Summary
뇌하수체는 신체의 내분비 시스템의 핵심 조절자입니다. 이 기사는 생물학과 기능이 제대로 이해되지 않은 땀샘의 줄기 세포 집단을 연구하기 위해 새로운 3D 시험관 내 모델로서 마우스 뇌하수체에서 오가노이드의 발달을 설명합니다.
Abstract
뇌하수체는 신체 성장, 신진 대사, 성적 성숙, 생식 및 스트레스 반응을 포함한 주요 생리 과정을 조절하는 마스터 내분비선입니다. 십여 년 전, 뇌하수체에서 줄기 세포가 확인되었습니다. 그러나, 생체내 트랜스제닉 접근법의 적용에도 불구하고, 이들의 표현형, 생물학 및 역할은 불분명하다. 이러한 수수께끼를 해결하기 위해 뇌하수체 줄기 세포 생물학을 깊이 풀기 위해 새롭고 혁신적인 오가노이드 시험관 내 모델이 개발되었습니다. 오가노이드는 정의된 배양 조건 하에서 조직(상피) 줄기 세포로부터 자가발전하고 그 줄기 세포와 그 조직의 여러 특징을 재검토하는 3D 세포 구조를 나타낸다. 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드가 땀샘의 줄기 세포로부터 발달하고 생체 내 표현형 및 기능적 특성을 충실하게 재구성한다는 것이 여기에서 보여집니다. 그 중에서도, 이들은 이식성으로 가해진 국소 손상에 반응하여 발생하는 생체내에서 줄기 세포의 활성화 상태를 재현한다. 오가노이드는 줄기 표현형을 견고하게 유지하면서 장기간 확장 가능합니다. 새로운 연구 모델은 신생아 성숙에서 노화와 관련된 퇴색, 건강에서 병든 땀샘에 이르기까지 뇌하수체 리모델링의 주요 조건 동안 줄기 세포의 표현형과 행동을 해독하는 데 매우 중요합니다. 여기에서, 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드를 확립하기 위한 상세한 프로토콜이 제시되며, 이는 뇌하수체 줄기 세포의 수수께끼 같은 세계로 뛰어들 수 있는 강력한 도구를 제공한다.
Introduction
뇌하수체는 시상 하부와 연결된 뇌 기저부에 위치한 작은 내분비선입니다. 땀샘은 말초 및 중추(시상 하부) 입력을 통합하여 조정되고 조정된 호르몬 방출을 생성함으로써 적절한 시간에 적절한 호르몬을 생산하기 위한 하류 표적 내분비 기관(예: 부신 땀샘 및 생식선)을 조절합니다. 뇌하수체는 내분비 시스템의 핵심 조절자이므로 당연히 마스터 글 랜드1이라고 불립니다.
마우스 뇌하수체는 세 개의 엽(도 1), 즉 전엽(AL), 중간엽(IL), 및 후엽(PL)으로 구성된다. 주요 내분비 AL은 성장 호르몬 (GH)을 생산하는 somatotropes를 포함하여 다섯 가지 호르몬 세포 유형을 포함; 프로락틴(PRL)을 생성하는 락토트로프; 부신피질자극호르몬(ACTH)을 분비하는 피질염 호르몬; 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산을 담당하는 갑상선 로프; 황체 형성 호르몬 (LH)과 여포 자극 호르몬 (FSH)을 만드는 생식선 로프. PL은 호르몬 옥시토신과 바소프레신 (항 이뇨 호르몬)이 저장되는 시상 하부의 축삭 돌기로 구성됩니다. IL은 AL과 PL 사이에 위치하고 있으며 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH)을 생산하는 멜라노로프를 수용합니다. 인간 뇌하수체에서, IL은 발달 중에 퇴행하고, 멜라노트로프는AL1 내에 퍼진다. 내분비 세포 이외에, 뇌하수체는 또한 줄기 세포의 풀을 포함하고, 본질적으로 전사 인자 SOX2 2,3,4,5,6에 의해 표시된다. 이들 SOX2+ 세포는 구순구개열의 상피 내벽(AL과 IL 사이의 배아 잔여 내강)인 한계 구역(MZ)에 위치하거나, AL의 실질에 걸쳐 클러스터로서 확산되어, 샘 내에 2개의 줄기 세포 틈새를 제안한다(도 1)2,3,4,5,6.
