Summary
Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.
Abstract
Los microtúbulos, compuestos por dímeros de α/β-tubulina, son un componente crucial del citoesqueleto de las células eucariotas. Estos polímeros en forma de tubo exhiben inestabilidad dinámica a medida que las subunidades de heterodímero de tubulina se someten a polimerización y despolimerización repetitivas. El control preciso de la estabilidad y la dinámica de los microtúbulos, logrado a través de las modificaciones postraduccionales de la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos, es esencial para diversas funciones celulares. Las disfunciones en los microtúbulos están fuertemente implicadas en la patogénesis, incluidos los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso se centra en agentes terapéuticos dirigidos a los microtúbulos que modulan la estabilidad, ofreciendo posibles opciones de tratamiento para estas enfermedades y cánceres. En consecuencia, comprender el estado dinámico de los microtúbulos es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y los efectos terapéuticos.
Tradicionalmente, la dinámica de los microtúbulos se ha evaluado in vitro o en células cultivadas mediante fraccionamiento aproximado o inmunoensayo, utilizando anticuerpos dirigidos a modificaciones postraduccionales de la tubulina. Sin embargo, el análisis preciso del estado de la tubulina en los tejidos mediante estos procedimientos plantea desafíos. En este estudio, desarrollamos un método simple e innovador de fraccionamiento de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón.
El procedimiento consistió en homogeneizar tejidos de ratón disecados en un tampón estabilizador de microtúbulos en una proporción de volumen de 19:1. A continuación, los homogeneizados se fraccionaron mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos tras una centrifugación lenta inicial (2.400 × g) para eliminar los residuos. La primera etapa de ultracentrifugación (100.000 × g) precipitó microtúbulos estables, mientras que el sobrenadante resultante se sometió a una segunda etapa de ultracentrifugación (500.000 × g) para fraccionar los microtúbulos lábiles y los dímeros de tubulina soluble. Este método determinó las proporciones de tubulina que constituyen microtúbulos estables o lábiles en el cerebro del ratón. Además, se observaron distintas variaciones tisulares en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionaron con la capacidad proliferativa de las células constituyentes. Estos hallazgos ponen de relieve el importante potencial de este novedoso método para analizar la estabilidad de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
Los microtúbulos (MT) son estructuras tubulares alargadas que comprenden protofilamentos formados por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempeñan un papel esencial en diversos procesos celulares, como la división celular, la motilidad, el mantenimiento de la forma y el transporte intracelular, lo que los convierte en componentes integrales del citoesqueleto eucariota. El extremo negativo de las MT, donde la subunidad de α-tubulina está expuesta, es relativamente estable, mientras que el extremo positivo, donde la subunidad de β-tubulina está expuesta, sufre despolimerización dinámica y polimerización2. Este ciclo continuo de adición y disociación de dímeros de tubulina en el extremo positivo, denominado inestabilidad dinámica, da lugar a un proceso repetitivo de rescate y catástrofe3. Los MT exhiben dominios focales con variaciones localizadas en la inestabilidad dinámica, incluyendo dominios estables y lábiles4.
El control preciso de la inestabilidad dinámica de las MT es crucial para numerosas funciones celulares, particularmente en neuronas caracterizadas por morfologías intrincadas. La adaptabilidad y durabilidad de las MT juegan un papel vital en el desarrollo y buen funcionamiento de las células nerviosas 5,6,7. Se ha encontrado que la inestabilidad dinámica de los MT está asociada con varias modificaciones postraduccionales (PTM) de la tubulina, como acetilación, fosforilación, palmitoilación, destirosinación, delta 2, oxidación de poliglutamina y poliglicación. Además, la unión de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) sirve como mecanismo regulador8. Los PTM, excluyendo la acetilación, se producen predominantemente en la región carboxiterminal de la tubulina situada en la superficie externa de los MT. Estas modificaciones crean diversas condiciones superficiales en los MT, lo que influye en su interacción con los MAP y, en última instancia, gobierna la estabilidad del MT9. La presencia de un residuo de tirosina carboxiterminal en la α-tubulina es indicativa de MT dinámicos, que son rápidamente reemplazados por el pool de tubulina libre. Por el contrario, la destirosinación del extremo carboxilo y la acetilación de Lys40 significan MTs estables con inestabilidad dinámica reducida 9,10.
