Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Anvendelse af optisk kohærenstomografi på en musemodel af retinopati

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en in vivo-billeddannelsesteknik ved hjælp af optisk kohærenstomografi for at lette diagnosen og den kvantitative måling af retinopati hos mus.

Abstract

Optisk kohærenstomografi (OCT) tilbyder en ikke-invasiv metode til diagnosticering af retinopati. OCT-maskinen kan tage retinale tværsnitsbilleder, hvorfra retinaltykkelsen kan beregnes. Selvom OLT er meget udbredt i klinisk praksis, er dets anvendelse i grundforskning ikke så udbredt, især hos små dyr som mus. På grund af den lille størrelse af deres øjenkugler er det udfordrende at foretage fundusbilledundersøgelser hos mus. Derfor kræves et specialiseret retinalt billeddannelsessystem for at imødekomme OCT-billeddannelse på små dyr. Denne artikel viser et system for OLT-undersøgelsesprocedurer for små dyr og en detaljeret metode til billedanalyse. Resultaterne af retinal OCT-undersøgelse af lipoproteinreceptor (Vldlr) og C57BL/6J-mus præsenteres. OCT-billederne af C57BL/6J-mus viste nethindelag, mens Vldlr-knockout-mus viste subretinal neovaskularisering og retinal udtynding. Sammenfattende kan OCT-undersøgelse lette ikke-invasiv påvisning og måling af retinopati i musemodeller.

Introduction

Optisk kohærenstomografi (OCT) er en billeddannelsesteknik, der kan give in vivo høj opløsning og tværsnitsbilleddannelse for væv 1,2,3,4,5,6,7,8, især til den ikke-invasive undersøgelse i nethinden 9,10,11,12 . Det kan også bruges til at kvantificere nogle vigtige biomarkører, såsom retinal tykkelse og retinal nervefiberlagtykkelse. OCT-princippet er optisk kohærensreflektometri, som opnår tværsnitsvævsinformation fra kohærensen af lys, der reflekteres fra en prøve, og omdanner den til en grafisk eller digital form gennem et computersystem7. OCT anvendes i vid udstrækning i oftalmologiske klinikker som et vigtigt redskab til diagnose, opfølgning og styring for patienter med retinale lidelser. Det kan også give indsigt i patogenesen af retinale sygdomme.

Ud over kliniske anvendelser er OLT også blevet anvendt i dyreforsøg. Selvom patologi er guldstandarden for morfologisk karakterisering, har OCT fordelen ved ikke-invasiv in vivo-billeddannelse og langsgående opfølgning. Desuden har det vist sig, at OCT er godt korreleret med histopatologi i retinopati dyremodeller 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Musen er det mest almindeligt anvendte dyr i biomedicinske undersøgelser. Imidlertid udgør dens små øjenkugler en teknisk udfordring for at udføre OCT-billeddannelse hos mus.

Sammenlignet med det OCT, der først blev brugt til retinal billeddannelse hos mus21,22, er OCT hos små dyr nu blevet optimeret med hensyn til hardware- og softwaresystemer. For eksempel reducerer OCT i kombination med trackeren signifikant signal-støj-forholdet; OCT-softwaresystemopgraderinger gør det muligt at registrere flere retinale lag automatisk; og den integrerede DLP-beamer hjælper med at reducere bevægelsesartefakterne.

Lipoproteinreceptor med meget lav densitet (Vldlr) er et transmembranprotein i endotelceller. Det udtrykkes på retinale vaskulære endotelceller, retinale pigmentepitelceller og omkring den ydre begrænsende membran23,24. Subretinal neovaskularisering er fænotypen af Vldlr knockout mus23. Derfor bruges Vldlr knockout-mus til at undersøge patogenesen og potentiel terapi af subretinal neovaskularisering. Denne artikel demonstrerer anvendelsen af OCT-billeddannelse til påvisning af retinale læsioner i Vldlr knockout-mus i håb om at give en teknisk reference til retinopatiforskning i smådyrsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operationerne blev udført efter erklæringen om brug af dyr i oftalmisk og synsforskning fra Association for Research in Vision and Ophthalmology. Det eksperimentelle design blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). To måneder gamle C57BL/6J-mus og Vldlr-knockoutmus blev brugt i denne undersøgelse. Der var 7 mus i hver gruppe, som alle var hunmus og vejede 20 g til 24 g.