뇌하수체의 필수 불가결 한 특성을 감안할 때, 땀샘의 오작동은 심각한 이환과 관련이 있습니다. 과뇌하수체증(하나 이상의 호르몬의 과다 분비를 특징으로 함) 및 뇌하수체 기능 저하증(하나 이상의 호르몬의 결함 또는 누락된 생산)은 뇌하수체 신경내분비 종양(PitNETs; 예를 들어, 쿠싱병으로 이어지는 ACTH 생성 종양) 또는 유전적 결함(예를 들어, 왜소증을 초래하는 GH 결핍)7에 의해 야기될 수 있다. 또한, 뇌하수체 수술 (예를 들어, 종양을 제거하기 위해), 감염 (예를 들어, 시상 하부 - 뇌하수체 결핵, 또는 세균성 수막염 또는 뇌염에 따른 감염), Sheehan 증후군 (출생시 심한 혈액 손실로 인한 불충분 한 혈류로 인한 괴사), 뇌하수체 졸중 및 외상성 뇌 손상은 뇌하수체 기능 저하의 다른 중요한 원인입니다8 . 마우스 뇌하수체는 재생 능력을 가지고 있으며, 내분비 세포 9,10의 트랜스제닉 절제에 의해 도입 된 국소 손상을 복구 할 수 있음이 밝혀졌습니다. SOX2+ 줄기 세포는 활성화된 표현형을 나타내는 가해진 손상에 급격하게 반응하며, 이는 향상된 증식(줄기 세포 확장의 결과)과 줄기 관련 인자 및 경로(예: WNT/NOTCH)의 발현 증가로 특징지어집니다. 더욱이, 줄기 세포는 절제 호르몬을 발현하기 시작하여, 최종적으로 9,10개월 후(5 내지 6)개월에 걸쳐 고갈된 세포 집단의 실질적인 회복을 초래한다. 또한, 땀샘의 신생아 성숙 단계 (출생 후 처음 3 주) 동안, 뇌하수체 줄기 세포는활성화 된 상태에서 번성하는 반면, 유기체 노화는 노화 (또는 '화염')시 염증 (미세) 환경 증가로 인해 계내 줄기 세포 기능 저하와 관련이 있습니다 (또는 '화염')10,14 . 또한, 선에서의 종양발생은 또한 줄기 세포 활성화 7,15와 관련된다. 줄기 세포 활성화가 뇌하수체 리모델링의 여러 상황에서 발견되었지만 (7,16에서 검토), 근본적인 메커니즘은 불분명하다. 생체 내 접근법 (예 : 트랜스제닉 마우스의 계보 추적)은 뇌하수체 줄기 세포의 명확하거나 포괄적 인 그림을 전달하지 못했기 때문에 정상 및 병든 뇌하수체에서 줄기 세포 생물학을 탐구하기위한 신뢰할 수있는 시험관 내 모델의 개발이 필수적입니다. 원발성 뇌하수체 줄기 세포의 표준 시험관내 배양은 표현형의 급속한 손실을 갖는 매우 제한된 성장 능력 및 비생리학적 (2D) 조건 때문에 부적절하게 남아있다(보다 상세한 개요를 위해,16 참조). 3D 구체 배양물(pituispheres)은 측면 집단 및 SOX2+ 표현형 2,3,4에 의해 확인된 바와 같이 뇌하수체 줄기 세포로부터 확립되었다. 뇌하수구는 줄기 세포로부터 clonally 성장하고, 줄기 마커를 발현하고, 내분비 세포 유형으로의 분화 능력을 나타낸다. 그러나, 그것들은 제한된 통과 가능성 (2-3 구절)만을 보여주면서 상당히 확장되지 않습니다 3,4. 구형 구조체는 또한 50% 희석된 마트리겔에서 1주일 동안 배양하였을 때 해리되지 않은 뇌하수체 줄기세포 클러스터로부터 수득되었으나 확장성은 나타나지 않았다(도 17). 뇌하수구 접근법은 주로 줄기 세포 번호에 대한 판독 도구로 사용되지만, 추가 적용은 열등한 확장 용량(16)에 의해 제한된다.
