Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Abstract

A tomografia de coerência óptica (OCT) oferece um método não invasivo para o diagnóstico de retinopatia. A máquina OCT pode capturar imagens transversais da retina a partir das quais a espessura da retina pode ser calculada. Embora a OCT seja amplamente utilizada na prática clínica, sua aplicação na pesquisa básica não é tão prevalente, especialmente em pequenos animais, como camundongos. Devido ao pequeno tamanho de seus globos oculares, é um desafio realizar exames de imagem de fundo de olho em camundongos. Portanto, um sistema de imagem retiniana especializado é necessário para acomodar a imagem OCT em pequenos animais. Este artigo demonstra um sistema específico para pequenos animais para procedimentos de exame OCT e um método detalhado para análise de imagens. Os resultados do exame OCT da retina de camundongos knockout do receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (Vldlr) e camundongos C57BL/6J são apresentados. As imagens OCT de camundongos C57BL/6J mostraram camadas da retina, enquanto as de camundongos knockout Vldlr mostraram neovascularização sub-retiniana e afinamento da retina. Em resumo, o exame OCT poderia facilitar a detecção não invasiva e a medição da retinopatia em modelos de camundongos.

Introduction

A tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica de imagem que pode fornecer imagens in vivo de alta resolução e corte transversal para tecidos 1,2,3,4,5,6,7,8, especialmente para o exame não invasivo na retina 9,10,11,12 . Também pode ser usado para quantificar alguns biomarcadores importantes, como a espessura da retina e a espessura da camada de fibras nervosas da retina. O princípio da OCT é a reflectometria de coerência óptica, que obtém informações teciduais transversais a partir da coerência da luz refletida de uma amostra e a converte em uma forma gráfica ou digital através de um sistema computacional7. A OCT é amplamente utilizada em clínicas de oftalmologia como uma ferramenta essencial para diagnóstico, acompanhamento e manejo de pacientes com distúrbios da retina. Também pode fornecer informações sobre a patogênese das doenças da retina.

Além das aplicações clínicas, a OCT também tem sido usada em estudos com animais. Embora a patologia seja o padrão-ouro de caracterização morfológica, a OCT tem a vantagem de imagens in vivo não invasivas e acompanhamento longitudinal. Além disso, tem sido demonstrado que a OCT está bem correlacionada com a histopatologia em modelos animais de retinopatia 11,13,14,15,16,17,18,19,20. O rato é o animal mais comumente usado em estudos biomédicos. No entanto, seus pequenos globos oculares representam um desafio técnico para a realização de imagens OCT em camundongos.

Em comparação com a OCT usada pela primeira vez para imagens da retina em camundongos21,22, a OCT em pequenos animais agora foi otimizada em relação a sistemas de hardware e software. Por exemplo, o OCT, em combinação com o rastreador, reduz significativamente a relação sinal-ruído; As atualizações do sistema de software OCT permitem que mais camadas da retina sejam detectadas automaticamente; e o beamer DLP integrado ajuda a reduzir os artefatos de movimento.

O receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (Vldlr) é uma proteína transmembrana em células endoteliais. É expressa em células endoteliais vasculares da retina, células epiteliais pigmentares da retina e ao redor da membrana limitante externa23,24. A neovascularização sub-retiniana é o fenótipo de camundongos knockout Vldlr 23. Portanto, camundongos knockout Vldlr são usados para investigar a patogênese e a potencial terapia da neovascularização sub-retiniana. Este artigo demonstra a aplicação de imagens OCT para detectar lesões retinianas em camundongos knockout Vldlr, na esperança de fornecer alguma referência técnica para a pesquisa de retinopatia em modelos animais de pequeno porte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

As operações foram realizadas seguindo a Declaração sobre o Uso de Animais na Pesquisa Oftalmológica e Visão da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia. O delineamento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da instituição (Comitê de Ética Médica da JSIEC, EC 20171213(4)-P01). Camundongos C57BL/6J de dois meses de idade e camundongos knockout Vldlr foram utilizados neste estudo. Havia 7 camundongos em cada grupo, todos do sexo feminino e pesavam de 20 g a 24 g.