1. Eksperimentelle betingelser

  1. Tildel musene til to grupper: en forsøgsgruppe bestående af Vldlr knockout-mus og en kontrolgruppe bestående af C57BL/6J-mus.
  2. Foder musene med mad og vand konventionelt.
  3. Hæv musene i dyrelaboratoriet under stabile forhold med stuetemperatur (22 ° C), fugtighed (50-60%), lys-mørk cyklus (12 h-12 timer) og rumlysintensitet (350-400 lux).
  4. Forbered forsøgsudstyret: optisk kohærenstomografi med konfokal scanning laser oftalmoskop (cSLO) til små dyr (figur 1A).
  5. Forbered alle materialer, der er nødvendige for forsøget (figur 1B), og vej musene (figur 1C).

2. Informationsoptegnelser

  1. Optag oplysningerne: gruppe, kode, fødselsdato, alder, køn, vægt og bedøvelsesdosering.

3. Opstart og test af instrumenter

  1. Tænd for computeren, og start softwaren.
  2. Klik på knappen Test program for at fuldføre testprogrammet.
  3. Tænd termostaten, og forvarm den til en temperatur på 37 °C.
  4. Start OCT-modulproceduren efter programtesten.
  5. Opret et nyt emne, og udfyld museoplysningerne.
  6. Forvarm det elektriske tæppe og dæk det med kirurgiske håndklæder.

4. Anæstesi

  1. Brug frysetørret bedøvelsespulver indeholdende Tiletamin og Zolazepam til fremstilling af bedøvelsesblandingen.
    BEMÆRK: Følg lokale dyreetiske komités anbefalinger for valg, dosering og rute for anæstesiadministration. Anæstetiser dyret med et bedøvelsesmiddel, der vil give immobilitet og tab af smerteopfattelse i mindst 1 time, hvorefter dyret genopretter hurtigt. Dosering bør være baseret på længden af forsøgstid, dyrevægt, og andre faktorer.
  2. Anæstetik dyret ved hjælp af den fremstillede bedøvelsesblanding. Sørg for at holde dyret varmt under hele proceduren indtil genopretning.

5. Anvendelse af mydriatiske dråber

  1. Opnå manuel fastholdelse af musen ved skrubben, få øjeæblet til at stikke lidt ud, og drej musehovedet med det ene øje opad.
  2. Påfør de mydriatiske dråber for at udvide pupillerne (figur 2A).
  3. Kontroller for pupiludvidelse efter 10 min.

6. Placering af musen

  1. Placer en mus på en elektrisk tæppeplatform.
  2. Overtræk begge øjne med medicinsk natriumhyaluronatgel (figur 2B).
  3. Skru en 60 D dobbelt sfærisk linse (forudindstillet linse) på cSLO-enheden (figur 1A-5, 6).
  4. Placer en 100 D kontaktlinse på musens hornhinde med den konkave side, der berører natriumhyaluronatgelen på hornhindeoverfladen (figur 2C, D og figur 3A-II).
  5. Placer musen på den lille dyreplatform med konstant temperatur, og hold øjet 1-2 mm væk fra cSLO-enhedens linse (figur 3A).
  6. Juster kontaktlinsens vinkel med tang for at holde pupillen i midten af linsen.
  7. Finjuster justeringerne af hovedet for at få øjet til at vende lige frem.