이러한 단점을 해결하고 극복하기 위해, MZ 및 실질 줄기 세포를 함유하는 마우스의 주요 내분비 AL로부터 시작하는 새로운 3D 모델, 즉 오가노이드가 최근에 확립되었다. 오가노이드는 실제로 뇌하수체의 줄기 세포에서 유래하고 그들의 표현형18을 충실하게 재구성하는 것으로 나타났습니다. 또한, 오가노이드는 장기간 확장 가능하며 줄기 성질을 견고하게 유지합니다. 따라서, 그들은 심오한 탐구를 위해 일차 뇌하수체 줄기 세포를 확장하는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 탐색은 뇌하수체로부터 분리될 수 있는 제한된 수의 줄기 세포로는 달성될 수 없으며, 이는 또한 2D 조건(16)에서 팽창가능하지 않다. 오가노이드는 새로운 뇌하수체 줄기 세포 특징 (생체 내에서 번역 가능)을 밝히는 데 유용하고 신뢰할 수있는 도구임을 보여주었습니다 (생체 내에서 번역 가능)14,18. 중요하게도, 오가노이드 모델은 국소 조직 손상 및 신생아 성숙 동안 발생하는 것으로서 뇌하수체 줄기 세포 활성화 상태를 충실하게 반영하여, 향상된 형성 효율을 나타내고 상향조절된 분자 경로를 복제한다(14,18). 따라서 뇌하수체 유래 오가노이드 모델은 혁신적이고 강력한 뇌하수체 줄기 세포 생물학 연구 모델이자 줄기 세포 활성화 판독 도구입니다.
이 프로토콜은 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드의 확립을 상세히 기술한다. 이러한 목적을 위해, AL은 단리되고 단일 세포로 해리되며, 이는 세포외 매트릭스-모방 매트릭스(이하 ECM으로 지칭됨)에 매립된다. 세포-ECM 어셈블리는 이어서 줄기 세포 성장 인자 및 뇌하수체 배아 조절제를 본질적으로 함유하는 정의된 배지에서 배양된다 (추가로 '뇌하수체 오가노이드 배지'(PitOM)로 지칭됨)18; 표 1). 일단 오가노이드가 완전히 발달되면(10-14일 후), 이들은 순차적 계대통과 골짜기를 더욱 확장시킬 수 있고 광범위한 하류 탐사를 거칠 수 있다(예를 들어, 면역형광, RT-qPCR, 및 벌크 또는 단일 세포 전사체; 그림 1). 장기적으로 뇌하수체 줄기 세포 오가노이드가 조직 복구 접근법과 재생 의학의 길을 열어 줄 것으로 예상됩니다.
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Protocol
본 연구를 위한 동물실험은 KU 루벤 동물실험윤리위원회(P153/2018)의 승인을 받았다. 모든 마우스는 표준화 된 조건 (23 ± 1.5 °C의 항온, 상대 습도 40 % -60 % 및 12 시간의 주야간 사이클)하에 대학의 동물 시설에 수용되어 물과 음식 광고 리비툼에 접근 할 수있었습니다.
1. 생쥐
- 젊은 성인 연령 (8-12 주령)의 C57BL/6J 마우스와 같은 시판 마우스 균주를 사용하십시오. 일반적으로, 2-3마리의 마우스는 프로토콜에 대해 충분한 수의 AL 세포를 제공한다.