Los PTM de la tubulina se han empleado ampliamente en experimentos para evaluar la dinámica y la estabilidad de las MT 5,7,11,12,13,14,15. Por ejemplo, en los estudios de cultivos celulares, las tubulinas se pueden segregar en dos grupos: el grupo de tubulinas libres y el grupo MT. Esto se logra liberando tubulina libre a través de la permeabilización celular antes de fijar los MT restantes 15,16,17,18,19. Los métodos bioquímicos implican el uso de estabilizadores químicos de MT que protegen a las MT de catástrofes, permitiendo la separación de MTs y tubulina libre a través de la centrifugación20,21,22. Sin embargo, estos procedimientos no diferencian entre MT estables y menos estables (lábiles), lo que hace imposible cuantificar MT o tubulina soluble en tejidos como el cerebro. En consecuencia, la evaluación de la estabilidad de la MT en organismos en condiciones fisiológicas y patológicas ha demostrado ser un desafío. Para abordar esta limitación experimental, hemos desarrollado una técnica novedosa para separar con precisión las MT y la tubulina libre en tejido de ratón23.
Este método único de fraccionamiento de MT implica la homogeneización de los tejidos en condiciones que mantienen el estado de la tubulina en los tejidos y la centrifugación en dos pasos para separar las MT estables, las MT lábiles y la tubulina libre. Este sencillo procedimiento puede aplicarse a estudios amplios, como la investigación básica sobre las MT y las MAP en organismos vivos, los análisis fisiológicos y patológicos de la salud y las enfermedades asociadas a la estabilidad de la MT, y el desarrollo de fármacos y otras terapias dirigidas a las MT.
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Protocol
1. Método de fraccionamiento MT
NOTA: Todos los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Doshisha. Aquí se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos, de 3 a 4 meses de edad. En este protocolo, los tejidos disecados, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, se homogeneizaron inmediatamente en un tampón estabilizador de microtúbulos (MSB) helado, que contenía Taxol (estabilizador de MT) a una concentración que impedía no solo la despolimerización sino también la repolimerización de MT. El homogeneizado se separó en tres fracciones mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos (Figura 1). Todos los pasos de este protocolo se completaron sin interrupción en un ambiente de temperatura fría, y los tejidos y fracciones no se congelaron hasta que se disolvieron en tampón de muestra de dodecil sulfato de sodio (SDS).
- Preparación de MSB y microtubos
- Para preparar MSB, mezcle los siguientes reactivos: 0,1 M de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), pH 6,8 (neutralizado por KOH), 10% glicerol, 0,1 mM de DTT, 1 mM de MgSO 4, 1 mM de EGTA, 0,5% de Triton X-100, inhibidores de la fosfatasa (1 mM de NaF, 1 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de Na3VO4, 0,5 μM de ácido okadaico), 1x cóctel de inhibidores de la proteasa, e inhibidores de la proteasa (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/mL de pepstatina, 1 μg/mL de antidolor, 10 μg/mL de aprotinina, 10 μg/mL de leupeptina, 50 μg/mL de TLCK) (ver Tabla de Materiales) y se denominan MSB(-).
- Justo antes de la disección del tejido, agregue 10 μM de Taxol y 2 mM de GTP (ver Tabla de Materiales) a MSB(-). Este búfer se denota como MSB(+). Prepare el tampón el día de su uso y manténgalo en hielo.
- Prepare los microtubos para la toma de muestras. Microtubo vacío de 2,0 mL para almacenamiento homogeneizado; microtubo vacío de 1,5 mL para el almacenamiento de lisado de sobrenadante1 (S1), muestra de precipitado2 (P2) y precipitado3 (P3); Microtubo de 1,5 ml con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para el almacenamiento de tejido disecado; Microtubo de 1,5 ml con 200 μl de tampón de muestra de 2 SDS (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerol; 2% 2-mercaptoetanol; 4% SDS) para el almacenamiento de muestras S1 y sobrenadante3 (S3); y microtubo de centrifugación para rotores centrífugos TLA55 y TLA120.2 (ver Tabla de Materiales). Etiquete todos los tubos y colóquelos en hielo.
- Homogeneización de tejidos de ratón
- Prepare una mesa refrigerada para la disección de tejidos. Primero, llene una caja con hielo picado y coloque dos placas de Petri sobre hielo, una con el lado interno hacia arriba y la otra con el lado externo. Llene el PBS helado en un plato para el lavado transitorio y el almacenamiento de los tejidos disecados. Coloque papel de filtro humedecido con PBS en otro plato volteado.