7. Konfokal scanning laser oftalmoskop (cSLO)

  1. Klik på OCT-knappen , vælg musemodulet , og start cSLO-programmet (figur 4B).
  2. Vælg IR-tilstand (lyskilde: rødt lys), og juster parameteren (rækkevidde: 2047, figur 4D).
  3. Vælg det øje, der skal undersøges (højre øje: Figur 4C-1; venstre øje: Figur 4C-2).
  4. Styr håndtaget, og bevæg langsomt den forudindstillede linse mod kontaktlinsen.
  5. Juster dioptriværdien, indtil den bageste polbilleddannelse er klar (figur 4E).
  6. Foretag yderligere justeringer for at justere billedet af den retinale bageste pol og centrere den ved synsnervehovedet.

8. Optisk kohærenstomografi (OCT)

  1. Start OCT-programmet (figur 4G).
  2. Klik på statuslinjen op og ned, indtil OCT-billedet vises (figur 4H).
  3. Juster parametre: Range Min (Figur 4I) = 0-20, Range Max (Figur 4J) = 40-60.
  4. Juster den forudindstillede linseafstand og positionsretning, indtil der opnås et ideelt OCT-billede.
  5. Vælg scanningspositionen ved at flytte standardlinjen i cSLO (figur 4M).
  6. Begynd at scanne fra synsnervehovedet.
  7. Saml billeder i samme rækkefølge for hvert øje: vandret linje: optisk nervehoved → overlegen → ringere; lodret linje: optisk nervehoved → nasal → tidsmæssig.
  8. Saml billeder fra fire retninger.
  9. Klik på Gennemsnit for at overlejre cSLO- og OCT-billedsignalerne (figur 4F og figur 4O).
  10. Klik på skudknappen for at hente SLO-OCT-billedet (figur 4P).
  11. Gem og eksporter alle billederne (figur 4Q, R).

9. Forsøgets afslutning (efter OLT-undersøgelsen)

  1. Placer musen på det elektriske tæppe for at holde den varm, indtil den vågner.
    BEMÆRK: Musen skal overvåges, indtil den genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Postoperativ eksponering for stærkt lys bør minimeres.
  2. Fjern 100 D kontaktlinsen.
  3. Påfør levofloxacin øjengelen for at beskytte hornhinden.
  4. Placer musen tilbage i buret, når den vågner op.
    BEMÆRK: Sørg for, at den undersøgte mus ikke returneres til selskab med andre mus, før den er helt genoprettet.
  5. Sluk for softwaren, og sluk for computeren.
  6. Rengør 100 D-kontaktlinsen med vand; tør linsen.
  7. Rengør og desinficer miljøet.

10. Billedanalyse

  1. Sammenlign OCT-billederne af Vldlr-knockoutmus med C57BL/6J-musene.
  2. Overhold flere positioner: lodrette og vandrette scanninger, der passerer gennem den optiske papillen; overlegne, ringere, nasale og tidsmæssige scanninger; og unormale refleksionsstedsscanninger.
  3. Overhold tykkelsen, formen, lagdelingen og unormale refleksionslæsioner i nethinden i hvert billede samt den glasagtige grænseflade mellem nethinden og glaslegemet.
  4. Optag placeringer, egenskaber og antal læsioner.

11. Retinal stratificering korrektion

  1. Klik på Indlæs undersøgelse på OCT-grænsefladen (figur 5A).
  2. Kald OCT-billederne af en mus fra et pop op-vindue.
  3. Vælg billeder: OCT-billedscanning gennem den optiske papill, vandret eller lodret.
  4. Dobbeltklik på billedet i mediebeholderen for at få det vist på skærmen (figur 5C).
  5. Klik på Lagregistrering for at fuldføre automatisk lagdeling på nethinden (figur 5D).
  6. Vælg skillelinjerne på begge sider af det lag, der er forberedt til analyse (figur 6D-10).
  7. Vælg en separat skillelinje (figur 6B-6), og klik på Rediger lag (figur 6A-1) for at aktivere linjen, når der vises en rød cirkel (figur 6B-7).
  8. Juster afstanden (figur 6A-4, f.eks. 50) og grænseområdet (figur 6A-5, f.eks. 50).
  9. Rediger skillelinjen ved at flytte den røde cirkel (sammenlign den grønne skillelinje i figur 6B og figur 6C; Figur 6C viser det ændrede resultat).

12. Retinal laminering tykkelse

  1. Klik på knappen Målemarkør (figur 6D-9).
  2. Vælg skillelinjen for det lag, der skal analyseres (vælg f.eks. 4. og 5. skillelinje i det ydre nukleare lag på listen) for at få vist grænsen for laget på OCT-billedet (figur 6D-10).
  3. Vælg Opret forbindelse til lag (figur 6D-11) og Bevar forbindelsen på farten (figur 6D-12).
  4. Vælg det område, der skal vises for at få vist resultaterne (den valgte kolonne er farvet, figur 6D-13).
  5. Klik på den position, der skal analyseres på OCT-billedet for at få målelinjen til at vises (vinkelret på den vandrette akse og i overensstemmelse med farven på det resulterende område) (figur 6D-14).
  6. Klik på den næste kolonne for den næste måling og afslør de tidligere data (figur 6E-15).
  7. Læs Vert-værdien (tykkelsen af den målte position) i rækken Længde i μm (væv) (figur 6E, rødt rektangel).
  8. Klik på Slet markør (figur 6E-16) og Ny markør (figur 6E-17) for at teste igen, så resultaterne dækker de oprindelige data (hvis det er nødvendigt at foretage en ny måling).
  9. Tryk på Udskriv Scr på tastaturet for at gemme skærmbilleder, eller klik på Gem undersøgelse for at gemme direkte (Figur 5H).
  10. Indtast dataene i et regneark eller statistisk software til statistisk analyse.

13. Måling af fuld retinal tykkelse

  1. Vælg linje 1 (ILM, indre begrænsende membran, figur 7B) og linje 7 (OS-RPE, OS: ydre fotoreceptorsegmenter; RPE: retinal pigment epitellag, figur 7C) i listen i øverste højre hjørne.
    BEMÆRK: Den fulde retinale tykkelse betyder tykkelsen af retinal neurepitellaget, som er nethinden mellem ILM og OS-RPE på OCT).
  2. Mål retinal tykkelsen på begge sider af den optiske papilla med et bestemt interval.
    1. For eksempel: Fra udseendet af retinalstrukturen ved kanten af den optiske papilla måles 4 værdier med 200 μm afstand mellem den vandrette lineal (figur 7G, H).
  3. Registrer alle målte værdier i et regneark.
  4. Brug flere t-test (en pr. række) til at sammenligne de målte værdier for hver tilsvarende position i begge grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Takket være OCT's højopløsningsscanninger kan lagene i musens nethinden observeres, og unormale refleksioner og deres nøjagtige placeringer kan identificeres. De retinale OCT-billeder af Vldlr-knockoutmus og C57BL/6J-mus blev sammenlignet i denne undersøgelse. OCT-billederne af alle C57BL/6J-mus viste forskellige retinale lag med forskellig reflektivitet, og afgrænsningen var klar (figur 8D). I modsætning hertil viste alle Vldlr knockout-mus unormale, hyperreflekterende læsioner på OCT-billederne (figur 8B).

Ufuldstændig glasagtig løsrivelse (PVD) i Vldlr knockout-mus

OCT-resultaterne viste nogle midterste reflekterende bånd på nethindefladerne af Vldlr knockout-mus (figur 8B, røde pile). Disse midterste reflekterende bånd klæbede til retinalbeholderen (figur 8B, grøn pil), svarende til cSLO-billedet (figur 8A, grøn pil). Disse egenskaber er i overensstemmelse med OCT-egenskaberne ved ufuldstændig glasagtig løsrivelse.

Subretinal neovaskularisering i Vldlr knockout mus

Resultaterne viste, at subretinal neovaskularisering havde to udviklingstilstande i Vldlr knockout-musene.

Med inddragelse af det ydre nukleare lag

En hyperreflekterende læsion med en bund-ned trekantet form på OCT-billedet dukkede op på det subretinale rum og spredte sig til det ydre nukleare lag. Læsionen brød ikke gennem det ydre plexiforme lag (figur 8B, hvid pil).