2. 마우스 AL의 분리 및 해리
참고: 배지 A, B 및 C는 미리19,20으로 준비됩니다. 조성물은 표 2에 나타내었다.
- 마우스 AL의 분리
- CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시키고, 이어서 감금시켰다(도 2A). 생쥐 머리를 탈이온수로 세척하여 혈액을 제거하고 70% EtOH로 분무하여 멸균 환경을 생성합니다.
- 멸균 수술 도구를 사용하여 귀 사이의 머리 피부를 제거합니다(그림 2B).
- 두개골을 열고 뇌를 제거하십시오.
- '코 다리'(즉, 전두엽 뼈의 전방 부분)를 부수십시오. 그림 2B) 멸균 가위로.
- 부러진 코 다리에서 시작하여 양쪽의 귀쪽으로 가위로 두개골을 더 엽니다(그림 2C).
- 뇌하수체를 만지지 않고 멸균 핀셋으로 두개골과 뇌를 제거하십시오 (그림 2D).
- 뇌하수체를 손상시키지 않고 무딘 핀셋으로 횡격막 셀레 를 제거하십시오. PL과 IL을 입체현미경으로 AL로부터 폐기한다.
참고: PL과 IL은 연결되어 있으므로 동시에 제거됩니다. 이 부분은 분홍색 AL과 비교하여 흰색 조직으로 나타납니다 (그림 2D). - 둔한 핀셋으로 AL을 조심스럽게 분리하고, 배지 A 3mL로 채워진 10mL 삼각플라스크에 수집한다( 표 2 참조). 추가 처리가 이루어질 때까지 플라스크를 얼음 위에 놓습니다.
- 마우스 AL의 해리
- 단리된 AL을 함유하는 삼각 플라스크로부터 상층액(SN) 배지 A를 제거하였다. 예열된(37°C) 2.5% 트립신 용액 2 mL를 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 트립신 용액을 제거하지 않고, 예열된(37°C) DNase 용액 2mL(배지 A에 2μg/mL; 0.22μm 메쉬를 통해 멸균 여과)를 첨가하고, 삼각 플라스크를 10회 소용돌이친다. 뇌하수체가 바닥에 가라 앉게하고 (~ 1 분) SN을 제거하십시오.
- 예열된(37°C) 트립신 억제제 용액 2mL(배지 A에 0.1mg/mL; 0.22μm 메쉬를 통해 멸균 여과)를 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. 뇌하수체 퇴적물을 바닥에 놓고 SN을 제거하십시오.
- 2 mL의 예열된(37°C) 배지 B( 표 2 참조)를 첨가하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. SN을 제거하지 않고, 2 mL의 예열된(37°C) 배지 C( 표 2 참조)를 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 뇌하수체가 바닥에 가라 앉게하고 SN을 제거하십시오. 뇌하수체를 예열된(37°C) 배지 C로 세 번 헹구십시오.
- 뇌하수체를 단일 세포로 해리시킵니다.
- 2 mL의 예열 (37 °C) 배지 C. Aspirate를 첨가하고 파편이 더 이상 보이지 않을 때까지 멸균되고 화염으로 연마 된 파스퇴르 피펫으로 뇌하수체를 여러 번 배출하십시오.
- 현탁액을 4.5 mL의 예열된(37°C) DNase 용액(배지 A에 2 μg/mL; 0.22 μm 메쉬를 통해 멸균 여과)이 있는 15 mL 튜브로 옮긴다. 삼각을 2 mL의 예열된(37°C) 배지 C로 세 번 헹구고 현탁액을 15 mL 튜브로 옮긴다.
- 수집된 세포 현탁액을 혼합하고, 이를 40 μm 세포 스트레이너를 통해 30 mL 튜브 내로 여과한다. 15 mL 튜브를 헹구고 세포 스트레이너를 2 mL의 배지 C로 세 번 헹구고 현탁액을 30 mL 튜브로 옮깁니다.
