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Biology

Simulation et échantillonnage basés sur la structure des mouvements des protéines du facteur de transcription le long de l’ADN, du passage à l’échelle atomique à la diffusion à grain grossier

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63406
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 4, 5,6,7
1Beijing Computational Science Research Center, 2Shenzhen JL Computational Science and Applied Research Institute, 3School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 4Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 5Department of Physics and Astronomy, University of California, Irvine, 6Department of Chemistry, University of California, Irvine, 7NSF-Simons Center for Multiscale Cell Fate Research, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

L’objectif de ce protocole est de révéler la dynamique structurelle de la diffusion unidimensionnelle des protéines le long de l’ADN, en utilisant une protéine du domaine WRKY du facteur de transcription végétale comme système exemplaire. Pour ce faire, des simulations de dynamique moléculaire atomistique et à gros grains ainsi que des échantillonnages informatiques approfondis ont été mis en œuvre.

Abstract

Le glissement unidimensionnel (1-D) de la protéine du facteur de transcription (TF) le long de l’ADN est essentiel pour faciliter la diffusion du TF afin de localiser le site d’ADN cible pour la régulation génétique. La détection de la résolution de la paire de bases (pb) du glissement tf ou du pas sur l’ADN est encore expérimentalement difficile. Nous avons récemment effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) entièrement atomiques capturant un pas spontané de 1 pb d’une petite protéine TF de domaine WRKY le long de l’ADN. Basé sur le chemin de pas WRKY de 10 μs obtenu à partir de telles simulations, le protocole montre ici comment effectuer des échantillonnages conformationnels plus étendus des systèmes TF-ADN, en construisant le modèle d’état de Markov (MSM) pour le pas de protéine 1-bp, avec différents nombres de micro- et macro-états testés pour la construction MSM. Afin d’examiner la recherche par diffusion 1D processive de la protéine TF le long de l’ADN avec la base structurelle, le protocole montre en outre comment mener des simulations MD à grains grossiers (CG) pour échantillonner la dynamique à longue échelle du système. De telles modélisations et simulations CG sont particulièrement utiles pour révéler les impacts électrostatiques protéine-ADN sur les mouvements de diffusion processifs de la protéine TF au-dessus de dizaines de microsecondes, par rapport aux mouvements de pas de protéines submicrosecondes à microsecondes révélés par les simulations de tous les atomes.

Introduction

Les facteurs de transcription (TF) recherchent l’ADN cible pour lier et réguler la transcription des gènes et les activités connexes1. Mis à part la diffusion tridimensionnelle (3D), la diffusion facilitée de TF a été suggérée comme étant essentielle pour la recherche d’ADN cible, dans laquelle les protéines peuvent également glisser ou sauter le long de l’ADN unidimensionnel (1D), ou sauter avec transfert intersegmental sur l’ADN 2,3,4,5,6,7.

Dans une étude récente, nous avons mené des dizaines de microsecondes (μs) de simulations de dynamique moléculaire d’équilibre (MD) d’équilibre tout atome sur une plante TF - la protéine du domaine WRKY sur l’ADN8. Un pas complet de 1 bp de WRKY sur l’ADN poly-A en quelques microsecondes a été capturé. Les mouvements de la protéine le long du sillon de l’ADN et la dynamique de rupture-reformage des liaisons hydrogène (HB) ont été observés. Bien qu’une telle trajectoire représente un chemin échantillonné, un paysage global de pas de protéines fait encore défaut. Ici, nous montrons comment étendre les échantillonnages informatiques autour de la voie d’étape protéique initialement capturée avec le modèle d’état de Markov (MSM) construit, qui ont été largement mis en œuvre pour simuler une variété de systèmes biomoléculaires impliquant des changements conformationnels substantiels et une séparation à l’échelle de temps 9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19. Le but est de révéler l’ensemble conformationnel et les états méta-stables de la diffusion de la protéine TF le long de l’ADN pour une étape cyclique.

Alors que la simulation MD ci-dessus révèle la résolution atomique des mouvements des protéines pour 1 pb sur l’ADN, la dynamique structurelle de la diffusion processive à long terme du TF le long de l’ADN à la même haute résolution est difficilement accessible. La réalisation de simulations de DM à grains grossiers (CG) au niveau des résidus est toutefois techniquement accessible. L’échelle de temps de simulation CG peut être effectivement étendue à des dizaines ou des centaines de fois plus que les simulations atomiques 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Ici, nous montrons les simulations CG réalisées en implémentant le logiciel CafeMol développé par Takada lab30.

Dans le protocole actuel, nous présentons d’abord les simulations atomiques de la protéine du domaine WRKY le long de l’ADN poly-A et la construction MSM, qui se concentrent sur l’échantillonnage des mouvements de pas de la protéine pour seulement 1 pb le long de l’ADN. Ensuite, nous présentons la modélisation CG et les simulations du même système protéine-ADN, qui étendent l’échantillonnage informatique à la diffusion processive protéique sur des dizaines de bps le long de l’ADN.

Ici, nous utilisons le logiciel GROMACS31,32,33 pour effectuer des simulations MD et MSMbuilder34 pour construire le MSM pour des instantanés conformationnels échantillonnés, ainsi que pour utiliser VMD35 pour visualiser les biomolécules. Le protocole exige que l’utilisateur puisse installer et implémenter le logiciel ci-dessus. L’installation et la mise en œuvre du logiciel CafeMol30 sont alors nécessaires pour réaliser les simulations CG MD. D’autres analyses des trajectoires et de la visualisation sont également effectuées dans VMD.