OCT-udseendet af denne type subretinal neovaskularisering var i overensstemmelse med de patologiske fund vist i figur 9A. Det patologiske afsnit viste, at neovaskularisering (figur 9A, tyk grøn pil) brød gennem RPE, fotoreceptorens indre / ydre segmenter (IS / OS) og den eksterne begrænsende membran (ELM). Det invaderede det ydre nukleare lag (ONL), men brød ikke igennem det ydre plexiforme lag (OPL).

Uden inddragelse af det ydre nukleare lag

Et bånd af hyperreflekterende læsion optrådte på OCT-billedet, som var placeret i det subretinale rum (figur 8B, gul pil). cSLO-billedet viste den tilsvarende placering (figur 8A, gul pil). De yderligere scanninger af nethinden omkring dette sted (figur 8A, gul pil) viste de samme fund.

I overensstemmelse med læsionen (figur 10A, tyk blå pil) i det patologiske afsnit brød denne subretinale neovaskularisering ikke igennem ELM (figur 10A, tynd gul pil), men involverede delvist fotoreceptoren IS / OS.

Retinal tykkelse resultater

Retinaltykkelsen af højre øje på alle mus blev opnået ved anvendelse af OCT's automatiske stratificerings- og tykkelsesmålingsfunktion. Nethindetykkelsen af Vldlr knockout-mus (200,94 ± 14,64 μm) var signifikant lavere end for C57BL/6J-mus (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-test, 7 højre øjne/gruppe). Sammenligningen af retinal tykkelse i de fire retninger (tidsmæssig, nasal, overlegen og ringere) af den bageste polare mellem de to grupper er vist i figur 11.