- 유리 파스퇴르 피펫의 팁을 2 mL의 3% 소 혈청 알부민(BSA) 용액(배지 A; 0.22 μm 메쉬를 통해 멸균 여과)으로 채운 후, 튜브의 바닥에 부드럽게 피펫 밖으로 내보내어 가시밀도층을 형성하였다. 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리한다.
- 한 번의 유창한 움직임으로 튜브를 반전시켜 SN을 제거하고 P1000 팁으로 나머지 SN 방울을 제거하십시오. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F12(Adv DMEM/F12) 1mL에 재현탁하고 세포 계수기로 세포를 정량화합니다.
3. AL 유래 오가노이드의 확립 및 배양
참고 : ECM을 얼음 위에서 미리 해동시키고 (1 mL의 경우 2-3 시간) 프로토콜 기간 동안 얼음 위에 보관하십시오.
- 오가노이드 시딩 및 배양
- AL 세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리하고 SN을 제거하였다. 1.1 x 10 6 cells/mL의 세포 밀도에 도달하도록 계산된 특정 부피를 사용하여 Adv DMEM/F12에서 세포 펠릿을 재현탁하십시오.
참고: 예를 들어, 세포 현탁액에 500,000 cells/mL가 포함되어 있는 경우, 원하는 밀도인 1.1 x 106 cells/mL에 도달하려면 Adv DMEM/F12의 454.54 μL에 세포 펠릿을 재현탁해야 합니다. - 도금에 필요한 셀 현탁액의 부피를 꺼내고 (오가노이드 개발을 위해 시드 할 웰의 원하는 수에 따라) 30:70 비율 (30 % 세포 현탁액 (Adv DMEM / F12) 및 70 % ECM)으로 ECM을 추가하십시오. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오.
참고: 예를 들어, 30μL의 한 방울(단계 3.1.3 참조)의 경우, 9μL의 세포 현탁액(1.1 x 106 세포/mL 현탁액에서 채취할 때 ~10,000개의 세포 포함)을 21μL의 ECM과 (부드럽게) 혼합해야 합니다. - 웰 당, 30 μL 방울의 세포 현탁액/ECM 혼합물(단계 3.1.2 참조)을 미리 가온된(37°C) 48-웰 플레이트 상에 증착한다. 플레이트를 거꾸로 돌리고 ECM을 37°C에서 20분 동안 응고시키십시오.
주: 배양 플레이트를 37°C에서 적어도 24시간 동안 예열한다. - 플레이트를 적절한 배향으로 되돌리고 10 μM 락 억제제 (Y-27632)로 보충 된 250 μL의 예열 된 (37 °C) PitOM (표 1 참조)을 조심스럽게 첨가하십시오.
- 오가노이드가 완전히 성장할 때까지 2-3일마다 배지(Y-27632 없음)를 변경하여 오가노이드를 계속 배양하고, 이는 10-14일이 소요된다(그림 3A). 그런 다음 오가노이드를 통과하십시오.
참고 : 배지를 흡인 할 때 ECM 돔을 방해하지 않도록하십시오. 배양 플레이트를 약간 기울이고 웰의 바닥 테두리에서 배지를 제거하였다. 신선한(37°C에서 예열된) 배지는 웰의 측면에 부드럽게 첨가되어야 한다. 겔 액적이 탈부착되면, 오가노이드를 수집하고 재현탁시키고 새로운 ECM 액적에서 다시 배양한다.
- AL 세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리하고 SN을 제거하였다. 1.1 x 10 6 cells/mL의 세포 밀도에 도달하도록 계산된 특정 부피를 사용하여 Adv DMEM/F12에서 세포 펠릿을 재현탁하십시오.
- 오가노이드 패시징
- 배지를 부드럽게 흡인하고 400μL의 빙냉 Adv DMEM/F12를 첨가하여 ECM을 분해하고 마이크로 원심분리 튜브에 오가노이드를 수집합니다. 400 μL의 얼음처럼 차가운 Adv DMEM/F12 EM으로 한 번 씻으십시오. 4°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
- SN을 조심스럽게 제거하고 400 μL의 예열 (37°C) 트립플 익스프레스 효소 (1X)를 첨가한다. 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 400 μL의 빙냉 Adv DMEM/F12를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다. SN을 제거합니다.
- 펠렛을 100μL의 얼음처럼 차가운 Adv DMEM/F12로 재현탁시키고, 이어서 좁아진 P200 팁으로 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 오가노이드를 분해한다(즉, 미세원심분리 튜브의 바닥에 대해 빈 팁을 아래로 밀어 넣어 개구 직경을 감소시키는) 오가노이드 단편(직경 약 50μm)이 얻어질 때까지(그림 3B).
참고 : 해리 혼합물은 주로 오가노이드 단편과 몇 개의 단일 세포 만 포함해야합니다. 단일 세포로의 오가노이드의 가혹한 해리는 오가노이드의 재성장에 부정적인 영향을 미칩니다. - 800 μL의 Adv DMEM/F12를 첨가하고, 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리한다. SN을 제거합니다.
- 오가노이드를 1:2 ~ 1:4 비율로 통과시킵니다. 도금에 필요한 경우 펠렛을 적절한 부피의 Adv DMEM/F12에 재현탁하고 ECM을 30:70 비율(30% 셀 현탁액 및 70% ECM)으로 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오.
- 종자 및 단계 3.1.3-3.1.5에서 상기 기재된 바와 같은 오가노이드를 배양한다.
참고: 평균적으로 20개의 오가노이드가 시딩된 10,000개의 전체 AL 세포(0.2%)에서 웰당 발달합니다. 이러한 통로 0 오가노이드는 1:2 비율로 분할될 수 있으며, 그 결과 웰당 >50개의 오가노이드가 발달한다(통로 1). 그런 다음 오가노이드는 후속 통과 중에 1 : 2 ~ 1 : 4 비율로 분할 될 수 있습니다. 오가노이드의 재성장은 ~ 10 계대 후 (배양 3 개월에 해당) 느려지고, 점차적으로 점점 더 작은 오가노이드로 구체화됩니다.
4. AL 유래 오가노이드의 동결보존 및 해동
- 오가노이드의 동결 보존
- 3.2.1단계부터 3.2.5단계까지 패시징 프로토콜을 따릅니다.
- 오가노이드 펠릿 (단편 및 세포 함유)을 1 mL의 동결보존 배지로 재현탁시킨다 (표 3). 서스펜션을 냉동 상태로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
참고: 48-웰 플레이트의 최대 네 웰에서 나온 오가노이드(즉, 결과적인 단편 및 세포)는 하나의 cryovial에서 결합될 수 있다. - 냉동 용기에 냉동 장치를 넣고 -80 °C로 옮깁니다.
- 24시간 후, 샘플을 냉동 박스로 옮기고 장기 보관을 위해 액체 질소(-196°C)에 보관한다.
- 냉동 보존 된 오가노이드의 해동
- 액체 질소 탱크에서 냉동 장치를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 즉시 해동 프로토콜을 진행하십시오.
- 동결보존된 오가노이드 단편 및 단일 세포로 용액을 37°C(수조)에서 해동시킨다.
참고: DMSO에 의한 세포 독성을 피하기 위해 용액을 37°C에서 2분 이상 보관하지 마십시오. - 내용물을 30% 소 태아 혈청(FBS)과 함께 얼음처럼 차가운 Adv DMEM/F12 10mL가 들어있는 15mL 튜브로 옮깁니다. 30% FBS로 1mL의 Adv DMEM/F12로 냉동 장치를 헹구십시오.
- 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리한다. 펠렛을 얼음처럼 차가운 Adv DMEM/F12 1mL로 재현탁하고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 4°C에서 10분 동안 190 x g 에서 원심분리한다. 도금에 필요한 경우 펠렛을 적절한 부피의 Adv DMEM/F12에 재현탁하고 ECM을 30:70 비율로 첨가하십시오. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오.
- 종자 및 단계 3.1.3-3.1.5에서 상기 기재된 바와 같은 오가노이드를 배양한다.
5. AL 유래 오가노이드의 검증
- RNA 분리를 위한 오가노이드의 수집 및 용해
- 상기와 같은 오가노이드를 수집하고 원심분리한다(단계 3.2.1).
- SN을 제거하고 용해 완충액 350 μL를 1% 2-메르캅토에탄올로 첨가한다. 소용돌이를 30초 동안 -80°C에서 저장하거나 즉시 RNA 단리를 진행한다.
주의: 2-메르캅토에탄올은 독성 화합물입니다. 모든 작업은 니트릴 장갑, 먼지 마스크 및 안전 안경을 착용하면서 화학 흄 후드에서 수행되어야합니다. 2-메르캅토에탄올은 눈과 피부에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다.
- 면역-조직화학/형광 염색을 위한 오가노이드의 고정 및 매립
- 상기와 같은 오가노이드를 수집하고 원심분리한다(단계 3.2.1).
- SN을 제거하고, 1 mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하고, 오비탈 진탕기(100 rpm) 상에서 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션한다.
주의: PFA는 각막에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있는 알려진 인간 발암 물질입니다. 모든 작업은 화학 흄 후드에서 수행되어야합니다. 니트릴 장갑과 안전 안경은 항상 착용해야합니다. - 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 SN을 제거하였다. PBS 1 mL를 첨가하고, 오비탈 진탕기(100 rpm) 상에서 RT에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4°C에서 3분 동안 90 x g 에서 원심분리한다. 세척 단계를 두 번 반복하십시오. 4°C에서 PBS에 보관한다.
- 조직 처리 및 탈수를 위해, SN을 제거하고, 150 μL의 2% 아가로스 겔(PBS 중)을 미리 가온된 넓어진 p200 팁(팁의 작은 조각을 절단하여 제조)을 사용하여 오가노이드 펠릿에 첨가하였다. 즉시 전체 부피를 위로 파이프하고 마이크로 원심분리 튜브의 뚜껑에서 배출하십시오.
참고 : 오가노이드를 함유 한 젤이 빠르게 응고되기 때문에 신속하게 작동하는 것이 중요합니다. - 젤을 30 분 동안 단단히 응고시키고 겔 디스크를 조직학 카세트로 옮깁니다. 티슈 프로세서에서 탈수될 때까지 50% EtOH에 담그고 보관한다.
- 파라핀 임베딩을 위해, 겔 디스크(포셉 사용)를 임베딩 몰드에 놓고 따뜻한 파라핀(60°C)으로 채운다. 주형을 파라핀이 고형화될 때까지 4°C에서 놓는다(약 45분). 이들 샘플은 4°C에서 저장되거나 즉시 절편을 실시할 수 있다.
- 5 μm 두께의 오가노이드를 함유하는 파라핀 블록을 마이크로톰하고, 샘플을 유리 슬라이드 상에서 수집한다. 각 섹션 아래에 탈이온수 한 방울을 추가하여 단면의 적절한 스트레칭을 허용하고 슬라이드를 하룻밤 사이에 37°C에서 평평한 가열판 위에 놓습니다. 절편과 함께 슬라이드를 4°C에서 저장하거나 직접 면역조직화학 또는 면역형광 염색을 계속한다.
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Representative Results
AL의 단리 및 해리 후, 수득된 단일 세포를 ECM에 시딩하고 PitOM에서 성장시킨다(도 1, 표 1). 도 3A는 시딩에서의 세포 배양 및 밀도를 표시한다(Day 0). 일부 작은 파편이 존재할 수 있지만(그림 3A, 흰색 화살촉), 통과 시 사라집니다. 시딩 후 14일 후, AL 유래 오가노이드가 완전히 발달한다(그림 3A). 오가노이드는 내강을 둘러싸고있는 상피층과 함께 낭성 형태를 나타냅니다. 이 단계에서 오가노이드는 직경 500 μm에 도달하고 통과해야합니다. 도 3B는 해리된 오가노이드 단편의 재시딩 후 지시된 시간에 계대배양 후의 AL 유래 오가노이드 배양을 보여준다.