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Protocol

1. Construction du modèle d’état de Markov (MSM) à partir de simulations md atomiques

  1. Voie spontanée de pas protéique et collecte des structures initiales
    1. Utilisez une trajectoire MD8 de 10 μs entièrement atome obtenue précédemment pour extraire 10000 images uniformément d’un chemin de pas « vers l’avant » de 1 bp (c’est-à-dire une trame pour chaque nanoseconde). Le nombre total de trames doit être suffisamment grand pour inclure toutes les conformations représentatives.
    2. Préparez le chemin de transition avec 10000 images dans VMD en cliquant sur Fichier > Enregistrer les coordonnées, tapez protéine ou nucléique dans la zone Atomes sélectionnés et choisissez des images dans la zone Cadres, cliquez sur Enregistrer pour obtenir les images nécessaires.
      REMARQUE: Une trajectoire de simulation MD de 10 μs tout atome précédemment obtenue (appelée « trajectoire de pas en avant » ici) pour wrky marchant à 1 bp sur un ADN poly-A homogène de 34 pb8 a été utilisée comme voie initiale pour lancer d’autres échantillonnages conformationnels. Notez que dans la plupart des pratiques, cependant, un chemin initial est construit, en effectuant des simulations MD pilotées ou ciblées, ou en mettant en œuvre des méthodes générales de génération de chemins, etc. 36,37,38,39.
    3. Alignez l’axe long de l’ADN de référence (de la structure cristalline) sur l’axe des x et définissez le centre de masse initial (COM) de l’ADN complet de 34 pb à l’origine de l’espace de coordonnées pour faciliter une analyse plus approfondie des données. Pour ce faire, cliquez sur Extensions > console Tk dans VMD, puis tapez dans la fenêtre de commande de la console Tk :
      source rotate.tcl
      Le script tcl se trouve dans le fichier supplémentaire 3.
    4. Calculez ensuite la distance quadratique moyenne (RMSD) de l’épine dorsale protéique en alignant l’ADN central de 10 bp (A 14 à 23 et T 14' à 23') à celui de la structure cristalline40, et le RMSD représente des mesures géométriques des systèmes (voir figure 1A). Pour ce faire, cliquez sur VMD > Extensions > Analysis >'outil de trajectoire RMSD et tapez les noyaux et les résidus 14 à 23 et 46 à 55 dans la zone de sélection d’atomes, cliquez sur Aligner , puis sur RMSD pour calculer les valeurs RMSD.
    5. Calculer le degré de rotation de la protéine autour de l’ADN Θ(t) sur le plan y-z dans MATLAB en tapant la commande
      rad2deg(atan(z/y))
      avec le positionnement angulaire initial défini comme Θ(0)=0, comme conduit précédemment8.
    6. Tapez la commande suivante dans MATLAB41 pour utiliser les méthodes K-means 42,43,44 et classez les 10000 structures en 25 clusters en tapant :
      [idx, C]=kmeans( X, 25)
      ici X est une matrice 2D de RMSD et d’angle de rotation de WRKY sur l’ADN. Rassemblez les structures de ces 25 centres de cluster pour d’autres simulations MD.
      REMARQUE: Étant donné que la protéine RMSD échantillonnée par rapport à l’ADN couvre une plage d’environ 25 Å, nous choisissons 25 grappes pour avoir une grappe par angstrom.
  2. Réalisation dela 1 ère série de simulations MD et des paramètres de simulation
    1. Construisez des systèmes atomistiques pour les 25 structures en utilisant le logiciel GROMACS 5.1.232 sous le champ de force parmbsc145 et en utilisant le fichier buildsystem.sh du fichier supplémentaire 2 dans le shell.
    2. Effectuez des simulations MD 60-ns pour ces 25 systèmes sous ensemble NPT avec un pas de temps de 2 fs en tapant la commande suivante dans shell :
      gmx_mpi grompp -f md.mdp -c npt.gro -p topol.top -o md.tpr
      gmx_mpi mdrun -deffnm md
  3. Regroupement du 1St trajectoires autour de MD
    1. Supprimez les 10 premières ns de chaque trajectoire de simulation en tapant shell :
      gmx_mpi trjcat -f md.xtc -b 10000 -e 600000 -o newtraj.xtc
      et recueillir les conformations des trajectoires de 25 × 50 ns pour le regroupement afin de préparer les structures d’entrée pour les échantillonnages ultérieurs plus étendus (simulations MD 2ème tour).
      REMARQUE: Pour réduire l’impact de la trajectoire initiale et permettre l’équilibrage local, 10-ns de la période initiale de simulations ont été supprimés.
    2. Choisissez des paires de distance entre la protéine et l’ADN comme paramètres d’entrée pour la projection de l’analyse en composantes indépendante du temps (tICA)46,47,48. Utilisez la commande make_ndx dans GROMACS pour ce faire :
      gmx_mpi make_ndx entrée -f.pdb -o index.ndx
      REMARQUE: Ici, les atomes de protéine CA et les atomes lourds (NH1, NH2, OH, NZ, NE2, ND2) du résidu Y119, K122, K125, R131, Y133, Q146, K144, R135, W116, R117, Y134, K118, Q121 qui peuvent former des liaisons hydrogène (HB) avec le nucléotide d’ADN ont été sélectionnés, qui s’associent aux atomes O1P O2P et N6 du nucléotide d’ADN (A14-20, T19-23). Les acides aminés sélectionnés peuvent former des HB stables ou des ponts salins avec l’ADN.
    3. Copiez l’index atom sélectionné ci-dessus à partir du fichier index.ndx dans un nouveau fichier texte (index.dat). Obtenez les informations de paire entre ces atomes par le script python à partir du fichier supplémentaire 1 generate_atom_indices.py et tapez:
      Index generate_atom_indices.py python2.6.dat > AtomIndices.txt
      Cela génère les 415 paires de distance entre la protéine et l’ADN.
    4. Calculez les 415 paires de distance de chaque trajectoire en tapant la commande suivante dans la fenêtre de commande MSMbuilder :
      msmb AtomPairsFeaturizer -out pair_features --pair_indices AtomIndices.txt --top references.pdb --trjs « trajectories/*.xtc » --transformed pair_features --stride 5
    5. Effectuer tICA pour réduire la dimension des données sur les 2 premiers composants ou vecteurs indépendants du temps (tIC) en tapant :
      msmb tICA -i .. /tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --gamma 0,05 -t tica_results,h5
      REMARQUE: tICA est une méthode de réduction de dimension qui calcule la valeur propre de la matrice Equation 1 de corrélation décalée dans le temps pour déterminer les degrés de liberté de relaxation les plus lents du système de simulation par l’équation:
      Equation 2
      où Xi(t) est la valeur de la i-ième coordonnée de réaction au temps t, et Xj(t+Δt) est la valeur de la j-ième coordonnée de réaction au temps t+Δt. Equation 3 est la valeur attendue du produit des trajectoires de simulation globales Xi(t) et Xj(t + Δt). Les directions le long des degrés de liberté de relaxation les plus lents correspondent aux valeurs propres les plus grandes de la matrice Equation 1de corrélation décalée dans le temps ci-dessus. Ici, 2 tIC semblent être un ensemble minimal pour différencier trois macro-états sur notre construction MSM (abordé plus tard). On peut également calculer le score de quotient de Rayleigh à matrice généralisée (GMRQ)49, par exemple, pour explorer un ensemble optimal de composants à utiliser.
    6. Utilisez la commande dans MSMbuilder pour regrouper les jeux de données projetés en 100 clusters par la méthode K-center43,44 (voir Figure 1B) :
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 100.
      Sélectionnez la structure centrale de chaque cluster comme structure initiale pour la 2ème série de simulations MD. Conservez les informations de simulation des 100 structures simulées, y compris les positions, les températures, les pressions, etc., à l’exception des vitesses.
      REMARQUE: Après la première série de 25 simulations, la mémoire du chemin initial a été réduite, de sorte que nous générons plus de grappes, par exemple 100 grappes, dans la deuxième ronde, pour élargir considérablement les échantillons conformationnels.
  4. Réalisation des simulations approfondies du2 e tour de MD
    1. Effectuez des simulations MD 60-ns à partir de ces 100 structures initiales après avoir imposé des vitesses initiales aléatoires à tous les atomes. Ajoutez les vitesses initiales aléatoires en activant la génération de vitesse dans le fichier mdp, c’est-à-dire en changeant le fichier md.mdp gen_vel = no en gen_vel = yes.
    2. Supprimez les 10 premiers ns de chaque simulation comme décrit à l’étape 1.3.1, collectez 2 500 000 instantanés des trajectoires de 100 × 50 ns uniformément pour construire le MSM.
      REMARQUE: Notez que dans la construction ultérieure des macro-états, un petit nombre d’états hors trajectoire avec une population particulièrement faible (~ 0,2%, au bas du plan X-Θ) ont été trouvés. Ces états hors chemin sont classés comme un macro-état lorsque le nombre total de macro-états est défini sur 3 à 6 (Figure 2B). Étant donné qu’un macro-état de population aussi faible ne comprend que 3 trajectoires, qui ont été supprimées à la fin, les résultats montrés dans ce protocole ont en effet été obtenus à partir de 97 × 50 ns trajectoires, avec un total de 2 425 000 images ou instantanés.
  5. Regroupement des 2èmes trajectoires autour de MD
    1. Effectuer tICA pour les trajectoires du 2e tour comme fait précédemment. Tapez MSMbuilder:
      msmb tICA -i .. /tica_rc_a/tmp/ -o tica_results --n_components 2 --lag_time 10 --gamma 0,05 -t tica_results,h5
    2. Calculer l’échelle de temps implicite pour valider les paramètres du temps de retard de corrélation Δt et les nombres de micro-états (voir Figure 1C),
      Equation 4
      où τ représente le temps de latence utilisé pour construire la matrice de probabilité de transition (TPM); μk(τ) représente la kème valeur propre du TPM sous un temps de décalage de τ. Utilisez le script python du fichier supplémentaire 1 pour ce python BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d .. / -f .. /trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 10 -n 20 -s 500.
    3. Variez le temps de latence τ et le nombre de micro-états en modifiant les paramètres utilisés ci-dessus :
      python BuildMSMsAsVaryLagTime.py -d .. / -f .. /trajlist_num -i 50 -m 1000 -t 5 10 20 30 40 -n 20 -s 20 200 400 500 800 2000
      REMARQUE: Le système est considéré comme markovien lorsque les courbes d’échelle de temps implicites commencent à se stabiliser avec la séparation d’échelle de temps. Ensuite, choisissez le Dt comme temps de retard de corrélation, et le τ le temps de décalage où l’échelle de temps implicite commence à se stabiliser pour construire MSM.
    4. En conséquence, choisissez un nombre relativement grand (mais pas trop grand) d’états, N = 500, et un temps de retard de corrélation relativement court Δt = 10 ns. Le temps de latence s’est avéré être τ = 10 ns pour construire MSM.
    5. Classez les conformations en 500 clusters (voir Figure 1D) à l’aide de la commande :
      msmb KCenters -i ./tica_results.h5 -o kcenters_output -t kcenters_output --n_clusters 500
  6. Construction de VSS
    1. Regroupez les 500 micro-états en 3 à 6 macro-états pour déterminer le nombre de macro-états qui conviennent le mieux selon l’algorithme PCCA+50 dans MSMbuilder, en utilisant le script python dans le fichier supplémentaire 1 python msm_lumping_usingPCCAplus.py. Identifier un réseau cinétique réduit de modèles pour les changements conformationnels les plus essentiels des biomolécules, en construisant un petit nombre de macro-états, c’est-à-dire en regroupant cinétiquement des centaines de micro-états comme décrit ci-dessous17,51.
    2. Cartographier les conformations de haute dimension au X (mouvement de la protéine le long de l’axe long de l’ADN) et l’angle de rotation de la protéine le long de l’ADN pour chaque macro-état, comme décrit aux étapes 1.1.3 et 1.1.4 (par exemple, aucun état avec une population trop faible < 1%; voir la figure 2C). Trouvez ensuite les 3 macro-états qui représentent le mieux le système (Figure 1E). Voir la figure 2D pour des instantanés du mouvement des protéines le long de l’ADN et de l’angle de rotation des protéines autour de l’ADN.
      REMARQUE: Dans des travaux antérieurs générant la voie de pas en avant de la protéine spontanée de 10 μs, nous avons également effectué des simulations MD d’équilibre de 5 x 4 μs pour élargir modérément les échantillons. Nous avons montré la cartographie de la trajectoire avant d’origine (voir la figure 2A à gauche) et d’autres trajectoires d’échantillonnage de 4 μs sur la trajectoire avant effectuée précédemment (voir la figure 2A à droite)8. La cartographie des trajectoires originales de 100 × 50 ns (voir figure 2B à gauche)8 et des trajectoires de 97 × 50 ns utilisées dans ce travail est montrée (voir la figure 2B à droite).
  7. Calcul des temps moyens de premier passage (MFPT)
    1. Effectuez cinq trajectoires Monte Carlo (MC) de 10 ms basées sur le TPM du MSM à 500 micro-états avec le temps de latence de 10 ns défini comme pas de temps de MC. Calculez MFPT52 entre chaque paire de macro-états (Figure 3) par le script python dans le fichier supplémentaire 1 python mfpt_msm3.py.
    2. Calculez l’erreur moyenne et l’erreur type du MFPT à l’aide du fichier bash dans le fichier supplémentaire 2, tapez :
      sh mfpt_analysis.bash

2. Effectuer une simulation à gros grains (CG) pour échantillonner la dynamique à long terme

  1. Effectuez des simulations CG à l’aide du logiciel CafeMol 3.030. Consultez les paramètres de simulation CG spécifiés dans le fichier de configuration d’entrée avec une extension .inp, y compris les structures d’entrée, les paramètres de simulation, les fichiers de sortie, etc. Tapez la commande suivante sur le terminal pour exécuter la simulation CG :
    cafemol XXX.inp
  2. Spécifiez les blocs suivants dans le fichier d’entrée, chaque bloc commençant par l’étiquette < and ending with >>>>.
    1. Définissez le bloc des noms de fichiers (obligatoire) pour spécifier les répertoires de travail et le chemin d’accès au magasin de fichiers d’entrée/sortie. Tapez ce qui suit pour le bloc de noms de fichiers pour ces simulations :
      <<<< noms de fichiers
      chemin = XXXXX (chemin d’accès)
      filename = wrky (les noms des fichiers de sortie)
      SORTIE psf pdb film dcd rst
      path_pdb = XXXXX (chemin de structure natif d’entrée)
      path_ini = XXXXX (chemin de structure initial d’entrée)
      path_natinfo = XXXXX (chemin d’accès au fichier d’informations natif)
      path_para = XXXXX (chemin des fichiers de paramètres)
      >>>>
      REMARQUE: Comme le modèle Go53 est utilisé dans la modélisation CG, c’est-à-dire que la protéine sera biaisée vers la conformation native, il faut donc définir la structure modélisée comme conformation native. Ici, la structure cristalline d’entrée a été définie comme la conformation native.
    2. Définissez le bloc de contrôle de tâche (obligatoire) pour définir le mode d’exécution des simulations. Tapez la commande suivante :
      <<<< job_cntl
      i_run_mode = 2 (= 2 la simulation de température constante)
      i_simulate_type = 1 (=1 dynamique de Langevin)
      i_initial_state = 2 (=2 signifie que la configuration initiale est une configuration native)
      >>>>
      Sélectionnez les simulations de dynamique Langevin à température constante.
    3. Définissez l’unité et le bloc d’état (obligatoire) pour définir les informations pour les structures d’entrée. Tapez la commande suivante :
      <<<< unit_and_state
      i_seq_read_style = 1 (=1 signifie des séquences de lecture à partir du fichier PDB)
      i_go_native_read_style = 1 (=1 signifie que la structure native provient du fichier PDB)
      1 protéine .pdb (unité et état molecular_type native_structure)
      2-3 ADN ADN.pdb (unité et état molecular_type native_structure)
      >>>>
      REMARQUE: Les fichiers de structure d’entrée initiaux (protéine.pdb et ADN.pdb ici) sont nécessaires. Les structures sont écrites au format pdb. Deux fichiers pdb sont nécessaires ici: l’un est le fichier de structure protéique contenant les coordonnées des atomes lourds de WRKY (unité 1), et l’autre est les coordonnées de l’ADN double brin (ds) de 200 bp (unité 2-3). La protéine est initialement placée à 15 Å de l’ADN.
    4. Définissez le bloc de fonction d’énergie (obligatoire) défini dans le bloc energy_function. Tapez la commande suivante :
      <<<< energy_function
      LOCAL(1) L_GO
      LOCAL(2-3) L_DNA2
      NLOCAL(1/1) ALLER EXV ELE
      ADN NLOCAL(2-3/2-3) ELE
      NLOCAL(1/2-3) EXV ELE
      i_use_atom_protein = 0
      i_use_atom_dna = 0
      i_para_from_ninfo = 1
      i_triple_angle_term = 2
      >>>>
      REMARQUE: Dans les simulations CG, la protéine est grossièrement grainée par le modèle Go53 avec chaque acide aminé représenté par une particule CG placée à sa position Cα. La conformation protéique sera alors biaisée vers la structure native, ou structure cristalline ici, sous le potentiel Go (Figure 4A à gauche). L’ADN est décrit par le modèle 3SPN.254, dans lequel chaque nucléotide est représenté par 3 particules CG S, P, N, qui correspondent respectivement au sucre, au phosphate et à la base azotée (Figure 4A à droite). Les interactions électrostatiques et vdW sont considérées entre différentes chaînes. Les interactions électrostatiques entre la protéine et l’ADN dans la simulation CG sont approchées par le potentiel de Debye-Hückel55. L’énergie répulsive vdW prend la même forme que dans le modèle Go.
    5. Définissez le bloc md_information (obligatoire) pour définir les informations de simulation. Tapez la commande suivante :
      <<<< md_information
      n_step_sim = 1
      n_tstep(1) = 500000000
      tstep_size = 0,1
      n_step_save = 1000
      n_step_neighbor = 100
      i_com_zeroing = 0
      i_no_trans_rot = 0
      tempk = 300,0
      n_seed = -1
      >>>>
      La n_tstep est l’étape de simulation. Définissez la tstep_size comme la durée de chaque étape MD, chaque pas de temps CG Cafemol est d’environ 200 fs30, donc chaque étape MD ici est de 200 × 0,1 fs en principe. Mettez à jour la liste des voisins toutes les 100 étapes MD (n_step_neighbor = 100). Réglez la température de simulation sur 300 K. Contrôlez la température en utilisant l’algorithme Verlet de type vitesse pour mettre à jour la structure des protéines avec le thermostat Berendsen56.
      REMARQUE : Le n_step_sim est le numéro de bassin du potentiel basé sur le modèle Go, ou le nombre minimal local de la courbe d’énergie. Un potentiel à plusieurs bassins permet à la conformation des protéines d’être biaisée en différentes conformations, de sorte que la conformation des protéines peut passer d’un minimum local à un autre. Ici, seul le modèle Go à bassin unique est utilisé, ce qui signifie une seule conformation biaisée (structure cristalline) pour les protéines dans les simulations. Pendant ce temps, comme il n’y a pas d’interaction de liaison hydrogène protéine-ADN, etc. modélisée dans le contexte CG, les mouvements moléculaires peuvent être échantillonnés encore plus rapidement, c’est-à-dire > 10 fois que dans les simulations atomiques.
    6. Définissez le bloc électrostatique (requis uniquement lorsque l’interaction électrostatique est utilisée) car l’interaction électrostatique est considérée entre différentes chaînes, utilisez donc ce bloc pour définir les paramètres de l’interaction électrostatique en tapant:
      <<<< électrostatique
      cutoff_ele = 10,0
      ionic_strength = 0,15
      >>>>
      Réglez la longueur de Debye dans l’interaction électrostatique à 10 Å, correspondant à l’état de la solution. Réglez la force ionique à 0,15 M, comme à l’état physiologique.

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Representative Results

Glissement couplé à la rotation ou pas de 1 bp de WRKY de la construction MSM
Toutes les conformations protéiques sur l’ADN sont mappées au mouvement longitudinal X et à l’angle de rotation de la protéine COM le long de l’ADN (voir la figure 3A). Le couplage linéaire de ces deux degrés indique un pas couplé à la rotation de la protéine du domaine WRKY sur l’ADN. Les conformations peuvent être regroupées en 3 macro-états (S1, S2 et S3) dans le MSM. Le pas en avant de WRKY suit ensuite la transition macro-état S1->S2->S3. S1 fait référence à un état métastable initié par la structure modélisée (basée sur la structure cristalline du complexe WRKY-ADN40), avec une population de ~ 6%. Notez que dans la modélisation actuelle, la conformation initiale de la protéine a été adoptée à partir de la structure cristalline dans laquelle la protéine se lie à la séquence d’ADN spécifique W-box40. Un tel complexe protéine-poly-ADN-A modélisé conduit donc à des structures initiales moins favorables (S1) que les structures échelonnées ou finalement détendues (S3). Néanmoins, on peut constater que les liaisons hydrogène (HB) à l’interface protéine-ADN se rétablissent près du centre de S3 comme près du centre dans S1 (voir Figure 3B). Les HB à l’état S1 sont bien entretenus : K125 avec A15, R131, Q146 et Y133 avec A16, K144 et Y119 avec A17, R135 avec A18 (Figure 3B en haut à gauche). S3 fait référence à un état métastable après le pas protéique de 1 pb, avec presque tous les HB décalés sur une distance de 1 pb (figure 3B en bas), et les structures semblent stables avec la population la plus élevée (63%). L’état intermédiaire S2 relie S1 et S3, avec une population moyenne-élevée (~30%). Nous avons constaté que les R135 et K144 sont assez flexibles dans cet état intermédiaire et peuvent généralement casser les HB avec le nucléotide actuel et le reformer avec le nucléotide suivant (Figure 3B en haut à droite). Dans l’ensemble, la protéine WRKY COM a déplacé ~ 2,9 Å et a tourné ~ 55 ° à pas de 1 pb ici. L’étape de limitation de débit pour le pas WRKY est S2->S3, qui permet essentiellement la rupture et le reformage collectifs des HB et nécessite environ 7 μs en moyenne. En revanche, S1 à S2 peut transiter très rapidement à un moment d’environ 0,06 μs ou 60-ns (Figure 3B), impliquant principalement les fluctuations COM de la protéine (par exemple, en raison de changements d’orientation des protéines sur l’ADN).

Biais monocaténaire de WRKY pendant la diffusion processive dans le modèle CG
Dans notre étude récente, nous avons constaté que la protéine du domaine WRKY se lie préférentiellement à un brin de l’ADNds, peu importe lors d’un pas de 1 pb ou d’une liaison statique; et le biais monocaténaire devient très important, en particulier lors de la liaison à une séquence d’ADN spécifique8. Pendant ce temps, il n’est pas clair si une telle tendance persiste pendant la diffusion processive de la protéine le long de l’ADN. Ici, nous avons essayé d’examiner le biais potentiel du brin via les simulations CG. Fait intéressant, une configuration significative de liaison à l’ADN monocaténaire a été identifiée dans les simulations CG du WRKY pendant la diffusion processive. Pour voir cela, les numéros de contact entre la protéine et l’ADN ont été calculés sur les brins d’ADN respectifs (voir la figure 4B). Un contact est envisagé lorsque la distance entre la particule de protéine CG et la particule d’ADN CG P (groupe phosphate) est inférieure à 7 Å. La protéine montre en effet un biais pour l’un des brins d’ADN (par exemple, ~4 contacts à un brin et ~1 contact à l’autre), c’est-à-dire même lorsque des interactions détaillées telles que les HB à l’interface protéine-ADN ne sont pas modélisées.

Le brin d’ADN préféré, cependant, peut basculer de temps en temps entre les deux brins de l’ADN, en fonction de l’orientation de liaison ou de la configuration de la protéine sur l’ADN. En particulier, selon le numéro de contact formé entre la protéine et les brins respectifs d’ADN, il y a principalement 4 états ici (tels qu’étiquetés 1, 2, 3 et 4 dans la figure 4B, C). Aux états 1 et 3, une région zinc-doigt se lie vers la direction -Y, et le brin préféré est le bleu. Aux états 2 et 3, la région zinc-doigt se lie vers la direction +Y, et le brin préféré devient le brin rouge. On constate également que la région zinc-figner interagit de manière dominante avec l’ADN (voir la figure 4D). Par conséquent, le brin d’ADN étroitement lié à la région zinc-doigt est en effet le plus préféré. Selon l’échantillonnage ci-dessus, il apparaît donc que le biais de brin persiste mais bascule entre les deux brins d’ADN dans le modèle CG de la diffusion processive des protéines.

Étape résiduelle individuelle de protéines dans les simulations CG
Il a déjà été remarqué à partir de nos simulations CG que la taille du pas de WRKY peut varier sur différentes séquences d’ADN8. La protéine COM a tendance à faire un pas de 1 pb sur l’ADN poly-A homogène. Alors que sur l’ADN poly-AT avec une périodicité de 2 pb, la proportion de pas de 2 pb semble augmenter.

De plus, nous avons examiné ici si les résidus de protéines individuels se déplacent de manière synchrone à l’interface protéine-ADN. Nous avons calculé la taille de pas de chaque résidu hautement conservé dans le motif WRKY (WRKYGQK) pour chaque pas de temps 1000 (Figure 5A). La taille résiduelle de chaque résidu conservé peut ainsi être mesurée à partir des simulations CG. Les résultats montrent en effet que les tailles de pas de ces résidus individuels sont plus synchronisées sur l’ADN poly-A que sur les séquences d’ADN poly-AT ou aléatoires (Figure 5B).

Figure 1
Figure 1 : Génération de conformations et construction de micro-états/macro-états. (A) Le chemin de marche initial vers l’avant cartographié sur le RMSD protéine-ADN et l’angle de rotation des protéines autour de l’ADN. Les 25 structures initialement choisies sont étiquetées par des cercles rouges. (B) Les 100 centres de cluster de conformation du1er tour 25 x 50 ns trajectoires de simulation MD cartographiées sur les deux directions tIC à valeur propre la plus élevée. (C) Tracés de l’échelle de temps implicite en fonction du temps de latence pour la construction des HSH via tICA en utilisant des paires de distances choisies comme entrée. Pour chaque ensemble, MSM a été construit en projetant les conformations sur les 2 tIC supérieurs, suivis d’un regroupement de centres K pour produire 20 à 2000 micro-états (de la colonne de gauche à droite) avec un temps de retard de corrélation pour tICA choisi de 5 à 40 ns (de la ligne de haut en bas). (D) Les 500 micro-états construits et (E) les 3 macro-états construits, avec les centres de micro-états correspondants cartographiés le long des deux directions tIC les plus élevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Construction des macro-états. (A) La cartographie de la trajectoire initiale de marche vers l’avant (à gauche) et avec un petit nombre d’échantillons de trajectoire supplémentaires de micro-secondes (à droite) sur le mouvement du centre de masse de la protéine (COM) le long de l’axe long de l’ADN (X) et l’angle de rotation autour de l’ADN (obtenu précédemment8). (B) La cartographie des trajectoires originales de 100 × 50 ns et des trajectoires de 97 × 50 ns utilisées dans la construction actuelle des VSM. (C) La construction de 3 à 6 macro-États et leurs populations à partir des HSH construites sont étiquetées sur les cartes d’échantillonnage étendues. (D) Le mouvement des protéines X et l’angle de rotation autour de l’ADN sont montrés, respectivement. Les conformations échantillonnées sont finalement regroupées en 3 macro-états, le rouge, le bleu et le gris correspondant respectivement aux macro-états 1, 2 et 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Le MSM de la protéine du domaine WRKY marchant sur l’ADN poly-A. (A) La projection des instantanés conformationnels MD sur les coordonnées du mouvement COM de la protéine X et l’angle de rotation par rapport à l’ADN. Les 3 macro-états S1, S2 et S3 sont colorés en rouge, bleu et gris, respectivement. (B) Conformations représentatives et temps moyen de transition premier passage (MFPT) des 3 macro-états construits. Les liaisons hydrogène clés entre les protéines et l’ADN sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Le modèle à grains grossiers (CG) et les contacts formés entre les brins de protéines et d’ADN dans le modèle CG. (A) Le grain grossier des protéines (à gauche) et de l’ADN (à droite). (B) Le numéro de contact entre WRKY et chaque brin d’ADN le long de la simulation. (C) Les vues moléculaires des 4 modes de contact. La région protéique près du doigt de zinc est colorée en gris et l’autre région est colorée en vert. (D) La probabilité de contact de chaque acide aminé protéique avec l’ADN. Lorsque la distance entre la particule CG de l’acide aminé et toute particule d’ADN CG est inférieure à 7 Å, l’acide aminé est considéré comme étant en contact avec l’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : La taille des étapes de diffusion de l’acide aminé protéique individuel dans le motif WRKY comme WRKY se déplaçant le long de l’ADN. (A) Les résidus hautement conservés (WRKYGQK) dans la structure atomique (à gauche) et après un grain grossier (à droite). (B) La taille du pas pour chaque résidu conservé sur différentes séquences d’ADN (poly-A; poly-AT; séquences aléatoires) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Les codes python et les logiciels utilisés dans ce protocole. MSM est construit principalement en utilisant le MSMbuilder, les codes python nécessaires sont attachés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Les simulations de dynamique moléculaire atomistique sont effectuées par GROMACS, les commandes et les fichiers nécessaires pour construire des simulations entièrement atomiques sont également joints. Les simulations grossières sont effectuées par le logiciel CafeMol. Les résultats de la simulation sont analysés par VMD et MATLAB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Script tcl pour faire pivoter et déplacer la protéine dans VMD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ce travail porte sur la façon de mener des simulations et des échantillonnages informatiques basés sur la structure pour révéler un facteur de transcription ou une protéine TF se déplaçant le long de l’ADN, non seulement au détail atomique du pas, mais aussi dans la diffusion processive, ce qui est essentiel pour la diffusion facilitée de TF dans la recherche de cible d’ADN. Pour ce faire, le modèle d’état de Markov ou MSM d’une petite protéine du domaine TF WRKY marchant pour 1-bp le long de l’ADN poly-A homogène a d’abord été construit, de sorte qu’un ensemble de conformations protéiques sur l’ADN ainsi qu’une liaison hydrogène collective ou une dynamique HB à l’interface protéine-ADN peuvent être révélés. Pour obtenir le MSM, nous avons effectué deux séries de simulations approfondies de DM entièrement atomique le long d’un chemin de pas protéique spontané (obtenu à partir de la simulation précédente de 10 μs), avec des échantillonnages de courant en agrégation de 7,5 μs (125 x 60 ns). Des échantillons aussi étendus nous fournissent des instantanés pour le regroupement de conformation en centaines de micro-états, en utilisant les distances de paires interfaciales protéine-ADN comme mesures géométriques pour le clustering. La propriété markovienne de la construction MSM est partiellement validée par la détection de la séparation à l’échelle de temps des échelles de temps implicites calculées pour différentes longueurs ou temps de latence des simulations MD individuelles. 20 à 2000 micro-états ont ensuite été testés et comparés pour les propriétés de séparation à l’échelle de temps, avec 500 micro-états sélectionnés pour la construction MSM. En outre, les 500 micro-états ont été regroupés cinétiquement en un petit nombre de macro-états, pour lesquels nous avons testé divers nombres d’états et constaté que trois macro-états suffisaient pour le système actuel. Le modèle à trois états montre simplement que l’état S1 transite vers S2 relativement rapidement (dans les dizaines de ns), dominé par les fluctuations du centre de masse des protéines (COM) sur l’ADN, tandis que l’état S2 transite lentement vers S3 et limite le débit (~ 7 μs en moyenne), dominé par la dynamique collective HB pour le pas. Notez que l’agrégation cinétique des micro-états en un petit nombre de macro-états cinétiquement distincts est encore sujette à des développements méthodologiques, avec différents algorithmes testés et des techniques d’apprentissage automatique pour des améliorations 57,58,59,60,61,62,63 . Les étapes critiques pour construire MSM comprennent le choix des paires de distance utilisées dans tICA et la détermination des paramètres utilisés pour construire des micro-états. Le choix des paires de distance est basé sur la connaissance, et il est important de choisir les paires d’interaction les plus essentielles. Les paramètres de construction des micro-états, tels que le temps de retard de corrélation, le temps de latence, le muber des micro-états, doivent être correctement définis pour garantir que le système soit markovien.

Avec de tels efforts, la dynamique structurelle des protéines submicro- à micro-secondes avec des détails atomiques peut être systématiquement révélée pour les protéines marchant 1-bp le long de l’ADN. En principe, avec la matrice de probabilité de transition obtenue à partir de la construction MSM, le système peut évoluer à une longue échelle de temps au-delà des microsecondes, ou disons, pour approcher les millisecondes et au-dessus de 13,17,64. Cependant, il existe des limites intrinsèques à l’échantillonnage et à la construction des HSH, qui reposent sur des simulations individuelles inférieures à la microseconde autour d’un certain chemin initial, et la propriété markovienne peut ne pas être bien garantie 65,66. Dans la plupart des pratiques, le chemin initial a été construit sous forçage ou accélération, bien que dans le système actuel, nous tirions parti d’un chemin de pas protéique spontané (sans forçage ni accélération) obtenu à partir d’une simulation d’équilibre de 10 ms8. Les échantillonnages conformationnels agrégés sont encore limités de dizaines de microsecondes en raison du coût de calcul élevé des simulations atomiques. De tels échantillons de microsecondes du pas de protéine sont peu susceptibles de fournir des conformations suffisantes pour apparaître sur la diffusion TF processive à longue échelle. Le problème de mémoire deviendrait important si l’on implémente la matrice de probabilité de transition actuellement obtenue au-delà d’une certaine échelle de temps, et la propriété markovien n’est pas garantie pour assurer une utilisation correcte du MSMactuel 14,52,66. Par conséquent, pour échantillonner la diffusion processive à longue échelle de temps de TF le long de l’ADN, la modélisation et la simulation à grain grossier ou CG à niveau de résidus sont mises en œuvre à la place, afin d’équilibrer le maintien de la base structurelle et la réduction du coût de calcul.

Dans la modélisation et la simulation CG, les résidus de protéines et les nucléotides d’ADN sont représentés par des perles (c’est-à-dire une perle pour un acide aminé et trois perles pour un nucléotide), la conformation des protéines étant maintenue via le modèle Go vers une configuration native ou prééquilibrée30,53. Bien que le niveau atomique des interactions HB devienne absent dans le modèle CG, les interactions électrostatiques protéine-ADN sont bien maintenues, ce qui semble être capable de capturer les caractéristiques dynamiques dominantes dans la diffusion processive de la protéine le long de l’ADN 67,68,69,70. Des protocoles de mise en œuvre détaillés sont présentés ici pour la modélisation et la simulation du système WRKY-DNA. Les résultats représentatifs montrent de manière intéressante que tout d’abord, le biais d’ADN monocaténaire présenté dans la simulation atomique précédente du système WRKY-DNA persiste dans le modèle CG, tandis qu’une variété d’orientations / configurations de protéines échantillonnées lors de la diffusion processive conduisent à un changement du biais entre les deux brins de temps en temps. Par conséquent, un tel biais de brin d’ADN n’est pas nécessairement lié à l’association HB, mais semble reposer principalement sur les interactions électrostatiques protéine-ADN, qui varient pour diverses configurations ou orientations protéiques sur l’ADN. Ensuite, les acides aminés individuels à l’interface protéine-ADN ou à proximité, tels que les motifs WRKQGQK hautement conservés, montrent différentes tailles de pas ou modèles de synchronisation pour différentes séquences d’ADN. Dans notre étude précédente, les variations de taille de pas n’ont été montrées que pour l’OCM de la protéine, car la protéine a été modélisée pour diffuser le long de différentes séquences d’ADN. Notez que le modèle CG actuel de l’ADN prend en charge les variations de séquence d’ADN avec un paramétrage différent 54,71,72, bien que les détails atomiques soient manquants. Un paramétrage approprié dépendant de la séquence d’ADN dans la modélisation basée sur la structure du système protéine-ADN est donc essentiel pour révéler les mécanismes de recherche et de reconnaissance protéine-ADN sur plusieurs échelles de temps et de longueur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions #11775016 et #11635002 de la NSFC. JY a été soutenu par le CMCF de l’UCI via NSF DMS 1763272 et la subvention de la Fondation Simons #594598 et fonds de démarrage de l’UCI. LTD a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de Shanghai #20ZR1425400 et #21JC1403100. Nous reconnaissons également le soutien informatique du Beijing Computational Science Research Center (CSRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CafeMol Kyoto University coarse-grained (CG) simulations
GROMACS University of Groningen Royal Institute of Technology Uppsala University molecular dynamics simulations software
Matlab MathWorks Numerical calculation software
MSMbuilder Stanford University build MSM
VMD UNIVERSITY OF ILLINOIS AT URBANA-CHAMPAIGN molecular visualization program

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Biologie numéro 181
Simulation et échantillonnage basés sur la structure des mouvements des protéines du facteur de transcription le long de l’ADN, du passage à l’échelle atomique à la diffusion à grain grossier
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E, C., Dai, L., Tian, J., Da, L. T., … More

E, C., Dai, L., Tian, J., Da, L. T., Yu, J. Structure-Based Simulation and Sampling of Transcription Factor Protein Movements along DNA from Atomic-Scale Stepping to Coarse-Grained Diffusion. J. Vis. Exp. (181), e63406, doi:10.3791/63406 (2022).

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