Summary
Het doel van deze methodepaper is om een robuuste en reproduceerbare methodologie te demonstreren voor de verrijking, generatie en uitbreiding van primaire tumorcellijnen uit chirurgisch gereseceerd pleuraal mesothelioom.
Abstract
De huidige methodologieën voor de uitbreiding van primaire tumorcellijnen van zeldzame tumortypen ontbreken. Dit protocol beschrijft methoden om primaire tumorcellen uit te breiden van chirurgisch gereseceerd, maligne pleuraal mesothelioom (MPM) door een volledig overzicht te geven van het proces van spijsvertering tot verrijking, expansie, cryopreservatie en fenotypische karakterisering. Daarnaast introduceert dit protocol concepten voor tumorgeneratie die nuttig kunnen zijn voor meerdere tumortypen, zoals differentiële trypsinisatie en de impact van dissociatiemethoden op de detectie van celoppervlakmarkers voor fenotypische karakterisering. De belangrijkste beperking van deze studie is de selectie van tumorcellen die zich zullen uitbreiden in een tweedimensionaal (2D) kweeksysteem. Variaties op dit protocol, waaronder driedimensionale (3D) kweeksystemen, mediasupplementen, plaatcoating om de hechting te verbeteren en alternatieve desaggregatiemethoden, kunnen deze techniek en het algehele succespercentage van het vaststellen van een tumorlijn verbeteren. Over het algemeen biedt dit protocol een basismethode voor het vaststellen en karakteriseren van tumorcellen van deze zeldzame tumor.
Introduction
Maligne pleuraal mesothelioom (MPM) is een zeldzame tumor die sterk geassocieerd is met blootstelling aan asbest. Hoewel op immunotherapie gebaseerde benaderingen bemoedigende resultaten hebben laten zien, is er een tekort aan behandelingsopties beschikbaar voor patiënten die deze ziekte ontwikkelen, en de totale 5-jaarsoverleving is laag 1,2. Er zijn inspanningen aan de gang bij meerdere instellingen om deze ziekte beter te begrijpen en nieuwe therapeutische doelen te identificeren die de resultaten voor patiënten kunnen verbeteren. Hoewel er meerdere mesothelioom muismodellen zijn, is de toegang tot primaire mesothelioomtumorcellen beperkter3. In vitro expansie van primaire mesothelioom tumorcellen zou een waardevol modelsysteem bieden dat kan worden gebruikt om tumorcellen rechtstreeks te bestuderen en hun interactie met autologe immuuncellen zoals tumor-infiltrerende lymfocyten. Hoewel er rapporten zijn geweest over de uitbreiding van primaire mesothelioom tumorcellijnen, zijn dit er maar weinig en bieden ze geen gedetailleerde standaardoperatieprocedure (SOP). Bovendien zijn er weinig cellijnen beschikbaar uit commerciële bronnen zoals American Type Culture Collection (ATCC). Hoewel de beschikbaarheid van primaire tumorlijnen beperkt is, is aangetoond dat tumorcellen kunnen worden uitgebreid van pleurale effusies en rechtstreeks van het tumorweefsel 4,5. Bovendien is aangetoond dat uitgebreide tumorcellijnen het moleculaire profiel van de oorspronkelijke tumor behouden 4,5,6.
Ons laboratorium bestudeert de tumor-immuun micro-omgeving van MPM en heeft een methode ontwikkeld voor het uitbreiden van primaire MPM-tumorcellijnen uit chirurgisch gereseceerde gevallen. Deze methode is gebaseerd op onze ervaring met het vaststellen van primaire gemetastaseerde melanoomtumorcellijnen. Het doel van dit werk is om een gedetailleerde, praktische benadering te bieden voor de uitbreiding van primaire mesothelioomtumorlijnen met behulp van een 2D-modelsysteem en daaropvolgende fenotypische profilering. Gezien het recente succes van checkpointblokkadestrategieën gericht op CTLA4 en PD-1 in de eerstelijnssetting2, zou het vermogen om veel primaire tumorlijnen te genereren het begrip van zowel tumorintrinsieke mechanismen van resistentie kunnen bevorderen als een belangrijk modelsysteem kunnen bieden om T-celherkenning te beoordelen, waardoor ons begrip van de immuunrespons in MPM wordt verdiept.
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat elke tumor een andere micro-omgeving bevat en dat er een hoge mate van variabiliteit van expansiesucces is. Daarnaast selecteert deze methode voor tumorcellen die kunnen uitzetten in een 2D-kweeksysteem. Andere methoden waarbij een 3D-sferoïde of organoïde cultuur wordt geproduceerd, kunnen een alternatieve benadering bieden die een hoger slagingspercentage van expansie mogelijk maakt of resulteert in het vermogen om cellijnen af te leiden die niet in staat zijn om uit te breiden in een traditioneel 2D-systeem. Van dergelijke 3D-culturen is aangetoond dat ze nuttig zijn voor het genereren van tumortypen die moeilijk uit te breiden zijn, bijvoorbeeld alvleesklierkanker7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institution Review Board (IRB) van het MD Anderson Cancer Center van de Universiteit van Texas. Dit heeft betrekking op standaardzorg, chirurgisch gereseceerde MPM-tumoren die na geïnformeerde toestemming zijn verwijderd.
1. Bereiding van tumorverteringsmedia en andere geassocieerde media
- Om tumorverteringsmedia voor te bereiden, voegt u 5 ml 100% pen / strep (penicilline / streptomycine) toe aan 500 ml steriel Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium in een laminaire stromingskap.
- Breng het medium over naar een steriel filter van 500 ml, 0,22 μm polyethersulfon (PES) voor vacuümfiltratie.
OPMERKING: Filtratie- en aspiratiestappen moeten worden uitgevoerd met een standaard vacuümdruk van 75-150 torr. - Label en dateer het tumorverteringsmedium en bewaar het bij 4 °C.
OPMERKING: Het medium kan 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Breng het medium over naar een steriel filter van 500 ml, 0,22 μm polyethersulfon (PES) voor vacuümfiltratie.
- Om de tumorverterende enzymatische cocktail te bereiden, voegt u 2,5 ml 3% collagenase type 1, 1 ml 1,5 mg / ml hyaluronidase, 20 μl 250.000 eenheden / ml DNAse 1 tot 16,5 ml digestiemedium toe in een conische buis van 50 ml in een laminaire stroomkap.
OPMERKING: Het totale volume van de tumorverterende enzymatische cocktail is 20 ml; er is echter slechts 10 ml per tumormonster nodig. Als zodanig kan de resterende cocktail worden bewaard bij -20 °C totdat deze nodig is. Vries aliquots niet opnieuw in. - Om een volledig tumormedium te bereiden, voegt u 5 ml 100% pen / strep en 50 ml foetaal runderserum (FBS) toe aan 500 ml steriele RPMI 1640 in een laminaire stromingskap.
- Breng het medium over op een 500 ml, 0,22 μm PES steriel filter voor vacuümfiltratie.
- Label en dateer het volledige tumormedium en bewaar het bij 4 °C.
OPMERKING: Het medium kan 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Om gereduceerd serummedium voor te bereiden op uithongering, voegt u 5 ml 100% pen /strep en 5 ml FBS toe aan 500 ml steriele RPMI 1640 in een laminaire stromingskap.
- Breng het medium over op een 500 ml, 0,22 μm PES steriel filter voor vacuümfiltratie.
- Etiketteer en dateer het medium met gereduceerd serum en bewaar het bij 4 °C.
OPMERKING: Het medium kan 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Om vriesmedium te bereiden, voegt u 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan 45 ml FBS in een laminaire stromingskap.
- Breng het medium over op een 50 ml, 0,22 μm PES steriel filter voor vacuümfiltratie.
- Etiketteer en datum vijf conische buizen van 15 ml.
- Breng 10 ml vriesmedium over op elke buis en bewaar de buizen bij -20 °C.
- Om antibioticavrij medium voor mycoplasmatests te bereiden, voegt u 50 ml FBS toe aan 500 ml steriel RPMI 1640 in een laminaire stromingskap.
- Breng het medium over op een 50 ml, 0,22 μm PES steriel filter voor vacuümfiltratie.
- Etiketteer en dateer het antibioticavrije medium en bewaar het bij 4 °C.
OPMERKING: Het medium kan 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor fenotypische analyse voor te bereiden, voegt u 16,6 ml steriel runderserumalbumine toe aan 500 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een laminaire stromingskap.
- Label en dateer de FACS-buffer en bewaar deze bij 4 °C.
OPMERKING: FACS-buffer vereist geen filtersterilisatie zolang beide componenten steriel worden opgeslagen. FACS-buffer kan vóór opening gedurende 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Label en dateer de FACS-buffer en bewaar deze bij 4 °C.
2. Vertering van tumorweefsel
- Breng 10 ml tumorverterende enzymatische cocktail over van stap 1.2 naar een dissociatiebuis.
- Breng het stukje tumorweefsel over op een steriel 6-wells plaatdeksel met behulp van een steriel scalpel.
OPMERKING: De hoeveelheid medium die wordt overgedragen met het tumorweefsel is voldoende voor verwerking.- Verwijder alle vetweefsel, necrotisch weefsel en / of bloedstolsels met behulp van een nieuw steriel scalpel en tang.
OPMERKING: Vetweefsel is normaal gesproken geelachtig van uiterlijk en halfvast. Necrotisch weefsel is donkerder dan het omliggende weefsel qua uiterlijk en zeer zacht; zowel vet als necrotisch weefsel zal gemakkelijk uit elkaar vallen. Bloederig weefsel lijkt helderrood en kan bloed afgeven in het medium wanneer het wordt gemanipuleerd. Eenmaal verwijderd, moet het resulterende tumorweefsel vorm houden en bleek of roze zijn, afhankelijk van het weefseltype. - Snijd het hele tumorweefsel in 1 mm3 kleine fragmenten. Om ervoor te zorgen dat het weefsel niet uitdroogt, voegt u 500 μL steriele 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) toe aan het tumorweefsel.
- Verwijder alle vetweefsel, necrotisch weefsel en / of bloedstolsels met behulp van een nieuw steriel scalpel en tang.
- Breng tumorfragmenten over in de dissociatiebuis met 10 ml tumorverterende enzymatische cocktail (stap 2.1). Sluit de buis goed af, plaats hem met de kap naar beneden op de weefseldissociator en voeg het verwarmingsapparaat toe door het als een huls over de dissociatiebuis aan te brengen en erop te drukken om het op zijn plaats te klikken.
OPMERKING: De maximale capaciteit voor elke buis is 4 g tumor en 10 ml volume. - Selecteer de voorgeprogrammeerde instelling op de dissociator 37C_h_TDK_1. Controleer de status na 10 minuten om er zeker van te zijn dat er geen verstoppingsfout is zoals aangegeven door het knipperende rode lampje.
OPMERKING: Dit programma verwerkt bij 1.865 tpm gedurende 1 uur met een temperatuur van 37 °C.
OPMERKING: Als verstopping optreedt, verwijder dan de dissociatiebuis en draai deze handmatig om weefsel dat in het deksel is gevangen los te maken; vervang vervolgens de buis op de dissociator en hervat het programma. - Verwijder na de vertering van 1 uur de dissociatiebuis en plaats deze in een laminaire stromingskap. Filter de verteerde tumor door een celzeef van 70 μm op een conische buis van 50 ml te plaatsen en de verteerde tumor met een pipet van 10 ml op het filter te pipetteren. Als het filter verstopt raakt, schakelt u over naar een nieuw filter.
- Spoel de dissociatiebuis af met 10 ml verse tumorverteringsmedia en laat de was door het filter gaan.
- Verwijder het filter van 70 μm en gooi het weg.
- Breng het totale volume op 40 ml met tumorverteringsmedium.
- Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik een 2 ml aspiratpipet die aan een vacuümbron is bevestigd, aspirateer het supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de cellen met behulp van 10 ml steriel compleet tumormedium.
- Herhaal stap 2.6.
- Aspirateer het supernatant zoals beschreven in stap 2.7. Resuspendeer de cellen in 3 ml steriel compleet tumormedium en breng de celsuspensie over naar een put van een steriele 6-wellsplaat.
- Bewaar de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Breng na 24 uur het gebruikte medium over van de verteerde tumor in put 1 naar een nieuwe put (put 2) in dezelfde 6-wellsplaat. Voeg 3 ml steriel compleet tumormedium toe aan put 1.
- Breng het gebruikte medium over van put 1 en 2 en combineer tot put 3 in dezelfde 6-well plaat 24 uur na stap 2.11. Voeg 3 ml steriel compleet tumormedium toe aan putjes 1 en 2.
- Aspirateer het medium uit alle 3 putten en pipetteer 3 ml volledig tumormedium in elke put 48 uur na stap 2.12.
3. Generatie van primaire tumorcellijn
- Bepaal met behulp van een omgekeerde fasemicroscoop het percentage fibroblastbesmetting in de vroege passagecultuur.
OPMERKING: Fibroblasten zijn over het algemeen lang en onregelmatig en hebben een slecht gedefinieerd celmembraan. Ze lijken dun of plat op een Z-schaal.- Als fibroblastbesmetting groter is dan 20% van de cellen in de vroege passagecultuur, ga dan door met kweken nadat u het volledige medium hebt vervangen door een gereduceerd serummedium.
- Herhaal de vervanging met verlaagd serummedium in stap 3.1.1 tweemaal per week gedurende 3-4 weken.
- Wanneer de cultuur 80% confluentie bereikt, passeert u de cellen door 50:50 te splitsen in 2 nieuwe putten van een 6-well plaat. Ga door met het passeren van 50:50 in gereduceerde serummedia zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
- Herhaal stap 3.1.3 gedurende maximaal 4 weken en passeer indien nodig grotere kweekkolven door 50:50 te splitsen zodra de cultuur 80% samenvloeiing bereikt. Als de fibroblastpopulatie niet wordt teruggebracht tot 10% of minder, ga dan verder met stap 3.2 om de differentiële trypsinisatiemethode te proberen om fibroblastbesmetting te verwijderen. Ga anders verder met stap 3.3.
- Om tumorcellen te verrijken, spoelt u de put voorzichtig af met 1x PBS om het medium met serum te verwijderen.
- Voeg trypsine als volgt toe: 1 ml per put in een 6-well plaat, 2 ml voor een T25-kolf, 3 ml voor een T75-kolf.
- Plaats de 6-wells plaat of kolf gedurende 1 min in een incubator bij 37 °C. Verwijder de plaat of kolf uit de couveuse en controleer de hechting van de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. Als de cellen gedeeltelijk heffen of zweven, verwijder dan voorzichtig de zwevende cellen en trypsine alleen. Plaats de cellen in een conische buis van 15 ml met een gelijk of groter volume van het volledige tumormedium.
OPMERKING: Deze gedeeltelijke verzameling cellen op basis van adhesie-eigenschappen is de eerste van meerdere fracties. - Herhaal stap 3.2.1 en 3.2.2 totdat alle cellen zijn opgeheven of er 4 fracties zijn verwijderd.
- Centrifugeer alle onafhankelijke fracties bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer het supernatant zoals beschreven in stap 2.7 en resuspensieer de cellen met behulp van 5 ml steriel, gereduceerd serummedium.
- Plaats de cellen voor elke fractie in een T25-kolf en plaats de kolven in een broedmachine bij 37 °C.
- Beoordeel de cultuur na 48 uur om te bepalen welke fractie is verrijkt voor tumorcellen versus fibroblasten. Gooi fibroblastrijke kolven weg. Als fibroblastbesmetting <10% is, ga dan verder met expansie in het volledige tumormedium en ga verder met stap 4. Als de fibroblastbesmetting 10-30% is, herhaalt u stap 3.1.2-3.1.4. Als de fibroblastbesmetting groter is dan 30%, herhaalt u stap 3.2-3.2.7.
- Als er weinig of geen fibroblasten worden gedetecteerd binnen de vroege passagecultuur, ga dan door met het passeren van de cellen in het volledige tumormedium door 50:50 te splitsen zodra de cellen 80% samenvloeien in hun 6-well plaat of kolf.
4. Uitbreiding van vroege passage primaire tumorcellijn
- Zodra de primaire tumorkweek 10% of minder fibroblastbesmetting bevat, aspirateert u het medium en vervangt u het tweemaal per week door steriel volledig tumormedium.
OPMERKING: Het optimale mediumvolume voor een T25 is 5 ml; T75 is 12 ml; T150 is 25 ml.- Breng de cultuur 50:50 in grotere kolven als dat nodig is zodra deze 80% samenvloeiing in de plaat of kolf bereikt.
OPMERKING: De cultuur moet mogelijk in een hogere verhouding worden doorgegeven, afhankelijk van de groei. Pas je aan zodat de cultuur elke 3-5 dagen 80% samenvloeiing bereikt.
- Breng de cultuur 50:50 in grotere kolven als dat nodig is zodra deze 80% samenvloeiing in de plaat of kolf bereikt.
- Passage totdat de cultuur bij passage 4 of hoger is. Zodra de cultuur voor 80% samenvloeit in minimaal twee T75-kolven, gaat u verder met stap 5.
5. Karakterisering en banking van gevestigde primaire tumorcellijn
- Cryopreserve een T75-kolf als een vroege passagebevriezing. Voor mycoplasma testen van de resterende T75 kolven, ga verder met stap 5.2.
- Voor cryopreservatie van early-passage cellen ontdooit u 1 buis aliquoted vriesmedium bereid in stap 1.5.
- Verzamel de cellen door trypsinisatie door eerst de plaat te wassen met 1x PBS zoals beschreven in stap 3.2 en trypsine toe te voegen zoals beschreven in stap 3.2.1.
- Plaats de kolf gedurende 3 minuten in een broedmachine bij 37 °C. Verwijder de kolf uit de couveuse en controleer de hechting van de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. Als de cellen heffen of zweven, verwijder dan voorzichtig de zwevende cellen en trypsine. Plaats de cellen in een conische buis van 15 ml met een gelijk of groter volume van het volledige tumormedium.
OPMERKING: Als de cellen na 3 minuten blijven plakken, plaats de kolf dan nog eens 2 minuten terug in de couveuse. - Meng de buis goed door voorzichtig te pipetteren en verwijder 20 μL om te tellen.
- Centrifugeer de buis op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl de cellen draaien, tel je met behulp van een laboratoriumspecifiek telprotocol zoals trypan blue of acridine orange / propidiumjodide (AO / PI).
- Resuspensie van de cellen na centrifugatie in vriesmedium met een minimum van 2 × 106 cellen / 1 ml vriesmedium.
- Breng 1 ml van de celsuspensie over van stap 5.1.7 naar vooraf gelabelde cryovialen van 1,5 ml.
- Plaats de cryovialen in een vrieskamer met gecontroleerde snelheid en breng ze onmiddellijk over tot -80 °C.
- Bewaar de cellen bij -80 °C gedurende maximaal 1 week voordat ze worden overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Splits een T75 kolf 50:50 voor mycoplasma testen. Verander het medium in antibioticavrij medium dat in stap 1.6 is bereid.
- Ontdooi na 72 uur het mycoplasmadetectiereagens, substraat en controles bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voordat u gaat testen.
- Verzamel 1 ml van het supernatant uit elke te testen cultuur en plaats het in een conische buis van 15 ml.
- Pellet pelleteer alle gesuspendeerde cellen door het supernatant te centrifugeren op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Laad 100 μL monstersupernatanten en -controles in een witte 96-wellsplaat. Voeg 100 μL mycoplasmadetectiereagens toe aan elk monster en controleer.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat in een platenlezer en lees de luminescentie (lezen A, d.w.z. eerste lezing).
OPMERKING: Het protocol van de fabrikant van de mycoplasmakit geeft aan dat de standaardinstellingen op multifunctionele plaatlezers behouden blijven. De read is ingesteld op Luminescence endpoint met een integratietijd van 1 s en gain van 135. De plaatlezer gebruikt een routine voor automatisch schalen om het versterkingssignaal voor elk experiment te optimaliseren. De 1 s integratietijd is standaard standaard. Beide instellingen worden gebruikt om de intensiteit van het luminescerende signaal aan te passen dat door de plaatlezer wordt geïnterpreteerd en moeten mogelijk worden aangepast afhankelijk van de individuele plaatlezer. - Verwijder de plaat uit de plaatlezer en voeg 100 μL van het mycoplasmadetectiesubstraat toe aan elk monster en de controles.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat in de plaatlezer en lees de luminescentie (lezen B, d.w.z. tweede lezing).
- Om mycoplasma positiviteit te bepalen, bepaalt u de verhouding tussen lezen B en lezen A.
OPMERKING: Mycoplasma positiviteitsratio's worden beschreven in het protocol van de fabrikant van de mycoplasmakit. Metingen A en B worden verkregen met dezelfde instellingen en weerspiegelen eenvoudig de leesvolgorde.- Overweeg een verhouding < 1 mycoplasma-negatief te zijn.
- Beschouw een verhouding van 1-1,2 als niet overtuigend en herhaal stap 5.2.
- Beschouw een verhouding > 1,2 als mycoplasma-positief en controleer deze cultuur; beëindig de cultuur indien nodig.
- Flowcytometriekarakterisering van mycoplasma-negatieve tumorcellen
- Maak de tumorcellen los met behulp van celdissociatiebuffer.
- Tel de cellen en resuspensieer de cellen op 1 × 106/ml in FACS-buffer uit stap 1.7.
- Verwijder 100 μL celsuspensie in afzonderlijke buizen voor oppervlaktekleuring.
- Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer het supernatant en blok Fc-receptoren door de cellen gedurende 10 minuten in 500 μL 5% geitenserum in FACS-buffer bij kamertemperatuur te incuberen.
- Voeg 2 ml FACS-buffer toe en centrifugeer de suspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer het supernatant en voeg de oppervlaktevlekmix van antilichamen (tabel 1) en FACS-buffer toe, zodat het uiteindelijke volume 100 μL is. Bedek de monsters en kleur ze gedurende 30 minuten op ijs.
- Herhaal stap 5.3.6.
- Aspirateer het supernatant en fixeer de cellen door 200 μL 1% paraformaldehyde (PFA) plus 0,25% EtOH te resuspenderen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met de monsters beschermd tegen licht.
- Herhaal stap 5.3.6. Resuspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer voor acquisitie met behulp van een geschikte flowcytometer.
OPMERKING: Mesothelioom tumorcellen zullen naar verwachting positief zijn voor mesotheline en N-cadherine. Sommigen kunnen ook CD90 uitdrukken.
- Expanderen in volledig tumormedium en bank zoals beschreven in respectievelijk stap 4.1 en 5.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om fibroblastbesmetting van vroege passageculturen te bepalen, worden cellen beoordeeld met behulp van een omgekeerde fasemicroscoop om de frequentie van fibroblasten ten opzichte van de andere aanwezige aanhangende cellen te identificeren. Figuur 1 toont voorbeelden van toenemende fibroblastverontreiniging van 80% (figuur 1A), 50% (figuur 1B) en 30% (figuur 1C), vergeleken met een cultuur zonder fibroblastbesmetting (figuur 1D). Op basis van deze visuele beoordeling worden aanpassingen gedaan aan de uitbreidingsvoorwaarden zoals hierboven beschreven. Zodra een mycoplasmavrije cultuur met <10% fibroblastbesmetting is vastgesteld, wordt flowcytometrie gebruikt om de zuiverheid van de mesothelioomtumorlijn te bepalen.
Figuur 2A,B toont representatieve flowcytometrie oppervlaktekleuring van twee primaire mesothelioom tumorlijnen (MESO171 en MESO176) in vergelijking met ATCC-gevestigde mesothelioom tumorlijnen (NCI-H2452 en MSTO-211H) met een melanoom tumorlijn (MEL526) als negatieve controle. Mesothelioom tumorcellen kunnen mesotheline (figuur 2A) en N-cadherine (figuur 2B) tot expressie brengen. Gedetailleerde informatie met betrekking tot het gebruikte flowcytometriepaneel is weergegeven in tabel 1. De gatingstrategie is weergegeven in aanvullende figuur 1. Van belang is dat CD90 niet kan worden gebruikt als een fibroblast-specifieke marker, omdat het ook tot expressie kan worden gebracht door mesothelioomtumorcellen. Het belang van het testen van de impact van enzymatische onthechting op oppervlakte-eiwitmarkerexpressie wordt ook aangetoond, aangezien zowel trypsine als het protease-collagenasemengsel resulteerden in het verlies van oppervlakteexpressie van N-cadherine (figuur 2C) terwijl CD90 niet werd beïnvloed (figuur 2D).
Figuur 1: Representatieve beelden van toenemende frequentie van fibroblastbesmetting in vroege passageculturen en een gevestigde tumorlijn. (A) beeld van vroege passagecultuur met 80% fibroblastbesmetting. (B) Afbeelding van cultuur met een vroege passage die 50% fibroblastbesmetting bevat. (C) Afbeelding van vroege passagecultuur met 30% fibroblastbesmetting. (D) Afbeelding van een gevestigde primaire mesothelioom tumorlijn. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve flowcytometrie fenotypering van gevestigde mesothelioomtumorcellijn. (A en B) Histogrammen die het oppervlakteexpressiepatroon van mesotheline en N-cadherine op ATCC-mesothelioomcellijnen, controle melanoomtumorlijn en primaire mesothelioomtumorlijnen tonen. (C en D) Impact van trypsine, protease-collagenasemengsel en celdissociatiebuffer op N-cadherine en CD90. Afkortingen: Comp-X-A = gecompenseerd gebied van fluorofoor X; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oppervlakte antilichaam | Fortessa X20 Kanaal | Laser | Kloon | Isotype | Volume/ Monster (μL) |
| Live/Dead Geel | Bv510 | VIOLET | N.v.t | N.v.t | 1 |
| anti-mesotheline APC | Apc | Rood | REA1057 | IgG1 | 2 |
| anti-CD325 (N-Cadherine) PE | Pe | JG | 8C11 | IgG1 | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | | PE-Cy7 | JG | 5e10 | IgG1 | 5 |
Tabel 1: Flowcytometrie-antilichamen die worden gebruikt voor fenotype tumorlijnen. Afkortingen: PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine.
Aanvullende figuur S1: Gating-strategie voor fenotypische analyse van tumorlijnen. Dot plots worden getoond voor elke stap in de gating-strategie die leidt tot het beoordelen van de expressie van de markers van belang. Elke initiële poort met voorwaartse spreidings- en zijverstrooiingseigenschappen wordt gemaakt om de interessante cellen te identificeren, gevolgd door een QC-poort op basis van de tijdfunctie. De cellen worden vervolgens gesubgated om eventuele doubletten te verwijderen met behulp van voorwaartse en zijverstrooiingseigenschappen. De uiteindelijke QC-poort is gebaseerd op levensvatbaarheid, waarbij de dode cellen positief kleuren voor de kleurstof. Na de levensvatbaarheidspoort kan subgating worden uitgevoerd op basis van het paneel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel dit protocol eenvoudig is, zijn er een paar kritieke stappen die nauwlettend moeten worden gevolgd. De vroege passagebevriezing is belangrijk om het vermogen te behouden om het tumorcelverrijkingsproces te herhalen als het aanvankelijk niet succesvol is. Het vermogen om fibroblastische besmetting met het oog te beoordelen om de juiste splitsings- en media-uithongeringstechniek te bepalen, is van vitaal belang om fibroblastovergroei in de cultuur te voorkomen. Bovendien vereist de differentiële trypsinisatiemethode een zorgvuldige observatie van de cellen tijdens incubatie. De cellen kunnen met verschillende snelheden van de plastic plaat opstijgen, en dit zal variëren van cellijn tot cellijn. Tijdens het leren van dit proces en het verfijnen van deze besluitvormingsstap, kan een deel van de oorspronkelijke cultuur worden bewaard in een 6-well plaat met behulp van gereduceerd serumgebreksmedium (RPMI 1640 met 1% Pen / Strep en 1% FBS) totdat tumorcelverrijking kan worden waargenomen.
Een belangrijke factor die werd opgemerkt in de gevalideerde fenotypische karakterisering van de mesothelioomtumorlijnen was de impact van trypsinisatie en het protease-collagenasemengsel op de expressie van de mesothelioomtumorceloppervlakmarker, N-cadherine8. We zagen een verlies van de oppervlaktemarker als cellen werden losgemaakt met behulp van deze enzymen, wat eerder is beschreven9. Hoewel is aangetoond dat de meeste oppervlakte-eiwitten niet negatief worden beïnvloed door trypsine, is het belangrijk om elke oppervlaktemarker te testen tijdens het ontwerp van het stroompaneel10. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen om de tumorcellen te kweken of uit te breiden totdat de cellen een logfase van expansie bereiken en tijd hebben om deze markers opnieuw tot expressie te brengen. Met behulp van celdissociatiemedium kon de expressie van N-cadherine worden behouden voor detectie met behulp van flowcytometrie. Andere soorten dissociatiemedia kunnen ook markerretentie mogelijk maken; individuele laboratoria moeten deze media echter zorgvuldig testen voordat ze een flowcytometriepaneel opzetten.
Een belangrijke beperking van deze studie is dat het slagingspercentage van het vaststellen van een cellijn slechts 50% is. Dit kan te wijten zijn aan de heterogene aard van de micro-omgeving van de tumor. Manieren om dit proces te verbeteren kunnen het gebruik van 3D-kweeksystemen, de toevoeging van mediasupplementen om tumorcelexpansie te bevorderen, verbeterde deaggregatiemethoden, het gebruik van van de patiënt afgeleide xenografts of plaatcoating om tumorceladhesie te verbeteren11 omvatten. Inderdaad, 3D-culturen zijn succesvol gebleken bij het genereren van uitdagende tumorcellijnen zoals alvleesklierkanker7.
Een manier van selectie die niet in dit protocol is opgenomen, is tumorcelverrijking door celsortering op basis van een mesothelioomtumormarker zoals mesotheline. Aangezien mesothelioomtumorcellen de standaard fibroblastmarker, CD90, kunnen uitdrukken, kan positieve selectie een beter alternatief zijn. Het voorbehoud bij deze methode is de lage mate van cellulariteit in vroege culturen, waarvoor het nodig zou zijn om te worden gesorteerd in een klein volume, multiwell-plaat zoals een 384- of 96-wellplaat. Bovendien, aangezien dit protocol het gebruik van collagenase voor weefselvertering omvat, is het niet bekend of dit ook van invloed kan zijn op de oppervlakte-expressie van N-cadherine of mesotheline. Hoewel het mechanisme van mesotheline-expressie relatief onbekend is, speelt N-cadherine een belangrijke rol bij cellulaire adhesie en de verwijdering van dit eiwit kan een negatieve invloed hebben op de oprichting van een tumorlijn12. Dit wordt momenteel geëvalueerd.
Deze methode is belangrijk omdat het de generatie van een in vitro modelsysteem mogelijk maakt om dit zeldzame tumortype te bestuderen. Dit kan studies omvatten die nieuwe oppervlaktedoelen van mesothelioom identificeren, zoals mesotheline met CAR-T-cellen en tumorintrinsieke eigenschappen van resistentie tegen gerichte of immunotherapieën blootleggen. Bovendien, als deze cellen in vivo kunnen worden uitgebreid in muismodellen, zou dit ook een bron creëren voor het testen van cellulaire en op antilichamen gebaseerde therapieën en kleine moleculen. Een toekomstige richting voor dit protocol zal het testen van het vermogen zijn om andere subtypen van MPM's uit te breiden, zoals de sarcomatoïde en bifasische subsets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH is lid van de SAB for Briacell Therapeutics en de Mesothelioma Applied Research Foundation. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Raquel Laza-Briviesca bedanken voor haar bijdrage aan het starten van dit protocol en Drs. Boris Sepesi, Reza Mehran en David Rice voor de samenwerking op het gebied van weefselcollecties. Er is geen extra financiering verbonden aan dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
