Summary
このプロトコルは、ヒドロゲルや細胞を含むソフトマテリアルナノインデンテーション実験のための完全なワークフローを提供します。まず、力分光法データを取得するための実験手順が詳述されています。次に、そのようなデータの分析は、GitHubから無料でダウンロードできる新しく開発されたオープンソースのPythonソフトウェアを通じて詳細に説明されます。
Abstract
ナノインデンテーションとは、マイクロメトリックフォースプローブを使用してソフトバイオマテリアルや細胞の局所的な機械的特性を定量化する実験技術のクラスを指します。このアプローチは、メカノバイオロジー、生体材料設計、組織工学の分野で中心的な役割を果たし、単一細胞サイズ(μm)に匹敵する分解能でソフトマテリアルの適切な機械的特性評価を取得しています。このような実験データを取得するための最も一般的な戦略は、原子間力顕微鏡(AFM)を使用することです。この装置は、力(pNまで)と空間(サブnmまで)において前例のない分解能を提供しますが、その使いやすさは、ヤング率(E)などの機械的特性の積分指標の日常的な測定を妨げる複雑さによって制限されることがよくあります。光ファイバセンシング技術に基づくものなどの新世代のナノインデンターは、μmの空間分解能でサブnN力を加えることを可能にしながら、統合が容易であることから最近人気を博しているため、ヒドロゲルや細胞の局所的な機械的特性を調べるのに適しています。
このプロトコルでは、市販のフェルールトップ光ファイバセンシングナノインデンターを使用してヒドロゲルおよびセルに関するナノインデンテーションデータを取得するための実験手順を詳述するステップバイステップガイドが提示されます。いくつかのステップは本明細書で使用される器具に固有であるが、提案されたプロトコルは、他のナノインデンテーションデバイスのためのガイドとしてとらえることができ、いくつかのステップが製造業者のガイドラインに従って適合されることを前提とする。さらに、ナノインデンテーションデータを分析するためのユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイスを備えた新しいオープンソースのPythonソフトウェアが提示され、誤って取得された曲線のスクリーニング、データのフィルタリング、さまざまな数値手順による接触点の計算、 従来のEの計算、および特にシングルセルナノインデンテーションデータに適したより高度な分析が可能になります。
Introduction
生物学における力学の基本的な役割は、今日確立されています1,2。全組織から単一細胞まで、機械的特性は、調査中の生体材料の病態生理学的状態について知らせることができます3,4。例えば、癌の影響を受けた乳房組織は健康な組織よりも硬い、これは一般的な触診検査5の基礎となる概念である。特に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるコロナウイルス病2019(COVID-19)は、赤血球変形能の低下、リンパ球および好中球のこわばりの減少など、血球の機械的特性の変化によって強調されていることが最近示されていますSARS-CoV-2ナイーブな個人の血球と比較して6。
一般に、細胞と組織の力学は本質的に絡み合っており、各組織は構成細胞と細胞外マトリックス(ECM)のそれらに同時に影響を及ぼし、依存する特定の機械的特性を持っています5。このため、生物学の力学を研究するための戦略には、生理学的に関連する機械的刺激を備えた基板を操作して、それらの刺激に応答した細胞の挙動を解明することがよくあります。例えば、Englerらによる独創的な研究は、柔らかくて硬い2次元ポリアクリルアミド(PAAm)ヒドロゲルで研究されたように、間葉系幹細胞の系統の関与がマトリックスの弾力性によって制御されることを実証しました7。
調査中の生体材料を機械的に特徴付けるための多くの戦略が存在し、空間スケール(すなわち、局所からバルク)および変形のモード(例えば、軸方向対せん断)において異なり、その結果、慎重な解釈を必要とする異なる情報が得られる3,8,9,10。ソフトバイオマテリアルの力学は、一般的に剛性の観点から表されます。ただし、剛性は材料特性と形状の両方に依存しますが、弾性率は材料の基本的な特性であり、材料のジオメトリとは無関係です11。このように、異なる弾性率は特定のサンプルの剛性に関連しており、各弾性率は、異なる境界条件(例えば、自由膨張対閉じ込め)における特定の変形モード(例えば、軸方向対せん断)に対する材料の抵抗を包含する11,12。ナノインデンテーション実験は、生体材料が横方向に閉じ込められていない場合の一軸変形(インデンテーション)に関連するEを介した機械的特性の定量化を可能にする10,11,12。
マイクロスケールで生物学的システムのEを定量化する最も一般的な方法は、AFM13,14,15,16です。AFMは、pNレベルまでの力分解能とサブnmスケールまでの空間分解能を備えた非常に強力なツールです。さらに、AFMは、補完的な光学的および機械的ツールとの結合に関して非常に柔軟性があり、調査中の生体材料から豊富な情報を抽出する機能を拡張します13。ただし、これらの魅力的な機能には、実験セットアップの複雑さに代表される参入障壁があります。AFMは、ユーザーが堅牢なデータを取得する前に広範なトレーニングが必要であり、特にその独自の力と空間分解能が必要ない場合、生体材料の日常的な機械的特性評価に使用することは不当であることがよくあります。
このため、新しいクラスのナノインデンターは、その使いやすさから最近人気を博していますが、サブnNの力分解能とμmの空間分解能を備えたAFMに匹敵するデータを提供し、関連する長さスケールにわたって細胞によって加えられ、知覚される力を反映しています2。特に、光ファイバセンシング技術17,18に基づくフェルールトップナノインデンテーションデバイスは、メカノバイオロジーの分野で活躍する研究者の間で人気を博しています。そして、細胞19,20、ヒドロゲル8,21、および組織22,23を含む、これらのデバイスを使用した生体材料の機械的特性を報告する豊富な研究が発表されている。局所的な動的機械的特性(すなわち、貯蔵弾性率および損失弾性率)を調査するこれらのシステムの能力にもかかわらず、Eを生成する準静的実験は依然として最も一般的な選択肢である8,19,20,21。簡単に言えば、準静的ナノインデンテーション実験は、最大変位、力、または押し込み深さのいずれかによって定義される設定値まで一定の速度でサンプルをインデントし、カンチレバーの力と垂直位置の両方をいわゆる力-距離(F-z)曲線で記録することで構成されます。次に、F-z曲線は、接触点(CP)の識別によって力-インデンテーション(F-δ)曲線に変換され、適切な接触力学モデル(通常はヘルツモデル13)を取り付けてEを計算します。
フェルールトップナノインデンターの動作はAFM測定に似ていますが、検討する価値のある特異性があります。本研究では、市販のフェルールトップナノインデンターを用いて細胞や組織模倣ハイドロゲルから F-z 曲線をロバストに取得するためのステップバイステップガイドを提供し、本デバイスと他の同様のデバイスを使用した研究グループ間の実験手順の標準化を促進します。さらに、ナノインデンテーション実験を行うためのヒドロゲルサンプルと細胞の最適な調製方法に関するアドバイスと、実験経路に沿ったトラブルシューティングのヒントが提供されます。
さらに、ナノインデンテーション結果(すなわち、 E およびその分布)の変動性の多くは、データの分析に使用される特定の手順に依存し、これは自明ではない。この問題に対処するために、Pythonでプログラムされ、 F-z 曲線のバッチ分析のためのユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を備えた新しく開発されたオープンソースソフトウェアの使用手順が提供されています。このソフトウェアは、高速データスクリーニング、データのフィルタリング、さまざまな数値手順によるCPの計算、 Eの従来の計算、および弾性スペクトル24と呼ばれるより高度な分析を可能にし、細胞のバルクヤング率、アクチン皮質ヤング率、およびアクチン皮質の厚さを推定することができます。ソフトウェアはGitHubから自由にダウンロードでき、適切なデータパーサーを追加することで、他のシステムから発信されたデータを分析するように簡単に適合させることができます。このプロトコルは、他のフェルールトップナノインデンテーションデバイス、および他のナノインデンテーションデバイス全般に使用できることを強調し、いくつかのステップは特定の機器のガイドラインに従って適合されます。プロトコルを概略的に図 1にまとめます。
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Protocol
1. ナノインデンテーション測定用基板/セルの作製
- ナノインデンテーション実験用のPAAmヒドロゲル/セルの調製に関する 補足プロトコル に記載されている手順に従ってください。この手順を 図 2 にまとめます。
注:PAAmヒドロゲルは、メカノバイオロジーの分野で使用される最も一般的なヒドロゲルであるため、選択されています。しかしながら、プロトコルは、任意のタイプのヒドロゲル25 に等しく適用可能である( 考察、方法の修正を参照されたい)。
2.デバイスの起動、プローブの選択、およびプローブのキャリブレーション
- 補足プロトコルに記載されている手順に従って、デバイスを起動します。光ファイバフェルールトップナノインデンターの動作に関する技術的な詳細については、これらの参考文献17,18を確認してください。
- 以下の説明に従ってナノインデンテーションプローブを選択します。
注意: このプロトコルで使用されているようなすべての市販のプローブには、球形の先端が装備されています(図3A)。したがって、選択肢はカンチレバーの剛性と先端半径の2つの変数に絞り込まれます(図3B)。- 最良の結果を得るには、予想されるサンプル剛性に一致するカンチレバーの剛性(N / mのk)を選択します15(図3Cおよびディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。細胞の場合、0.01〜0.09 N / mの範囲のkを持つプローブを選択します。ヒドロゲルの場合、0.1〜0.9 N / mの範囲のkプローブを選択すると、予想されるEが数kPa〜100 kPaのゲルで最適な結果が得られます(代表的な結果を参照)。
- 先端半径(R(μm)は、インデンテーションプロセスの所望の空間分解能に応じて選択します。ヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞(平均直径~10-15μm26)などの小細胞の場合は、R = 3μmの球体を選択します。ヒドロゲルの場合、R = 10〜250μmの球を選択して、広い接触面積にわたって生体材料の機械的特性を調査し、局所的な不均一性を回避します。
- 図3Cおよびその他の製造元のガイドラインを参照して、適切なプローブを選択してください。
- プローブを選択したら、 補足プロトコル の手順に従ってナノインデンターに取り付けます。
3.プローブキャリブレーション
注意: 次の手順は、光ファイバセンシング技術に基づくフェルールトップナノインデンテーションデバイスに固有であり、ソフトウェアバージョン3.4.1で詳しく説明されています。その他のナノインデンテーションデバイスの場合は、デバイスの製造元が推奨する手順に従ってください。
- ソフトウェアのメインウィンドウで、[ 初期化]をクリックします。キャリブレーションメニューが表示されます。プローブの詳細を入力します(プローブのボックスの側面にあります。 入力 ボックス内のN / mの k、μmのR 、および空気中のキャリブレーション係数)。
- キャリブレーションディッシュを準備します:底が平らな厚いガラスのペトリ皿( ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。サンプル皿と同じ媒体で皿を満たします(これは空気でもかまいません)。媒体の温度をサンプルの温度と一致させます。
- キャリブレーション皿をプローブの下に置きます。必要に応じて、ナノインデンターのアームホルダーからプローブを引き出し、片手で持ってキャリブレーションディッシュを配置するスペースを確保します。プローブを元の位置にスライドさせて戻します。
- 液体中でのキャリブレーションのために次の2つのステップを実行します。空気中で測定する場合は、付属のポリテトラフルオロエチレン基板をキャリブレーションに使用し、手順5に進みます。
- ピペットの端をガラスフェルールに軽く接触させた状態でパスツールピペットを使用してプローブを70%エタノールの滴で予湿し、滴がカンチレバーと球形の先端27 の上を滑るようにします( ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。
- プローブが完全に水没するまでナノインデンターのアームを手動で下にスライドさせますが、それでもペトリ皿の底から遠く離れています。必要に応じて、キャリブレーションディッシュに培地を追加します。液体中の平衡状態に達するまで5分間待ちます。
- ソフトウェアの [初期化 ]メニューで、[ スキャン波長]をクリックします。干渉計の画面にはプログレスバーが表示され、コンピュータのソフトウェアの ライブ信号 ウィンドウには 図S1A(左)に示すパターンが表示されます。光学スキャンが成功したかどうかを確認するには、干渉計ボックスの 波長スキャン パネルに移動します。成功すると、正弦波が表示されます(図1A、右)。エラーが表示された場合は、 ディスカッション (メソッドのトラブルシューティング) を参照してください。
- [初期化]メニューで[サーフェスの検索]をクリックすると、カンチレバーの曲げで設定されたしきい値に達するまでプローブが徐々に下がります。ガラスのペトリ皿と接触すると、プローブの動きが止まります。
- プローブが表面に接触しているかどうかを確認します。ソフトウェアのメインウィンドウにある y 下向き矢印ボタンを使用して、プローブを1μm下に移動します。カンチレバーが基板に接触しているときに、各ステップでのベースラインの変化について、ソフトウェアの ライブウィンドウ の緑色の信号(カンチレバーのたわみ)を観察します(図S1B)。変化がない場合、カンチレバーは接触していません(次の手順を参照)。
- [サーフェスを検索]タブの[オプション]メニューの[しきい値]の値をデフォルト値の 0.01 から一度に 0.01 ずつ増やし、接触するまで[サーフェスの検索]ステップを繰り返します。または、緑色のベースラインが各下向きのステップでシフトし始めるまで、プローブを1μmの小さなステップで接触させます。
注: 最も柔らかいカンチレバー(k = 0.025 Nm-1)の場合は、[サーフェスの検索]タブの[オプション]メニューの[しきい値]の値を、手順 6 を事前に実行して大きくします。しきい値 0.06 または 0.07 から開始し、必要に応じて 0.1 まで増やします。これは、環境ノイズにより、接触前にカンチレバーがしきい値を超えて曲がる可能性があるためです。ソフトプローブの場合、同じメニューでアプローチ速度(μm/s)を下げると、手順も改善されます。 - [初期化]メニューで、[調整]をクリックします。
- ソフトウェアのライブ信号ウィンドウをチェックし、ピエゾの変位信号とカンチレバーの偏向 信号 の両方が同時に上昇することを確認します(図S1C)。
- 時間に不一致がある場合、プローブはガラスと完全に接触していません。カンチレバー信号のベースラインが変わるまでプローブを1μmのステップで下に移動し(ステップ7を参照)、ステップ9を繰り返します。
- キャリブレーションステップ中にカンチレバー信号がまったく変化しない場合、プローブは表面から遠く離れています。表面が正しく見つかるまで接触しきい値を繰り返し上げ(手順8を参照)、波長スキャンから最初からキャリブレーションを繰り返します。
- キャリブレーションが完了したら、表示されるポップアップウィンドウで新旧のキャリブレーション係数を確認します。新しいキャリブレーション係数が正しい範囲内にある場合は、[新しい係数を使用]をクリックします。キャリブレーションに失敗し、新しい係数がNaNであるか、予想される範囲内にない場合は、解決策についてディスカッション(メソッドのトラブルシューティング)を参照してください。
注:屈折率n(水の場合はn = 1.33)の液体媒体でキャリブレーションを実行した場合、新しい係数はプローブのボックスに提供されている係数よりも~n倍低くする必要があります。キャリブレーションが空気中で実行された場合、新しいキャリブレーション係数と古いキャリブレーション係数はほぼ等しくなります。 - 復調円が次のように正しく校正されているかどうかを確認します。干渉計デスクトップの復 調 タブに移動します。光学テーブルまたはナノインデンターを軽くたたいて、十分なノイズを誘発します。離散データポイントで構成される白い円は、赤い円をほぼ覆う必要があります(図S1D)。
- 白い円が赤い円と重なっていない場合、または干渉計のディスプレイに警告が表示される場合は、復調円を再校正する必要があります。これは、以下に説明するように2つの方法で実行できます。
- ナノインデンターの本体を連続してタップして、1つの完全なノイズを誘導し、干渉計の キャリブレーション ボタンを押します。
- ガラス基板に接触して入力し、ソフトウェアのメインウィンドウの[初期化]メニューから[キャリブレーション]を押します。キャリブレーション係数は保存しないでください。この時点で、もう一度確認し、白い円が赤い円と重なっていることを確認します。
注意: 信号が復調サークルからわずかにずれているだけでなく、非常に小さくなっているか、まったく見えない場合は、カンチレバーが光ファイバに付着していることを意味します。この問題に関するトラブルシューティングのアドバイスに従い ( 説明、方法のトラブルシューティングを参照)、手順 13.1 または 13.2 を繰り返します。カンチレバーが水平位置に戻ると(図3A)、信号は復調円に回復します。
- 下記のように、キャリブレーション直後にガラス基板にくぼみを入れてキャリブレーションを検証します。
- [ 実験の構成 ] をクリックして実験ファイルを読み込むか作成し、[ サーフェスの検索 ] ステップと [インデント ] ステップを追加します。圧痕ステップでは、デフォルトの変位モード設定を使用し、最大変位をキャリブレーション距離(3,000 nm)に変更して、プローブを硬い基板に対して変位させます。
- [実験の実行]をクリックし、干渉計ウィンドウで復調円を確認します。白い信号を確認し、インデント中に赤い円の上にあることを確認してください。
- Time Data グラフのソフトウェアのメイン ウィンドウで結果を確認し、圧痕が接触し始め、材料の変形が予想されないため、ピエゾの変位(青い線)がカンチレバーのたわみ(緑の線)と等しいことを確認します。信号が並列でない場合は、ディスカッション(メソッドのトラブルシューティング)を参照してください。
- キャリブレーションメニューのローカルパスを変更するには、 キャリブレーション保存パス を適切なディレクトリに設定します。
- プローブが正常に校正されたら、ピエゾを500μm上に移動します。
4. 軟質材料のヤング率の測定
- ヒドロゲルのナノインデンテーション
- サンプルを含むペトリ皿を顕微鏡のステージにロードし、ナノインデンターのプローブをサンプルの上の目的の x-y 位置に手動で移動します。
- この段階でプローブとサンプルの表面の間に1〜2 mmを残すように注意しながら、プローブを溶液中で手動でスライドさせます。プローブが培地内で平衡化するまで5分間待ちます。
- プローブがはっきりと見えるように光学顕微鏡の z 面に焦点を合わせます。
- 以下に説明するように、単一のインデントを実行して実験パラメータを調整します。
- ソフトウェアのメインウィンドウで新しい実験を構成します。[ 実験の構成] をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。[ サーフェスの検索 ] ステップを追加します。[ サーフェスを検索 ]ステップのすべてのパラメータは、必要に応じてソフトウェアの [オプション ]メニューで変更できます。
注意: 検索サーフェス は、表面が見つかるまでプローブを下げてから、サンプルの表面 上のZ(μm)で定義された距離までプローブを引っ込めます。選択したカンチレバーがサンプルに対して硬すぎる場合、またはサンプルが粘着性がある場合、ステップ後もプローブはサンプルと接触している可能性があり、ベースラインのない曲線になります(図4C)。この問題を解決するには、 表面上のZ(μm)を増やします。 - インデントステップを追加します。[プロファイル]タブを選択し、[変位制御]をクリックします。デフォルトのインデントプロファイルのままにします。
- ソフトウェアのメインウィンドウで [実験の実行 ]をクリックします。これにより、サーフェスが検索され、単一のインデントが実行されます。単一のインデントが期待どおりに表示されない場合は、 図4 と ディスカッション( メソッドのトラブルシューティング)で説明されているように実験パラメーターを調整します。
- ソフトウェアのメインウィンドウで新しい実験を構成します。[ 実験の構成] をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。[ サーフェスの検索 ] ステップを追加します。[ サーフェスを検索 ]ステップのすべてのパラメータは、必要に応じてソフトウェアの [オプション ]メニューで変更できます。
- インデントが希望どおりに表示されたら、サンプルの十分な領域がインデントされるようにマトリックススキャンを構成します。[実験 の構成]をクリックし、以前に決定した実験パラメータを使用して [サーフェス検索 ]ステップを追加し、[ マトリックススキャン ]ステップを追加します。
- フラットヒドロゲルの場合、10〜100μm(すなわち、dx = dy = 10〜100μm)の間隔で50〜100点(すなわち、xおよびyで5 x 10または10 x 10)を含むマトリックススキャンを構成する。[ステージ位置を使用]をクリックして、現在のステージ位置からマトリックススキャンを開始します。[サーフェスの自動検索]ボックスにチェックマークを付けて、設定された実験パラメータを使用して各インデントのサーフェスを検索します。
- オーバーサンプリングを回避するには、ステップ サイズを接触半径の少なくとも 2 倍に設定します (