1. Condições experimentais

  1. Atribua os ratos a dois grupos: um grupo experimental composto por camundongos knockout Vldlr e um grupo controle composto por camundongos C57BL/6J.
  2. Alimente os ratos com comida e água convencionalmente.
  3. Elevar os ratos no laboratório animal sob condições estáveis de temperatura ambiente (22 °C), umidade (50-60%), ciclo claro-escuro (12 h-12 h) e intensidade da luz ambiente (350-400 lux).
  4. Preparar o equipamento experimental: tomografia de coerência óptica com oftalmoscópio a laser de varredura confocal (cSLO) para animais de pequeno porte (Figura 1A).
  5. Preparar todos os materiais necessários para o experimento (Figura 1B) e pesar os camundongos (Figura 1C).

2. Registos de informação

  1. Registre as informações: grupo, código, data de nascimento, idade, sexo, peso e dosagem anestésica.

3. Inicialização e teste do instrumento

  1. Ligue o computador e inicie o software.
  2. Clique no botão Testar programa para concluir o programa de teste.
  3. Ligue o termóstato e pré-aqueça-o à temperatura de 37 °C.
  4. Inicie o procedimento do módulo OCT após o teste do programa.
  5. Crie um novo assunto e preencha as informações do mouse.
  6. Pré-aqueça o cobertor elétrico e cubra-o com toalhas cirúrgicas.

4. Anestesia

  1. Use pó anestésico liofilizado contendo tiletamina e zolazepam para preparar a mistura anestésica.
    NOTA: Siga as recomendações do comitê de ética animal local para a escolha, dosagem e via de administração da anestesia. Anestesiar o animal com um anestésico que proporcionará imobilidade e perda da percepção da dor por pelo menos 1 hora, após o que o animal se recupera rapidamente. A dosagem deve ser baseada na duração do tempo de experimento, peso do animal e outros fatores.
  2. Anestesiar o animal utilizando a mistura anestésica preparada. Certifique-se de manter o animal aquecido durante todo o procedimento até a recuperação.

5. Aplicação de gotas midriáticas

  1. Consiga a contenção manual do mouse pelo scruff, faça com que o globo ocular se projete ligeiramente e gire a cabeça do mouse com um olho voltado para cima.
  2. Aplicar as gotas midriáticas para dilatar as pupilas (Figura 2A).
  3. Verifique se há dilatação da pupila após 10 minutos.

6. Posicionamento do mouse

  1. Coloque um mouse em uma plataforma de cobertor elétrico.
  2. Revestir ambos os olhos com gel de hialuronato de sódio medicinal (Figura 2B).
  3. Parafuse uma lente esférica dupla 60 D (lente predefinida) no dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
  4. Coloque uma lente de contato 100 D na córnea do camundongo com o lado côncavo tocando o gel de hialuronato de sódio na superfície da córnea (Figura 2C, D e Figura 3A-II).
  5. Coloque o mouse sobre a plataforma animal pequena e de temperatura constante e mantenha o olho a 1-2 mm de distância da lente do dispositivo cSLO (Figura 3A).
  6. Ajuste o ângulo da lente de contato com pinças para manter a pupila no centro da lente.
  7. Ajuste os ajustes na cabeça para fazer com que o olho fique voltado para a frente.

7. Oftalmoscópio a laser de varredura confocal (cSLO)

  1. Clique no botão OCT , escolha o módulo do mouse e inicie o programa cSLO (Figura 4B).
  2. Selecione o modo IR (fonte de luz: luz vermelha) e ajuste o parâmetro (intervalo: 2047, Figura 4D).
  3. Selecione o olho a ser examinado (olho direito: Figura 4C-1; olho esquerdo: Figura 4C-2).
  4. Controle a alavanca e mova a lente predefinida em direção à lente de contato lentamente.
  5. Ajuste o valor da dioptria até que a imagem do polo posterior esteja clara (Figura 4E).
  6. Faça ajustes adicionais para alinhar a imagem do polo posterior da retina, centralizando-a na cabeça do nervo óptico.

8. Tomografia de coerência óptica (OCT)

  1. Inicie o programa OCT (Figura 4G).
  2. Clique na barra de progresso para cima e para baixo até que a imagem da OCT apareça (Figura 4H).
  3. Ajustar parâmetros: Range Min (Figura 4I) = 0-20, Range Max (Figura 4J) = 40-60.
  4. Ajuste a distância da lente predefinida e a direção da posição até obter uma imagem OCT ideal.
  5. Selecione a posição de varredura movendo a linha padrão no cSLO (Figura 4M).
  6. Comece a varredura da cabeça do nervo óptico.
  7. Coletar imagens na mesma ordem para cada olho: linha horizontal: cabeça do nervo óptico → superior → inferior; linha vertical: cabeça do nervo óptico → nasal → temporal.
  8. Colete imagens de quatro direções.
  9. Clique em Média para sobrepor os sinais de imagem cSLO e OCT (Figura 4F e Figura 4O).
  10. Clique no botão de captura para adquirir a imagem SLO-OCT (Figura 4P).
  11. Salve e exporte todas as imagens (Figura 4Q, R).

9. Fim da experiência (após o exame PTU)

  1. Coloque o mouse sobre o cobertor elétrico para mantê-lo aquecido até que ele acorde.
    NOTA: O rato deve ser monitorizado até recuperar a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. A exposição pós-operatória à luz brilhante deve ser minimizada.
  2. Remova a lente de contato 100 D.
  3. Aplique o gel de olho de levofloxacina para proteger a córnea.
  4. Coloque o rato de volta na gaiola depois de acordar.
    NOTA: Certifique-se de que o rato examinado não é devolvido à companhia de outros ratinhos até que esteja totalmente recuperado.
  5. Desligue o software e desligue o computador.
  6. Limpe a lente de contato 100 D com água; secar a lente.
  7. Limpar e desinfetar o ambiente.

10. Análise de imagem

  1. Compare as imagens OCT de camundongos knockout Vldlr com as de camundongos C57BL/6J.
  2. Observe múltiplas posições: varreduras verticais e horizontais passando pela papila óptica; exames superiores, inferiores, nasais e temporais; e varreduras anormais do local de reflexão.
  3. Observe a espessura, a forma, as camadas e as lesões de reflectância anormais da retina em cada imagem, bem como a interface vítrea da retina e do corpo vítreo.
  4. Registre os locais, características e números de lesões.

11. Correção da estratificação retiniana

  1. Clique em Load Examination na interface da OCT (Figura 5A).
  2. Chame as imagens OCT de um mouse de uma janela pop-up.
  3. Selecionar imagens: Digitalização de imagens OCT através da papila óptica, horizontal ou verticalmente.
  4. Clique duas vezes na imagem no Media Container para exibi-la na tela (Figura 5C).
  5. Clique em Layer Detection (Detecção de camadas ) para concluir a colocação automática de camadas na retina (Figura 5D).
  6. Selecione as linhas divisórias em ambos os lados da camada preparada para análise (Figura 6D-10).
  7. Selecione uma linha divisória separada (Figura 6B-6) e clique em Edit Layer (Figura 6A-1) para ativar a linha quando um círculo vermelho aparecer (Figura 6B-7).
  8. Ajuste o espaçamento (Figura 6A-4, por exemplo, 50) e o intervalo limite (Figura 6A-5, por exemplo, 50).
  9. Modifique a linha divisória movendo o círculo vermelho (compare a linha divisória verde na Figura 6B e na Figura 6C; A Figura 6C mostra o resultado modificado).

12. Espessura da laminação da retina

  1. Clique no botão Measure Marker (Figura 6D-9).
  2. Selecione a linha divisória da camada a ser analisada (por exemplo, na camada nuclear externa, selecione a 4ª e a5ª linha divisória na lista) para exibir o limite da camada na imagem OCT (Figura 6D-10).
  3. Selecione Connect with Layer (Figura 6D-11) e Stay Connected on Move (Figura 6D-12).
  4. Selecione a área para exibir os resultados (a coluna selecionada é colorida, Figura 6D-13).
  5. Clique na posição a ser analisada na imagem OCT para que a linha de medição apareça (perpendicular ao eixo horizontal e consistente com a cor da área resultante) (Figura 6D-14).
  6. Clique na próxima coluna para a próxima medição e revele os dados anteriores (Figura 6E-15).
  7. Leia o valor Vert (espessura da posição medida) na linha Comprimento em μm (tecido) (Figura 6E, retângulo vermelho).
  8. Clique em Delete Marker (Figura 6E-16) e New Marker (Figura 6E-17) para testar novamente para que os resultados cubram os dados originais (se a remedição for necessária).
  9. Pressione Print Scr no teclado para salvar capturas de tela ou clique em Save Examination para salvar diretamente (Figura 5H).
  10. Insira os dados em uma planilha ou software estatístico para análise estatística.

13. Medição da espessura total da retina

  1. Selecione a linha 1 (ILM, membrana limitante interna, Figura 7B) e a linha 7 (OS-RPE, OS: segmentos fotorreceptores externos; PSE: camada epitelial pigmentar da retina, Figura 7C) na lista no canto superior direito.
    NOTA: A espessura total da retina significa a espessura da camada do neurepitélio da retina, que é a retina entre ILM e OS-RPE na OCT).
  2. Meça a espessura da retina em ambos os lados da papila óptica em um intervalo específico.
    1. Por exemplo: a partir do aparecimento da estrutura da retina na borda da papila óptica, meça 4 valores com espaçamento de 200 μm da régua horizontal (Figura 7G, H).
  3. Registre todos os valores medidos em uma planilha.
  4. Use vários testes t (um por linha) para comparar os valores medidos de cada posição correspondente em ambos os grupos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Graças às varreduras de alta resolução da OCT, as camadas da retina do rato podem ser observadas e reflexões anormais e suas localizações exatas podem ser identificadas. As imagens de OCT da retina de camundongos knockout Vldlr e C57BL/6J foram comparadas neste estudo. As imagens OCT de todos os camundongos C57BL/6J mostraram várias camadas da retina com diferentes refletividades, e a demarcação foi clara (Figura 8D). Em contraste, todos os camundongos knockout Vldlr apresentaram lesões anormais e hiper-reflexivas nas imagens OCT (Figura 8B).

Descolamento vítreo incompleto (PVD) em camundongos knockout Vldlr

Os resultados da OCT mostraram algumas bandas reflexivas médias nas superfícies da retina de camundongos knockout Vldlr (Figura 8B, setas vermelhas). Essas bandas refletivas médias aderiram ao vaso da retina (Figura 8B, seta verde), correspondendo à imagem cSLO (Figura 8A, seta verde). Essas características são consistentes com as características da OCT do descolamento vítreo incompleto.

Neovascularização sub-retiniana em camundongos knockout Vldlr

Os resultados mostraram que a neovascularização sub-retiniana teve dois modos de desenvolvimento nos camundongos knockout Vldlr .

Com envolvimento da camada nuclear externa

Uma lesão hiperrreflexiva, com uma forma triangular de baixo para baixo na imagem OCT, apareceu no espaço sub-retiniano e se espalhou para a camada nuclear externa. A lesão não rompeu a camada plexiforme externa (Figura 8B, seta branca).

O aspecto da OCT desse tipo de neovascularização sub-retiniana foi consistente com os achados patológicos mostrados na Figura 9A. O corte patológico mostrou que a neovascularização (Figura 9A, seta verde espessa) rompeu o PSE, os segmentos interno/externo fotorreceptor (IS/OS) e a membrana limitante externa (ELM). Ele invadiu a camada nuclear externa (ONL), mas não rompeu a camada plexiforme externa (OPL).

Sem envolvimento da camada nuclear externa

Uma faixa de lesão hiperrreflexiva apareceu na imagem da OCT, que estava localizada no espaço sub-retiniano (Figura 8B, seta amarela). A imagem cSLO mostrou a localização correspondente (Figura 8A, seta amarela). Os exames adicionais da retina em torno deste local (Figura 8A, seta amarela) mostraram os mesmos achados.

Consistente com a lesão (Figura 10A, seta azul espessa) no corte patológico, essa neovascularização sub-retiniana não rompeu o ELM (Figura 10A, seta amarela fina), mas envolveu parcialmente o fotorreceptor IS/OS.

Resultados da espessura da retina

A espessura da retina do olho direito de todos os camundongos foi obtida utilizando-se a função de estratificação automática e medição de espessura da OCT. A espessura da retina dos camundongos knockout Vldlr (200,94 ± 14,64 μm) foi significativamente menor que a dos camundongos C57BL/6J (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, teste t, 7 olhos direitos/grupo). A comparação da espessura da retina nas quatro direções (temporal, nasal, superior e inferior) do polar posterior entre os dois grupos é mostrada na Figura 11.

Figure 1
Figura 1: Preparação de materiais experimentais e animais. (A) Equipamento: 1. Dispositivo cSLO/OCT para imagens de retina de pequenos animais, 2. computador e monitor, 3. Plataforma animal pequena e de temperatura constante, 4. termostato, 5. lente predefinida, 6. instalação da lente predefinida. (B) Medicamentos e pequenos itens: I. povidona-iodo, II. microseringa, III. solução de mistura anestésica, IV. temporizador, V. colírio midriático, VI. fórceps, VII. gel médico de hialuronato de sódio, VIII. cotonete médico, IX. pomada ocular antibiótica, X. Lente de contato 100 D (duas). (C) Medição de peso em uma balança digital. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscópio a laser de varredura confocal; OCT = tomografia de coerência óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparação antes do exame OCT de camundongos . (A) Aplicação de colírio Mydriasis, (B) revestimento em gel de hialuronato de sódio na córnea, (C, D) colocação de uma lente de contato 100 D, com superfície côncava entrando em contato com a córnea. Abreviação: OCT = tomografia de coerência óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Procedimentos de exame OCT . (A) Posicionamento da posição do rato, I. lente predefinida, II. lente de contato, III. Plataforma animal pequena e de temperatura constante. (B) Funcionamento da máquina cSLO/OCT, IV. alavanca de operação, V. alavanca de inclinação, VI. Dispositivo cSLO. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscópio a laser de varredura confocal; OCT = tomografia de coerência óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Processo de geração de imagens OCT. Não. Modo de medição , B. Start Laser do laser IR, C. seleção ocular (C-1-OD; C-2-OS), D. gama de laser IR, E. a dioptria, F. sobreposição da imagem cSLO, G. botão laser start/stop de varredura OCT H. referência da imagem OCT, I. Alcance Min: 0-20, J. Alcance máximo: 50-60, K. intensidade do sinal da imagem, L. direção de digitalização (por exemplo, varredura vertical), M. posição de digitalização selecionada movendo a linha de referência verde (por exemplo, varredura vertical através da papila óptica), N. exibição em tempo real da imagem OCT, O. sobreposição da imagem OCT, P. Captura: aquisição de imagem, Q. IMAGENS SLO-OCT que foram adquiridas, R. Salvar exame: salvar o resultado do exame. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscópio a laser de varredura confocal; OCT = tomografia de coerência óptica; RI = infravermelho; DO = olho direito; OS = olho esquerdo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Interface de delaminação automática da retina no sistema OCT. A. Botão Load Examination, B. Media Container, mostrando todas as imagens OCT, C. OCT imagem sendo selecionada para análise, D. Layer Detection button para camadas retinais automáticas, E. lista de linhas divisórias, F. delaminação automática na retina, G. Edit Layer button para correção em camadas, H. Save Examination para salvar os resultados. Barras de escala = 200 μm. Abreviação: OCT = tomografia de coerência óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Correção em camadas (A-C) e medição de espessura (D-E). (A) Interface de ativação de edição em camadas: 1. Botão Editar camada, 2. lista de linhas divisórias (por exemplo, selecionar todas as linhas), 3. linhas divisórias ativadas, 4. Ajuste de espaçamento, 5. Ajuste do Limit Range. (B) Ativação de uma linha divisória (por exemplo, linha 3 em A), 6. linha 3, a linha entre a camada plexiforme interna e a camada nuclear interna, 7. um exemplo de erro de camadas. (C) Modificação do erro de sobreposição, 8. o círculo vermelho para modificação. (D) Um exemplo de medida da espessura lamelar da retina, 9. Botão Marcador de Medida, 10. linhas divisórias da camada nuclear externa, 11. Conecte-se com a camada (a medição se conectará com a camada de acordo com as linhas divisórias), 12. Mantenha-se conectado em movimento (a posição de medição é onde o clique manual fica), 13. a localização da exibição do resultado, 14. a linha de medição (perpendicular ao eixo horizontal). (E) Aquisição do resultado da medição, 15. os resultados da medição (retângulo vermelho: o valor de Vert é o resultado da espessura), 16. Botão Excluir marcador para exclusão de registro de medição, 17. Novo botão r Markepara remedição (o novo resultado substituirá o registro original). Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Medição da espessura total da retina. A. Botão Measure Marker, B. seleção da linha 1 (ILM) e C. linha 7 (OS-RPE) para mostrar os limites da retina de espessura total, D. Conecte-se com a seleção de camada, E. Fique conectado na seleção de movimento, F. barra de régua (barras de régua verticais e horizontais, ambas de 200 μm de comprimento), G. linhas de medição na retina (4 linhas com 200 μm de comprimento de régua horizontal como espaçamento em cada lado de cada lado de a papila óptica), H. os resultados da medição (os resultados são diferenciados por cores diferentes e correspondem à cor das linhas de medição na retina), I. Extração de dados do valor Vert na linha Comprimento em μm (tecido). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: ILM = membrana limitante interna; OS-RPE = segmento externo fotorreceptor do epitélio pigmentar da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Comparação das imagens cSLO e OCT de camundongos Vldlr knockout e C57BL/6J. Imagens cSLO (A) e OCT (B) de camundongos knockout Vldlr em comparação com as imagens cSLO (C) e OCT (D) de camundongos C57BL/6J. Características da OCT em camundongos knockout Vldlr (B): 1) Linha reflexiva média (B, setas vermelhas) na superfície interna da retina com adesão ao vaso da retina (B, seta verde). 2) Lesões hiperrreflexivas, localizadas no espaço sub-retiniano, com (B, seta branca) ou sem (B, seta amarela) envolvimento da camada nuclear externa. As setas na imagem cSLO (A) representam os locais das setas coloridas correspondentes na imagem OCT (B). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscópio a laser de varredura confocal; OCT = tomografia de coerência óptica; Vldlr = receptor de lipoproteína de densidade muito baixa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Modo 1: cortes de parafina retiniana com coloração de hematoxilina-eosina em knockout Vldlr e camundongo C57BL/6J. (A) Um exemplo de neovascularização sub-retiniana invadindo a camada nuclear externa (seta verde espessa), localizada na parte média da retina de um camundongo knockout Vldlr. (B) Controle normal, a parte média da retina de um camundongo C57BL/6J. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: Vldlr = receptor de lipoproteína de densidade muito baixa; ILM = membrana limitante interna; NFL = camada de fibras nervosas da retina; GCL = camada de células ganglionares da retina; IPL = camada plexiforme interna; INL = camada nuclear interna; OPL = camada plexiforme externa; ONL = camada nuclear externa; ELM = membrana limitante externa; SI = segmento interno fotorreceptor; OS = segmento externo fotorreceptor; PSE = camada de epitélio pigmentar da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Modo 2: cortes de parafina retiniana com coloração de hematoxilina-eosina em Vldlr knockout e camundongo C57BL/6J. (A) Um exemplo de neovascularização sub-retiniana sem o envolvimento da camada nuclear externa (seta azul espessa) e com ELM intacto (seta amarela fina), localizado na retina da periferia média em um camundongo knockout Vldlr. (B) Controle normal, a retina da periferia média de um camundongo C57BL/6J. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: VLDR = receptor de lipoproteína de densidade muito baixa; ILM = membrana limitante interna; NFL = camada de fibras nervosas da retina; GCL = camada de células ganglionares da retina; IPL = camada plexiforme interna; INL = camada nuclear interna; OPL = camada plexiforme externa; ONL = camada nuclear externa; ELM = membrana limitante externa; SI = segmento interno fotorreceptor; OS = segmento fotorreceptor externo; PSE = camada de epitélio pigmentar da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Comparação da espessura da retina entre camundongos C57BL/6J e camundongos knockout Vldlr (todos os dados do olho direito). (A) Espessura da retina (μm) através da papila do nervo óptico por varredura horizontal OCT. (B) Espessura da retina (μm) através da papila do nervo óptico por varredura vertical OCT. A coordenada horizontal representa as posições de medição com espaçamento de 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Abreviaturas: T = Temporal; P = Papila óptica; N = Nasal; S = Superior; I = Inferior; OCT = tomografia de coerência óptica; VLDR = receptor de lipoproteína de densidade muito baixa; OD = olho direito. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neste estudo, a OCT usando um sistema de imagem de retina de pequenos animais foi aplicada para avaliar as alterações da retina em camundongos knockout Vldlr , que demonstram descolamento vítreo posterior incompleto, neovascularização sub-retiniana e afinamento da espessura da retina. OCT é um método de imagem não invasivo para examinar a condição da retina in vivo. A maioria dos dispositivos OCT são projetados para exame oftalmológico humano. O tamanho do equipamento de hardware, a configuração da distância focal, a configuração dos parâmetros do sistema e os requisitos de posicionamento do examinando são todos baseados no olho humano. Modificações das configurações da lente e do sistema são necessárias para examinar pequenos animais com equipamentos OCT específicos para humanos. Este artigo apresenta os procedimentos de exame de PTU de pequenos animais.

A distância focal é diferente durante a digitalização de imagens de diferentes pequenos animais com diferentes tamanhos de globos oculares. Essa diferença na distância focal é crítica e deve ser resolvida para obter imagens de fundo de olho claras e precisas. Um método eficaz é substituir a lente objetiva por lentes de diferentes curvaturas. Devido ao seu pequeno globo ocular, o mouse precisa de uma lente de contato de 100 D na frente da córnea, além da lente predefinida 60 D duplamente esférica do equipamento OCT.

A OCT só pode fornecer varreduras de linha que cobrem apenas uma região limitada da retina. Portanto, é essencial padronizar o protocolo de varreduras de OCT para comparação qualitativa e quantitativa dos achados de OCT em diferentes grupos. Três varreduras horizontais e três verticais foram realizadas aqui. Esta máquina fornece uma imagem cSLO em tempo real para monitorar a localização da varredura OCT para que a posição da varredura possa ser ajustada com precisão e conveniência. Varreduras adicionais podem ser adicionadas quando uma reflexão anormal é encontrada.

Os parâmetros de aquisição de imagem precisam ser ajustados com cuidado. Aqui, recomenda-se que o Range Min seja de 0 a 20 e o Range Max seja de 50 a 60 (Figura 4I, J). Quando os parâmetros são superajustados, o contraste do sinal da imagem seria aprimorado, e o sinal refletido da retina com baixa reflexão se torna menor ou mesmo preto, e algumas informações morfológicas serão perdidas.

A seguir estão algumas dicas para evitar a deterioração da qualidade da imagem: 1. Coloque uma lente de contato na frente dos olhos imediatamente após a anestesia para evitar cataratas; 2. Certifique-se de que a lente predefinida e a lente de contato estão limpas; 3. Evite que os pelos entrem entre a córnea e a lente de contato; 4. Certifique-se de que o doppler, o contraste e o brilho nos parâmetros OCT estejam definidos adequadamente.

As imagens OCT podem ser usadas para detectar qualitativamente lesões e medir quantitativamente métricas como a espessura da retina. Aqui, um método é proposto para medir a espessura da retina em vários locais, e a média pode ser calculada como a espessura média da retina. Isto é conseguido através da função de estratificação automática do sistema OCT. Portanto, a espessura das laminações da retina também pode ser medida. O método de medição é simples e preciso (Figura 6 e Figura 7). Os resultados mostraram que a espessura da retina foi menor em camundongos knockout Vldlr do que em camundongos C57BL/6J, consistente com a literatura25. A diferença na espessura da retina entre os dois grupos pode ser claramente demonstrada por um gráfico gerado a partir das medidas em múltiplos locais (Figura 11). Análise semelhante de retinopatia e métodos de medição da espessura da retina também foram relatados no modelo de camundongo com doença de Stargardt26. No entanto, vale a pena notar que as bandas hiper-reflexivas na interface vítrea da retina não pertencem ao tecido da retina e devem ser removidas durante a estratificação. Além disso, se as lesões sub-retinianas invadirem a retina, a medida da espessura deve incluir a porção invadida.

Este sistema de imagem da retina de pequenos animais tem algumas limitações. Por exemplo, embora possa fornecer imagens claras do polo posterior dentro de 35°, a aquisição de imagens da retina periférica ainda é um desafio. Além disso, o cSLO forma uma imagem em escala de cinza, que não é tão boa quanto uma imagem de fundo de olho colorido para detectar lesões de fundo (pigmentação, sangramento, exsudação). Por conseguinte, são necessárias mais melhorias. Em resumo, o exame OCT pela máquina cSLO poderia facilitar a detecção e medição não invasivas da retinopatia em modelos de camundongos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram não haver potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Fonte do Projeto: Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2018A0303130306). Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório de Pesquisa Oftalmológica, ao Joint Shantou International Eye Center da Universidade de Shantou e à Universidade Chinesa de Hong Kong pelo financiamento e materiais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
  2. Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
  3. Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
  4. Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
  5. Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
  6. Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
  7. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  8. Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
  9. Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
  10. Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
  11. Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
  12. Podoleanu, A. G. Optical coherence tomography. Journal of Microscopy. 247 (3), 209-219 (2012).
  13. Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
  14. Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
  15. Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
  16. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
  17. Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
  18. Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  19. Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
  20. Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
  21. Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
  22. Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
  23. Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
  24. Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
  25. Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  26. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).

Tags

Medicina Edição 179
Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. … More

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter