Summary
Лекарственно-индуцированное повреждение печени (DILI) является основной причиной лекарственной недостаточности. Был разработан протокол для точного прогнозирования ответственности DILI соединения с использованием микрофизиологической системы печени (MPS). Модель печени использует кокультуру первичных печеночных клеток и трансляционно значимых конечных точек для оценки клеточных реакций на лечение.
Abstract
DILI является основной причиной истощения в разработке лекарств с более чем 1000 одобренными FDA препаратами, которые, как известно, потенциально вызывают DILI у людей. К сожалению, DILI часто не обнаруживается до тех пор, пока лекарства не достигнут клинических стадий, что ставит под угрозу безопасность пациентов и приводит к значительным потерям для фармацевтической промышленности. Принимая во внимание, что стандартные 2D-модели имеют ограничения в обнаружении DILI, важно разработать модели in vitro, которые являются более прогностическими для улучшения переводимости данных. Чтобы детально понять причинно-следственную связь и механистические аспекты DILI, была разработана MPS печени человека, состоящая из первичных паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени человека (NPC) и культивируемая в 3D-микротизю на инженерном каркасе под перфузией. Криоконсервированные первичные человеческие гепатоциты (PHH) и клетки Купфера (HKCs) кокулировались в виде микротиз в платформе MPS в течение двух недель, и каждое интересующее соединение повторно дозировалось на микроткани печени при семи тестовых концентрациях в течение четырех дней. Были проанализированы функциональные специфические для печени конечные точки (включая клинические биомаркеры, такие как аланинаминотрансфераза, АЛТ) для оценки функции печени. Острое и хроническое воздействие соединений различной степени тяжести DILI может быть оценено путем сравнения реакций на одиночные и многодозированные микроткани. Методология была подтверждена широким набором тяжелых и умеренно гепатотоксических соединений. Здесь мы показываем данные по пиоглитазону и троглитазону, известным гепатотоксическим соединениям, изъятым с рынка для возникновения печеночной недостаточности. В целом, было показано, что модель MPS печени может быть полезным инструментом для оценки DILI и его связи с изменениями функции печени. Модель может быть дополнительно использована для оценки того, как новые соединения ведут себя в различных подгруппах пациентов и как на профили токсичности могут влиять состояния заболевания печени (например, вирусный гепатит, жировая болезнь печени).
Introduction
DILI остается наиболее распространенной причиной острой печеночной недостаточности в США и Европе и является основной причиной истощения соединений в процессе разработки препарата1. Почти все классы лекарств могут вызывать гепатотоксичность, причем агенты центральной нервной системы и антибиотики являются наиболее распространенными методами лечения, которые вызывают DILI у пациентов2. Медикаментозная гепатотоксичность обусловлена сложным взаимодействием генетических, негенетических и экологических факторов, приводящих к гибели гепатоцитов и других типов клеток печени, включая холангиоциты и эндотелиальные клетки 1,3.
Агенты, вызывающие DILI, могут быть классифицированы двумя способами: те, которые вызывают предсказуемое дозозависимое повреждение печени, или те, которые вызывают идиосинкразический DILI, который является редким и развивается независимо от дозы препарата, или пути, или продолжительности введения, но отвечает за до шестой части всех острых печеночных недостаточностей в США только4. К сожалению, DILI часто не обнаруживается до тех пор, пока лекарства не достигнут клинических стадий процесса разработки лекарств. Ранг повреждения печени, вызванный лекарственными средствами (или DILIrank), состоит из более чем тысячи одобренных FDA лекарств, которые разделены на четыре класса в соответствии с их потенциалом вызывать DILI, и их использование у пациентов должно тщательно контролироваться5.
Изучение механизмов гепатотоксичности препарата остается очень сложным, и поэтому для изучения механизмов DILI было разработано множество доклинических моделей. Современные модели in vitro и in vivo, используемые для прогнозирования DILI в доклиническом развитии, имеют несколько ограничений для обеспечения понимания сложных, многогранных взаимодействий в живом человеческом теле. Раковые печеночные клеточные линии (т.е. HepG2, HepaRG), культивируемые в 2D, все еще используются на ранних стадиях разработки лекарств для оценки токсичности соединений-кандидатов6. Тем не менее, эти клеточные линии поступают от отдельных доноров и показывают аномальные уровни функции печени и не всегда проявляют высокую чувствительность к обнаружению DILI 7,8. В качестве альтернативы раковым печеночным клеточным линиям PHH лучше представляют физиологию печени человека, если их правильно культивировать in vitro, хотя с их культурой существует несколько ограничений, таких как короткое время инкубации с лекарствами, относительно короткая продолжительность жизни, потеря экспрессии генов печени и изменения метаболических функций лекарств 9,10,11 . PHH могут культивироваться на белках внеклеточного матрикса в стандартных 2D-пластинах клеточных культур, но в качестве недостатка быстрое снижение их функции означает, что они имеют низкую чувствительность (<50%) для прогноза DILI12.
С другой стороны, тестирование на животных моделях является медленным, дорогостоящим и нуждается в межвидовом переводе для экстраполяции прогнозирования на людей. Большинство недавно разработанных препаратов не получают одобрения, что делает этот процесс дорогостоящим и рискованным5. Кроме того, для тестирования новых специфических для человека модальностей животные модели менее подходят из-за последовательности генов или различий в иммунологическом ответе по сравнению с людьми13.
Следовательно, интерес к более продвинутым трехмерным (3D) моделям печени in vitro экспоненциально вырос. Культивирование PHH как сфероидальных структур, генерируемых гравитационной агрегацией в висячих каплях или на сверхнизких поверхностях крепления, представляет собой высокопроизводительный метод оценки сложных обязательств14. Сфероиды PHH использовались для оценки DILI в болезненном фоне (например, стеатоз и холестаз)15. Было разработано большое разнообразие моделей, включающих покрытые микроструктурированные кокультуры гепатоцитов со стромальными фибробластами16, 3D-биопечатные ткани печени17, 3D сфероидные культуры с печеночными непаренхимальными клетками15 или без них. Однако все эти методы все еще имеют недостатки, и культивирование PHH в более физиологически значимой микросреде может обеспечить им более высокий уровень функциональности в течение длительных периодов времени, чтобы позволить исследовать длительное воздействие потенциальных гепатотоксикантов. Кроме того, для улучшения трансляционной релевантности любой продвинутой культуры PHH in vitro необходимо использовать клинически значимые функциональные конечные точки или биомаркеры выхода токсичности, чтобы можно было сравнивать данные in vivo или клинические сценарии18.
В этом исследовании мы оценили, может ли MPS, также известный как Organ-on-a-Chip (OOC), модель печени in vitro быть использована для понимания подробных механистических аспектов токсичности печени. Ранее было показано, что MPS поддерживает высокофункциональные 3D-микротизы печени под течением до 4 недель19. Система была недавно протестирована FDA и показала высокую воспроизводимость при выполнении лекарственной токсичности, метаболизма и внутриклеточного накопления20. Более того, по сравнению со сфероидами и сэндвич-культурами система имела более стабильную функцию и более высокую чувствительность при обнаружении токсичности нескольких препаратов20. На сегодняшний день MPS используется в широком спектре применений, которые охватывают ADME21, моделирование заболеваний (HBV22, NAFLD23,24,25) и лекарственно-лекарственные взаимодействия26, что потенциально делает его очень подходящим для оценки острого и хронического DILI. Технология, представленная здесь, предлагает альтернативу для сокращения разрыва между более традиционными клеточными культурами и моделями на животных и клиническими испытаниями на людях, продвигаясь к моделированию биологических условий человека для поддержки оценки токсичности печени соединений-кандидатов на доклинических стадиях процесса разработки препарата.
Protocol
Вся работа проводилась в лаборатории в соответствии со строгими процедурами охраны труда и техники безопасности и в соответствии с собственными лабораторными оценками рисков и СОП. Все используемое оборудование обслуживается в соответствии с рекомендациями производителя. Микробиологические шкафы безопасности (MBSC) обслуживаются ежегодно, а Ki-Discus (йодид калия) тестируется по британским стандартам. Протокол следует Кодексу практики и директивам Управления по тканям человека Соединенного Королевства (HTA) и использует первичные человеческие клетки из этических источников, поставляемые поставщиками, которые полностью соответствуют общим требованиям к информированному согласию (45 CFR § 46.116 и § 46.117) и Надлежащей клинической практике (GLP) (ICH E6), а также нормативным и этическим комитетам.
1. Подготовка среды для культивирования клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте посадочную среду Advanced DMEM на день -1 и храните при температуре 4 °C. Подготовьте среду Для технического обслуживания Advanced DMEM на 1-й день и храните при температуре 4 °C в течение 1 недели.
- Посев улучшенной среды DMEM для PHH и кокультуры HKCs: Дополнить одну бутылку 500 мл Advanced DMEM среды (Таблица материалов) 18 мл коктейля А (конечная концентрация 3,6%) и 25 мл FBS (конечная концентрация 5%).
- Содержание Усовершенствованная среда DMEM для PHH и HKCs кокультуры: Дополните одну бутылку 500 мл Advanced DMEM среды (Таблица материалов) 20 мл коктейля B (конечная концентрация 4%) и 500 нМ гидрокортизона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрокортизон будет приготовлен в свежем виде в день использования, и шаги по приготовлению запасного раствора и необходимые разведения упомянуты ниже. - Получение гидрокортизона 500 нМ в поддерживающей усовершенствованной среде DMEM
- Приготовление исходного раствора (20 мМ): Взвесьте 7,24 мг гидрокортизона (Таблица материалов) в стеклянный флакон объемом 1 мл. Запишите точное количество взвешенного гидрокортизона и определите объем диметилсульфоксида (ДМСО) с помощью следующего расчета:
- Приготовление рабочего раствора гидрокортизона 100 мкМ: Добавьте 5 мкл исходного раствора 20 мМ к 995 мкл Advanced DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление 25 мкл раствора ДМСО со стадии 1 в воде или среде приводит к концентрации ДМСО 0,5%. В конечном растворе концентрация ДМСО составит 0,0025%. В этом случае дополнительный объем в 5 мкл приводит к незначительному изменению общего объема. - Приготовление рабочего раствора гидрокортизона 500 нМ в Advanced DMEM: Чтобы приготовить 1 мл 500 нМ раствора гидрокортизона в Advanced DMEM, добавьте 5 мкл исходного раствора 100 мкМ гидрокортизона к 995 мкл поддерживающей усовершенствованной DMEM среды.
- Приготовление исходного раствора (20 мМ): Взвесьте 7,24 мг гидрокортизона (Таблица материалов) в стеклянный флакон объемом 1 мл. Запишите точное количество взвешенного гидрокортизона и определите объем диметилсульфоксида (ДМСО) с помощью следующего расчета:
2. Настройка и грунтовка MPS (День -1)
- Подключите контроллер к его док-станции в инкубаторе клеточных культур и убедитесь, что свежий осушитель (Таблица материалов) добавляется в банку с осушителем, расположенную в задней части контроллера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блок контроллера со временем вытягивает влагу из инкубатора и сохраняется сухим с использованием свежего осушителя. - Включите контроллер , нажав на переключатель лодочного коромысла, расположенный позади него, и подождите 5 минут, пока система стабилизируется и достигнет давления. Затем проверьте экран для пневматического отчета, чтобы убедиться, что: (i) выход резервуара под давлением достиг ~ 2000 мБар и (ii) Выход вакуумного резервуара достиг ~ 850 мБар.
- Снимите каждую пластину с упаковки и визуально осмотрите каждую скважину, чтобы проверить наличие возможных дефектов (отсутствующие строительные леса, трещины и т. Д.).
- Вставьте драйвер (с включенной пластиной) на док-станцию, чтобы проверить, распознается ли драйвер док-станцией и контроллером. Проверьте, что выход резервуара под давлением снизился менее чем на 100 мБар, а выход вакуумного резервуара увеличился менее чем на 500 мБар.
- Грунтуйте каждую скважину, добавляя 500 мкл посадочной среды Advanced DMEM (предварительно прогретой до 37 °C) на сторону резервуара.
- Выберите программу Prime на экране контроллера (расход вверх в течение 3 мин со скоростью 2,5 мкл/с) до тех пор, пока жидкость не пройдет через опоры фильтра. ПРИМЕЧАНИЕ: «Восходящий поток» - это настройка на контроллере, которая позволяет среде течь из резервуара вверх через леса в пластине LC12.
- Заполните все колодцы еще 1,1 мл среды Seeding Advanced DMEM, чтобы покрыть поверхностный канал. Тогда все скважины будут иметь полный рабочий объем 1,6 мл.
- Поместите драйверы с пластинами в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO2 , подключитесь к док-станции и запустите программу Incubate .
ПРИМЕЧАНИЕ: Все программы, используемые в эксперименте (Prime, Incubate, Seed, Media Change), предварительно установлены в системе MPS. Загрунтуйте тарелки в инкубатор до готовности к посеву.
3. Посев клеток печени в MPS (День 0)
- Предварительно валидировать все PHHS и HKCs. Все лоты PHH и HKCs предварительно проверяются внутри компании перед проведением эксперимента с клеточной культурой (см. Дополнительный материал).
- Разморозьте флаконы с клетками PHH и HKCs (Таблица материалов), удерживая флаконы стабильно на водяной бане с температурой 37 °C до тех пор, пока не останется только небольшой кусочек льда.
- Пипетка PHH попадает непосредственно в пробирку предварительно подогретой (37 °C) криоконсервированной среды восстановления гепатоцитов CHRM среды (максимум два флакона на трубку).
- Аккуратно выложите клетки в пипетку, затем используйте 1 мл CHRM, чтобы промыть оставшиеся клетки из криотрубы. Будьте очень осторожны с клетками при оттаивании и переносе в коническую трубку.
ОСТОРОЖНО Не перемешивайте флаконы во время размораживания, и не пипеткой их содержимого вверх и вниз. - Клетки Pipette HKCs осторожно из криотрубы превращаются в 10 мл ледяной среды для посева Advanced DMEM в 15 мл центрифужной трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно комбинировать до 2 флаконов ГКЦ. - Центрифугирование обоих типов клеток при комнатной температуре (RT) при 100 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант.
- Повторно суспендируйте PHH в теплой среде Seeding Advanced DMEM и HKCs в ледяной среде Seeding Advanced DMEM (чтобы помочь уменьшить слипание клеток), используя 1 мл на флакон клеток, добавленных в трубку, и поместите клетки на лед. Используйте мягкое раскачивание, чтобы повторно суспендировать клетки.
ВНИМАНИЕ: Не восстанавливайте PHH действием пипетки, так как это может привести к гибели клеток. - Объедините клеточные суспензии из нескольких трубок (если применимо - т.е. если все PHH от одного донора), но не смешивайте типы клеток.
- Подсчет ячеек. Регистрируют жизнеспособность (должна быть выше 85% для обоих типов клеток, PHH и HKCs) и общее количество клеток. Если жизнеспособность клеток падает ниже 85%, разморозьте новый флакон клеток и переоцените жизнеспособность клеток.
- Рассчитайте жизнеспособность ячейки, используя следующую формулу:
- Рассчитать желаемый объем клеточной суспензии для посева в каждую скважину и дополнительный объем посевной продвинутой DMEM среды, необходимой для того, чтобы довести общий объем посева до 400 мкл. Количество клеток в лунке: 0,4 x 106 PHH и 0,04 x 106 ГХК на скважину, а плотность клеток 0,25 x 106 PHHs/мл, соответственно 0,025 x 106 ГКЦ/мл.
- Отсоедините драйвер от док-станции и поместите его в MBSC.
- Аспирируйте среду от вышеуказанного каркаса до остановочного пункта (спускаясь по глубокой выемке на подпорном кольце), канала и резервуара. Оставьте «мертвый объем» в 0,2 мл в культуральном колодце, достигнув чуть выше эшафота. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не удалить общую среду над каркасом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
- Добавьте 400 мкл среды Seeding Advanced DMEM в камеру скважины, верните драйвер на стыковочную станцию в инкубаторе и запустите программу Media Change в течение 3 минут. Программа автоматически приостановит работу через 3 минуты.
- После завершения отсоедините драйвер от док-станции и поместите его обратно в MBSC.
- Аспирируйте среду от вышеуказанного каркаса вниз к точке остановки и в конце резервуара каждой скважины.
- Осторожно повторно суспендируйте PHH, осторожно раскачивая трубку, затем добавьте необходимый объем клеточной суспензии в каждую культуру. Осторожно пипетируйте клеточную суспензию, убедитесь, что клетки равномерно рассеиваются по каркасу пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить хорошее покрытие по всему каркасу, используйте медленное вихревое движение, чтобы пипетки клеток спустились на каркас. - Аналогичным образом, тщательно повторно суспендируйте ГКЦ и добавьте клеточные суспензии в каждую культуру хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленное вихревое движение для засева ГКЦ, чтобы обеспечить хорошее покрытие по всему каркасу. Две подстадии посева могут быть разделены, или два типа клеток могут быть предварительно смешаны при соответствующей плотности и посеяны одновременно. - После того, как все колодцы содержат оба типа ячеек, поместите драйвер MPS на док-станцию в инкубаторе, не подключая его физически, и оставьте его стоять в течение 1 часа.
- Через 1 ч заполните каждую скважину необходимым объемом дополнительной посадочной среды Advanced DMEM до 400 мкл и запустите программу Seed .
- Через 2 минуты программа автоматически приостановит, вытащит драйвер из инкубатора и медленно добавит 1000 мкл среды Seeding Advanced DMEM в канал (ближе к концу резервуара, чем камера скважины) для достижения общего объема 1,4 мл (с дальнейшим мертвым объемом 200 мкл в каналах).
- Переместите тарелки в инкубатор и запустите остальную часть программы Seed в течение 8 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Flow автоматически переключится на программу Incubate через 8 часов.
4. Смена СМИ (День 1)
- Отсоедините драйвер от док-станции и поместите его в MBSC.
- Выполните замену среды, удалив среду Seeding Advanced DMEM в камере скважины до точки остановки.
- Добавьте 400 мкл среды ТЕХНИЧЕСКОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ Advanced DMEM в камеру скважины, верните драйвер на стыковочную станцию в инкубаторе и запустите программу Media Change в течение 3 минут. Программа автоматически приостановит работу через 3 минуты.
- Отсоедините драйвер от док-станции и в MBSC удалите среду из резервуарной камеры, канала и точки остановки над каркасом. В этот момент культуре колодец будет возвращен в мертвый объем.
- Доливайте камеру резервуара 1,4 мл свежей предварительно нагретой (37 °C) средой для технического обслуживания Advanced DMEM.
- Верните водителя на док-станцию в инкубаторе и запустите программу Incubate .
5. Контроль качества микротизсу печени (QC), сбор сред, изменение среды и дозировка лекарств (День 4)
- На 4-й день выполните смену носителя с помощью среды DMEM и проверки качества Maintenance Advanced, чтобы убедиться, что посев прошел успешно.
ПРИМЕЧАНИЕ: QC - это процесс, используемый для проверки состояния образующихся микротиз путем измерения лактатдегидрогеназы (LDH) и мочевины. - Перед запуском QC подготовьте свежие растворы для каждого соединения для тестирования (либо в среде Maintenance Advanced DMEM, либо в среде Maintenance Advanced DMEM, содержащей 0,1% DMSO, в зависимости от растворимости каждого соединения). Подготовьте соответственно разбавления для получения испытательных концентраций для каждого соединения.
- Отсоедините драйвер и пластину от док-станции и передайте на MBSC.
- Перенесите 50 мкл среды из каждой скважины с помощью пипетки на пластину 96 скважин для выполнения анализа LDH (Таблица материалов) перед отбором проб и 25 мкл для анализа мочевины (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы LDH и мочевины будут проводиться в соответствии с инструкциями производителя. - Продолжают эксперимент после КК, если показания ЛДГ ниже 2 а.е./106 клеток, а мочевина выше 40 мкг/сут/106 клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альбумин не используется в качестве контроля качества, потому что это длительный анализ для выполнения в день и будет проанализирован позже, как только эксперимент будет завершен из образцов, изъятых на 4-й день. - Если какие-либо скважины выходят из строя, удалите их из экспериментального проекта.
- Как только экспериментальная компоновка будет подтверждена, возьмите образец оставшихся сред из каждой скважины, убедившись, что они не нарушают культуру клеток, касаясь каркаса. Храните собранные носители (помеченные как образцы предварительной дозы) при -80 °C для последующих анализов.
- Выполните изменение мультимедиа в MBSC, выполнив действия 4.3-4.5. Замените скважины на среду Maintenance Advanced DMEM с правильной концентрацией препарата в соответствии с экспериментальным дизайном.
- После завершения верните водителя на док-станцию в инкубаторе и запустите программу Incubate .
6. Сбор средств массовой информации, изменение сми и дозирование лекарств (День 6)
- Подготовьте свежие исходные растворы для каждого соединения для тестирования (либо в среде С улучшенным содержанием DMEM, либо в среде DMEM с улучшенным содержанием, содержащей 0,1% DMSO, в зависимости от растворимости каждого соединения). Подготовьте разбавления соответствующим образом, чтобы получить испытательные концентрации для каждого соединения в соответствии с планом пластины.
- Отсоедините драйвер и пластину от док-станции и переведите на MBSC.
- Соберите среду из каждой лунки (~ 1 мл) вручную с помощью пипетки, чтобы убедиться, что она не нарушает культуру клеток, касаясь каркаса, анализ на ЛДГ и мочевину. Храните остальные собранные носители при -80 °C для последующих анализов и маркируйте их 48-часовыми образцами после дозы.
- Повторно дозируйте каждую лунку с той же концентрацией препарата, что и на 4-й день, и в соответствии с планом пластин, выполнив изменение среды , выполнив шаги 4,3-4,5.
- После завершения верните водителя на док-станцию в инкубаторе и запустите программу Incubate .
7. Окончание эксперимента (День 8)
- Отсоедините драйвер и пластину от док-станции и переведите на MBSC.
- Пробуйте среду из каждой скважины вручную с помощью пипетки, следя за тем, чтобы не потревожить культуру клеток, коснувшись каркаса.
- Проанализ изъятых носителей для LDH и мочевины и хранение остальных собранных носителей при -80 °C для последующих анализов.
- Запуск анализа CYP3A4-glo.
- Измерьте влияние препаратов, протестированных на активность цитохрома P450 CYP3A4 в PHH в конце эксперимента, используя этот анализ.
- Восстановите реагент обнаружения (для анализа CYP3A4 см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Если реагент обнаружения ранее был восстановлен и заморожен, извлеките его из морозильной камеры при температуре -20 °C и дайте ему оттаять при RT.
- Подготовьте 20 мМ запаса D-люциферина стандарта в соответствии с инструкциями производителя.
- Подготовьте рабочую люминогенную субстратную среду с разбавлением Люциферина IPA 1:1000 в среде Технического Усовершенствования DMEM (2 мл люминогенной субстратной среды на скважину).
- Выполните изменение среды, как описано в шагах 4.3-4.5, с помощью люминогенной субстратной среды. Сохраните 500 мкл люминогенной субстратной среды в стеклянном флаконе емкостью 1,5 мл (Таблица материалов) в качестве входного материала.
- Верните водителя на док-станцию в инкубаторе и запустите программу Incubate в течение 1,5 ч.
- Готовят стандартную кривую D-люциферина в питательной среде в пробирках объемом 1,5 мл по инструкции производителя и пипетку по 50 мкл каждого стандарта в двух экземплярах на белой непрозрачной 96-луночной пластине (см. Таблицу материалов), используя культуральную среду в качестве заготовки или 0 мкМ.
- По истечении времени извлеките драйвер из док-станции и возьмите образец носителя для анализа CYP3A4, выполнив шаги 7.4.9-7.4.13.
- После инкубации перенесите 50 мкл пробной среды из каждой скважины и входного материала на 96-луночную непрозрачную белую пластину люминометра, содержащую эталоны. Позаботьтесь о том, чтобы оставить по крайней мере два пустых ряда на непрозрачной пластине между стандартами и образцами, чтобы избежать переноса света между верхними стандартами и показаниями образцов.
- Добавьте 50 мкл реагента обнаружения люциферина в каждую лунку, чтобы инициировать люминесцентную реакцию.
- Инкубируйте пластину в RT на пластинчатом шейкере в течение 20 минут в темноте, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал.
- Запишите люминесценцию с помощью люминометра или ПЗС-камеры.
- Постройте стандартную кривую, взяв среднее значение каждой точки, а затем вычитая среднее значение заготовок. Используйте уравнение линии для расчета скорости метаболизма (pmol/min/106 клеток) в остальных образцах, не забывая включать любые проведенные разведения.
- Снимите каркасы с пластин с помощью пары пинцетов и поместите их в 24-луночную пластину, содержащую 500 мкл D-PBS (без Ca++ и Mg++) в каждой лунке, заботясь о том, чтобы не нарушить микротизю.
- Делайте снимки каждого каркаса с помощью инвертированного светового микроскопа с увеличением в 10 раз.
- Проведение анализа СПС (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями завода-изготовителя:
- Разморозьте реагент на РТ.
- Дважды мойте каркасы 500 мкл D-PBS (без Ca++ и Mg++) на каждом этапе стирки.
- Добавьте 120 мкл реагента и 120 мкл PBS к каждому каркасу и те же объемы в пустую скважину (это будет служить заготовкой). Поместите пластину, покрытую алюминиевой фольгой, на шейкер и энергично встряхните (500 об/мин) в течение 5 мин с последующим 30 мин инкубации для стабилизации сигнала люминесценции.
- Перенесите 100 мкл лизированных образцов в двух экземплярах на четкую 96-луночную пробирную пластину с плоским дном для измерения. Убедитесь, что пустые колодцы не размещены рядом с другими измерительными скважинами с высокой люминесценцией.
- Запишите люминесценцию с помощью считывателя микропластин.
- Сравните люминесценцию образцов с люминесценцией эталонов для определения АТФ, обнаруженной реагентом в образцах.
Representative Results
В рукописи описывается модель MPS печени, используемая для оценки DILI. MPS облегчает генерацию 3D-микротиз печени, которые поддерживают высокую функциональность под потоком до 4 недель. PHH / HKCs высеваются на покрытые коллагеном каркасы с образованием микротизов печени, которые перфузируются питательной средой и, после прохождения проверки QC, дозируются соединениями. Здесь мы показываем данные для троглитазона и пиоглитазона, двух структурно сходных соединений, но с разной степенью тяжести DILI.
На 4-й день, перед введением препарата, оценивается проверка КК сформированных микротизов печени и состоит из высвобождения ЛДГ и синтеза мочевины (рисунок 1А). QC направлен на подтверждение того, что MPS печени производит высоко последовательные и функционирующие микроткани печени. Данные, представленные здесь, получены из трех экспериментов и показывают хорошие уровни воспроизводимости с низкой внутри- и межизученной изменчивостью. После 8-дневной культуры оцениваются множественные показатели здоровья и печени (альбумин, мочевина, CYP3A4, АТФ) и контрольные микротизы показывают высокий уровень печеночной функциональности и воспроизводимости (рисунок 1B, C). Контрастно-фазовая микроскопия и окрашивание ПЧ микротисс печени (см. Дополнительный материал) показывают высокую консистенцию посева по всем микроканалам каркаса и выявляют распределение ГКЦ в микротканях PHH (рисунок 1D)
Рисунок 1: МПС печени производит высоковоспроизводимые данные и последовательные микротизы. (A) 3D показатели КК печени на 4-й день и оценка функциональности в конце исследования на 8-й день -(B) Альбумин и мочевина, (C) CY3A4 и АТФ). Данные собираются из 3 экспериментов; в каждом эксперименте было 3 реплики управления транспортным средством. Показаны следующие данные: Среднее ± SD, N = 9. (D) Фазово-контрастная микроскопия (10x и 20x) и IF 3D-микротизов печени, генерируемых кокультурированием PHH и HKCs в платформе MPS печени для оценки DILI. Для визуализации ГКК перед посевом ГКК трансдуцировали аденовирусным вектором, экспрессирующим эгГФП (см. Дополнительный материал). Показаны репрезентативные микрофотографии. Трансдукция и визуализация были выполнены как отдельный эксперимент для демонстрации локализации клеток, а не с помощью описанного протокола DILI. Клетки ГХК предварительно проверяются внутри компании перед использованием в экспериментальной клеточной культуре и должны иметь низкий уровень активации после оттаивания; это оценивается путем измерения биомаркеров IL-6 и TNF-альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Известно, что троглитазон вызывает тяжелый ДИЛИ; после его лицензии на лечение диабета 2 типа, он был отозван FDA после 3 лет на рынке из-за частоты повреждений печени, связанных с его использованием. На сегодняшний день опубликованные исследования на животных не смогли предсказать потенциал троглитазона вызывать серьезные повреждения печени. Токсичность этого соединения также не была обнаружена в стандартных 2D печеночных анализах in vitro 14.
Микротизы печени в МПС дозировали троглитазоном в течение 96 ч, и это вызывало острую токсическую реакцию,Сmax , которая была обнаружена высвобождением АЛТ и ЛДГ и быстрым снижением производства альбумина и мочевины при температуре около 15 х Смакс после острого воздействия троглитазона (рисунок 2А). Клеточная конечная точка (содержание АТФ) и активность CYP3A4 (для оценки метаболической биотрансформации), отобранные после воздействия 96 ч, дополнительно подтвердили токсичность, вызванную троглитазоном и значениями EC:50, были в значительной степени сопоставимы с другими конечными точками (рисунок 2B). Снимки микроскопии Брайтфилда, сделанные после 8-дневной культуры в MPS, показывают здоровую микротизсу печени, равномерно посеянную по всему каркасу (контроль транспортного средства), в отличие от генерализованной гибели / деградации тканей, как видно на репликатах, обработанных положительным контролем и троглитазоном в двух верхних тестовых концентрациях (рисунок 2C).
Рисунок 2: Определение риска DILI троглитазона с использованием нескольких гепатотоксических конечных точек. Микроткани печени подвергали воздействию семи тестовых концентраций троглитазона в течение 96 ч и сравнивали по (А) высвобождению ЛДГ, высвобождению АЛТ, производству альбумина, синтезу мочевины, активности CYP3A4 и содержанию АТФ. Синие линии - экспозиция 48 ч (только конечные точки мультимедиа), красные линии - экспозиция 96 ч. Положительным контролем было 100 мкМ хлорпромазина. Все конечные точки измеряются из одних и тех же культур MPS печени. Показанные данные являются средними ± SD, N = 3. (B) Сводка чисел E:50, полученных на основе данных. N.D. = данные, не подлежащие отображению. Линия = не анализирована. (C) Репрезентативная ярко-полевая микроскопия микроткани печени после 8-дневной культуры (увеличение в 10 раз). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Также исследовалась токсичность печени после воздействия пиоглитазона. Пиоглитазон является соединением, которое, как известно, имеет низкое значение DILI4 и не оказывает гепатотоксичности в классических культурах первичных гепатоцитов 2D и даже в некоторых более продвинутых 3D-моделях10,11. Мягкие гепатотоксические эффекты наблюдались в обеих проверенных временных точках (рисунок 3). Высвобождение LDH или ALT обнаружено не было; однако через 48 ч наблюдалось умеренное снижение производства альбумина и мочевины при приблизительно 25x Cmax (рисунок 3A). Очень незначительное снижение содержания АТФ наблюдалось также при высоких концентрациях пиоглитазона, но это не было значительным. Значения EC:50, полученные на основе кривых "доза-реакция", представлены на рисунке 3B. Микроскопия выявила незначительное изменение микротизвестности после 96-часового воздействия пиоглитазона в двух самых высоких испытанных концентрациях (рисунок 3C). Результаты демонстрируют способность ПЕЧЕНИ MPS обнаруживать токсичность соединений с легкой проблемой DILI.
Рисунок 3: Определение риска ДИЛИ пиоглитазона с использованием нескольких гепатотоксических конечных точек. Микроткани печени подвергали воздействию семи тестовых концентраций пиоглитазона в течение 96 ч и сравнивали по (А) высвобождению ЛДГ, высвобождению АЛТ, производству альбумина, синтезу мочевины, активности CYP3A4 и содержанию АТФ. Синие линии - экспозиция 48 ч (только конечные точки мультимедиа), красные линии - экспозиция 96 ч. Положительным контролем было 100 мкМ хлорпромазина. Все конечные точки измеряются из одних и тех же культур MPS печени. Показанные данные являются средними ± SD, N = 3. (B) Резюме чисел EC:50, полученных на основе данных. N.D. = данные, не подлежащие отображению. Линия = не анализирована. (C) Репрезентативная ярко-полевая микроскопия микроткани печени после 8-дневной культуры (увеличение в 10 раз). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Путем оценки всех функциональных конечных точек и биомаркеров выхода токсичности, которые могут представлять in vivo или клинические сценарии (высвобождение ЛДГ, синтез мочевины, производство альбумина, активность CYP3A4, содержание АТФ, высвобождение АЛТ) и подтверждения данных, полученных для обоих испытанных соединений, дозированных в семиточечном диапазоне доз в течение 48 ч и 96 ч, была создана тепловая карта для получения «сигнатуры гепатотоксичности», помогая идентифицировать соединения с различным уровнем беспокойства DILI (рисунок 4).
Рисунок 4: Определение «сигнатуры токсичности» с МПС печени. Тепловая карта, показывающая троглитазон и пиоглитазон из шести функциональных специфических для печени конечных точек (высвобождение ЛДГ, синтез мочевины, продукция альбумина, высвобождение АЛТ, активность CYP3A4 и содержание АТФ) после 48 ч и 96 ч воздействия семиточечного диапазона доз. Каждое значение генерируется как Среднее, N = 3, и нормализуется для контроля выборок. Значения на цветовых полосах представляют собой сгибовое увеличение по сравнению с базовыми элементами управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный материал: Флуоресцентный микроскоп, визуализирующий микроткани и предквалификационная оценка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
MPS предназначены для рекапитуляции функциональных единиц органов человека in vitro и были разработаны для устранения ограничений обычных 3D-моделей клеточных культур27. Печень является одним из наиболее моделируемых органов с использованием MPS, и было разработано большое разнообразие систем. Печень человека отвечает за метаболизм лекарств и генерацию токсичных метаболитов лекарств, и ее функция является ключевым элементом для моделирования разработки лекарств, включая оценку ответственности DILI соединений28. Здесь мы ввели новый метод оценки DILI с использованием печеночного MPS; протокол позволяет искать механистическую информацию для каждого анализируемого соединения, чтобы определить, как оно может вызвать DILI, а также является высокочувствительным и надежным анализом. Микроткани печени образуются в пластинах MPS, которые представляют собой кокультуру PHH и HKCs и являются высокофункциональными с высоким уровнем производства альбумина и мочевины, а также высокой активностью CYP3A4 по сравнению со стандартными моделями печени in vitro 20.
Хотя модель DILI, описанная здесь, может служить полезным инструментом на более поздних этапах доклинического тестирования в процессе разработки лекарств, она также имеет несколько ограничений. Поскольку большинство MPS в настоящее время доступны на рынке, это платформа с низкой пропускной способностью и, следовательно, более сложная в использовании для крупномасштабных мероприятий по скринингу наркотиков. Состоящая из микротравм, образованных кокультурными PHH и HKCs, модель DILI также не может полностью охватить сложность печени человека, и дальнейшая оптимизация путем включения различных типов клеток (например, иммунных клеток) была бы полезна для повышения ценности существующей модели. Этот одноорганный MPS также может быть объединен с другими платформами органов, которые могут иметь общую среду и допускать перекрестные помехи органов на клеточном или эндокринном уровне, и это может помочь лучше понять механистическое понимание токсичности, не ограничивающееся только самой печенью. Кроме того, как и любая относительно новая технология, она может считаться дорогостоящей и, следовательно, ограниченной доступностью.
MPS - это платформа, используемая для разработки органотипических моделей одиночных или многочеловеческих тканей. Система состоит из контроллера, пуповинного кабеля и драйвера MPS, в который вставлена пластина (рисунок 5A). Каждая пластина MPS печени имеет 12 независимых открытых скважин для культивирования первичных клеток печени в 3D на инженерных каркасах. Таким образом, система проверяется QC, и пластины грунтуются в день -1, PHH и HKC высеиваются на пластинах в нулевой день (рисунок 5B, см. 1). Встроенные микронасосы облегчают циркуляцию клеточных культуральных сред через каркасы, облегчая образование 3D-микротравм (рисунок 5B, см. 2). Сформированные микроткани получают QC на 4-й день, дозируют с различными концентрациями каждого соединения каждые 48 ч в течение 4 дней и анализируют на биомаркеры конечных точек на 8-й день (рисунок 5C). Экспериментальная временная шкала анализа DILI на пластине MPS изображена на рисунке 5D.
Рисунок 5: Микрофизиологическая система и экспериментальная временная шкала стандартного анализа DILI. (A) Микрофизиологическая система с ее компонентами: контроллером (1), пуповинным кабелем (2), док-станцией (3), драйвером MPS (4) и пластиной LC12 (5). (B) Посев PHH и HTC на пластину LC12 в день 1 (1) и встроенные микронасосы облегчают циркуляцию среды для культивирования клеток с настраиваемыми скоростями потока через 3D-микроткани, засеянные на каркасах (2). (C) Снос строительных лесов в конце исследования. D) Экспериментальная временная шкала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
При выполнении протокола важно, чтобы перед запуском была выполнена надежная проверка контроля качества системы, проверка правильной работы системы, а расходные пластины визуально проверяются и эффективно грунтуются, чтобы обеспечить равномерную функциональность во всех скважинах. Наличие высококачественных первичных клеток человека имеет важное значение для этого протокола, поскольку гепатоциты, как известно, последовательно придерживаются в экспериментах с клеточными культурами и образуют 3D-взаимодействия. Оттаивание этих клеток также является критическим шагом, так как первичные гепатоциты не должны быть повторно суспендированы пипетным действием, поскольку это может быстро привести к гибели клеток. Жизнеспособность клеток выше 85% имеет решающее значение для успешного посева, так как большое количество клеточного мусора будет мешать образованию 3D-микротизнеса. Проверка КК сформированных микротизов печени на 4-й день также важна, и пользователь должен убедиться, что измерены приемлемые уровни ЛДГ и мочевины, поскольку параметры вне диапазона могут указывать на некачественное образование тканей и позволяют легко устранять неполадки. Наконец, гидрокортизон, используемый в среде клеточной культуры, должен быть приготовлен свежим в день использования, чтобы предотвратить любую нежелательную деградацию, которая может повлиять на функциональность клеточной культуры, поскольку это требуется для поддержания метаболической функциональности гепатоцитов.
Несмотря на значительную сложность, МПС печени не содержит всех типов клеток печени человека. Можно добавить дополнительные типы клеток в модель 24,29 для повышения физиологической значимости, но они должны быть добавлены только с четким обоснованием контекста использования. Для изучения DILI PHH являются ключевым типом клеток, и включение ГКЦ в эту модель позволяет определить некоторые иммунологические ответы. Следует также отметить, что PHH, выделенные из печени человека, и коммерчески доступные криоконсервированные PHH, как правило, демонстрируют некоторые вариации от партии к партии. Здесь мы продемонстрировали, что этот протокол дает воспроизводимые результаты при использовании с высококачественными препаратами клеток. Тем не менее, можно было бы ожидать некоторого разнообразия лотов, и это можно было бы еще больше преодолеть, используя объединенные партии нескольких доноров. Эти ограничения могут быть преодолены путем использования гепатоцитоподобных клеток, дифференцированных от iPSC, которые повторяют многие функциональные свойства PHH и которые были использованы в процессе разработки лекарственного средства30. ГХК также демонстрируют вариативность многих партий и высокий уровень активации при оттаивании; таким образом, доноры ГХК предварительно валидируются внутри компании перед использованием в экспериментальной клеточной культуре (кокультура с валидированными PHH) и должны иметь низкие уровни активации после оттаивания; это оценивается путем измерения биомаркеров IL-6 и TNF-альфа (см. Дополнительный материал).
Представленные здесь данные подтверждают, что анализ может точно обнаруживать DILI, помогая идентифицировать гепатотоксиканты, которые могут не быть обнаружены 2D10,11 и даже некоторыми 3D-моделями. Данные, полученные с помощью MPS, по-прежнему не используются в качестве стандарта фармацевтической промышленностью для нормативных представлений или скрининга лекарств из-за отсутствия стандартизации и гармонизации процессов, включая воспроизводимость между сайтами20. Данные и экспериментальные подходы, продемонстрированные здесь, решают эту проблему, показывая, что модель печени может использоваться регулярно и надежно в скринингах DILI для точного прогнозирования ответственности новых соединений.
Путем измерения диапазона конечных точек для получения «сигнатуры гепатотоксичности», помогая идентифицировать соединения с различными уровнями беспокойства DILI (включая соединения, не обнаруживаемые другими методами in vitro) и их механизмы токсичности. Эта технология может сократить разрыв между традиционной клеточной культурой и животными моделями с одной стороны и клиническими испытаниями на людях, продвигаясь к моделированию биологических условий человека для доклинической оценки токсичности печени в рамках процесса разработки препарата.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. финансировала это исследование.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S.
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