δ はくぼみの深さ)。 - 変位制御でマトリックススキャンプロファイルを設定します。プロファイルがヘルツモデルの仮定に違反していないことを確認します( ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。
- セグメント数はデフォルト値である 5 のままにして、デフォルトの変位プロファイルを使用します。必要に応じて、各傾斜セグメントの最大変位と時間の観点から変位プロファイルを変更すると、それぞれ最大押し込み深さとひずみ速度に影響します。ひずみ速度>10 μm/sを超えないようにしてください( 説明、方法の制限を参照)。
- アプローチ速度の値を入力すると、接触前にプローブがサンプルに向かって移動する速度が決まります。格納速度をアプローチ速度に合わせます(下記の注を参照)。
注意: ソフトカンチレバーやノイズの多い環境では、1,000〜2,000 nm / sのアプローチ速度が推奨されます。より硬いカンチレバーと制御された環境では、これを増やすことができます。 - 構成済みの実験を目的の [実験パス] に保存し、[実験の構成] ウィンドウの [全般] タブで、データを保存するディレクトリを [パスの保存] で選択します。[実験を実行] をクリックします。
- オーバーサンプリングを回避するには、ステップ サイズを接触半径の少なくとも 2 倍に設定します (
- マトリックススキャンが完了したら、プローブを200〜500μm上げ、プローブを最初の領域から十分に離れたサンプルの別の領域に移動します。
- 各サンプルで十分なデータが取得されるように、実験を少なくとも2回繰り返します(つまり、サンプルごとに少なくとも2つのマトリックススキャン、それぞれ50〜100の曲線を含む)。
- 細胞のナノインデンテーション
- 上記のようにサンプルを顕微鏡にロードします。
- 単一セルのくぼみの場合は、セルのサイズと広がりに応じて、セルとプローブの両方が20倍または40倍の倍率で見えるように z 平面に焦点を合わせます。
- インデントするセルの上にプローブを移動します。
- ソフトウェアのメインウィンドウで新しい実験を構成します。[ 実験の構成] をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。変位モードのデフォルトパラメータを持つサーフェス 検索 および インデンテーション ステップを追加します。
- [ 実験を実行]をクリックすると、サーフェスが検索され、1つのインデントが実行されます。インデントが成功したかどうかを確認します。曲線が期待どおりに表示されない場合は、実験パラメータを調整します( 図4 および ディスカッション、メソッドのトラブルシューティングを参照)。
- インデントが成功した場合は、マトリックス スキャンを実験に追加します。ヒドロゲルのナノインデンテーション実験に与えられた手順に従ってください。ステップサイズでセルの小さな領域をインデントできるようにマトリックススキャンを構成します。HEK293T細胞については、0.5〜5μmの間隔で25点。
- セルサイズに応じて、マトリックススキャンを調整して、チップがセル制限の外側にインデントしないようにします(つまり、異なるマップジオメトリを実行したり、より少ないポイントをプローブしたりします)。
- [ 実験の実行] をクリックし、完了するのを待ちます。
- マトリックススキャンが完了したら、プローブを接触から外します( z 平面で50 μm)。
- プローブを新しいセルの上に移動し、プロセスを繰り返します( ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。
- プローブの清掃と機器の電源オフ
- 補足プロトコルに記載されている手順に従って、プローブをクリーニングし、ナノインデンテーションデバイスのスイッチを切ります。
δ はくぼみの深さ)。5.データ分析
- ソフトウェアのダウンロードとインストール
- 補足プロトコルに記載されている手順に従って、データ分析用のソフトウェアをダウンロードしてインストールします28,29。
- F-z曲線のスクリーニングとJSON形式のクリーニングデータセットの作成
- 手順 2 から 3 で説明されているように、ラボ コンピューターのコマンド ラインから prepare.py を起動します。
- Windows コンピューターを使用している場合は、 NanoPrepare フォルダーを Shift キーを押しながら右クリックし、[ PowerShell ウィンドウをここで開く] をクリックします。 python prepare.py コマンドを入力し、 Enter キーを押します。GUIが画面にポップアップ表示されます(図S2)。
- MacOSコンピュータを使用している場合は、 NanoPrepare フォルダを右クリックし、[ フォルダの新しいターミナル]をクリックします。 python3 prepare.py コマンドを入力して Enter キーを押すと、GUI が起動します (図 S2)。
- ドロップダウン リストから O11NEW データ形式を選択します。データが正しくロードされていない場合は、GUIを再起動して O11OLDを選択します。
注: O11NEW 形式は、ソフトウェアバージョン3.4.1のフェルールトップ光ファイバセンシングナノインデンテーションデバイスを使用して取得したデータに対して機能します。この形式は、以前のソフトウェアバージョン、少なくとも2019年から2020年にインストールされたナノインデンターに属するソフトウェアバージョンでも機能します。 - [ フォルダの読み込み]をクリックします。分析するデータを含むフォルダーを選択します-シングルマトリックススキャンまたはマルチマトリックススキャン。一番上のグラフ(生の曲線)には、アップロードされたデータセットが入力されます。特定の曲線を視覚化するには、その曲線をクリックします。これにより、緑色で強調表示され、下のグラフ(現在の曲線)に表示されます。
- 以下に概説するように、GUIの右側にあるタブを使用してデータセットをクリーンアップします。
- [セグメント]ボタンを使用して、解析する正しいセグメント( F-z カーブの前方セグメント)を選択します。具体的な数は、実験を行う際にナノインデンテーションソフトウェアで選択したセグメントの数によって異なります。
- [50 nmの切り抜き]ボタンを使用して、左端(Lがチェックされている場合)、右端(Rがチェックされている場合)、または両側(RとLの両方がチェックされている場合)で曲線を50nmトリミングします。このボタンを数回クリックすると、必要なだけトリミングされます。これを使用して、F-zカーブの開始/終了に存在するアーチファクトを除去します。
- [カンチレバー]タブで、ばね定数、先端形状、先端半径を調べます。タブを調べて、メタデータが正しく読み取られていることを確認します。
- [スクリーニング]タブを使用して、特定の力に達しなかったすべてのカーブを破棄する力のしきい値を設定します。破棄されたカーブは赤で強調表示されます。
- 手動切り替えボタンを使用して、正しく取り込まれていないカーブを手動で削除します。特定の曲線をクリックしてOUTを選択すると、曲線が赤で強調表示されます。
- [ JSON の保存] をクリックします。クリーニングされたデータ・セットの適切な名前 (単一の JSON ファイル) を入力します。ナノアナリシス ソフトウェアがインストールされているコンピューターに JSON ファイルを送信します。
6.正式なデータ分析
- 前述のように、NanoAnalysisフォルダーに移動し、ターミナルを起動して、コマンドラインから nano.py ファイルを起動します。python nano.py または python3 nano.py コマンド (オペレーティング・システムによって異なります) を入力し、Enter キーを押します。GUIが画面にポップアップ表示されます(図S3)。
- GUI の左上にある [実験の読み込み] をクリックし、JSON ファイルを選択します。これにより、ファイルリストと、F-zカーブでデータセットを示す生のカーブグラフが入力されます。F 軸と z 軸の両方が、データセットの読み込み時にバックグラウンドで計算される CP 座標を基準にして表示されます (次の注を参照)。[統計] ボックスで、3 つのパラメーター (アクティブ化された N、失敗した N 、除外された N の値) を確認します。
注:アクティブ化 されたNは、後続のヘルツ/弾性スペクトル分析で分析され、 生の 曲線グラフに黒で表示される曲線の数を表します。Nfailed は、信頼できる CP が見つからなかった曲線の数を表し、グラフに青色で表示されます。これらの曲線は、後続の解析で自動的に破棄されます。ソフトウェアを開くと、一部のカーブが自動的に故障したセットに移動される場合があります。これは、CPがデフォルトのしきい値アルゴリズム(以下を参照)でソフトウェアを開いたときに計算されるためです。Nexcluded は、解析から除外するために手動で選択されたカーブを表し、グラフに赤で表示されます(以下を参照)。 - 破損カーブ、除外カーブ、およびアクティブ化カーブの数が妥当かどうかを確認します。 生の 曲線グラフをチェックして、曲線を視覚化します。
- 特定の曲線をより詳細に視覚化するには、その曲線をクリックします。これにより、緑色で強調表示され、 現在の曲線 グラフに表示されます。単一のカーブを選択すると、 R と k のパラメータ(すべてのカーブで同じである必要があります)がGUIの Stats ボックスに入力されます。
- トグルボックスを使用して、特定のカーブのステータスを変更します。ステータスを変更する特定のカーブをクリックし、[アクティブ化]、[失敗]、または[除外]のいずれかをクリックします。[統計] ボックスのカウントは自動的に更新されます。
注: 生の曲線グラフのデータ セットのビューを変更するには、[表示] ボックスを使用します。すべてをクリックすると、すべてのカーブが表示されます(つまり、アクティブ化、失敗、およびそれぞれの色で除外されます)。アクティブ化されたカーブと失敗したカーブを表示するには 失敗 をクリックし、アクティブ化された曲線のみを表示するには アクティブ化 をクリックします。アクティブ化と除外の間のすべてのカーブのステータスをリセットするには、リセットボックスでアクティブ化または除外をクリックします。 - データセットをさらにクリーンアップしたら、以下に概説するデータ分析パイプラインに従います。
- GUI(フィルタリングボックス)に実装されたフィルター、つまりプロミネンシーフィルターと呼ばれるカスタムフィルター、Savitzky Golay30,31(SAVGOL)フィルター、および特定のウィンドウ内のデータの中央値の計算に基づく平滑化フィルター(中央値フィルター)を使用して、曲線に存在するノイズをフィルタリングします。フィルターの詳細については、「説明 (プロトコルの重要な手順)」を参照してください。
- 現在の曲線グラフでフィルタリングされた 曲線 を調べます。フィルタリングされた曲線は黒で表示され、フィルタリングされていないバージョンの曲線は緑色で表示されます。
注:元の信号の特徴を保持するために、データをできるだけフィルタリングしないことをお勧めします。過剰フィルタリングは、データに存在する違いを滑らかにする可能性があります。プロミネンシーフィルターをアクティブにして作業すれば、ナノインデンテーションデータのヘルツ分析には十分です。データが特にノイズが多い場合は、SAVGOLまたはメディアンフィルタを追加で適用できます。 - CPを見つけるアルゴリズムを選択します。[接触点]ボックスで、ソフトウェアに実装されている一連の数値手順、つまり適合度(GoF)32、分散比(RoV)32、二次導関数33、またはしきい値33のいずれかを選択します。アルゴリズムの詳細については、「ディスカッション、プロトコルの重要な手順」を参照してください。
注:CPは、プローブが材料と接触するポイントであり、 F-z データを F-δ データに変換するために識別する必要があります(ソフトマテリアルの場合、 δ は有限であり、計算する必要があります)。選択したアルゴリズムはデータセットのすべてのアクティブな曲線に適用され、アルゴリズムがCPをロバストに見つけることができない曲線は失敗したセットに移動されます。 - データセットに合わせてアルゴリズムのパラメーターを調整して、プロトコルの重要なステップである ディスカッションで詳しく説明されているようにCPが正しく配置されるようにします。CPが単一のカーブのどこに見つかったかを表示するには、カーブをクリックして選択し、 検査をクリックします。表示されるポップアップ・ウィンドウをチェックして、CPが配置されている場所を特定します。
- 表示される赤い線(選択された関心領域においてアルゴリズムが計算したパラメータ)が、CPの位置に対応する最大値または最小値を有するかどうかを確認する(例えば、GoFの場合、パラメータはR2である)。必要に応じて、すべてのカーブに対してこのプロセスを繰り返します。
注: ポップアップの軸は絶対座標であるため、CP の位置を表示できます。逆に、 生の曲線 と 現在の曲線 のグラフの軸はCPを基準にして表示され、CPの位置は(0,0)です。 - ヘルツ解析をクリックします。これにより、以下に説明する3つのグラフが生成されます。
- データセット内の個々のF δ曲線を平均ヘルツ適合値(赤い破線)とともに確認します。[最大インデンテーション (nm)] の下の [結果] ボックスで、ヘルツ モデルが適合されるインデントを nm 単位で調整します。ヘルツモデルを有効にするには、Rの最大~10%に設定します(ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。
- 平均F δ曲線と平均ヘルツフィット(赤い破線)とともに1標準偏差(SD)を示す誤差バンドを確認します。参考のために、生の曲線グラフの平均ヘルツ適合度と、現在の曲線の各曲線のヘルツ適合を視覚化します。
- ヘルツモデルを個々の曲線に当てはめることから生じる E の散布図を確認してください。
- ファイル名、 F-z 曲線、 F-δ 曲線、または散布図上の点のいずれかをクリックして、各プロットの曲線を強調表示します。散布図のデータポイントがデータの分布の外側にあるように見える場合は、それをクリックして、それが属する曲線を調べます。「 検査 」ボタンをクリックして、CP が正しく検出されたことを確認します。必要に応じて、解析から曲線を除外します。
- 結果ボックスで、計算された平均EとそのSD(Eγ ± σ)を調べ、それらが特定の実験に対して妥当であることを確認します。
- [ 保存 ] ボックスで、[ Hertz] をクリックします。ポップアップウィンドウで、ファイル名とディレクトリを入力します。完了したら、[ 保存]をクリックします。.tsv ファイルが作成されます。任意の追加のソフトウェアで.tsvファイルを開き、統計分析とさらなるプロットに値を使用します。
注: このファイルには、各曲線から得られた E と平均 E とその SD が含まれています。 さらに、このファイルには、解析された曲線の数、R、k、ヘルツ モデルに使用される最大インデントなど、解析に関連付けられたメタデータが含まれています。 - この手順は省略可能です。 [平均 F-Ind ] をクリックして、平均力と平均くぼみを、力の 1 つの SD と共にエクスポートします。
- 細胞ナノインデンテーションデータについては、弾性スペクトル分析をクリックしてください(代表的な結果と考察を参照)。生成された2つのプロット、すなわち、各曲線のくぼみの深さ(E(δ))の関数としてのEと、モデルの(黒い破線)によって適合された1つのSD(赤の実線と影付きの領域)を示す誤差帯のある平均E(δ)を調べ、細胞のアクチン皮質のヤング率、細胞のバルクヤング率を推定できます。 そしてアクチン皮質の厚さ。さらに、上のグラフの平均E(δ)を赤で確認してください。
- 補間ボックスがオンになっていることを確認し、弾性スペクトル解析の実行に必要な導関数が補間された信号で計算されるようにします(代表的な結果を参照)。
- [結果] ボックスを調べて、皮質のヤング率 (E 0 ± σ)、細胞のバルク ヤング率 (Eb ± σ)、および皮質の厚さ (d0 ± σ) を報告します。
注:平均弾性スペクトルは、最初はノイズが多く、正弦波振動が目立つように見える場合があります。その結果、式(3)が正しくはめ込まれないことがある。この場合、平滑化SAVGOLフィルタ34 のウィンドウ長を繰り返し増加させることで、この問題が解決する。 - 分析が終了したら、[保存] ボックスの [ES] をクリックします。これにより、指定したディレクトリに、平均くぼみの深さと接触半径の関数としての平均弾性、実験に関連付けられたメタデータ(上記を参照)、および上記で説明した推定モデルパラメータを含む.tsvファイルがエクスポートされます。最後に、δとそのSDへの依存性を無視した平均弾性も報告されています。
- ソフトウェアを閉じ、保存した結果を他の任意のソフトウェアに入力して、データをさらにプロットし、統計分析を実行します。
- この手順はオプションです: グラフを右クリックして [エクスポート] を選択して、GUI からグラフをエクスポートします。グラフを.svgでエクスポートして、フォント、フォントサイズ、線のスタイルなどのパラメータを作成します。選択した別のソフトウェアで編集できます。
メモ:カスタムCPアルゴリズムとフィルタをプログラムして、既存のものに追加することができます。詳細については、 補足注 1 を参照してください。
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Representative Results
プロトコルに従って、F-z曲線のセットが得られます。データセットには、適切な曲線と、分析を続行する前に破棄する曲線が含まれている可能性があります。一般に、曲線の形状が図 4A に示すものと異なる場合は、曲線を破棄する必要があります。図5AIは、NanoPrepare GUIにアップロードされた予想されるE 0.8 KPa35のソフトPAAmヒドロゲルで得られた~100個の曲線のデータセットを示しています。ほとんどの曲線は、明確で平坦な基線、遷移領域、および材料13 の見かけの剛性に比例する傾斜領域を示します。ただし、少数の曲線は、ベースラインがない、接触がない、ベースラインが傾斜しているなど、図4Aに示す形状からの変更を示しています。これらの曲線は、NanoPrepare (図 5AII、赤い曲線) と、標準の JSON 形式で保存されたクリーンなデータセット (図 5AIII) を使用してデータセットから簡単に削除できます。クリーンなデータセットは、すべての曲線をバッチ処理するように設計されたNanoAnalysis(図5BIV)にアップロードされます。つまり、ワークフローの各ステップがデータセット全体に適用されます。アップロード後、プロトコルの重要なステップであるディスカッションで説明されている1つ以上のフィルタを使用して、曲線をフィルタリングしてランダムノイズを除去できます(図5BV)。次に、CPは、ソフトウェアに実装され、プロトコルの重要なステップであるディスカッションで詳述されているアルゴリズムの1つを使用して配置されます(図5BVI)。CPが特定されると、F-zデータはF-δデータに変換されます。このソフトウェアは、球状の先端を持つプローブを使用する光ファイバセンシングに基づくフェルールトップナノインデンテーションデバイスからのデータを主に分析するように設計されているため、ヘルツ分析は、半径Rの球と無限に拡張された線形弾性均質等方性(LEHI)半空間との接触を近似するヘルツモデルに基づいています13:
ここで、 F は力、 δ はくぼみ、 E はヤング率、 ν はポアソン比であり、非圧縮性を仮定すると0.5と見なされます。したがって、 F δ 曲線を式(1)に当てはめることにより、 E を推定することができます(ヘルツモデルの仮定のプロトコルの 議論クリティカルステップを参照)(図5BVII)。
ヘルツ分析に加えて、ソフトウェアはより高度な分析、すなわち弾性スペクトルを実行することができ、これは細胞ナノインデンテーションデータに特に有用である。また、ヘルツモデルを介して得られた機械的特性に対する下地基板の影響を推定するためのツールとしても使用できます。以下に、アプローチを簡単に要約します。完全な詳細は、元の出版物24に記載されています。
任意の幾何学の軸対称パンチと弾性半空間のインデントを記述するOliver-Pharrモデル36から始めて、球面圧子の特定のケースに対して E(δ)を導き出すことができます。ν を0.5とすると、 E(δ)は24の形式になります。
式(2)を使用して各F δ曲線のE(δ)を計算すると、一連の曲線、つまり弾性スペクトル(ES)が得られます。データセット内のすべての曲線の平均をとることにより、平均ESが得られる(図5BVIII、赤い実線)。平均 ES は、データセット内の E がδによってどのように変化するかに関する情報を提供するため、便利なツールです。細胞ナノインデンテーション実験の特定のケースでは、細胞の厚さは先験的に知られていないため、ヘルツ分析に適切なフィッティング範囲を選択することはやや任意であることを意味します。平均ESを使用することにより、見かけのE(δ)に対する基板効果が明らかになり、ツールを使用して、E(δ)が減衰後に増加し始めるポイントに対応する適切なフィッティング範囲を選択できます。さらに、単純な二分子膜モデルがアクチン皮質の厚さ(d0)、アクチン皮質のヤング率(E0)、および細胞のバルクヤング率(Eb)の推定に有効であることが以前に実証され、計算および実験的に検証されています24。このモデルでは、セルを厚さd 0と弾性率E 0の最外層と、弾性率Eb
ここで、Rは先端の半径、Λは現象学的パラメータであり、有限要素解析シミュレーション24から1.74と決定されました。この手順はNanoAnalysisソフトウェアに実装されており、平均ESを式(3)に適合させて、E 0、Eb、およびd 0の推定値を得ることができます(図5BVIII、黒い破線)。方法論の詳細については、元の出版物24を参照してください。
プロトコルの実行可能性を実証するために、既知のE(AFMによって測定)35のPAAmヒドロゲルの弾性を調製し、プロトコルのパート1で提案された手順を使用してテストしました。各ゲルについて、サンプルの2つの異なる領域における2つの剛性マップを、R = 52 μmおよびk = 0.46 N / mの先端を備えた市販のフェルールトップナノインデンターを使用して取得しました。各マップは変位制御で実行される50のくぼみで構成され、xとyのステップサイズはオーバーサンプリングを避けるために20μmに設定されました。図6Aは、軟質PAAmヒドロゲル(予想E 0.8 kPa)および硬いPAAmヒドロゲル(予想E 8 kPa)の平均F-δ曲線を平均ヘルツモデルとともに示しています35。NanoAnalysisソフトウェアを介してヘルツ分析を実行し、Eの個々の値をプロットすることにより、両方のヒドロゲルについて予想されるEが取得されました(図6B)。
さらに、HEK293T細胞に対するナノインデンテーション実験を行った。各細胞で x および y ステップサイズを0.5μmに設定してマトリックススキャンを実行し、各細胞で最低25個の曲線を取得することにより、6つの個々の細胞をインデントしました。その結果、分析されたデータセットには~200個の曲線が含まれていました。選択したプローブは 、R = 3.5 μmおよび k = 0.02 N / mでした。
図7A は、平均ヘルツ曲線と対応する平均ヘルツモデルを示し、式(1)のフィッティングから得られた平均 E を、200nmのくぼみまでのナノアナリシスの個々の曲線にプロットしたものです。 E は915±633Pa(平均±SD)であることが見出され、これは文献24で報告された値に従ったものである。その幅広い用途にもかかわらず、ヘルツモデルは、細胞ナノインデンテーション実験のための押し込み深さの増加に伴う力の進化を完全には捉えていません(図7A)。このため、ESは単一細胞の機械的特性を研究するのに特に適したツールです。
図7Bは、平均ESを、200nmのくぼみまで嵌合した式(3)とともに示す。平均ESは~200nmのくぼみの深さで増加し始め、これはプローブされた見かけのEに対する基板の寄与を示しています(図S4)。このため、ヘルツモデル(図7A)と二分子膜モデル(図7B)の両方のフィッティング範囲として200nmが選択されました。式(3)を平均ESに当てはめることで、ヘルツモデルを使用して分析された単純なナノインデンテーション実験ではアクセスできない重要な情報を抽出することができました。具体的には、アクチン皮質弾性率E0は5.794±0.095kPa、アクチン皮質の厚さd0は311±3nm、体積弾性率Eb は0.539±0.002kPa(平均±SD)と推定された。全ての値は、同じ細胞型24に対してAFMを用いて実施した以前の実験に従ったものであり、文献37、38において報告されている値を用いた。具体的には、アクチン皮質は、接着細胞37に対して300〜400nmの間であり、細胞38の大部分よりも最大10倍硬いと予想される。
二層モデルに関係なく、標準ヘルツモデルとESアプローチで得られた結果を直接比較すると、 図7Cに示され、比較可能な平均で重複する分布が明らかになります。
図1:プロトコルの概要。 プロトコルは以下の部分で構成されています:(A)パート1:ナノインデンテーション実験用のサンプル(ヒドロゲルまたは細胞のいずれか)の準備。(B)パート2:適切なプローブの選択とプローブの校正。(C)パート3:サンプルの剛性マップを取得してナノインデンテーション実験を実行します。(D)パート4:i)最初のGUI(NanoPrepare)を介して取得したデータセットをクリーニングし、クリーニングされたデータセットと関連するメタデータを標準のJSONファイルとして保存することで構成されるデータの分析。ii)サンプルのヤング率 E を推定するためのデータフィルタリング、CP識別、およびモデルフィッティングで構成される2番目のGUI(NanoAnalysis)でクリーニングされたデータセットを分析します。結果は、任意のソフトウェアで実行できるさらなるプロットと統計分析のために保存されます。Biorender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サンプル調製 。 (A)ナノインデンテーション実験用のフラットPAAmヒドロゲルを調製するために提案されたステップ。これらは、I)ヒドロゲル溶液を疎水性スライドガラス上に注ぎ、それをシラン化カバーガラスで覆う;II)重合が起こるのを20分間待ち、スライドガラスからカバーガラス−ゲル複合体を剥離する工程;III)カバーガラスゲル複合体をシャーレに付着させ、ナノインデンテーション実験のために適切な溶液(このプロトコルの文脈では精製水)を添加する。同じ理論的根拠を、任意の他のタイプのヒドロゲルに適合させ、適用することができる。(B)ナノインデンテーション実験用の細胞を調製するために提案されたステップ。これらは、I)細胞を播種し、細胞接着を待つ。II)細胞周期の観点から細胞集団を同期させるために細胞を飢餓状態にする血清(任意選択);III)ナノインデンテーション実験を開始する前に、細胞が所望のコンフルエントで接着状態になるのを待つ。Biorender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ナノインデンテーションプローブの概要と選択。 (A)フェルールトッププローブの模式図(左)と先端半径250μmの球形フェルールトッププローブの写真(右)。すべてのコンポーネントは写真にラベル付けされています。(B)カンチレバーと球状の先端の拡大模式図。カンチレバーは、弾性定数kのフーケアンばねとして扱われます(表現のために角度で示されています)。先端は半径 R で定義されます。 試料がインデントされると、プローブはその基準位置z0から量zだけ変位し、その結果、カンチレバーは、その基準曲げd0からdを曲げる。F = k(d - d 0)の力がサンプルに適用され、その結果、インデントδ =(z - z 0)-(d - d 0)になります。(C)カンチレバーの剛性kは、基板の予想される弾性に応じて選択する必要があります。プロットは、エネルギーがカンチレバーの曲げと基板のくぼみの間で均等に共有されていると仮定して、1μmのくぼみとのヘルツ接触を考慮して取得されました(つまり、d = δ)。先端半径が大きいほど、カンチレバーは、特定のEを持つ基板に対して同じくぼみに到達するために硬くなるはずです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: F-z 曲線の形態学的特徴。 (A)実験が成功すると、明確なベースラインを持つ F-z 曲線のアプローチセグメントが得られます(先端はサンプルに近づいていますが、接触していません)。先端が最初にサンプルに接触する遷移領域。変位に伴って力が増加する領域であり、先端がサンプルを徐々にインデントしている領域。この領域の傾きは、材料13の見かけの剛性に比例し、硬い生体材料(例えば、高度に架橋されたゲル)に属する曲線は、より柔らかい生体材料(例えば、弱架橋ゲルおよび細胞)に属する曲線よりも急勾配になることを意味する。(B)先端がサンプルと接触したことのないアプローチカーブ。解決方法については、「 ディスカッション 」の方法のトラブルシューティングを参照してください。(C)先端がサンプルと接触し始めたアプローチ曲線。解決方法については、「 ディスカッション 」の方法のトラブルシューティングを参照してください。示されたデータは、予想される E 0.8 kPa35のソフトPAAmヒドロゲルで行われた実験からのものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Python GUIを使用したデータ分析ワークフロー。 (A)ソフトPAAmヒドロゲル(予想されるE 0.8 kPa35)上の市販のフェルールトップナノインデンターを使用して取得したF-z曲線のサンプルデータセットがNanoPrepareにアップロードされました。図 4A で説明した形状に従わない曲線はデータセットから除外され、クリーンなデータセットと関連するメタデータは標準の JSON ファイルとして保存されます。(B)クリーンなデータセットは2番目のGUI(NanoAnalysis)にアップロードされ、1つ以上のフィルターを適用して曲線をフィルタリングしてノイズを除去することができます(ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。さらに、CPアルゴリズムが選択され、すべての曲線のCPが自動的に特定されます(ディスカッション、プロトコルの重要なステップを参照)。次に、ヘルツ分析が実行され、各くぼみのF δ曲線が生成され、ヘルツモデルが適合されてEの散布図が生成されます。得られた結果は、さらにプロットするために保存できます。細胞については、弾性スペクトル24と呼ばれる追加の分析を行うことができる。表示されているすべてのグラフは、NanoPrepareとNanoAnalysis GUIの両方から直接エクスポートされました。ワークフローの各ステップの詳細は、本文に記載されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:PAAmヒドロゲルの弾性。 (A)軟質PAAmヒドロゲル(予想E 0.8 kPa 35)および硬いPAAmヒドロゲル(予想E 8 kPa35)で取得した~100個の曲線のセットからの平均F-δ曲線。実線は平均を示し、影付きのバンドは1つのSDを示します。破線は、NanoAnalysisソフトウェアの平均Eを使用してプロットされたヘルツモデルを示しており、ヘルツモデルを最大2,000 nm(Rの~4%、R = 52 μm、 k = 0.46 N/m)までの各曲線に当てはめることによって得られます。曲線は、デフォルトパラメータを有するプロミネンシーフィルタを用いて平滑化され、CPは、RoVアルゴリズム32を用いて同定された。(B)統計的比較のためにプロットされたナノアナリシスで実行された分析から得られたEの個々の値。雨雲プロットは、参考文献39で説明されているPythonモジュールを使用して取得されました。p < 0.0001、両側対応のないt検定、α=0.05。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:HEK293T細胞の弾力性。 (A)6つの個別のHEK293T細胞で取得した~200個の曲線のセットからの平均F-δ曲線。青色の実線は平均を示し、影付きのバンドは 1 つの SD を示します。破線は、NanoAnalysisソフトウェアを使用して計算された平均Eを使用してプロットされたヘルツモデルを示し、ヘルツモデルを最大200 nm(Rの~6%、R = 3.5 μm、k = 0.02 N/m)までの各曲線に当てはめることによって得られます。曲線は、デフォルトパラメータを有するプロミネシーフィルタおよび次数3およびウィンドウ長80nmを有するSAVGOLフィルタ34を用いて平滑化され、CPは閾値アルゴリズム33を用いて同定された。ヘルツモデルを使用すると、挿入図に概略的に示すように、細胞はヤング率Eの均質な球として扱われます(核は絵の目的で描かれています)。(B)(A)に記載の同じデータセットで計算された平均弾性スペクトル。赤い実線は平均を示し、影付きのバンドは 1 つの SD を示します。二層モデルを平均弾性スペクトルに当てはめることにより、E0、Eb、およびd0の推定値が計算されます。示されているデータセットの場合:E 0 = 5.79 ± 0.09 kPa、Eb = 0.539 ± 0.002 kPa、d0 = 311 ± 3 nm(平均±SD)。 (C)E分布の観点からのヘルツモデルと弾性スペクトルアプローチの比較。弾性スペクトルの場合、分布は、くぼみの深さ(最大くぼみ200 nmまで)に関係なく、平均弾性スペクトルからのEの値を表します。ヒストグラムに重ねられた連続線は、基礎となる分布のガウスカーネル密度推定値です。 E = 915 ± 633 Pa(ヘルツ)およびE = 890 ± 297 Pa(弾性スペクトル)(平均±SD)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図S1:キャリブレーション手順。 (A)波長スキャンに成功しました。波長スキャン中のカンチレバーのたわみとピエゾの変位信号(左)。波長スキャン終了時の干渉計の画面上の正弦波(右)。(B)表面手順を見つけます。カンチレバーのたわみとピエゾの変位信号は、プローブが硬い基板と接触した後、1μmステップで低下します。(C)幾何学的因子キャリブレーション。硬い基板のくぼみ中、カンチレバーのたわみはカンチレバーの変位(それぞれ緑と青の線)に従います。インデントはほぼゼロ(赤い線)である必要があります。たわみが変位の時間的遅れ(緑色の破線)の場合、プローブは硬い基板と完全に接触していません。(D)復調信号。キャリブレーション手順の終了時(左)とナノインデンターをタップしたとき(右)の干渉計の画面に表示される復調信号。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S2:ナノ準備GUI。 NanoPrepare GUI のスクリーンショット。各ウィジェットの機能に関する詳細は、メイン プロトコル と ディスカッションに記載されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S3:ナノアナリシスGUI。 ナノアナリシスGUIのスクリーンショット。各ウィジェットの機能に関する詳細は、メイン プロトコル と ディスカッションに記載されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ノート1:カスタムフィルターとCPアルゴリズムをナノアナリシスソフトウェアに追加する。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足プロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S4:平均弾性スペクトルの深さ依存性。 プロットは、平均弾性スペクトル
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Discussion
このプロトコルは、市販のフェルールトップナノインデンターを使用して、ハイドロゲルとシングルセルの両方で力分光ナノインデンテーションデータを堅牢に取得する方法を示しています。さらに、ナノインデンテーションデータの分析のための正確なワークフローを含むPythonでプログラムされたオープンソースソフトウェアの使用手順が提供されます。
プロトコルの重要なステップ
次の手順は、このプロトコルに従う場合に特に重要であることが確認されています。
サンプル調製
測定を開始する前に、測定の制約を念頭に置いてサンプルを準備することが重要です。つまり、サンプルは表面に接着し、できるだけ平らでなければなりません。これは、ヒドロゲルなど、細胞のように表面に自然に付着しないサンプルを調製する場合に特に重要です。まず、サンプルは測定を妨げ、プローブを損傷する可能性があるため、溶液中に浮遊してはなりません。このためには、カバーガラスの化学的官能基化が推奨され、その結果、ヒドロゲルは表面に付着して重合することができ、それは後で水没中にペトリ皿に接着することができる。さらに、プローブによるコヒーレントな表面検出を確実にし、マトリックススキャン中に x および y を移動するときにプローブが損傷しないように、サンプルの表面は可能な限り平坦でなければなりません。ヒドロゲル溶液は、疎水性スライドガラス上で重合することができ、これにより、得られたヒドロゲルはそれに付着することなく平らになる。これらの考慮事項に従わないと、クリーンな F-z データを取得することが困難になります。
細胞調製の場合、データの均質性を向上させるために、類似した形態の細胞をインデントするのが最善です。細胞が不均一な集団で増殖する場合、細胞周期の同期を助け、したがって潜在的な実験的交絡因子を除去するために、血清飢餓ステップを事前測定に導入することができる40,41。非接着性細胞またはオルガノイド培養の場合、測定中に生物学的サンプルの安定性と接着性を確保するために追加の手順を実行する必要があります。追加のステップには、細胞を培養プレートに化学的に結合させることや、現在広く市販されている組織接着剤を使用することが含まれる場合があります。
ナノインデンテーション実験
サンプルの予想されるE15に応じて、正しいkのカンチレバーを選択することが重要です。これは、カンチレバーが硬すぎると、サンプルがインデントされますが、カンチレバーが大きく曲がらないためです。逆に、カンチレバーがサンプルに対して柔らかすぎる場合、カンチレバーは最小限のくぼみで過度に曲がります。どちらのインスタンスも、後続の分析で E の計算が誤って発生します。
プローブのキャリブレーションでは、キャリブレーションディッシュの液体に遭遇したときの表面張力を最小限に抑えるために、キャリブレーションディッシュに挿入する前にプローブを濡らす必要があります。そうしないと、気泡が閉じ込められたり、カンチレバーが光ファイバーに押し付けられたりする可能性があります。これにより、プローブが損傷する可能性もあります。
キャリブレーションには、厚いガラスのペトリ皿の使用をお勧めします。ガラスはカンチレバーに比べて無限に硬いため、ガラスをへこませながらカンチレバーの k を正確に校正できます。さらに、ガラスの重量は、より軽いプラスチック製のペトリ皿と比較して、騒音(気流や音響振動など)に対してより堅牢な安定した基板を保証します。較正は、検出器で測定された干渉信号(V/t)の線形化手順を実行し、これは、信号が線形化ツール18として単位円(復調円)を用いて線形カンチレバー曲げ(μm/t)に変換されることを意味する。たわみ感度(μm/V)は、干渉計でデフォルトで設定され、Vをμmに変換するために使用されます。この手順では、球形の先端と信号の読み出しが発生するファイバ位置との間の位置の不一致に起因するキャリブレーション係数も決定されます(図3A)。硬い基板状のガラスにくぼみ込むことにより、ファイバーによって測定されるたわみは、ピエゾによって変位する距離とほぼ同じであり、これは押し込み深さがほぼゼロであることを意味する。それらの比率を取ると、キャリブレーション係数が得られます。機器の校正が正しく実行され、 F-z データの取得を続行する前にすべてのチェックが満たされていることが重要です。
インデント プロファイルを構成するときは、後でデータの分析に使用するヘルツ モデルの仮定に留意すると便利です。ヘルツモデルは、サンプルがLEHI無限に拡張された半空間であると仮定して導き出され、その結果、次の実際的な結果が生じます:i)適用されたひずみは20%を超えてはならず(経験則として、 δ はチップの Rの10%を超えてはなりません)、ii) δ サンプルの厚さの10%未満であり、他のサンプルの寸法と比較して小さくする必要があります13。
最大変位(または動作モードに応じて押し込み深さ/力)は、結果として得られる δ、および表面またはバルクの機械的特性が必要かどうかに応じて調整できます。サンプルがわずかに大きい δにインデントされている場合でも、ヘルツモデルは、NanoAnalysisソフトウェアの仮定内にある最大 δと、この範囲を推定するために使用される平均ESまで適合させることができます( 代表的な結果を参照)。
細胞ナノインデンテーション実験では、同じ細胞に対して複数のマトリックススキャンを実行することは困難です。しかしながら、細胞が十分に大きい場合、別の適切な領域を見つけて、同じ細胞に対して手順を繰り返すことが可能であり得る、例えば、ユーザが別の細胞と比較した細胞の特定の領域の機械的特性の差を検出したい実験。通常、細胞ごとにマップが実行され、生物学的条件ごとに最低5つの細胞がインデントされます。各サンプルで十分なデータが得られるように、実験を少なくとも3回繰り返すことをお勧めします(つまり、生物学的条件ごとに3回の反復)。
重要なことに、取得した曲線は、平坦なベースライン、遷移領域、および傾斜領域を提示する必要があります。ベースラインを示さない曲線は、CPの位置が不確かであるため、後で分析することはできません。曲線が 図4Aに示す形状から逸脱している場合は、実験を続行する前に接触しきい値を最適化する必要があります(以下の方法のトラブルシューティングを参照)。
機械的特性を局所的に調査する技術の性質を考慮して、統計的に堅牢な結果を保証するのに十分なデータを取得する必要があります。
データ分析
このプロトコルに記載されているソフトウェアは、ナノインデンテーションデータを分析するために日常的に採用されており、いくつかの査読付きジャーナル(例えば、ヒドロゲルのナノインデンテーション8,21、細胞のナノインデンテーション24,42)に掲載された結果を得るために使用されています。ナノインデンテーションデータの分析は簡単ではありません。次の部分に特に注意することをお勧めします。
データセットのスクリーニング:データセットはNanoPrepareソフトウェアで徹底的にスクリーニングされ、クリーンアップされたデータセットをJSONファイルとして保存する前に、失敗した曲線をすべて削除する必要があります。NanoAnalysisソフトウェアではカーブを解析から除外できますが、JSONファイルは変更できません。そのため、クリーニングされたデータセットと分析されたデータセットの一貫性を確保するために、NanoPrepareソフトウェアでスクリーニングプロセスを慎重に実行することをお勧めします。
データのフィルタリング: フィルターの使用は、データにノイズが多い場合に便利であり、ES 分析を実行するときに推奨されます。以下に説明するように、3つの主要なフィルターが使用されます。
プロミネンシー:このフィルターは、フーリエ空間の顕著なピークを除去し、市販のフェルールトップナノインデンターに典型的な機器振動を排除します。フィルターは3つのパラメータに基づいています:プロミネンシー(a.u.):フーリエ空間のピークプロミネンシー。最小周波数(チャネル):フィルタリングされる最小周波数。バンド(ピーク位置の%):ピーク位置のパーセンテージでフィルタリングされた周波数の周りの幅。市販のフェルールトップナノインデンターから発信されたデータに対してこのフィルターを有効にするには、チェックボックスをクリックし、デフォルトのパラメータのままにします。
Savitzky Golay (SAVGOL), SciPyライブラリのアルゴリズム34 (scipy.signal.savgol_filter): このフィルターは、局所最小二乗多項式近似に基づいてデータを平滑化します。データが特にノイズが多い場合は、このフィルターをアクティブにします。多項式の順序とフィルターウィンドウの長さをGUIで変更し、データのノイズの程度に応じて変更します。詳細については、参考文献30,31を参照してください。ES 分析に対してこのフィルターをアクティブにします。
メディアンフィルタ、SciPyライブラリ34 (scipy.signal.medfilt)のアルゴリズム:このフィルタは、各ポイントを特定のウィンドウ内のそのポイントの周りで計算された中央値に置き換えることに基づいてデータを平滑化します。GUIでウィンドウの長さを、データのノイズの程度に応じて変更します。このフィルターは、SAVGOL フィルターの代替として使用されます。
プロミネンシーフィルターをアクティブにすると、市販のフェルールトップナノインデンターに典型的な機器ノイズ(低周波振動)を除去するのに役立ちます。一般に、単純なヘルツ分析を実行するときにSAVGOL34 などの他のフィルターをアクティブにする必要はありません。ESを計算する際には、プロミネンシーフィルタとSAVGOLフィルタ34の両方をアクティブにし、データに存在するノイズのレベルに応じてスムージングウィンドウを設定することをお勧めします。これは、ESに微分項(式2)が含まれており、ノイズに非常に敏感であるためです。例えば、 図7 の結果は、窓80nmおよび多項式次数3を有するSAVGOLフィルタ34 と共にプロミネンシーフィルタを用いて得られた。ただし、データセット間に存在する違いが隠される可能性があるため、データを過度に平滑化しないことが重要です。
CPの同定:分析の最も重要な部分はCPの同定であり、これはEの絶対値とその分布の両方に強く影響します32,33。人間のバイアスを除去するためにCPを見つける自動検索手順に基づく4つのアルゴリズムがNanoAnalysisソフトウェアに実装されています。全てのアルゴリズムは文献32,33に文書化されている。一般に、対象領域内のすべてのポイントは、アルゴリズム固有のパラメーターが計算されている間、試行 CP としてテストされます。アルゴリズムに応じて最大値または最小値にすることができる最適化されたパラメータを返すポイントは、CP32とみなされます。これらの手順は、人間の偏見を取り除き、問題に統計的アプローチをとるために実装されています。各アルゴリズムは、特定のパラメーターの最適化に基づいて CP を計算するため、識別される CP はアルゴリズムごとにわずかに異なります。そのため、Eの相対的な差が保持されるため、比較したいデータセット間で同じCPアルゴリズムと特定のパラメータ(RoVアルゴリズムのウィンドウ長など)を維持することが最も重要です。さまざまなCPアルゴリズムとそのパラメータを以下に要約します。
適合度(GoF): 各(z、F)ペアから接触力学モデル(ヘルツ)を関心領域にフィッティングし、R2値が最も高いフィットを選択することに基づくアプローチ。非接触と接触の間の遷移が明らかな場合、高度に架橋されたヒドロゲルなどの硬い材料で発生します。このアルゴリズムは計算コストが高く、一般的に最も低速です。ここでは、より正確な結果が得られることが示されているため、ヘルツモデルがRの最大δ約10%までしか適合しないように実装されています32。
分散比(RoV):非接触および接触領域32における偏向(力)信号の分散の比を計算することに基づくアプローチ。
二次微分:たわみ(力)信号33の二次導関数に基づくアプローチ。信号がクリーンな場合はうまく機能します。信号のノイズが大きすぎる場合、このアプローチはお勧めしません。
閾値:非接触領域33における平均たわみ(力)に基づくアプローチ。つまり、接触領域の近くでユーザーが選択した力の値から始めて、アルゴリズムは、力の値がベースラインの平均よりも大きい最初のポイントを見つけるまで、各ポイントをベースラインに向かって反復処理します。このポイントがCPとして選択されます。このアルゴリズムは非常に堅牢であり、使用することをお勧めします。
各アルゴリズムの使用方法の詳細については、以下を参照してください。CPアルゴリズムには、特定のデータセットに合わせてGUIで変更する必要がある数値定数が含まれます。具体的には、以下のパラメータはGoF、RoV、および二次微分法に共通であり、CPが検索される曲線のサブ領域(関心領域またはROI)を選択することができます。
安全しきい値(nN):CPが検索される最大力をnN(および対応する z 点)で定義します。これはROIの右境界であり、デフォルト値は10nNです。最大荷重がこのしきい値を下回るすべてのカーブは、自動的に破損したセットに移動されます。この値を、非接触から接触への移行を少し上回る力の値に変更します。
X範囲(nm):安全なしきい値に対応する z 点からnmの範囲を定義します。これはROIの左の境界です。デフォルトの1,000 nmが適切な開始点ですが、CPが曲線で遅すぎる(つまり、傾斜領域)場合は、この値を増やします。逆に、CPが早すぎる(つまり、ベースラインで)見つかった場合は、この値を小さくします。
ここでは、各アルゴリズムに固有のパラメーターをまとめます。GoF の場合、ウィンドウフィット (nm) は、試行 CP からヘルツモデルがフィットされるまでのウィンドウを nm 単位で表します。これは 、R の 10% の値に制限されています。RoVの場合、ウィンドウRoV(nm)は、たわみ(力)信号の分散が計算される試行CPの左右にあるnm単位のウィンドウを表します。第2微分の場合、ウィンドウP(nm)は、偏向(力)信号の二次導関数を計算するために使用されるSAVGOLフィルタ34 に渡されるウィンドウを表す。デフォルト値はさまざまなアルゴリズムのテストから設定されており、通常は変更する必要はありません。
しきい値アルゴリズムでは、次のパラメーターを変更できます。
整列しきい値(nN): CPが検索される力(F0)は、この点から開始してベースラインに向かって移動します。最大力がこのしきい値を下回るすべてのカーブは、自動的に破損したセットに移動されます。デフォルト値は 10 nN です。ただし、この値は、非接触から接触への移行を少し上回る力の値に変更します。対応する z 点(z0)は、後でアルゴリズムで使用するために保存されます(以下を参照)。
[左揃えステップ (nm)]: このパラメーターは、z 0 (既定値は 2,000 nm) の左に追加するシフトを定義し、(z 0 - 左揃えステップ) で定義されるポイントが計算されます。このポイントは、ベースラインの平均が計算されるポイントです(以下を参照)。
平均面積 (nm): このパラメーターは、ベースラインの平均が計算される (z0 - 左揃えステップ) の左右の平均面積を定義します。デフォルト値は100nmで、変更する必要はありません。
F0から反復すると、CPは、ベースラインの平均によって定義される力を超える値を持つ最初の点と見なされます。
ESとノイズに関する注意:平均的なESは、最初は正弦波振動が顕著でノイズが多く見え、その結果、式(3)が正しく適合しない場合があります。この場合、平滑化SAVGOLフィルタ34 のウィンドウを大きくすると、通常、この問題が解決する。
メソッドの変更とトラブルシューティング
メソッドのトラブルシューティング
波長スキャンのトラブルシューティング
波長スキャンの実行後に干渉計のディスプレイにエラーメッセージが表示される場合は、次の問題が原因である可能性があります:i)環境がノイズによって汚染されている可能性があります。気流、大きな音、機械的振動などの騒音源を取り除きます。ii)プローブが正しく接続されていない可能性があります。緑色の光ファイバコネクタを抜き差しします。iii)カンチレバーが汚れている可能性があります。プローブをイソプロパノールを含むペトリ皿に数分間浸してから水に浸して洗浄します。iv)カンチレバーに気泡が存在する可能性があります。イソプロパノールを含むペトリ皿にプローブを沈め、液体を上下にピペッティングして流れを作ります。v)カンチレバーは、顕微鏡で見ることができる繊維に曲がったり付着したりすることがあります。ティッシュワイプでカンチレバーにそっと触れて解放します。カンチレバーに触れるときは、過度の力を加えるとカンチレバーが破損する可能性があるため、特に注意してください。vi)顕微鏡で見ることができるプローブからカンチレバーがありません。唯一の解決策は、新しいプローブを使用することです。波長スキャンを再試行すると、成功するはずです。
キャリブレーションのトラブルシューティング
キャリブレーションが失敗し、新しい係数がNaNであるか、予想される範囲にない場合は、次の問題が原因である可能性があります:i)チップが基板と完全に接触していません。 プロトコルに記載されている手順に従って、チップが基板に接触していることを確認してください。ii)先端とガラス表面の間の引力(スナップオン動作)により、過度に曲がったカンチレバーが校正されます。プローブをイソプロパノールで5分間吸引し、次に水に入れて洗浄します。イソプロパノールで皿をきれいにします。iii)チップ/皿が汚染されている可能性があります:プローブをイソプロパノールで5分間洗浄し、次に水に入れて清掃します。イソプロパノールで皿をきれいにします。iv)カンチレバーが繊維に曲がったり付着したりする可能性があります。ティッシュワイプでそっと触れて離します。トラブルシューティング後、波長スキャンとキャリブレーションの両方を繰り返します。
連絡先のトラブルシューティング
曲線が 図4Aに示す形状から逸脱している場合は、実験を続行する前に実験パラメータを調整する必要があります。最も一般的な問題の2つは次のとおりです。
先端がサンプルと接触しないアプローチ曲線(図4B)。これは、接触しきい値が低すぎる値に設定され、ノイズによってカンチレバーが指定されたしきい値に対応する量だけ曲がった場合に発生します。この問題を解決するには、[ オプション ]メニューに移動し、0.01のステップでしきい値をゆっくりと増やし、曲線が 図4Aに示すようになるまでインデントを実行します。同じメニューで速度を下げることも、この問題の解決に役立ちます。
先端がサンプルと接触し始めたアプローチカーブ(図4C)。これは、接触しきい値が高すぎる値に設定されており、カンチレバーが最初にサンプルに触れたときに指定されたしきい値に対応する量だけ曲がらない場合に発生します。この問題を解決するには、[ オプション ] メニューのしきい値を 0.01 ステップでゆっくりと下げ、曲線が 図 4A のようになるまでインデントを実行します。ベースラインがないとCPの正しい計算が妨げられ、最終的にEの誤計算につながるため、この問題は特に問題になります 。
メソッドの変更
プロトコルを拡張して、異なるタイプのヒドロゲルのEを定量化することができる。PAAmヒドロゲルは、メカノバイオロジーの分野で使用される最も一般的なヒドロゲルであるため、このプロトコルに選択されました。しかしながら、このプロトコルは、合成、例えばポリエチレン−グリコール(PEG)43およびゼラチンメタクリロイル(GelMA)44,45の両方の任意のタイプの弾性ヒドロゲル25に等しく適用可能である。コラーゲン46などの天然。さらに、合理的な範囲内で、テストするサンプルの寸法に制約はありません。たとえば、このプロトコルは、後にバルクレオメーターを使用してテストされ、直径が~15 mm、厚さが~2 mmである必要がある合成PEGヒドロゲルのEを定量するために使用されています8。このプロトコルは、ペトリ皿で重合されたPDMS膜のEを特徴付けるためにも実装されています(結果は公開されていません)。
従来の倒立位相差顕微鏡を使用して行われる単一細胞の標準的なインデントに加えて、フェルールトップナノインデンターは複雑なイメージングシステムと互換性があり、細胞の核や細胞質などの局所的な弾性細胞内構造を調べるために使用されてきました47。ステップは特定の光学系に応じて調整する必要がありますが、このプロトコルは、ナノインデンテーション実験の実行と結果のデータの分析に関して一般的に適用可能です。
さらに、プロトコルは、細胞およびヒドロゲルの機械的特性の測定に限定されず、オルガノイド48、スフェロイド49、および腎臓、肝臓、脾臓、および子宮23などの全組織の局所弾性特性を測定するように適合させることができる。読者は、そのようなサンプルに対してナノインデンテーション実験を行うことに関する特異性について参考文献23、48、49に向けられる。考慮すべき1つの側面は、変位制御がオープンループモードで機能し、サンプルからのフィードバックを受け取らないことです。そのため、一定の応力/ひずみと速度は保証されず、サンプルの柔らかい部分は、硬い領域と比較してますます速くインデントされます。これは、組織などの機械的に不均一なサンプルに関連し、押し込み制御(Iモード)または荷重制御(Pモード)のいずれかを選択する方が適切であり、サンプルの機械的に不均一な領域全体で一貫した応力/ひずみと速度を保証します。
メソッドの制限
粘弾性は、弾力性に加えて、生理学的および病理学的に関連するプロセスの調節において重要な役割を果たすという証拠が増えています。これは、細胞、ECM、および組織が粘弾性であり、弾力性がそれらの機械的挙動の1つの構成要素のみを表すためです50、51、52、53。フェルールトップナノインデンターは、応力緩和、クリープコンプライアンス、および異なる周波数(時間)レジームにわたる貯蔵弾性率と損失弾性率の両方を抽出する動的機械解析を含む粘弾性特性を特徴付けるための機能を提供しますが、このプロトコルは、メカノバイオロジーおよび組織工学の文脈で最も研究されている機械的変数である弾性にのみ焦点を当てています(たとえば、参考文献3を参照)。
実験とデータ分析の両方に影響を与える基本的な仮定は、くぼんだ基板がLEHIソリッドとして振る舞うことです。これは、応力-ひずみ応答が線形であり、時間依存の挙動がなく、サンプルが機械的に均質で等方性であることを意味します。これらの仮定に基づいて、基板の機械的特性は、特定の接触力学モデル(この場合はヘルツモデル)(式1)に従ったヤング率によって定量化されます。小さな準静的な力/変形の場合、このプロトコル35 で使用されるPAAmゲルなどの化学的に架橋されたヒドロゲルは、弾性固体と粘弾性効果が最小限で無視できる程度とほぼ同じように動作します53。一方、細胞はLEHI固体ではなく、複雑な機械的挙動を示します9。細胞のヤング率は、押し込み手順のひずみ速度(すなわち速度)に大きく依存しますが、明確な傾向は確立されず、先端サイズや最大押し込み深さなどの追加の変数がこの関係に影響を与えます9。それにもかかわらず、このプロトコルで使用されているような準静的変形(v = 5 μm / s)では、細胞は顕著な弾性応答を示し、散逸効果は最小限です9。ひずみ速度依存性は、読者が参照される時間依存変数を考慮したより複雑なモデルによって捕捉することができる54。
さらに、同じ基本的な仮定に従って、ポアソン比(ν)は、ヘルツ分析とES分析の両方で0.5と見なされます。サンプル間で比較する場合、これは係数としての結果にのみ影響します。しかしながらν は、セル55 については周波数依存量であり、ヒドロゲル56については0.5から逸脱することが示されている。
プロトコルの別の制限は、ソフトウェアがより洗練された接触力学モデルによるEの定量化を提供しないという事実にあります。ヘルツモデルは、AFM実験で最も使用されている接触力学モデルであり、非常に効果的です13,15;ただし、先端とサンプルの間の短距離または長距離の引力などのより複雑なイベントは考慮されていません。ジョンソン-ケンダル-ロバーツモデルのようなより複雑なモデルは、これらの挙動をキャプチャすることができるが13、ソフトウェアには実装されていない。複雑さに及ぶさまざまな接触力学モデルの概要については、読者は参考文献13に誘導されます。
既存/代替方法に対する本方法の意義
マイクロスケールで生体材料および単一細胞の局所弾性特性を定量化する最も一般的なアプローチは、AFM 13、14、15、16です。AFMは強力で汎用性の高い装置ですが、ユーザーが実験を堅牢に行うには、セットアップが複雑なため、広範なトレーニングが必要です。フェルールトップナノインデンターは、プラグアンドプレイソリューションを提供すると同時に、生体材料の局所的な機械的特性を調べるためにμm分解能でnN力を加えることができます(例:参考文献8,19,20,21)。メカノバイオロジー16および組織工学14のコンテキストでAFMを使用するための標準化されたプロトコルが存在しますが、フェルールトップナノインデンターデバイスの操作を詳述するプロトコルはありません。このプロトコルにより、経験の浅いユーザーは、コミュニティ内の実験ワークフローを標準化することを目的としたガイドラインに従うことで、ヒドロゲルと細胞の両方でナノインデンテーション実験を実行できます。さらに、ナノインデンテーション実験のデータ分析は自明ではなく、プログラミングの経験がないユーザーにとってはほとんどアクセスできません。取得したデータセットをライトおよび標準フォーマットでクリーニングおよび保存し、数回クリックするだけで再現可能な方法で標準ヘルツ分析とES分析24の両方を実行することを可能にする直感的なソフトウェアの使用に関する指示が提供される。
このプロトコルに従うことにより、AFMを用いて得られた結果と同等の結果が得られ、ヒドロゲルのE(参考文献35の結果と比較した図6の結果)および細胞の機械的特性(参考文献24の結果と比較した図7の結果)の両方について、複雑さのほんの一部である。この方法は、一般的な適用性のものであり、特定のデバイスに基づいていくつかのステップが修正されることを与えられた異なるタイプのナノインデンターに適合させることができる。
特定の研究分野におけるこの方法の重要性と潜在的な応用
細胞、ハイドロゲル、組織の弾性特性を特徴付けることは、メカノバイオロジー、組織工学/再生医療などに焦点を当てた多くの研究室で標準的な慣行です3。このプロトコルは、単一細胞、ヒドロゲルの弾性特性を定量化するために使用でき、機械的特性の変化によって特徴付けられる生理学的に関連するプロセスのコンテキストで組織およびより複雑な生体材料に適合します。例えば、天然ECMの動態を模倣するために、分解性3D PEG−ラミニンヒドロゲルは、細胞がそれらの周囲環境をリモデリングすることを可能にし、細胞を含まない同じゲルと比較して、9日間にわたって~50%の ゲルEの減少 をもたらすことが示されている21。プロトコルは一般的な適用性であり、本明細書に記載されるサンプルおよび光学セットアップに限定されない。このプロトコルは、生理学および疾患における機械的特性の研究に焦点を当てた研究室におけるナノインデンターの使用を容易にすることが想定されている。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
GCとMAGOは、CeMiのすべてのメンバーを認めています。MSSは、EPSRCプログラム助成金(EP/P001114/1 )による 支援を認めています。
GC:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、形式解析(ナノインデンテーションデータの解析)、検証、調査(ポリアクリルアミドゲルのナノインデンテーション実験)、データキュレーション、ライティング(原案、レビュー、編集)、可視化(図とグラフ)。 MAGO:調査(ゲルと細胞サンプルの準備、細胞のナノインデンテーション実験)、書き込み(元のドラフト、レビューと編集)、視覚化(図とグラフ)。 NA:検証、書き込み(レビューと編集)。 IL:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、検証、執筆(レビューと編集)。 MV:概念化、ソフトウェア(オリジナルソフトウェアとアルゴリズムの設計と開発)、検証、リソース、執筆(原案、レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達 MSS:リソース、ライティング(レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達。すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-1577P | |
| 35 mm cell treated culture dishes | Greiner CELLSTAR | 627160 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Acrylsilane | Alfa Aesar | L16400 | |
| Ammonium Persulfate | Merk | 7727-54-0 | |
| Bisacrylamide | Merk | 110-26-9 | |
| Chiaro nanoindenter | Optics 11 Life | no catologue number | |
| Ethanol | general | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16140071 | |
| High glucose DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Isopropanol | general | ||
| Kimwipe | Kimberly Clark | 21905-026 | |
| Microscope glass slides | VWR | 631-1550P | |
| MilliQ system | Merk Millipore | ZR0Q008WW | |
| OP1550 Interferometer | Optics11 Life | no catalogue number | |
| Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) | Optics 11 Life | no catologue number | |
| Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) | Optics 11 Life | no catologue number | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RainX rain repellent | RainX | 26012 | |
| Standard petri dishes (90 mm) | Thermo Scientific | 101RTIRR | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | 110-18-9 | |
| Vaccum dessicator | Thermo Scientific | 531-0250 | |
| Software | |||
| Data acquisition software (v 3.4.1) | Optics 11 Life | ||
| GitHub Desktop (Optional) | Microsoft | ||
| Python 3 | Python Software Foundation | ||
| Visual Studio Code (Optional) | Microsoft |
References
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