Figure 1
Figur 1: Forberedelse af forsøgsmaterialer og dyr. (A) Udstyr: 1. cSLO / OCT-enhed til nethindebilleddannelse hos små dyr, 2. computer og skærm, 3. Lille dyreplatform med konstant temperatur, 4. termostat, 5. forudindstillet linse, 6. installation af den forudindstillede linse. (B) Lægemidler og småting: I. povidon-jod, II. mikrosprøjte, III. bedøvelsesmiddel blanding opløsning, IV. timer, V. mydriatiske øjendråber, VI. tang, VII. medicinsk natriumhyaluronat gel, VIII. medicinsk vatpind, IX. antibiotisk øjensalve, X. 100 D kontaktlinse (to). (C) Vægtmåling på en digital vægt. Forkortelser: cSLO = konfokal scanning laser oftalmoskop; OCT = optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse før OCT-undersøgelse af mus . (A) Mydriasis øjendråbepåføring, (B) natriumhyaluronatgelbelægning på hornhinden, (C, D) placering af en 100 D kontaktlinse med konkav overflade, der kontakter hornhinden. Forkortelse: OCT = optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Procedurer for OLT-undersøgelse . (A) Placering af museposition, I. forudindstillet linse, II. kontaktlinse, III. Lille dyreplatform med konstant temperatur. (B) Drift af cSLO/OCT-maskinen, IV. betjeningshåndtag, V. vippehåndtag, VI. cSLO enhed. Forkortelser: cSLO = konfokal scanning laser oftalmoskop; OCT = optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: OCT-billeddannelsesproces. A. Måletilstand , B. Start Laser af IR-laseren, C. øjenvalg (C-1-OD; C-2-OS), D. rækkevidde af IR-laser, E. diopteren, F. overlejring af cSLO-billedet, G. OCT-scanningsstart/stop-laserknap H. reference til OCT-billede, I. Område Min: 0-20, J. Rækkevidde Maks.: 50-60, K. billedets signalintensitet, L. scanningsretning (f.eks. lodret scanning), M. scanningsposition valgt ved at flytte den grønne referencelinje (f.eks. lodret scanning gennem den optiske papill), N. realtidsvisning af OCT-billedet, O. overlejring af OCT-billedet, P. Skud: billedoptagelse, Q. SLO-OCT-billeder, der er erhvervet, R. Gem undersøgelse: gemmer undersøgelsesresultatet. Skala søjler = 200 μm. Forkortelser: cSLO = konfokal scanning laser oftalmoskop; OCT = optisk kohærenstomografi; IR = infrarød; OD = højre øje; OS = venstre øje. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Automatisk retinal delaminering interface på OCT system. A. Belastningsundersøgelsesknap, B. Mediebeholder, der viser alle OCT-billeder, C. OCT-billede, der vælges til analyse, D. Lagdetekteringsknap til automatisk retinal lagdeling, E. skillelinjeliste, F. automatisk delaminering på nethinden, G. Rediger lag-knap til lagdelt korrektion, H. Gem undersøgelse -knap til at gemme resultaterne. Skala søjler = 200 μm. Forkortelse: OCT = optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Lagdelt korrektion (A-C) og tykkelsesmåling (D-E). (A) Lagdelt redigeringsaktiveringsgrænseflade: 1. Knappen Rediger lag, 2. skillelinjeliste (f.eks. valg af alle linjer), 3. aktiverede skillelinjer, 4. Justering af afstand, 5. Justering af grænseområde. (B) Aktivering af en skillelinje (f.eks. linje 3 i A), 6. linje 3, linjen mellem det indre plexiformlag og det indre nukleare lag, 7. et eksempel på lagdelingsfejl. (C) Ændring af lagdelingsfejl, 8. den røde cirkel til modifikation. (D) Et eksempel på måling af retinal lamellær tykkelse, 9. Knappen Mål markør, 10. skillelinjer i det ydre nukleare lag, 11. Opret forbindelse til lag (målingen forbinder med laget i henhold til skillelinjerne), 12. Hold forbindelsen på farten (målingspositionen er det sted, hvor det manuelle klik forbliver), 13. placeringen af resultatvisningen, 14. målelinjen (vinkelret på den vandrette akse). (E) Erhvervelse af måleresultat, 15. måleresultaterne (rødt rektangel: Vert-værdi er tykkelsesresultatet), 16. Knappen Slet markør til sletning af målepost, 17. Ny Marker-knap til genmåling (det nye resultat overskriver den oprindelige post). Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Måling af fuld retinal tykkelse. A. Mål markørknap, B. linje 1 (ILM) og C. linje 7 (OS-RPE) valg til visning af grænserne for nethinden i fuld tykkelse, D. Forbind med lagvalg, E. Bliv forbundet ved valg af bevægelse, F. linealbjælke (lodrette og vandrette linealstænger, begge 200 μm lange), G. målelinjer på nethinden (4 linjer med 200 μm vandret lineallængde som afstand på hver side af den optiske papiller), H. måleresultaterne (resultaterne er differentieret med forskellige farver og svarer til farven på målelinjerne på nethinden), I. Dataudtræk fra Vert-værdien i rækken Længde i μm (væv). Skala søjler = 200 μm. Forkortelser: ILM = indre begrænsende membran; OS-RPE = fotoreceptor ydre segment af retinal pigmentepitel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Sammenligning af cSLO- og OCT-billeder af Vldlr-knockout- og C57BL/6J-mus. cSLO (A) og OCT (B) billeder af Vldlr knockout mus sammenlignet med cSLO (C) og OCT (D) billeder af C57BL/6J mus. Karakteristik af OCT i Vldlr knockout mus (B): 1) Midterste reflekterende linje (B, røde pile) på nethindens indre overflade med vedhæftning til retinalbeholderen (B, grøn pil). 2) Hyperreflekterende læsioner, placeret ved det subretinale rum, med (B, hvid pil) eller uden (B, gul pil) involvering af ydre nukleare lag. Pilene på cSLO-billedet (A) repræsenterer placeringen af de tilsvarende farvepile på OCT-billedet (B). Skala søjler = 200 μm. Forkortelser: cSLO = konfokal scanning laser oftalmoskop; OCT = optisk kohærenstomografi; Vldlr = lipoproteinreceptor med meget lav densitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Tilstand 1: retinale paraffinsektioner med hæmatoxylin-eosinfarvning i Vldlr knockout og C57BL/6J mus. (A) Et eksempel på subretinal neovaskularisering, der invaderer det ydre nukleare lag (tyk grøn pil), der er placeret i den midterste del af nethinden på en Vldlr-knockoutmus. (B) Normal kontrol, den midterste del af nethinden på en C57BL/6J mus. Skala søjler = 50 μm. Forkortelser: Vldlr = lipoproteinreceptor med meget lav densitet; ILM = indre begrænsende membran; NFL = nethinden nerve fiberlag; GCL = retinal ganglioncellelag; IPL = indre plexiformlag; INL = indre nukleart lag; OPL = ydre plexiformlag; ONL = ydre nukleare lag; ELM = ekstern begrænsende membran; IS = fotoreceptor indre segment; OS = fotoreceptor ydre segment; RPE = retinalt pigmentepitellag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Tilstand 2: retinale paraffinsektioner med hæmatoxylin-eosinfarvning i Vldlr knockout og C57BL/6J mus. (A) Et eksempel på subretinal neovaskularisering uden involvering af ydre kernelag (tyk blå pil) og med intakt ELM (tynd gul pil), placeret i den midterste periferi nethinde i en Vldlr knockout mus. (B) Normal kontrol, den midterste periferi nethinde af en C57BL/6J mus. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: VLDR = lipoproteinreceptor med meget lav densitet; ILM = indre begrænsende membran; NFL = nethinden nerve fiber lag; GCL = retinal ganglioncellelag; IPL = indre plexiformlag; INL = indre nukleart lag; OPL = ydre plexiformlag; ONL = ydre nukleare lag; ELM = ekstern begrænsende membran; IS = fotoreceptor indre segment; OS = ydre fotoreceptorsegment; RPE = retinalt pigmentepitellag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Sammenligning af nethindetykkelse mellem C57BL/6J mus og Vldlr knockout mus (alle data fra højre øje). (A) Retinal tykkelse (μm) gennem synsnervepapillen ved OCT vandret scanning. (B) Retinal tykkelse (μm) gennem synsnervepapillen ved OCT lodret scanning. Den vandrette koordinat repræsenterer målepositionerne med en afstand på 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Forkortelser: T = Temporal; P = Optisk papiller; N = Nasal; S = Overlegen; I = ringere; OCT = optisk kohærenstomografi; VLDR = lipoproteinreceptor med meget lav densitet; OD = højre øje. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse blev OCT-billeddannelse ved hjælp af et retinalt billeddannelsessystem til små dyr anvendt til at evaluere retinale ændringer i Vldlr knockout-mus, som viser ufuldstændig posterior glasagtig løsrivelse, subretinal neovaskularisering og retinal tykkelse udtynding. OCT er en ikke-invasiv billeddannelsesmetode til at undersøge nethindens tilstand in vivo. De fleste OCT-enheder er designet til menneskelig øjenundersøgelse. Størrelsen på hardwareudstyret, indstillingen af brændvidden, indstillingen af systemparametrene og eksaminandens positioneringskrav er alle baseret på det menneskelige øje. Ændringer af linsen og systemindstillingerne er nødvendige for at undersøge små dyr med menneskespecifikt OCT-udstyr. Dette dokument præsenterer olt-undersøgelsesprocedurer for små dyr.

Brændvidden er forskellig under billedscanning af forskellige smådyr med forskellige størrelser af øjenæbler. Denne forskel i brændvidde er kritisk og skal løses for at opnå klare og nøjagtige fundusbilleder. En effektiv metode er at erstatte objektivlinsen med linser med forskellige krumninger. På grund af sit lille øjeæble har musen brug for en kontaktlinse på 100 D foran hornhinden ud over den dobbeltsfæriske 60 D forudindstillede linse på OCT-udstyret.

OCT kan kun levere linjescanninger, der kun dækker et begrænset område af nethinden. Derfor er det vigtigt at standardisere protokollen for OCT-scanninger til kvalitativ og kvantitativ sammenligning af OLT-fund i forskellige grupper. Tre vandrette scanninger og tre lodrette scanninger blev udført her. Denne maskine giver et cSLO-billede i realtid til overvågning af placeringen af OCT-scanningen, så scanningens position kan justeres nøjagtigt og bekvemt. Yderligere scanninger kan tilføjes, når der findes en unormal refleksion.

Parametrene for billedoptagelse skal justeres omhyggeligt. Her anbefales det, at rækkevidden min. er 0-20 og rækkevidden max er 50-60 (figur 4I, J). Når parametrene overjusteres, forbedres billedets signalkontrast, og det reflekterede signal fra nethinden med lav refleksion bliver lavere eller endda sort, og nogle morfologiske oplysninger vil gå tabt.

Følgende er nogle tip til at undgå forringelse af billedkvaliteten: 1. Placer en kontaktlinse foran øjnene umiddelbart efter anæstesi for at undgå grå stær; 2. Sørg for, at den forudindstillede linse og kontaktlinsen er rene; 3. Undgå hår, der kommer ind mellem hornhinden og kontaktlinsen; 4. Sørg for, at doppler, kontrast og lysstyrke i OCT-parametrene er indstillet korrekt.

OCT-billederne kan bruges til kvalitativt at detektere læsioner og kvantitativt måle målinger såsom retinal tykkelse. Her foreslås en metode til at måle nethindetykkelsen flere steder, og gennemsnittet kan beregnes som den gennemsnitlige nethindetykkelse. Dette opnås gennem OLT-systemets automatiske stratificeringsfunktion. Derfor kan tykkelsen af retinale lamineringer også måles. Målemetoden er enkel og præcis (figur 6 og figur 7). Resultaterne viste, at nethindetykkelsen var lavere i Vldlr knockout-mus end C57BL/6J-mus, i overensstemmelse med litteraturen25. Forskellen i nethindetykkelse mellem de to grupper kan tydeligt vises ved en graf genereret fra målingerne på flere steder (figur 11). Lignende retinopatianalyse og målemetoder for retinal tykkelse er også blevet rapporteret i Stargardt sygdomsmusemodel26. Det er dog værd at bemærke, at de hyperreflekterende bånd ved nethindens glasagtige grænseflade ikke tilhører retinalvævet og bør fjernes under stratificering. Hertil kommer, at hvis subretinale læsioner invaderer nethinden, skal tykkelsesmålingen omfatte den invaderede del.

Dette smådyrs retinale billeddannelsessystem har nogle begrænsninger. For eksempel, selvom det kan give klare billeder af den bageste pol inden for 35 °, er billedoptagelse af den perifere nethinde stadig udfordrende. Derudover danner cSLO et gråskalabillede, som ikke er så godt som et farvefundusbillede til at detektere funduslæsioner (pigmentering, blødning, ekssudation). Derfor er der behov for yderligere forbedringer. Sammenfattende kan OCT-undersøgelse af cSLO-maskinen lette ikke-invasiv detektion og måling af retinopati i musemodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Projektkilde: Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (2018A0303130306). Forfatterne vil gerne takke Ophthalmic Research Laboratory, Joint Shantou International Eye Center of Shantou University og Chinese University of Hong Kong for finansiering og materialer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
  2. Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
  3. Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
  4. Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
  5. Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
  6. Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
  7. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  8. Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
  9. Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
  10. Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
  11. Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
  12. Podoleanu, A. G. Optical coherence tomography. Journal of Microscopy. 247 (3), 209-219 (2012).
  13. Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
  14. Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
  15. Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
  16. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
  17. Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
  18. Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  19. Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
  20. Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
  21. Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
  22. Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
  23. Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
  24. Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
  25. Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  26. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).

Tags

Medicin udgave 179
Anvendelse af optisk kohærenstomografi på en musemodel af retinopati
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. … More

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter