Summary
La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.
Abstract
La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.
Introduction
El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral1. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real2. A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras especies de aves. En este protocolo, se describe un modelo alternativo ex ovo CAM utilizando embrión de codorniz japonesa (Coturnix japonica). Debido a su pequeño tamaño, permite el uso de un número mucho mayor de individuos experimentales que el pollo CAM. Además, el desarrollo embrionario más corto de 16 días de los embriones de codorniz es otra ventaja. Los primeros vasos más grandes en la CAM de codorniz aparecen en el día embrionario (DE) 7. Esto se puede comparar directamente con el desarrollo del embrión de pollo (etapas 4-35); Sin embargo, las etapas posteriores de desarrollo ya no son comparables y requieren menos tiempo para el embrión de codorniz3. De interés es la ocurrencia regular de ramificación microvascular similar a la de las CAM de pollo 4,5,6. La rápida maduración sexual, la alta producción de huevos y la reproducción de bajo costo son otros ejemplos que favorecen el uso de este modelo experimental7.
Un modelo CAM aviar se utiliza a menudo en estudios de terapia fotodinámica (TFD)8. La TFD se utiliza para tratar varias formas de cáncer (tumores pequeños localizados) y otras enfermedades no oncológicas. Su principio está en la administración de un fármaco fluorescente, un fotosensibilizador (PS), al tejido dañado y su activación con luz de la longitud de onda adecuada. Una PS prospectiva utilizada en la investigación es la hipericina, originalmente aislada de la planta medicinal hierba de San Juan (Hypericum perforatum)9. Los fuertes efectos fotosensibilizantes de este compuesto se basan en sus propiedades fotoquímicas y fotofísicas. Estos se caracterizan por múltiples picos de excitación de fluorescencia en el rango de 400-600 nm, que inducen la emisión de fluorescencia a aproximadamente 600 nm. Los máximos de absorción de hipericina dentro de la banda espectral están en el rango de 540-590 nm, y los máximos de fluorescencia están en el rango de 590-640 nm9. Para lograr estos efectos fotosensibilizantes, la hipericina es excitada por la luz láser a una longitud de onda de 405 nm después de la administración local10. En presencia de luz, la hipericina puede exhibir efectos virucidas, antiproliferativos y citotóxicos11, mientras que no hay toxicidad sistémica y es liberada rápidamente del organismo. La hipericina es una sustancia lipofílica que forma agregados no fluorescentes insolubles en agua, por lo que se utilizan varios tipos de nanoportadores, como las nanopartículas poliméricas 12,13 o las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL, LDL)14,15, para ayudar a su entrega y penetración en las células. Dado que CAM es un sistema naturalmente inmunodeficiente, las células tumorales se pueden implantar directamente en la superficie de la membrana. El modelo también es adecuado para registrar la extensión del daño vascular inducido por TFD de acuerdo con una puntuación definida16,17. La luz de menor intensidad en comparación con la TFD se puede utilizar para el diagnóstico fotodinámico (PDD). El monitoreo del tejido bajo la luz LED de excitación violeta también conduce a la fotoactivación de fotosensibilizadores18,19,20 que resulta en una emisión de luz fluorescente, pero no proporciona suficiente energía para iniciar una reacción PDT y dañar las células. Lo convierte en una buena herramienta para la visualización y diagnóstico de tumores o para el monitoreo de la farmacocinética de las PSs utilizadas14,15.
Este artículo describe la preparación del ensayo de codorniz ex ovo CAM con tasas de supervivencia superiores al 80%. Este cultivo ex ovo se aplicó con éxito en un gran número de experimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los equipos y reactivos deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados con etanol al 70% o luz UV.
1. Incubación de huevos
- Almacene los huevos de codorniz fertilizados a 10-15 °C durante un máximo de 4-5 días antes de comenzar la incubación. Use solo huevos limpios y sin daños.
- Incubar los huevos en una incubadora de tiro forzado durante ~ 53-54 h. Ponga los huevos horizontalmente con la rotación de huevos desactivada, al 50% -60% de humedad y a 37,5 °C de temperatura de incubación.
2. Preparación ex ovo del cultivo
NOTA: Después de la incubación inicial, los huevos son adecuados para comenzar el cultivo ex ovo .
- Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70%, sin rotar el huevo.
- En un gabinete estéril de flujo laminar, abra la cáscara del huevo con pequeñas tijeras quirúrgicas estériles y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos. Si se hace correctamente, el embrión se colocará sobre una yema intacta. Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%.
- Agregue aproximadamente 5 ml de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que el CAM se seque.
- Coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos, manteniendo una temperatura de 37 ° C y 80% -90% de humedad.
- Cuando el CAM esté completamente desarrollado (a partir de ED7), coloque un anillo de silicona esterilizado (6 mm de diámetro y aproximadamente 1,5 mm de espesor) en la superficie del CAM, a lo largo de los pequeños capilares. Evite los vasos sanguíneos principales al colocar el anillo.
NOTA: El anillo define el espacio de trabajo, ayuda a marcar el lugar de aplicación de la sustancia y evita que el contenido líquido se escape. - Terminar el cultivo de los embriones de acuerdo con la legislación del país.
- Es importante destacar que use guantes o mantenga las manos desinfectadas con etanol al 70% durante el trabajo. Aspire embriones con punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío.
Figura 1: Preparación del cultivo ex ovo . (A) Huevos de codorniz japonesa tal como se almacenan e incuban. (B) Desinfección de la superficie del huevo con etanol. (C) La cáscara de huevo se corta con tijeras. (D) El contenido del huevo se vacía en el pozo. (E) Embrión de 3 días debidamente preparado, con vasculatura CAM en desarrollo. (F) Placas de cultivo almacenadas en una incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Placa de cultivo de 6 pocillos con embriones y anillos de silicona colocados en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Inoculación de células tumorales
NOTA: Todos los procedimientos requieren el uso de un gabinete de flujo laminar estéril.
- Cultivar diferentes tipos de células adherentes en matraces de acuerdo con los respectivos protocolos de cultivo.
- Retire el medio viejo de los matraces y enjuague la capa celular con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los restos del medio.
- Después de la tripsinización, inhiba la tripsina agregando el medio de cultivo y cosecha las células en tubos de centrífuga. Centrifugar las células y resuspender el pellet celular en un medio de cultivo fresco. Contar las células y resuspenderlas en un medio de cultivo celular a la concentración deseada.
NOTA: También es posible producir cultivos celulares 3D, es decir, esferoides utilizando, por ejemplo, el método de gota colgante21.
- Implante 1 x 10 5-1 x 106 células tumorales o5-15 esferoides (por CAM) en 30 μL de solución de medio celular en el anillo de silicona en la parte superior de la CAM.
NOTA: El volumen depende del tamaño del anillo de silicona utilizado. Si se utiliza un anillo de silicona con un diámetro mayor, se necesita un volumen mayor para cubrir toda el área. Dependiendo del tipo de célula, o para diferentes tipos de experimentos, se pueden utilizar varias concentraciones celulares. A veces, el raspado fino de CAM se utiliza para mejorar la adhesión de las células incrustadas. - Devolver las CAM con células inoculadas a la incubadora (37 °C y 80%-90% de humedad).
Figura 3: Inoculación de CAM con tumores . (A) Aspiración de esferoides con una pipeta, y (B) implantación en la superficie de CAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Aplicación del fotosensibilizador
- Aplicación de hipericina
- Con poca luz, prepare una solución madre de hipericina de 2 mM disolviéndola en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100%. Prepare una solución de trabajo de 79 μM de hipericina poco antes del experimento con PBS estéril o solución salina. Asegúrese de que la concentración final de DMSO en todas las soluciones sea siempre inferior al 0,2%, lo que no afecta el desarrollo del embrión.
- En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina al anillo de silicona. Un volumen de 30 μL es suficiente para llenar un anillo con un diámetro de 6 mm.
- Mantener los embriones en una incubadora a 37 °C y 80%-90% de humedad. La hipericina en una solución acuosa es fotoactiva después de su monomerización en el tejido, aproximadamente 3 h después de su aplicación en el CAM.
- Aplicación de hipericina con LDL, HDL o nanopartículas como sistemas de transporte
NOTA: Estos sistemas de transporte se utilizan para mejorar la penetración de la hipericina en las células y estructuras celulares.- Debido a la fotosensibilidad, realice todos los pasos, incluida la preparación de soluciones, con poca luz y almacene las soluciones en la oscuridad.
- Preparar las formulaciones de hipericina-LDL e hipericina-HDL mezclando volúmenes apropiados de lipoproteínas y soluciones madre de hipericina en PBS de acuerdo con la referencia15. La concentración de LDL o HDL a hipericina es 20:115.
- Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerización de apertura de anillo catiónico vivo según las referencias12,13. Ajustar la concentración de hipericina en nanopartículas poliméricas con PBS a 10 μM12,13.
5. PDD y PDT
- Realizar PDD
- En condiciones estériles, aplique fotosensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas cargadas de hipericina o hipericina con portador de lipoproteínas) en la superficie CAM, con o sin células tumorales (ED 7-9).
- Ilumine el CAM usando luz de excitación violeta (luz LED circular hecha a medida de longitud de onda de 405 nm) y registre la fluorescencia de hipericina en el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital a intervalos de tiempo de 0, 1, 3, 5, 24 y 48 h después de la administración de hipericina.
- Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento, poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz afecta la fotoactivación de la hipericina.
- Evalúe la intensidad de fluorescencia utilizando un programa de procesamiento y análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ22).
- Divida los canales de imagen RGB en imágenes rojas, verdes y azules separadas. Analice la imagen de intensidad roja en forma de 8 bits. Evalúe la intensidad roja del área dentro del anillo y aproxime a ella como la fluorescencia de hipericina. Obtenga gráficos de perfil de imagen completa (utilizando el complemento Profile Plot de ImageJ) en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina (es decir, desde 0 h, justo después de la administración, hasta 48 h).
- Realizar PDT
- Realizar la TFD al menos 3 h después de la aplicación de hipericina.
- Coloque la fibra óptica sobre la superficie del CAM para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona.
- Realizar irradiación in vivo (1-2 min) con una luz láser de 405 nm a una velocidad de fluencia de 285 mW/cm2.
- Grabar CAM con luz blanca y luz fluorescente de 405 nm antes y después del tratamiento fotodinámico (24 h y 48 h).
- Detecte fotodaños 24 h y 48 h después de la TFD a partir de las imágenes tomadas con luz blanca. Evaluar el daño vascular por una puntuación semicuantitativa16: 1 - sin destrucción; 2 - cierre parcial de los capilares (diámetro ≤10 μm) sin destrucción de vasos medianos o grandes (diámetro ≥50 μm) y más pequeños (diámetro 10-50 μm); 3 - cierre parcial de vasos más pequeños con capilares que desaparecen; 4 - cierre parcial de vasos más grandes con vasos más pequeños y capilares que desaparecen; y 5 - fototrombosis total con la mayoría de los vasos desapareciendo.
Figura 4: Tratamiento de CAM con luz láser. Esta foto fue tomada con fines ilustrativos. Para PDD o PDT, la habitación debe estar oscura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Preparación de CAM para una evaluación adicional
- Incrustación de parafina
- Fijar el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante un mínimo de 2 h y un máximo de durante la noche.
- Retire el PFA y corte cuidadosamente de la CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona.
- Deshidratar inmediatamente el tejido CAM en series ascendentes de alcohol de la siguiente manera. Coloque el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 min, solución de eosina durante 2 min (para facilitar la ubicación del tejido en el bloque de parafina), etanol al 96% durante 3 x 5 min (siempre en una nueva placa de Petri) y etanol al 100% durante 5 min y xileno durante 2 x 10 min.
- Con una espátula o un cepillo fino, transferir las muestras lo más rápidamente posible a la parafina disuelta en placas de Petri (59 °C). Después de 24 h, coloque el tejido en molde histológico, llénelo con un medio de inserción de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador. Corte la CAM solidificada del medio de incrustación, gírela en la bandeja 90°, llénela nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique.
- Preparar secciones de 5-10 μm en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.
- Preparación de secciones CAM congeladas para histología
NOTA: Para algunas metodologías, incluida la histología, las secciones congeladas preparadas en el microtomo criostato son más adecuadas. Siga los pasos a continuación para preparar las secciones CAM congeladas.- Monte cuidadosamente CAM nativa o fijada con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio.
- Llene el molde de incrustación a la mitad con un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) y congele en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol.
- Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrir con medio OCT y congelar como en el paso 6.2.2.
- Análisis fractal de codornices CAM
NOTA: Los cambios en la vasculatura causados por la TFD pueden evaluarse calculando el coeficiente de dimensión fractal19.- En la cabina de flujo laminar, desbordar CAM en una placa de cultivo con una solución de fijación precalentada (37 °C) de paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS.
- Retirar la solución de fijación después de 48 h. Separe cuidadosamente la CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávela en PBS.
- Monte la CAM lavada en un portaobjetos de vidrio y déjela secar lentamente.
- Fotografíe la diapositiva utilizando una cámara digital y un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea.
- Procesar imágenes digitales con el software ImageJ22. Para el análisis, seleccione una región cuadrada (512 × 512 píxeles) del área con ramas arteriales distales. Binariza y esqueletizar las imágenes y calcular el coeficiente de dimensión fractal (Df) siguiendo los procedimientos descritos en la referencia31.
- Análisis molecular del tejido CAM
- Para el análisis molecular, separe cuidadosamente la CAM nativa, congele en nitrógeno líquido y guárdela a -80 °C.
- Determinar la expresión génica de acuerdo con los protocolos estándar para el aislamiento de ARN23, la transcripción inversa en ADNc y la PCR cuantitativa24.
Figura 5: Tejido CAM para análisis fractal. Después de PDT, CAM se fija, se monta en un portaobjetos y se seca para el análisis fractal. La foto fue tomada con luz blanca usando un transiluminador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La localización del tumor en la superficie CAM es difícil con luz blanca. Se espera que el fotosensibilizador (aquí, hipericina) utilizado en el PDD sea absorbido selectivamente por el tumor y ayude a visualizar el tumor. La adición de hipericina y el uso de luz fluorescente (p. ej., 405 nm) mostraron muy bien la posición del tumor (carcinoma de células escamosas TE1) (Figura 6A). El análisis histológico mostró células tumorales vitales invadiendo tejidos sanos. Las estructuras concéntricas de células escamosas anormales, a menudo descritas en el tejido del carcinoma de células escamosas (perlas de queratina), fueron visibles (Figura 6B). El crecimiento del tumor se acompañó de edema y engrosamiento de la membrana.
Figura 6: Tumor TE1 de carcinoma de células escamosas que crece en la superficie de CAM . (A) La imagen fue tomada usando luz blanca (izquierda) y luz LED de 405 nm (derecha) con la adición de hipericina. La extensión del crecimiento tumoral se visualiza y define mejor. (B) Sección transversal del tumor que crece en la superficie de CAM, con metástasis (M, perlas de queratina) en el tejido CAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un fotosensibilizador y una exposición más prolongada del tejido con luz enfocada de alta intensidad se utilizan en la TFD. Dicho tratamiento afecta la vasculatura CAM, causando trombosis, cierre de vasos más grandes y desaparición de vasos y capilares más pequeños (Figura 7). El área donde se aplicó el tratamiento (dentro del anillo de silicona) se vio afectada, y hubo una clara diferencia en la densidad del vaso dentro del anillo y en el área circundante.
Figura 7: Ejemplo de cambios en la vasculatura CAM 24 h después de la TFD. El tratamiento con láser causó la desaparición de la mayoría de los capilares, comparando la densidad del vaso dentro y fuera del área de tratamiento en el anillo de silicona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La luz láser utilizada en TFD sin la presencia de fotosensibilizador no causó ningún daño (Figura 8, línea media, "irradiación solamente"), comparable al control sin ningún tratamiento (Figura 8, línea superior, "control"). La línea inferior de las imágenes muestra cambios en la fluorescencia de hipericina en el tiempo, causados por la monomerización de la hipericinaagregada 10. La TFD se aplicó después de 3 h de incubación con hipericina y 2 h más tarde ya había cambios visibles. La imagen de luz blanca tomada 24 h después del tratamiento muestra un daño extenso en la vasculatura.
Figura 8: Cambios en la intensidad de fluorescencia y densidad de vasculatura CAM después de la administración de hipericina y la irradiación láser (TFD). Las imágenes se tomaron a las 0, 1, 3, 5 y 24 h utilizando luz de 405 nm y luz blanca. La línea superior de imágenes corresponde al control sin tratamiento. La línea media de las imágenes corresponde únicamente a la irradiación láser (es decir, sin hipericina); La irradiación láser (2 min, 405 nm de luz láser, tasa de fluencia 285 mW / cm2) se aplicó 3 h después de la administración de hipericina. La línea inferior de las imágenes corresponde al tratamiento con hipericina e irradiación láser (TFD); La irradiación láser se aplicó después de 3 h de incubación con hipericina. Las imágenes muestran claramente el daño a la vasculatura CAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La TFD afectó negativamente la estructura tisular de la CAM. El análisis histológico (Figura 9) reveló que la CAM control no tratada tenía un espesor relativamente uniforme; sin embargo, el tratamiento con TFD hizo que la CAM se volviera más delgada y frágil.
Figura 9: Análisis histológico de los tejidos de control y CAM tratados con TFD . (A) Sección transversal de MCA de control no tratada. El grosor de CAM es relativamente uniforme. (B) Sección transversal de CAM después del tratamiento con TFD. En comparación con el control, el CAM es más delgado y frágil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del desarrollo, el CAM se vuelve más delgado y se adhiere a la cáscara del huevo, lo que lleva a rupturas de la membrana.
A partir del día 7 de incubación, los embriones son menos sensibles a la agitación; la zona CAM cubre casi toda la superficie del pozo y está lista para nuevos experimentos. Aunque los embriones muertos pueden representar un riesgo de infección, con los métodos de trabajo adecuados en al menos condiciones semiestériles, no afectan a los otros embriones vivos en la placa de 6 pocillos. La tasa de supervivencia del embrión ex ovo de codorniz en los experimentos actuales fue de alrededor del 80%, que es comparativamente mejor que en los experimentos ex ovo de pollo25,26,27.
En los experimentos actuales, se utilizó un anillo de silicona para delimitar el espacio de trabajo. Hasta ahora, no hay evidencia disponible de que los anillos por sí solos tengan algún efecto sobre el desarrollo, crecimiento o angiogénesis del tejido CAM28. Kohli et al. probaron el uso de biomateriales de diferentes estructuras y composiciones en un modelo CAM de pollo, y se observaron vasos sanguíneos en todos los andamios probados, excepto en la silicona, donde no se observaron vasos sanguíneos para infiltrarse29. Solo el manejo descuidado del anillo puede causar sangrado de la CAM y disminuir la supervivencia de los embriones.
Debido a sus propiedades, este modelo CAM representa una alternativa viable y económicamente ventajosa a los animales de laboratorio, como ratones, ratas o conejos, especialmente para observar el cambio de vasculatura durante PDT30. También es adecuado para monitorizar cambios en la expresión génica y cambios tisulares a nivel histológico24. Este modelo naturalmente inmunodeficiente tiene una red vascular rica y fácilmente visible que permite la visualización en tiempo real de los ensayos13,31.
La cáscara de huevo de codorniz es fácil de abrir, y el cultivo ex ovo es simple y requiere menos espacio para el almacenamiento30. El desarrollo de un embrión de codorniz es corto y permite una alta rotación de experimentos. Este rápido desarrollo puede, sin embargo, ser una desventaja en experimentos que requieren más tiempo (por ejemplo, para el desarrollo y crecimiento del tumor), ya que la ventana experimental es de un máximo de 7 días. Entre otras desventajas de usar codornices está la constitución más delicada del embrión y su sensibilidad a la contaminación. El pequeño tamaño de la codorniz CAM restringe la aplicación de varias sustancias experimentales10.
Las imágenes de luz blanca pueden mostrar tumores más grandes y bien definidos bastante bien, pero las imágenes de fluorescencia son una herramienta muy atractiva para la detección de enfermedades, especialmente para tumores muy pequeños o grupos de células tumorales32, posiblemente para visualizar los bordes de la lesión. Se observa una mayor acumulación de fotosensibilizadores en la región tumoral, por lo que el diagnóstico fotodinámico es muy útil en la localización temprana o durante la extirpación quirúrgica. También se utilizan filtros ópticos para obtener la imagen correctamente32; En el presente caso, sin embargo, las fotos fueron tomadas sin filtros especiales. El uso de este tipo de imágenes (sin sistema de bloqueo) es, por ejemplo, en endoscopia y PDD de tumores de vejiga urinaria y gliomas, por lo que tiene una aplicación clínica adecuada.
A pesar de algunas desventajas, el ensayo CAM de codorniz japonesa es una gran herramienta para nuevas pruebas de fármacos y el desarrollo de nuevas técnicas biofotónicas, así como el diagnóstico y la terapia fotodinámica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por VEGA 2/0042/21 y APVV 20-0129. La contribución de V. Huntošová es el resultado de la implementación del proyecto: Comunidad científica abierta para la investigación interdisciplinaria moderna en medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoyado por el Programa Operativo Infraestructura Integrada, financiado por el FEDER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R.
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al.
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
