Summary
Läkemedelsinducerad leverskada (DILI) är en viktig orsak till läkemedelssvikt. Ett protokoll har utvecklats för att exakt förutsäga DILI-ansvaret för en förening med hjälp av ett levermikrofysiologiskt system (MPS). Levermodellen använder samkulturen av primära leverceller och translationellt relevanta effektmått för att bedöma cellulära svar på behandlingen.
Abstract
DILI är en viktig orsak till utmattning i läkemedelsutveckling med över 1000 FDA-godkända läkemedel som är kända för att potentiellt orsaka DILI hos människor. Tyvärr upptäcks DILI ofta inte förrän läkemedel har nått kliniska stadier, vilket riskerar patienternas säkerhet och leder till betydande förluster för läkemedelsindustrin. Med tanke på att standard 2D-modeller har begränsningar när det gäller att upptäcka DILI är det viktigt att utveckla in vitro-modeller som är mer förutsägbara för att förbättra dataöversättningsbarheten. För att förstå kausalitet och mekanistiska aspekter av DILI i detalj har en human lever-MPS bestående av humana primära leverparenkymala och icke-parenkymala celler (NPC) och odlade i 3D-mikrovävnader på en konstruerad byggnadsställning under perfusion utvecklats. Kryokonserverade primära humana hepatocyter (PHH) och Kupffer-celler (HKK) odlades som mikrovävnader i MPS-plattformen i upp till två veckor, och varje förening av intresse doserades upprepade gånger på levermikrotvävnader vid sju testkoncentrationer i upp till fyra dagar. Funktionella leverspecifika effektmått analyserades (inklusive kliniska biomarkörer såsom alaninaminotransferas, ALT) för att utvärdera leverfunktionen. Akut och kronisk exponering för föreningar med olika DILI-svårighetsgrader kan bedömas genom att jämföra svar med enstaka och flerdoserade mikrovävnader. Metoden har validerats med en bred uppsättning svåra och milt hepatotoxiska föreningar. Här visar vi data för pioglitazon och troglitazon, välkända hepatotoxiska föreningar som dragits tillbaka från marknaden för att orsaka leversvikt. Sammantaget har det visat sig att lever-MPS-modellen kan vara ett användbart verktyg för att bedöma DILI och dess samband med förändringar i leverfunktionen. Modellen kan dessutom användas för att bedöma hur nya föreningar beter sig i distinkta patientundergrupper och hur toxicitetsprofiler kan påverkas av leversjukdomstillstånd (t.ex. viral hepatit, fettlever).
Introduction
DILI är fortfarande den vanligaste orsaken till akut leversvikt i USA och Europa och är en ledande orsak till utmattning av föreningar i läkemedelsutvecklingsprocessen1. Nästan alla klasser av läkemedel kan orsaka levertoxicitet, med medel och antibiotika i centrala nervsystemet som de absolut vanligaste behandlingarna som orsakar DILI hos patienter2. Läkemedelsinducerad levertoxicitet orsakas av en komplex interaktion mellan genetiska, icke-genetiska och miljömässiga faktorer, vilket leder till döden av hepatocyter och andra levercelltyper, inklusive kolangiocyter och endotelceller 1,3.
DILI-orsakande medel kan klassificeras på två sätt: de som orsakar förutsägbar dosberoende leverskada eller de som orsakar idiosynkratisk DILI som är sällsynt och utvecklas oberoende av läkemedelsdos, eller administreringsväg eller administreringstid, men som är ansvarig för upp till en sjättedel av alla akuta leversvikt i USA endast4. Tyvärr upptäcks DILI ofta inte förrän läkemedel har nått de kliniska stadierna i läkemedelsutvecklingsprocessen. Läkemedelsinducerad leverskada rang (eller DILIrank) består av mer än tusen FDA-godkända läkemedel som är indelade i fyra klasser beroende på deras potential att orsaka DILI, och deras användning hos patienter måste övervakas noggrant5.
Att studera mekanismer för läkemedelshepatotoxicitet är fortfarande mycket utmanande, och därför har många prekliniska modeller utvecklats för att utforska mekanismer för DILI. Nuvarande in vitro- och in vivo-modeller som används för att förutsäga DILI i preklinisk utveckling har flera begränsningar för att ge insikter om de komplexa, mångfacetterade interaktionerna i en levande mänsklig kropp. Cancerösa levercellinjer (dvs. HepG2, HepaRG) odlade i 2D används fortfarande i de tidiga stadierna av läkemedelsutveckling för att utvärdera toxiciteten hos kandidatföreningar6. Trots det kommer dessa cellinjer från enstaka givare och visar onormala nivåer av leverfunktion och uppvisar inte alltid hög känslighet för detektion av DILI 7,8. Som ett alternativ till cancerösa levercellinjer representerar PHH bättre mänsklig leverfysiologi om de odlas på lämpligt sätt in vitro, även om det finns flera begränsningar med deras kultur, som kort inkubationstid med läkemedel, relativt kort livslängd, förlust av levergenuttryck och förändringar av läkemedelsmetaboliska funktioner 9,10,11 . PHH kan odlas på extracellulära matrisproteiner i vanliga 2D-cellodlingsplattor, men som en nackdel innebär den snabba nedgången i deras funktion att de har låg känslighet (<50%) för DILI-förutsägelse12.
Å andra sidan är testning på djurmodeller långsam, dyr och behöver en översättning mellan arter för att extrapolera förutsägelse till människor. De flesta nyutvecklade läkemedel misslyckas med att få godkännande vilket gör denna process kostsam och riskabel5. För att testa nya människospecifika modaliteter är dessutom djurmodeller mindre lämpliga på grund av skillnader i gensekvens eller immunologisk respons jämfört med människor13.
Följaktligen har intresset för mer avancerade tredimensionella (3D) in vitro-levermodeller ökat exponentiellt. Odling av PHH som sfäroida strukturer som genereras av gravitationsaggregering i hängande droppar eller på ultralåga fästytor representerar en metod med hög genomströmning för att bedöma sammansatta skulder14. PHH-sfäroider har använts för att bedöma DILI i en sjuk bakgrund (t.ex. steatos och kolestas)15. En mängd olika modeller har utvecklats för att inkludera pläterade mikromönstrade cokulturer av hepatocyter med stromala fibroblaster16, 3D-biotryckta levervävnader 17, 3D-sfäroidkulturer med eller utan leverfria icke-parenkymala celler15. Alla dessa metoder har dock fortfarande nackdelar, och odling av PHH i en mer fysiologiskt relevant mikromiljö skulle kunna ge dem högre funktionalitetsnivåer under längre tidsperioder för att möjliggöra undersökning av långvarig exponering för potentiella hepatotoxiska ämnen. För att förbättra den translationella relevansen av en avancerad in vitro-PHH-odling måste dessutom kliniskt relevanta funktionella endpoints eller biomarkörer för toxicitetsproduktion användas för att data ska kunna jämföras in vivo eller kliniska scenarier18.
I denna studie bedömde vi om en MPS, även känd som en organ-on-a-chip (OOC), in vitro-levermodell kunde användas för att förstå de detaljerade mekanistiska aspekterna av levertoxicitet. MPS har tidigare visat sig upprätthålla mycket funktionella 3D-levermikrovävnader, under flöde, i upp till 4 veckor19. Systemet har nyligen testats av FDA och visat sig ha hög reproducerbarhet vid utförande av läkemedelstoxicitet, metabolism och intracellulär ackumulering20. Dessutom, jämfört med sfäroider och sandwichkulturer, hade systemet en mer stabil funktion och högre känslighet för att detektera toxiciteten hos flera läkemedel20. Hittills har MPS använts i ett brett spektrum av applikationer som täcker ADME21, sjukdomsmodellering (HBV22, NAFLD 23,24,25) och läkemedelsinteraktioner 26, vilket potentiellt gör den mycket lämpad för att bedöma akut och kronisk DILI. Tekniken som presenteras här erbjuder ett alternativ för att stänga klyftan mellan mer traditionella cellkulturer och djurmodeller och kliniska prövningar på människa, och avancerar mot simulering av humanbiologiska förhållanden för att stödja bedömningen av kandidatföreningars levertoxicitet i prekliniska stadier av läkemedelsutvecklingsprocessen.
Protocol
Allt arbete utfördes i laboratoriet enligt strikta hälso- och säkerhetsprocedurer och i enlighet med sina egna laboratorieriskbedömningar och SOP. All utrustning som används servas enligt tillverkarens riktlinjer. Mikrobiologiska säkerhetsskåp (MBSC) servas årligen och Ki-Discus (kaliumjodid) testas enligt brittiska standarder. Protokollet följer den brittiska humanvävnadsmyndighetens (HTA) uppförandekod och direktiv och använder etiskt framställda primära mänskliga celler som tillhandahålls av leverantörer som helt uppfyller de allmänna kraven för informerat samtycke (45 CFR §46.116 och §46.117) och Good Clinical Practice (GLP), (ICH E6) och reglerings- och etikkommittéer.
1. Förbereda cellodlingsmedier
OBS: Förbered Seeding Advanced DMEM medium på dag -1 och förvara vid 4 °C. Förbered Maintenance Advanced DMEM medium på dag 1 och förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Seeding Advanced DMEM-medium för PHHs och HKCs coculture: Komplettera en flaska 500 ml Advanced DMEM-medium (Materialtabell) med 18 ml Cocktail A (slutlig koncentration på 3.6%) och med 25 ml FBS (slutlig koncentration 5%).
- Underhåll Avancerat DMEM-medium för PHHs och HKCs coculture: Komplettera en flaska 500 ml Advanced DMEM medium (Materialtabell) med 20 ml Cocktail B (slutlig koncentration på 4%) och 500 nM hydrokortison.
OBS: Hydrokortison kommer att göras färskt på användningsdagen, och stegen för hur man förbereder stamlösningen och erforderliga utspädningar nämns nedan. - Beredning av 500 nM hydrokortison i underhåll Advanced DMEM Medium
- Beredning av utgångsstamlösningen (20 mM): Väg upp 7,24 mg hydrokortison (materialtabell) i en 1 ml injektionsflaska av glas. Registrera den exakta mängden hydrokortison som vägts ut och bestäm volymen dimetylsulfoxid (DMSO) med hjälp av följande beräkning:
- Beredning av den bearbetade 100 μM hydrokortisonstamlösningen: Tillsätt 5 μl av den ursprungliga 20 mM stamlösningen till 995 μl avancerad DMEM.
OBS: Utspädning av 25 μl av DMSO-lösningen från steg 1 i vatten eller media resulterar i 0,5 % DMSO-koncentration. I den slutliga lösningen kommer DMSO-koncentrationen att vara 0,0025%. I detta fall resulterar den ytterligare volymen på 5 μL i en obetydlig förändring av den totala volymen. - Beredning av den arbetande 500 nM hydrokortisonlösningen i avancerad DMEM: För att bereda 1 ml 500 nM hydrokortisonlösning i avancerad DMEM, tillsätt 5 μL av stamlösningen av 100 μM hydrokortison till 995 μL av Maintenance Advanced DMEM-mediet.
- Beredning av utgångsstamlösningen (20 mM): Väg upp 7,24 mg hydrokortison (materialtabell) i en 1 ml injektionsflaska av glas. Registrera den exakta mängden hydrokortison som vägts ut och bestäm volymen dimetylsulfoxid (DMSO) med hjälp av följande beräkning:
2. MPS-installation och priming (dag -1)
- Anslut styrenheten till dess dockningsstationshus i en cellodlingsinkubator och se till att färskt torkmedel (materialtabell) läggs till i torkmedelsburken på baksidan av styrenheten.
OBS: Styrenheten drar fukt från inkubatorn över tiden och hålls torr med färskt torkmedel. - Slå på regulatorn genom att trycka på båtvippomkopplaren bakom den och vänta i 5 minuter tills systemet stabiliseras och når trycket. Kontrollera sedan skärmen för den pneumatiska rapporten för att säkerställa: (i) tryckreservoarutgången nådde ~ 2000 mBar och (ii) vakuumreservoarutgången nådde ~ 850 mBar.
- Ta bort varje platta från förpackningen och inspektera varje brunn visuellt för att kontrollera eventuella defekter (saknade byggnadsställningar, sprickor etc.).
- Sätt i en drivrutin (med en skylt på) på dockningsstationen för att kontrollera att föraren känns igen av dockningsstationen och styrenheten. Kontrollera att tryckreservoarutgången har sjunkit med mindre än 100 mBar och vakuumreservoarutgången har ökat med mindre än 500 mBar.
- Fyll på varje brunn genom att tillsätta 500 μL Seeding Advanced DMEM-medium (förvärmt till 37 °C) på reservoarsidan.
- Välj Prime-programmet på styrenhetens skärm (uppflöde i 3 min vid 2,5 μL/s) tills vätskan kommer genom filterstöden. OBS: "Uppflöde" är en inställning på regulatorn som gör att media kan strömma från behållaren uppåt genom ställningarna i LC12-plattan.
- Fyll alla brunnar med ytterligare 1,1 ml Seeding Advanced DMEM-medium för att täcka ytkanalen. Alla brunnar kommer då att ha sin fulla arbetsvolym på 1,6 ml.
- Placera drivrutinerna med plattor i en 37 ° C och 5% CO 2-inkubator, anslut till dockningsstationen och kör Incubate-programmet.
OBS: Alla program som används i experimentet (Prime, Incubate, Seed, Media Change) är förinställda i MPS-systemet. Primera plattorna i inkubatorn tills de är klara att fröas.
3. Sådd av leverceller till MPS (dag 0)
- Förvalidera alla PHHS och HKC. Alla PHHs och HKCs Lots är förvaliderade internt innan cellodlingsexperimentet utförs (se Kompletterande material).
- Tina injektionsflaskor med PHH- och HKCs-celler (materialtabell) genom att hålla injektionsflaskorna stadigt i ett 37 °C vattenbad tills endast en liten isbit återstår.
- Pipettera PHH direkt i ett rör av förvärmda (37 °C) kryokonserverade hepatocytåtervinningsmedium CHRM-medier (max två injektionsflaskor per rör).
- Pipettera cellerna försiktigt och använd sedan 1 ml CHRM för att tvätta eventuella kvarvarande celler från kryoröret. Var mycket försiktig med celler när du tinar och överför till ett koniskt rör.
VAR FÖRSIKTIG Rör inte om injektionsflaskorna under upptining och pipettera inte innehållet upp och ner. - Pipettera HKCs-celler försiktigt från kryoröret till 10 ml iskall Seeding Advanced DMEM-medium i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: Upp till 2 injektionsflaskor med HKC kan kombineras. - Centrifugera båda celltyperna vid rumstemperatur (RT) vid 100 x g i 10 minuter. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera PHH: erna i varmt Seeding Advanced DMEM-medium och HKC i iskall Seeding Advanced DMEM-medium (för att minska cellklumpning), med 1 ml per injektionsflaska med celler som läggs till röret och placera cellerna på is. Använd en mild gungning för att återsuspendera cellerna.
VARNING: Återsuspendera inte PHH genom pipettverkan, eftersom det kan leda till celldöd. - Kombinera cellsuspensionerna från flera rör (om tillämpligt - dvs om alla PHH är från samma givare), men blanda inte celltyper.
- Räkna celler. Registrera livskraften (måste vara över 85% för båda celltyperna, PHH och HKC) och det totala antalet celler. Om cellviabiliteten sjunker under 85%, tina en ny injektionsflaska med celler och ompröva cellviabiliteten.
- Beräkna cellviabilitet med följande formel:
- Beräkna den önskade volymen av cellsuspensionen för att fröa in i varje brunn och ytterligare volym av Seeding Advanced DMEM-medium som behövs för att ta den totala såddvolymen till 400 μL. Cellnummer per brunn: 0,4 x 10 6 PHH och 0,04 x 10 6 HHKC per brunn och celldensitet på 0,25 x 106 PHH / ml, 0,025 x 106 HHKCs/ml.
- Koppla bort drivrutinen från dockningsstationen och placera den i MBSC.
- Aspirera media från ovanstående byggnadsställning till stopppunkten (går ner i det djupa hacket på hållringen), kanal och reservoar. Lämna en "död volym" på 0,2 ml i kulturbrunnen och nå strax ovanför byggnadsbänken. Försiktighet måste vidtas för att inte ta bort det totala mediet ovanför ställningen för att undvika att luftbubblor bildas.
- Lägg till 400 μL Seeding Advanced DMEM-medium i brunnskammaren, sätt tillbaka drivrutinen på dockningsstationen i inkubatorn och kör Media Change-programmet i 3 minuter. Programmet pausas automatiskt efter 3 minuter.
- När du är klar kopplar du bort drivrutinen från dockningsstationen och placerar den tillbaka i MBSC.
- Aspirera media från ovanstående byggnadsställning ner till stopppunkten och vid reservoaränden av varje brunn.
- Återsuspendera försiktigt PHH: erna genom att försiktigt gunga röret och tillsätt sedan den önskade volymen av cellsuspensionen till varje odlingsbrunn. Pipettera försiktigt cellsuspensionen, se till att cellerna sprids jämnt över plattans byggnadsställning.
OBS: För att säkerställa god täckning i hela ställningen, använd en långsam virvlande rörelse för att pipettera celler ner på ställningen. - På samma sätt, försiktigt återsuspendera HKCs och tillsätt cellsuspensionerna till varje odlingsbrunn.
OBS: Använd en långsam virvlande rörelse för att seeda HKC för att säkerställa god täckning i hela ställningen. De två sådda delstegen kan separeras, eller så kan de två celltyperna förblandas med lämplig densitet och seedas samtidigt. - När alla brunnar innehåller båda celltyperna, placera MPS-drivrutinen på dockningsstationen i inkubatorn utan att fysiskt ansluta den och låt den stå i 1 timme.
- Efter 1 h fyller du upp varje brunn med önskad volym av ytterligare Seeding Advanced DMEM-medium för att nå 400 μL och kör Seed-programmet .
- Efter 2 minuter pausar programmet automatiskt, tar bort drivrutinen från inkubatorn och tillsätter långsamt 1000 μL av Seeding Advanced DMEM-mediet till kanalen (närmare reservoaränden än brunnskammaren) för att uppnå en total volym på 1,4 ml (med ytterligare 200 μL dödvolym i kanalerna).
- Flytta plattorna till inkubatorn och kör resten av fröprogrammet i 8 timmar.
OBS: Flow växlar automatiskt till inkubera program efter 8 timmar.
4. Medieförändring (dag 1)
- Koppla bort drivrutinen från dockningsstationen och placera den i MBSC.
- Utför medieändring genom att ta bort Seeding Advanced DMEM-mediet i brunnskammaren ner till stopppunkten.
- Lägg till 400 μl av Maintenance Advanced DMEM-mediet i brunnskammaren, sätt tillbaka drivrutinen på dockningsstationen i inkubatorn och kör Media Change-programmet i 3 minuter. Programmet pausas automatiskt efter 3 minuter.
- Koppla bort föraren från dockningsstationen och, i MBSC, suga bort media från reservoarkammaren, kanalen och stopppunkten ovanför byggnadsställningen. Vid denna tidpunkt kommer kulturbrunnen att återföras till den döda volymen.
- Fyll på reservoarkammaren med 1,4 ml färskt förvärmt (37 °C) Maintenance Advanced DMEM-medium.
- Sätt tillbaka föraren på dockningsstationen i inkubatorn och kör inkuberingsprogrammet .
5. Levermikrotissue kvalitetskontroll (QC), medieinsamling, medieförändring och läkemedelsdosering (dag 4)
- Utför dag 4 en medieändring med hjälp av DMEM-mediet för underhåll och QC-kontroller för att säkerställa att seedningen har lyckats.
OBS: QC är en process som används för att kontrollera hälsan hos de bildade mikrovävnaderna genom att mäta laktatdehydrogenas (LDH) och urea. - Innan du kör QC, förbered färska stamlösningar för varje förening som ska testas (antingen i Maintenance Advanced DMEM-medium eller Maintenance Advanced DMEM-medium som innehåller 0,1% DMSO, beroende på lösligheten för varje förening). Bered utspädningar i enlighet med detta för att ge testkoncentrationer för varje förening.
- Koppla bort drivrutinen och plattan från dockningsstationen och överför till en MBSC.
- Överför 50 μL media från varje brunn med hjälp av en pipett till en 96-brunnsplatta för att utföra en LDH-analys (materialtabell) före provtagning och 25 μl för en ureaanalys (materialtabell).
OBS: LDH- och ureaanalyser kommer att utföras enligt tillverkarens instruktioner. - Fortsätt experimentet efter QC om LDH-avläsningarna är lägre än 2 AU/10 6 celler och urea är över 40 μg/dag/106 celler.
OBS: Albumin används inte som QC eftersom det är en lång analys att köra på dagen och kommer att analyseras senare när experimentet är klart från de prover som togs ut på dag 4. - Om några brunnar misslyckas QC, ta bort dem från den experimentella designen.
- När den experimentella layouten har bekräftats, ta prov på det återstående mediet från varje brunn och se till att inte störa cellkulturen genom att röra vid ställningen. Förvara det insamlade mediet (märkt som prov före dos) vid -80 °C för senare analyser.
- Utför medieändring i en MBSC genom att följa stegen 4.3-4.5. Byt brunnarna till Maintenance Advanced DMEM-medium med rätt läkemedelskoncentration enligt experimentell design.
- När du är klar returnerar du drivrutinen till dockningsstationen i inkubatorn och kör inkuberingsprogrammet .
6. Medieinsamling, medieförändring och läkemedelsdosering (dag 6)
- Förbered färska stamlösningar för varje förening som ska testas (antingen i Maintenance Advanced DMEM-medium eller Maintenance Advanced DMEM-medium som innehåller 0,1% DMSO, beroende på lösligheten för varje förening). Bered spädningar i enlighet med detta för att ge testkoncentrationer för varje förening enligt plattplanen.
- Koppla bort drivrutinen och plattan från dockningsstationen och överför till en MBSC.
- Samla media från varje brunn (~ 1 ml) manuellt med en pipett och se till att inte störa cellkulturen genom att röra vid ställningen, analys för LDH och urea. Förvara resten av det insamlade mediet vid -80 °C för senare tester och märk dem 48 timmar efter dosen.
- Dosera varje brunn med samma läkemedelskoncentration som på dag 4 och enligt plattplanen genom att utföra Media Change enligt steg 4.3-4.5.
- När du är klar returnerar du drivrutinen till dockningsstationen i inkubatorn och kör inkuberingsprogrammet .
7. Avsluta experimentet (dag 8)
- Koppla bort drivrutinen och plattan från dockningsstationen och överför till en MBSC.
- Provmedia från varje brunn manuellt med hjälp av en pipett, se till att inte störa cellkulturen genom att röra vid ställningen.
- Analysera de uttagna medierna för LDH och urea och lagra resten av de insamlade medierna vid -80 °C för senare analyser.
- Kör CYP3A4-glo-analys.
- Mät effekterna av de testade läkemedlen på cytokrom P450 CYP3A4-aktivitet i PHH i slutet av experimentet med denna analys.
- Rekonstituera detektionsreagenset (för CYP3A4-analys, se materialförteckningen) enligt tillverkarens anvisningar. Om detektionsreagenset tidigare har beretts och frysts, ta bort det från frysen på -20 °C och låt det tina vid RT.
- Förbered 20 mM lager D-luciferin standard enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered arbetsluminogent substratmedium med en utspädning på 1:1000 av Luciferin IPA i Maintenance Advanced DMEM-medium (2 ml luminogent substratmedium per brunn).
- Utför en medieändring enligt beskrivningen i steg 4.3–4.5 med luminogent substratmedium. Spara 500 μl av det luminogena substratmediet i en 1,5 ml injektionsflaska av glas (Materialtabell) som insatsmaterial.
- Sätt tillbaka föraren på dockningsstationen i inkubatorn och kör inkuberingsprogrammet i 1,5 timmar.
- Förbered D-luciferin-standardkurvan i odlingsmedium i 1,5 ml rör enligt tillverkarens anvisningar och pipettera 50 μL av varje standard i två exemplar på en vit ogenomskinlig 96-brunnsplatta (se materialtabell), med odlingsmedium som blankt eller 0 μM.
- När tiden har gått tar du bort drivrutinen från dockningsstationen och provmediet för CYP3A4-analys enligt steg 7.4.9-7.4.13.
- Efter inkubation överför 50 μl av provmediet från varje brunn och det ingående materialet till den 96 brunnar ogenomskinliga vita luminometerplatta som innehåller standarder. Var noga med att lämna minst två tomma rader på den ogenomskinliga plattan mellan standarderna och proverna för att undvika ljusöverföring mellan de högsta standarderna och provavläsningarna.
- Tillsätt 50 μl Luciferin detektionsreagens till varje brunn för att initiera en självlysande reaktion.
- Inkubera plattan vid RT på en plattskakare i 20 minuter i mörkret för att stabilisera den självlysande signalen.
- Spela in luminescensen med en luminometer eller CCD-kamera.
- Rita standardkurvan genom att ta medelvärdet av varje punkt och sedan subtrahera medelvärdet av ämnena. Använd linjens ekvation för att beräkna ämnesomsättningen (pmol / min / 106 celler) i resten av proverna, kom ihåg att inkludera eventuella utspädningar.
- Ta bort ställningarna från plattorna med en pincett och placera dem i en 24-brunnsplatta som innehåller 500 μL D-PBS (utan Ca++ och Mg++) i varje brunn, var noga med att inte störa mikrovävnaden.
- Ta ögonblicksbilder av varje byggnadsställning med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop med förstoring 10x.
- Köra ATP-analysen (se materialförteckningen) enligt tillverkarens instruktioner:
- Tina reagenset vid RT.
- Tvätta ställningarna två gånger med 500 μL D-PBS (utan Ca++ och Mg++) för varje tvättsteg.
- Tillsätt 120 μl reagens och 120 μl PBS till varje ställning och samma volymer till en tom brunn (detta fungerar som ämne). Placera plattan täckt med aluminiumfolie på en shaker och skaka kraftigt (500 rpm) i 5 minuter följt av 30 minuters inkubation för att stabilisera luminiscenssignalen.
- Överför 100 μL av lysproverna i två exemplar till en klar 96-brunnsanalysplatta med platt botten för mätning. Se till att de tomma brunnarna inte placeras bredvid de andra mätbrunnarna med hög luminescens.
- Spela in luminescensen med en mikroplattläsare.
- Jämför provernas luminescens med standardernas luminescens för att bestämma ATP detekterad av reagenset i proverna.
Representative Results
Manuskriptet beskriver en lever-MPS-modell som används för att bedöma DILI. MPS underlättar genereringen av 3D-levermikrovävnader som upprätthålls mycket funktionella under flöde i upp till 4 veckor. PHHs / HKCs frös på kollagenbelagda byggnadsställningar för att bilda levermikrotvävnader som perfuseras med ett tillväxtmedium och, efter att ha klarat QC-kontrollen, doseras med föreningar. Här visar vi data för troglitazon och pioglitazon, två strukturellt liknande föreningar men med olika DILI-svårighetsgrader.
Vid dag 4, före läkemedelsdosering, bedöms en QC-kontroll av bildade levermikrovävnader och består av LDH-frisättning och ureasyntes (figur 1A). QC syftar till att bekräfta att levern MPS producerar mycket konsekventa och fungerande levermikrovävnader. De data som presenteras här genereras från tre experiment och visar goda nivåer av reproducerbarhet med låg intra- och inter-studievariation. Efter en 8-dagars odling bedöms flera hälso- och levermått (albumin, urea, CYP3A4, ATP) och kontrollmikrovävnader visar höga nivåer av leverfunktionalitet och reproducerbarhet (figur 1B, C). Kontrastfasmikroskopi och IF-färgning av levermikrovävnaderna (se kompletterande material) visar hög såddkonsistens i hela ställningens mikrokanaler och avslöjar fördelningen av HKC i PHH-mikrovävnaderna (Figur 1D)
Figur 1: Lever-MPS producerar mycket reproducerbara data och konsekventa mikrovävnader. (A) QC-mätvärden för 3D-levermikrovävnad vid dag 4 och funktionsbedömning i slutet av studien vid dag 8 -(B) albumin och urea, (C) CY3A4 och ATP). Data samlas in från 3 experiment; I varje experiment fanns det 3 replikat för fordonskontroll. Data som visas är Medelvärde ± SD, N = 9. (D) Faskontrastmikroskopi (10x och 20x) och IF av 3D-levermikrovävnader som genereras av coculturing PHH och HKCs i lever MPS-plattform för bedömning av DILI. För att visualisera HHKC: erna transducerades HKK: er före sådd med en adenoviral vektor som uttrycker eGFP (se kompletterande material). Representativa fotomikrografer visas. Transduktionen och avbildningen utfördes som ett fristående experiment för att demonstrera celllokalisering och gjordes inte med det beskrivna DILI-protokollet. HKK-celler är förvaliderade internt före användning i experimentell cellodling och måste ha låga nivåer av aktivering efter upptining; detta bedöms genom att mäta biomarkörerna IL-6 och TNF-alfa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Troglitazon är känt för att orsaka allvarlig DILI; efter sin licens för behandling av typ 2-diabetes drogs den tillbaka av FDA efter 3 år på marknaden på grund av frekvensen av leverskada i samband med dess användning. Hittills har publicerade djurstudier misslyckats med att förutsäga troglitazones potential att orsaka allvarlig leverskada. Toxiciteten hos denna förening detekterades inte heller i standard in vitro 2D-leveranalyser14.
Levermikrovävnader i MPS doserades med troglitazon i 96 timmar, och det orsakade ett akut toxiskt svar,C maxdrivet , som detekterades genom ALT- och LDH-frisättning och en snabb minskning av albumin- och ureaproduktionen, cirka 15 x Cmax, efter akut exponering för troglitazon (figur 2A). Cellulärt effektmått (ATP-innehåll) och CYP3A4-aktivitet (för bedömning av metabolisk biotransformation), som provtagits efter exponering på 96 timmar, ytterligare bekräftad toxicitet orsakad av troglitazon och EC:50-värden var mycket jämförbara med andra effektmått (figur 2B). Brightfield-mikroskopibilder tagna efter 8-dagars odling i MPS avslöjar en frisk levermikrovävnad, jämnt sådd i hela ställningen (vehikelkontroll) i motsats till generaliserad vävnadsdöd / nedbrytning som ses i replikaten behandlade med positiv kontroll och troglitazon vid de två översta testkoncentrationerna (figur 2C).
Figur 2: Bestämning av DILI-risken för troglitazon med användning av flera hepatotoxiska effektmått. Levermikrovävnader exponerades för sju testkoncentrationer av troglitazon i 96 timmar och jämfördes med (A) LDH-frisättning, ALT-frisättning, albuminproduktion, ureasyntes, CYP3A4-aktivitet och ATP-innehåll. Blå linjer - 48 timmars exponering (endast mediaslutpunkter), röda linjer - 96 timmars exponering. Positiv kontroll var 100 μM klorpromazin. Alla effektmått mäts från samma lever-MPS-kulturer. Data som visas är medelvärde ± SD, N = 3. (B) Sammanfattning av E:50-nummer som genererats från data. N.D. = data som inte kan plottas. Linje = ej analyserad. (C) Representativ ljusfältmikroskopi av levermikrovävnader efter 8-dagars odling (förstoring 10x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Levertoxicitet efter exponering för pioglitazon undersöktes också. Pioglitazon är en förening som är känd för att vara av låg DILI-oro4 och utövade inte levertoxicitet i klassiska 2D-primära hepatocytkulturer och även i vissa mer avancerade 3D-modeller10,11. Lindriga levertoxiska effekter observerades vid båda de testade tidpunkterna (figur 3). Ingen LDH- eller ALT-frisättning upptäcktes; Efter 48 timmar observerades dock en mild minskning av albumin- och ureaproduktionen, vid ca 25x Cmax (figur 3A). Mycket liten minskning av ATP-halten observerades också vid höga pioglitazonkoncentrationer, men detta var inte signifikant. EC:50-värden som genereras från dos-responskurvor presenteras i figur 3B. Mikroskopi avslöjade liten mikrovävnadsförändring efter 96 timmars exponering för pioglitazon vid de två högsta testade koncentrationerna (figur 3C). Resultaten visar förmågan hos levern MPS att detektera toxiciteten hos föreningar med mild DILI-oro.
Figur 3: Bestämning av DILI-risken för pioglitazon med hjälp av flera hepatotoxiska effektmått. Levermikrovävnader exponerades för sju testkoncentrationer av pioglitazon i 96 timmar och jämfördes med (A) LDH-frisättning, ALT-frisättning, albuminproduktion, ureasyntes, CYP3A4-aktivitet och ATP-innehåll. Blå linjer - 48 timmars exponering (endast mediaslutpunkter), röda linjer - 96 timmars exponering. Positiv kontroll var 100 μM klorpromazin. Alla effektmått mäts från samma lever-MPS-kulturer. Data som visas är medelvärde ± SD, N = 3. (B) Sammanfattning av EC:50-nummer som genererats från data. N.D. = data som inte kan plottas. Linje = ej analyserad. (C) Representativ ljusfältmikroskopi av levermikrovävnader efter 8-dagars odling (förstoring 10x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Genom att bedöma alla funktionella endpoints och biomarkörer för toxicitetsproduktion som kan representera in vivo eller kliniska scenarier (LDH-frisättning, ureasyntes, albuminproduktion, CYP3A4-aktivitet, ATP-innehåll, ALT-frisättning) och bekräfta de data som genererats för båda testade föreningarna doserade vid ett sjupunktsdosintervall i 48 timmar och 96 timmar, har en värmekarta genererats för att ge en "signatur av levertoxicitet", hjälpa till att identifiera föreningar med varierande nivå av DILI-oro (figur 4).
Figur 4: Bestämning av "signatur av toxicitet" med lever-MPS. Värmekarta som visar troglitazon och pioglitazon från sex funktionella leverspecifika endpoints (LDH-frisättning, ureasyntes, albuminproduktion, ALT-frisättning, CYP3A4-aktivitet och ATP-innehåll) efter 48 h och 96 timmars exponering för sjupunktsdosintervall. Varje värde genereras som Medelvärde, N = 3 och normaliseras för att kontrollera prover. Värdena på färgfälten representerar en vikökning jämfört med baslinjekontrollerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande material: Fluorescerande mikroskopavbildning av mikrovävnader och prekvalificeringsbedömning av celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
MPS är utformade för att rekapitulera funktionella enheter av mänskliga organ in vitro och har utvecklats för att hantera begränsningarna hos konventionella 3D-cellodlingsmodeller27. Levern är ett av de mest modellerade organen som använder MPS, och en mängd olika system har utvecklats. Den mänskliga levern är ansvarig för läkemedelsmetabolism och generering av toxiska läkemedelsmetaboliter, och dess funktion är ett nyckelelement för modell för läkemedelsutveckling, inklusive bedömning av DILI-ansvar för föreningar28. Här har vi introducerat en ny metod för att bedöma DILI med hjälp av en lever-MPS; protokollet gör det möjligt att söka mekanistiska insikter för varje förening som analyseras för att avgöra hur det kan orsaka DILI samt att vara en mycket känslig och robust analys. Levermikrovävnader bildas i MPS-plattorna, som är en samkultur av PHH och HKC och är mycket funktionella med höga nivåer av albumin- och ureaproduktion samt hög CYP3A4-aktivitet jämfört med standard in vitro-levermodeller 20.
Även om DILI-modellen som beskrivs här kan fungera som ett användbart verktyg i senare skeden av preklinisk testning i läkemedelsutvecklingsprocessen, har den också flera begränsningar. Eftersom majoriteten av MPS för närvarande finns på marknaden är det en plattform med låg genomströmning och därför svårare att använda för storskalig läkemedelsscreening. Bestående av mikrovävnader som bildas genom kokulturering av PHH och HKCs kan DILI-modellen inte heller helt fånga komplexiteten hos den mänskliga levern, och ytterligare optimering genom att införliva olika typer av celler (t.ex. immunceller) skulle vara fördelaktigt för att tillföra värde till den befintliga modellen. Denna enorganiga MPS kan också kombineras med andra organplattformar som kan dela ett gemensamt medium och tillåta organöverhörning på cellulär eller endokrin nivå, och det kan hjälpa till att bättre förstå de mekanistiska insikterna om toxicitet som inte bara är begränsade till själva levern. Dessutom kan den, som all relativt ny teknik, anses kostsam och därmed ha begränsad tillgänglighet.
MPS är en plattform som används för att utveckla organotypiska modeller av enskilda eller multi- mänskliga vävnader. Systemet består av en styrenhet, navelkabel och MPS-drivrutin i vilken plattan sätts in (figur 5A). Varje lever-MPS-platta har 12 oberoende öppna brunnar för odling av primära leverceller i 3D på konstruerade byggnadsställningar. Sammanfattningsvis är systemet QC-kontrollerat och plattorna grundas vid dag -1, PHH: erna och HKC: erna är sådda på plattorna vid dag noll (figur 5B, se 1). Inbäddade mikropumpar underlättar cirkulationen av cellodlingsmedier genom byggnadsställningarna för att underlätta bildandet av 3D-mikrovävnader (figur 5B, se 2). Formade mikrovävnader är QC'd vid dag 4, doserade med olika koncentrationer av varje förening var 48: e timme i 4 dagar och analyserade för slutpunktsbiomarkörer vid dag 8 (figur 5C). Den experimentella tidslinjen för DILI-analysen i MPS-plattan visas i figur 5D.
Figur 5: Det mikrofysiologiska systemet och den experimentella tidslinjen för en standard DILI-analys. (A) Det mikrofysiologiska systemet med dess komponenter: styrenhet (1), navelkabel (2), dockningsstation (3), MPS-drivrutin (4) och LC12-platta (5). (B) Sådd av PHH och HHKC på LC12-plattan vid dag 1 (1) och inbäddade mikropumpar underlättar cirkulationen av cellodlingsmedier med justerbara flödeshastigheter genom 3D-mikrovävnaderna sådda på byggnadsställningarna (2). (C) Ta ner ställningarna i slutet av studien. (D) Experimentell tidslinje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När du utför protokollet är det viktigt att en robust system-QC-kontroll utförs före start, kontrollera att systemet fungerar pneumatiskt korrekt och förbrukningsplattorna inspekteras visuellt och grundas effektivt för att säkerställa jämn funktionalitet i alla brunnar. Att ha högkvalitativa primära mänskliga celler är viktigt för detta protokoll, med hepatocyter som är kända för att fästa konsekvent i cellodlingsexperiment och bilda 3D-interaktioner. Upptining av dessa celler är också ett kritiskt steg, eftersom primära hepatocyter inte bör återsuspenderas genom pipetterande verkan eftersom detta snabbt kan leda till celldöd. Att ha cellviabilitet över 85% är avgörande för framgångsrik sådd, eftersom stora mängder cellulärt skräp kommer att störa 3D-mikrovävnadsbildning. QC-kontrollen av bildade levermikrotvävnader vid dag 4 är också viktig, och användaren måste se till att acceptabla nivåer av LDH och urea mäts, eftersom parametrar utanför intervallet kan vara en indikation på vävnadsbildning av dålig kvalitet och möjliggöra enkel felsökning. Slutligen måste hydrokortisonet som används i cellodlingsmediet beredas färskt på användningsdagen för att förhindra oönskad nedbrytning som kan påverka cellodlingsfunktionaliteten, eftersom det är nödvändigt för att upprätthålla hepatocyternas metaboliska funktionalitet.
Trots att den har betydande komplexitet innehåller levern MPS inte alla celltyper i den mänskliga levern. Det är möjligt att lägga till ytterligare celltyper till modell24,29 för att öka fysiologisk relevans, men dessa bör endast läggas till med en tydlig motivering för användningssammanhanget. För att studera DILI PHH är nyckelcelltypen, och införlivandet av HKC i denna modell gör att vissa immunologiska svar kan bestämmas. Det bör också noteras att PHH isolerade från mänskliga lever och kommersiellt tillgängliga kryokonserverade PHH tenderar att visa vissa variationer från parti till parti. Vi har här visat att detta protokoll ger reproducerbara resultat när det används med högkvalitativa preparat av celler. En viss variation av partipartier kan dock förväntas, och detta kan övervinnas ytterligare genom att använda sammanslagna massor av flera givare. Dessa begränsningar kan övervinnas genom att använda hepatocytliknande celler differentierade från iPSC som rekapitulerar många funktionella egenskaper hos PHH och som har använts i läkemedelsutvecklingsprocessen30. HKC visar också mycket till mycket variation och en hög aktiveringsnivå vid upptining; Därför är HKK-givare förvaliderade internt före användning i experimentell cellodling (samodling med validerade PHH) och måste ha låga nivåer av aktivering efter upptining. detta bedöms genom mätning av biomarkörerna IL-6 och TNF-alfa (se Kompletterande material).
De data som presenteras här bekräftar att analysen kan detektera DILI exakt, vilket hjälper till att identifiera levertoxiska ämnen som kanske inte detekteras av 2D10,11 och till och med vissa 3D-modeller. Data som genereras från MPS används fortfarande inte som standard av läkemedelsindustrin för regulatoriska inlämningar eller läkemedelsscreeningsändamål på grund av bristen på processstandardisering och harmonisering, inklusive reproducerbarhet mellan platser20. De data och experimentella tillvägagångssätt som demonstreras här tar upp detta och visar att levermodellen kan användas rutinmässigt och robust i DILI-skärmar för att exakt förutsäga ansvaret för nya föreningar.
Genom att mäta en rad endpoints för att producera en "signatur av levertoxicitet", hjälpa till att identifiera föreningar med olika nivåer av DILI-oro (inklusive föreningar som inte kan detekteras med andra in vitro-metoder) och deras mekanismer för toxicitet avslöjas. Denna teknik kan stänga klyftan mellan traditionell cellodling och djurmodeller på ena sidan och kliniska prövningar på människa, och avancera mot simulering av humanbiologiska tillstånd för preklinisk bedömning av levertoxicitet som en del av läkemedelsutvecklingsprocessen.
Disclosures
Alla författare är anställda på CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. finansierade denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S.
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