- Para sacrificar un ratón, realice la luxación cervical bajo anestesia profunda con un anestésico mixto de butorfanol, midazolam y medetomidina. Luego, diseccione inmediatamente los tejidos, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, y lávelos con PBS helado en una placa de Petri.
NOTA: Cualquier tipo de tejido blando puede ser analizado por este método. Sin embargo, el tamaño del tejido está limitado por el rango de volumen recomendado del homogeneizador utilizado. Por ejemplo, si se utiliza un volumen de 2 ml de homogeneizador, se recomiendan 50-100 mg de tejido. - Después de pesar los microtubos de 1,5 ml llenos de PBS para el almacenamiento de tejido disecado, corte y almacene los tejidos dentro de los microtubos y vuelva a pesar cada microtubo. El peso húmedo de cada tejido se puede calcular restando el peso del tubo antes y después de agregar el tejido.
- Homogeneizar inmediatamente el tejido en MSB(+) helado con un homogeneizador refrigerado (ver Tabla de Materiales). El volumen de MSB(+) fue 19 veces (μL) el peso húmedo del tejido (mg). Realizar la homogeneización con 20 pasadas hasta que desaparezcan los trozos de tejido.
NOTA: Por ejemplo, se utilizan 1.900 μL de MSB(+) por 100 mg de tejido. Dado que el volumen de MSB(+) que se va a añadir debe ajustarse para cada peso húmedo de las piezas de tejido analizadas, es necesario pesar cada pieza de tejido con precisión.
- Centrifugación de los homogeneizados de tejido de ratón
- Mover todo el homogeneizado a un microtubo de 2 mL con una pipeta Pasteur y centrifugar a 2.400 × g durante 3 min a 2 °C para eliminar los residuos por precipitación.
- Transfiera todo el sobrenadante (fracción S1) a un nuevo microtubo y vórtice de 1,5 ml. A continuación, alícuota 200 μL de fracción S1 en un microtubo de centrifugación y centrifugar a 100.000 × g utilizando un rotor TLA-55 durante 20 min a 2 °C para obtener las proteínas de peso molecular relativamente grandes como precipitado (fracción P2).
NOTA: El volumen de la muestra sometida a los pasos de ultracentrifugación afecta el radio de centrifugación y la eficiencia de precipitación de las moléculas. Mantenga el volumen de la muestra a 200 μL o menos después de este paso para evitar un fraccionamiento inexacto. - Centrifugar todo el sobrenadante resultante (fracción S2) a 500.000 × g utilizando un rotor TLA-120.2 durante 60 min a 2 °C para separar los complejos de proteínas insolubles en el precipitado (fracción P3) de las proteínas solubles en el sobrenadante (fracción S3).
- Añadir 400 μL de tampón de muestra 1x SDS (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerol; 1% 2-mercaptoetanol; 2% SDS) a los tubos de fracción P2 y P3 y sonicar brevemente para disolver el precipitado. Transfiera estas muestras fraccionadas a un microtubo vacío de 1,5 ml.
- Disuelva la fracción total de S3 en 200 μL de tampón de muestra SDS 2x.
- Mezcle las fracciones S1 restantes con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2x para su uso como curva estándar para Western bóset.
- Hervir todas estas muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
- Cuantificación de proteínas en cada fracción
- Cuantificar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 mediante Western blot. En primer lugar, utilice la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% (SDS-PAGE) para separar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 debidamente diluidas, y la muestra de S1 diluida en serie de cualquier individuo como una curva estándar. Luego, electroseque las muestras en membranas de fluoruro de polivinilideno (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: La relación de dilución de cada fracción depende de la concentración de una proteína objetivo y de la reactividad del anticuerpo. (p. ej., α-tubulina, TUBB3, β-tub y tubulina tirosinada en el tejido cerebral: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2.000, S1 = 1/50,000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; tubulina acetilada en tejido cerebral: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulina en el hígado: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulina en timo: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 dilución de la concentración tisular). - Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris (50 mM de Tris-HCl pH 7,6; 152 mM de NaCl) con 0,1% de Tween 20 (TBS-T) durante más de 30 min.
- Sumergir la membrana en el anticuerpo primario que contiene TBS-T (ver Tabla de Materiales) durante más de 2 h. Después de eso, lave la membrana con TBS-T durante 3 minutos (3 veces).
- Marcar el anticuerpo primario utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP (ver Tabla de materiales) en TBS-T durante más de 1 h. Después de eso, lave la membrana con TBS-T durante 3 minutos (3 veces).
- Desarrollar las membranas con el reactivo de quimioluminiscencia mejorada. A continuación, analice las bandas de interés con un analizador de imágenes luminiscentes (consulte la tabla de materiales).
- Cuantifique las intensidades de las bandas de proteínas utilizando un software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y cree una curva estándar trazando las unidades de dilución de las muestras S1 diluidas utilizadas para la curva estándar a lo largo del eje X y las intensidades de banda a lo largo del eje Y.
- Lea la concentración de proteína (unidad) correspondiente a las muestras de fracción diluida. Multiplique la concentración leída por el factor de dilución de la muestra para obtener una unidad de proteína en cada fracción. Divida la unidad medida de cada fracción por la unidad de proteína total (P2 + P3 + S3) para obtener un porcentaje.
- Cuantificar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 mediante Western blot. En primer lugar, utilice la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% (SDS-PAGE) para separar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 debidamente diluidas, y la muestra de S1 diluida en serie de cualquier individuo como una curva estándar. Luego, electroseque las muestras en membranas de fluoruro de polivinilideno (consulte la Tabla de materiales).
2. Evaluación de las propiedades de la tubulina en cada fracción
NOTA: Este método bioquímico proporciona tres grupos de complejos de tubulina definidos por las propiedades de sedimentación. Aquí, se identificó el estado de los complejos de tubulina obtenidos en estas fracciones en función del tamaño del complejo y de los PTM de tubulina. Complete todos los pasos de este protocolo sin interrupción en un entorno de temperatura fría, pero no congele las muestras fraccionadas hasta que se disuelvan en el tampón de muestras SDS.
- Ensayo de trampa de filtro
- Filtrar las fracciones S2 y S3 (500 μL cada una) utilizando una columna de centrifugación de ultrafiltración de 300 kDa (ver Tabla de Materiales). Realice una centrifugación de 14.000 × g a 2 °C hasta que se filtre todo el sobrenadante, las proteínas eluidas se recojan en los tubos receptores y las proteínas atrapadas permanezcan en el filtro de los tubos de depósito.
- Trasladar los filtrados enteros (aproximadamente 500 μL) en tubos receptores en nuevos microtubos de 1,5 ml y disolverlos en 500 μl de tampón de muestra SDS 2x.
- Solubilizar los residuos en el filtro de los tubos de depósito en 1.000 μL de 1x tampón de muestra SDS pipeteando y transfiriendo las muestras a un nuevo microtubo de 1,5 mL.
- Hervir las muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
- Analizar las cantidades de tubulina por Western blot con DM1A (anticuerpo anti-α-tubulina, ver Tabla de Materiales).
- Cromatografía de exclusión por tamaño
- Preparar el tampón portador (0,1 M MES, pH 6,8; glicerol al 10%; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) suplementado con una concentración de 1/10 de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa como se describe en el paso 1.1.1. Luego, filtre la solución y guárdela en un ambiente frío.
- Preparar una columna de cromatografía de filtración en gel equipada con un sistema de cromatografía líquida preparativa en una cámara de cromatografía (ver Tabla de Materiales) a 4 °C.
- Antes de inyectar las muestras en la columna, fluya 180 ml del tampón portador para lavar la columna. El caudal es de 1 mL/min durante 3 h.
- Inyecte en la columna la tubulina porcina purificada disponible en el mercado (véase la Tabla de materiales) como control o la fracción S3 de cerebros de ratón (500 μl cada uno).
- Eluir a un caudal de 1,0 ml/min con tampón portador. Recoja las fracciones de 1,5 ml durante 120 min. Monitorizar las proteínas eluidas por absorbancia a 280 nm. Mantenga la presión máxima por debajo de 0,3 MPa.
- Después de vórtice de las fracciones recolectadas, mezcle 50 μL de ellas con 50 μL de tampón de muestra SDS 2x en un microtubo de 1,5 mL. Hervir todas las muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
- Analizar las cantidades de tubulina por Western blot con DM1A, anticuerpo anti-α-tubulina y KMX-1, anticuerpo anti-β-tubulina (ver Tabla de Materiales).
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Representative Results
Cuantificación de tubulina en las fracciones P2, P3 y S3 del cerebro de ratón mediante el método de fraccionamiento MT
La tubulina en el tejido de ratón se separó en las fracciones P2, P3 y S3 mediante el método de fraccionamiento MT y se cuantificó mediante Western blot (Figura 1A). El precipitado de MTs que permaneció en la fracción P2 por ultracentrifugación a 100.000 × g durante 20 min representó el 34,86% ± el 1,68% de la tubulina total en el cerebro de un ratón. El sobrenadante (S2) se centrifugó a 500.000 × g durante 60 min. Se obtuvo un precipitado (fracción P3) y un sobrenadante (fracción S3), que representaron el 56,13% ± el 2,12% o el 9,01% ± el 0,68% de la tubulina total en el cerebro del ratón, respectivamente (Figura 1B).
La corteza cerebral utilizada en este estudio contiene células neuronales y no neuronales, como la glía. Para evaluar selectivamente la estabilidad de la MT en las neuronas de cerebros de ratones, cuantificamos TUBB3, un subtipo de tubulina que se expresa exclusivamente en neuronas del sistema nervioso central y periférico, mediante Western blot con Tuj1 (anticuerpo anti-TUBB3). El porcentaje de TUBB3 en la fracción P2, P3 o S3 fue del 32,65% ± 2,20%, del 59,31% ± 2,61% o del 8,04% ± 0,74%, respectivamente. No fueron significativamente diferentes de los de la α-tubulina (Figura 1B). Estos resultados sugirieron que las neuronas y las células gliales exhiben una estabilidad similar de MT o que las neuronas contienen cantidades mucho más altas de tubulina que las células gliales in vivo.
Características de la tubulina recuperada en cada fracción
Aquí, el homogeneizado de tejido de ratón se separó en tres fracciones mediante ultracentrifugación en dos pasos con diferentes aceleraciones gravitacionales; Por lo tanto, los coeficientes de sedimentación entre las proteínas o sus complejos en cada fracción difirieron. Aunque la tubulina precipitada a 100.000 × g de ultracentrifugación se consideró MT convencional, debe aclararse cómo la tubulina recién obtenida de la fracción P3 difiere aquí de la de la tubulina en las fracciones P2 y S3.
Para caracterizar la tubulina S3, la fracción S2 (P3 + S3) o S3 se sometió a ultrafiltración y cromatografía de exclusión por tamaño. Los complejos de tubulina en la fracción S3 podían pasar completamente a través de una columna de centrifugación de ultrafiltración de 300 kDa, mientras que casi toda la tubulina en la fracción S2 estaba atrapada en el filtro (Figura 2A). Además, se midió el peso molecular de los complejos de tubulina en la fracción S3 mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La tubulina S3 eluida en un pico correspondiente a 100 kDa, que es similar a la de los dímeros de tubulina purificada disponibles comercialmente (Figura 2B, C). Además, las proporciones de α y β-tubulina recuperadas en cada fracción por el método de fraccionamiento MT fueron iguales (Figura 2D). De hecho, se ha demostrado que la α- y la β-tubulina pueden existir ligeramente como monómeros en las células vivas24. Sin embargo, a juzgar por el valor estimado de kD (orden nM) notificado y la concentración de tubulina recuperada en la fracción S3 (~11 μM), se cree que la mayor parte (> 98%) de tubulina existe como dímeros α/β. Por lo tanto, la tubulina en la fracción S3 es principalmente un dímero soluble de α/β-tubulina.
Los polímeros de tubulina se separaron en dos fracciones, P2 y P3, en función de sus modificaciones postraduccionales (PTM). Para diferenciar entre estas fracciones, se realizó Western blot utilizando anticuerpos específicos. El anticuerpo anti-α-tubulina acetilada, que sirve como marcador de MTs estables, demostró que la fracción P2 se enriqueció significativamente con 97,40% ± 0,52% de α-tubulina acetilada (Figura 2E), mientras que la α-tubulina total se recuperó en las fracciones P3 y S3 (Figura 1B). Por el contrario, el anticuerpo anti-tirosinado α-tubulina, indicativo de MTs lábiles, reveló que el 75,43% ± 2,69% de la α-tubulina tirosinada estaba presente en la fracción P3 (Figura 2F). Estos hallazgos confirman que la fracción P2 contiene principalmente tubulina dentro de MT estables, mientras que la fracción P3 consiste en tubulina dentro de MT lábiles.
Evaluación de la estabilidad de la MT bajo tratamiento con congelación y nocodazol
Se analizó el efecto de la congelación y el tratamiento con nocodazol sobre la estabilidad de los MT intracerebrales de ratón para determinar si los cambios transitorios en la estabilidad de los MT podían discernirse mediante el método de fraccionamiento de MT. Los MT generalmente se desmontan a bajas temperaturas, pero algunos MT permanecen estables en el frío. Después de pesar los cerebros, se congelaron en nitrógeno líquido y se colocaron a -80 °C durante 30 min. El cerebro congelado transitorio y el cerebro crudo como control se homogeneizaron y fraccionaron en las fracciones P2, P3 y S3. A continuación, se cuantificó la proporción de tubulina contenida en las tres fracciones mediante Western blot. Una vez que el cerebro se congeló antes de la homogeneización, la α-tubulina en la fracción P2 disminuyó, y la de la fracción P3 aumentó en comparación con la del cerebro crudo (Figura 3A). Las transferencias con 6-11B1 (α-tubulina acetilada) o 1A2 (α-tubulina tirosinada) también revelaron que la congelación cerebral disminuyó el nivel de acetilación (Figura 3B) y aumentó el nivel de tirosinación (Figura 3C) de la α-tubulina en la fracción P2.
El nocodazol es un agente dirigido a los microtúbulos (MTA) que previene la polimerización de la MT al unirse a la β-tubulina y promueve la despolimerización de la MT. Los cerebros de ratón se homogeneizaron en MSB(+) libre de Taxol con o sin 10 μM de nocodazol y se colocaron a 4 °C durante 20 min. El homogeneato no tratado o tratado con nocodazol se añadió a 10 μM de Taxol, se volvió a homogeneizar y se fraccionó en las fracciones P2, P3 y S3. A continuación, se cuantificó la proporción de tubulina contenida en las tres fracciones mediante Western blot. Los flashes con DM1A (α-tubulina) mostraron que la α-tubulina en la fracción P2 disminuyó y que en la fracción P3 tendió a aumentar con el tratamiento con nocodazol (Figura 3D). Estos resultados indican que la tubulina P2 se desestabilizó en respuesta a bajas temperaturas o nocodazol y que la fracción P2 contenía MTs robustas que resistieron las condiciones experimentales. A diferencia de la congelación, el nocodazol no afectó a los PTM de tubulina (Figura 3E, F). Sobre la base de los resultados y los datos anteriores, la despolimerización de los MT que no pueden ser detectados por el análisis PTM puede ser evaluada por este método.
Comparación de la proporción de MT estables, MT lábiles y tubulina libre en los tejidos
La estabilidad de las MT varía entre los diferentes tejidos, dependiendo de la capacidad proliferativa de las células dentro de esos tejidos. Cabe destacar que las MT estables son más abundantes en el sistema nervioso, que consiste principalmente en neuronas no proliferativas, en comparación con otros tejidos4. Para evaluar la capacidad del método de fraccionamiento de MT desarrollado para discernir las diferencias en la estabilidad de MT en varios tejidos, se fraccionaron los hígados y el timo de los ratones, y se cuantificó la tubulina recuperada en cada fracción. Los resultados revelaron que, en comparación con otros tejidos, el cerebro exhibía un nivel significativamente mayor de tubulinas P2, mientras que las tubulinas P3 estaban notablemente enriquecidas en tejidos que contenían células proliferativas (Figura 4). Además, la transferencia de Western con anticuerpos 6-11B1 y 1A2 confirmó la presencia de una mayor estabilidad de la MT en el sistema nervioso. Los distintos patrones de distribución de los PTM de tubulina indicaron claramente que la tubulina P2 que se encuentra específicamente en el sistema nervioso se originó a partir de MT estables (Figura 4). Estos hallazgos apoyan aún más la noción de que las fracciones P2 y P3 corresponden a MT estables y lábiles, respectivamente.
Figura 1: Cuantificación de tubulina en tejido de ratón mediante el método de fraccionamiento MT. (A) Resumen del método de fraccionamiento MT para tejidos. Las MT estables (fracción P2), las MT lábiles (fracción P3) y la tubulina libre (fracción S3) en los tejidos se pueden separar mediante ultracentrifugación en 2 pasos en condiciones que suprimen la polimerización y despolimerización de la MT durante la preparación. (B) Las MT en la corteza del ratón se precipitaron mediante ultracentrifugación convencional de 100.000 × g seguida de ultracentrifugación de 500.000 × g . A continuación, las tubulinas separadas en las fracciones P2, P3 y S3 se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina) y anti-Tuj1 (TUBB3). Se calculó la proporción de proteínas en cada fracción (P2, P3 o S3) con respecto a la fracción total (P2 + P3 + S3) como se describe en la sección Protocolo (medias ± DE, n = 4). Esta figura ha sido modificada a partir de Hagita et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El método de fraccionamiento de MT permite la separación de MT estables, MT lábiles y tubulina libre en la corteza cerebral del ratón. (A) Las fracciones S2 o S3 (entrada) se analizaron mediante el ensayo de trampa de filtro utilizando una columna de centrifugación de ultrafiltración de 300 kDa. Las tubulinas obtenidas por filtración (receptor) y atrapamiento (reservorio) se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina). (B) Las tubulinas porcinas purificadas se sometieron al método de fraccionamiento MT y se encontró que se recolectaron principalmente en la fracción S3. (C) Tamaño molecular de la tubulina en la fracción S3. La fracción S3 se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna de cromatografía de filtración en gel. Las proteínas de cada fracción se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina) y KMX-1 (β-tubulina). El peso molecular teórico se muestra en la parte superior de los paneles. (D) Las proporciones de α-tubulina y β-tubulina en cada fracción eran iguales. Las tubulinas separadas en las fracciones P2, P3 y S3 se cuantificaron mediante Western blot con KMX-1 (β-tubulina). Cuantificación de la proporción de α-tubulina y β-tubulina en cada fracción respecto a la suma de la fracción total (medias ± DE, n = 4). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student. (E,F) Las modificaciones de α-tubulina en las fracciones P2, P3 y S3 se verificaron mediante Western blot con 6-11B1 (α-tubulina acetilada: E) y 1A2 (α-tubulina tirosinada: F). Cuantificación de la proporción de α-tubulina tirosinada o acetilada en cada fracción en relación con la fracción total (medias ± DE, n = 4). (A-C) han sido modificados a partir de Hagita et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la despolimerización de la MT inducida por congelación o MTA. (A-C) Se evaluó la estabilidad de la MT después de 30 min de congelación a -80 °C. Las proporciones de tubulina contenidas en las tres fracciones del cerebro crudo y congelado se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina: A), 1A2 (α-tubulina tirosina: B) y 6-11B1 (α-tubulina acetilada: C). Se evaluó el efecto del nocodazol sobre la estabilidad de la MT. Las proporciones de tubulina contenidas en las tres fracciones de nocodazol cerebrales no tratadas o tratadas se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina: D), 1A2 (α-tubulina tirosinada: E) y 6-11B1 (α-tubulina acetilada: F). Los niveles relativos representativos de tirosinación (B,E) o acetilación (C,F) se normalizaron a la cantidad de α-tubulina total (A,D) ) (medias ± DE, n = 4). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Proporciones de MT estables, MT lábiles y tubulina libre en el cerebro, el hígado y el timo en ratones. Los cerebros, hígados y timos de ratones fueron diseccionados y sometidos al método de fraccionamiento MT. Las proteínas separadas en cada fracción se cuantificaron mediante Western blot con DM1A (α-tubulina), 6-11B1 (α-tubulina acetilada) y 1A2 (α-tubulina tirosinada). Se calculó la proporción de proteínas en cada fracción (P2, P3 o S3) con respecto a la fracción total (P2 + P3 + S3) como se describe en la sección Protocolo (medias ± DE, n = 4). Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La tarea más importante cuando se investiga el estado de la tubulina en el tejido de los organismos vivos es prevenir la polimerización o despolimerización accidental de la MT durante la preparación. La estabilidad de los MT en las muestras se ve afectada por factores como la concentración de Taxol en MSB, la proporción de cantidad de tejido a tampón y la temperatura durante el proceso desde la extracción del tejido hasta la homogeneización y centrifugación. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones en cada paso del protocolo para analizar tejido de ratón con un volumen de homogeneizado de 20 veces. Una mayor concentración de Taxol puede inducir la polimerización de la MT in vitro, incluso en condiciones de frío25. Al analizar tejidos con concentraciones de tubulina significativamente diferentes o realizar modificaciones sustanciales en el protocolo, cada operador debe optimizar los pasos de acuerdo con los objetivos específicos de sus experimentos.
En el estudio realizado, se obtuvo una nueva población de MTs, denominada P3, a partir de la "fracción soluble" convencional mediante ultracentrifugación a 500.000 × g20. Los cálculos teóricos basados en factores como el factor K del rotor, la fuerza centrífuga y la duración de la centrifugación sugieren que las tubulinas presentes en la fracción S3 probablemente representan dímeros de tubulina 6S. Por el contrario, la tubulina en la fracción P3 puede corresponder a MT que son más cortas en longitud en comparación con las encontradas en la fracción P2. Esta observación se alinea con el resultado que muestra que la congelación de los tejidos antes de la homogeneización, que conduce al colapso parcial de las MTs26, resultó en un aumento significativo de la tubulina dentro de la fracción P3 y una disminución concurrente en la fracción P2 (Figura 3A). Además, el análisis de los PTM de tubulina y las propiedades de unión de varios MAP indican que la fracción P2 o P3 contiene MT estables o lábiles, respectivamente. Por ejemplo, ciertos MAPs específicos de las MT estables, que se encuentran principalmente en las neuronas, estaban presentes exclusivamente en la fracciónP2 23. En consecuencia, es plausible sugerir que la fracción P3 comprende MTs que son más dinámicas y lábiles en comparación con las de la fracción P2.
De acuerdo con la teoría que subyace al método, las condiciones experimentales inapropiadas involucradas en la estabilización o centrifugación de la MT pueden resultar en un fraccionamiento deficiente. Por ejemplo, una baja concentración de Taxol conduce a una ligera disminución de la tubulina P2, mientras que el exceso de Taxol aumenta la tubulina P2 debido a la formación de MT durante la preparación23. Del mismo modo, el calentamiento inadecuado de los tejidos y las muestras puede hacer que los MT se hiperpolimenicen y que la tau se degrade o fragmente23. Además, las condiciones centrífugas son críticas para separar las fracciones P3 y S3, y una ligera disminución de la aceleración gravitacional reduce significativamente la recuperación de la fracción P3. Por lo tanto, se recomienda seguir estrictamente los pasos del protocolo si se observan fraccionamientos anormales.
Este sencillo método de fraccionamiento puede aplicarse ampliamente para analizar las proporciones de tubulinas entre las MT estables, las MT lábiles y los dímeros libres en los tejidos. Este método ofrece varias ventajas, ya que puede detectar cambios sutiles en el estado de la tubulina que pueden no ser evidentes a través de la cuantificación de los PTM de tubulina. El análisis de la estabilidad de la MT es importante para comprender la importancia fisiológica de las MT, particularmente en las células neuronales grandes y complejas, y para investigar los trastornos asociados con la desregulación de la MT. Las mutaciones o disfunciones en los genes de la tubulina o del MAP, por ejemplo, están relacionadas con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas27,28. En la enfermedad de Alzheimer, se sabe que las MT están reducidas, posiblemente debido a la pérdida funcional de la proteína tau en las neuronas afectadas 15,29,30,31,32,33. Los MTAs que modulan la estabilidad de la MT e inhiben la división celular han sido propuestos como terapias potenciales para trastornos neurológicos13,34. La utilización de este método único de fraccionamiento de MT para analizar la estabilidad y el comportamiento de las MT y las MAP en animales modelo de enfermedad puede contribuir significativamente a dilucidar la patogénesis de la demencia relacionada con tau e identificar nuevas dianas terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que denunciar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación científica y tecnológica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), una subvención para becarios de JSPS (A.HT.; 23KJ2078), una subvención para la investigación científica (B) JSPS KAKENHI (22H02946 para TM), una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras titulada "Envejecimiento de las proteínas cerebrales y control de la demencia" del MEXT (TM; 26117004), y por la beca de investigación Uehara de la Fundación Uehara Memorial (TM; 202020027). Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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