøker statusen til tubulin i vev fra levende organismer, forhindrer utilsiktet MT-polymerisering eller depolymerisering under fremstilling. Stabiliteten til MT i prøver påvirkes av faktorer som konsentrasjonen av Taxol i MSB, andelen vevsmengde til buffer og temperatur under prosessen fra fjerning av vev til homogenisering og sentrifugering. Derfor ble betingelsene optimalisert i hvert trinn i protokollen for å analysere musevev med et 20 ganger volum homogenat. En høyere konsentrasjon av Taxol kan indusere MT-polymerisering in vitro, selv under kjølte forhold25. Ved analyse av vev med signifikant forskjellige tubulinkonsentrasjoner eller betydelige protokollmodifikasjoner, bør hver operatør optimalisere trinnene i henhold til de spesifikke målene for eksperimentene.
I den utførte studien ble en ny populasjon av MT, referert til som P3, oppnådd fra den konvensjonelle "løselige fraksjonen" ved bruk av ultrasentrifugering ved 500 000 × g20. Teoretiske beregninger basert på faktorer som rotorens K-faktor, sentrifugalkraften og sentrifugaliseringens varighet antyder at tubulinene som er tilstede i S3-fraksjonen mest sannsynlig representerer 6S tubulindimerer. Omvendt kan tubulin i P3-fraksjonen tilsvare MT som er kortere i lengde sammenlignet med de som finnes i P2-fraksjonen. Denne observasjonen stemmer overens med resultatet som viser at frysing av vev før homogenisering, som fører til delvis kollaps av MTs26, resulterte i en signifikant økning i tubulin i P3-fraksjonen og en samtidig reduksjon i P2-fraksjonen (figur 3A). Videre indikerer analysen av tubulin PTM og bindingsegenskapene til forskjellige MAPs at P2- eller P3-fraksjonen inneholder henholdsvis stabile eller labile MTer. For eksempel var visse MAP-er spesifikke for stabile MT-er, hovedsakelig funnet i nevroner, utelukkende tilstede i P2-fraksjonen23. Følgelig er det plausibelt å foreslå at P3-fraksjonen består av MTs som er mer dynamiske og labile i forhold til de i P2-fraksjonen.
Ifølge teorien som ligger til grunn for metoden, kan uhensiktsmessige eksperimentelle forhold involvert i MT-stabilisering eller sentrifugering føre til dårlig fraksjonering. For eksempel fører en lav konsentrasjon av Taxol til en liten reduksjon i P2 tubulin, mens overskytende Taxol øker P2 tubulin på grunn av MT-dannelse under preparat23. På samme måte kan oppvarming av vev og prøver uhensiktsmessig føre til at MTs hyperpolymeriserer og tau nedbryter eller fragmenterer23. Videre er sentrifugalforholdene kritiske for å separere P3- og S3-fraksjonene, og en liten reduksjon i gravitasjonsakselerasjonen reduserer utvinningen av P3-fraksjonen betydelig. Derfor anbefales det å følge protokolltrinnene nøye hvis det observeres unormale fraksjoneringer.
Denne enkle fraksjoneringsmetoden kan brukes bredt for å analysere proporsjonene av tubuliner blant stabile MT-er, labile MT-er og frie dimerer i vev. Denne metoden gir flere fordeler, da den kan oppdage subtile endringer i tubulinstatus som kanskje ikke er synlige gjennom kvantifisering av tubulin PTM. Analyse av MT-stabilitet er viktig for å forstå den fysiologiske betydningen av MT, spesielt i store og komplekse nevronceller, og for å undersøke lidelser forbundet med MT-dysregulering. Mutasjoner eller dysfunksjoner i tubulin- eller MAP-gener er for eksempel knyttet til nevroutviklingsforstyrrelser og nevrodegenerative sykdommer27,28. I Alzheimers sykdom er MTs kjent for å bli redusert, muligens på grunn av funksjonelt tap av tau-protein i berørte nevroner 15,29,30,31,32,33. MTAer som modulerer MT-stabilitet og hemmer celledeling har blitt foreslått som potensielle terapier for nevrologiske lidelser13,34. Bruk av denne unike MT-fraksjoneringsmetoden for å analysere stabiliteten og oppførselen til MTs og MAPs i sykdomsmodelldyr kan bidra betydelig til å belyse patogenesen av tau-relatert demens og identifisere nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av JST etableringen av universitetsstipendier mot etableringen av vitenskapelig teknologisk innovasjon (A.HT .; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), et stipend-i-hjelp for vitenskapelig forskning (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), et stipend-i-hjelp for vitenskapelig forskning på innovative områder med tittelen "Brain Protein Aging and Dementia Control" fra MEXT (TM; 26117004), og av Uehara Research Fellowship fra Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C.
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al.
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D.