때때로, 하나 이상의 조밀한 구조가 오가노이드 배양물에서 나타날 수 있다(도 3A, 불리하다). 통과 할 때, 조밀 한 오가노이드가 인계받는 경향이 있으며, 두 번의 통과 후에 조밀 한 구조 만 가진 문화권에서 끝납니다 (그림 3B, 불리한). 따라서 조밀 한 오가노이드를 함유 한 우물로 진행하지 않는 것이 좋습니다 (통로 0). 대안적으로, 조밀한 오가노이드는 침강에 의해 폐기될 수 있고, 이는 낭성 오가노이드를 계속 남겨둔다. 이 조밀 한 오가노이드의 기원은 현재 불분명하지만, 덜 뚜렷한 뇌하수체 성질을 보여줍니다18. 오가노이드가 통과 후 덜 효율적으로 재성장하지 않거나 덜 효율적이라면 해리 절차를 최적화해야합니다. 특히, 너무 가혹하게 해리하지 않도록주의해야합니다. 오가노이드는 단일 세포가 아닌 단편으로 분할되어야합니다 (그림 3B, Day 0, inset).
면역형광염색 분석은 상피 마커인 E-cadherin(E-Cad) 및 시토케라틴 8/18(CK8/18; 도 3C), 이외에도, 이는 뇌하수체18에서 줄기 세포 마커로서 기술되었다. 오가노이드의 줄기 성질은 SOX2 및 TROP2 발현에 의해 추가로 입증되며, 이들 둘 모두는 또한 뇌하수체 줄기 세포 마커로서 확인되었다 (도 3C)14,18. LHX3는 (초기 발달하는) 뇌하수체에서 특이적으로 발현되는 전사 인자로, 오가노이드의 뇌하수체 표현형을 검증한다(도 3C). 오가노이드를 구성하는 세포 중 일부는 증식 상태에 있고, 증식 마커 Ki67을 발현한다(도 3C).
AL 유래 오가노이드의 뇌하수체(stemness) 표현형의 추가 탐색 및 검증은 역전사-정량적 PCR(RT-qPCR)로 수행된다. 줄기 마커인 Sox2, Cdh1 (E-Cad를 코딩), Krt8, Krt18 및 Trop2 의 높은 발현은 오가노이드에 존재하며, 일차 AL에서보다 명백하게 높으며, 이는 오가노이드가 줄기 세포에 대해 풍부하고, 따라서 앞서 기술된 바와 같이 AL 줄기 세포 구획을 나타낸다는 것을 나타낸다 (도 3D)18. 특히, 발달 전사 인자 Pitx1 및 Pitx2 는 AL에서 여러 호르몬 세포 유형에서 발달 한 후에도 발현 된 채로 남아 있으며, 따라서 AL 에서도 높은 발현을 보입니다. 배양물은 다수의 계대 후에 이들 마커의 지속된(높은) 발현에 의해 입증된 바와 같이 그들의 줄기 표현형을 견고하게 유지한다(도 3D).
그림 1 : 건강하고 병든 뇌하수체에서 오가노이드의 설립, 유지 보수, 특성화 및 적용 가능성에 대한 개요. AL, 전엽; IL, 중간엽; PL, 후엽; MZ, 한계 영역; PitOM, 뇌하수체 오가노이드 배지 (BioRender.com 로 생성됨). AL의 줄기 세포 틈새 시장은 보라색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 안락사된 성인 마우스로부터의 뇌하수체 분리. 대표적인 이미지는 (A) 목이 졸리고, (B) 머리 피부 제거(코 다리가 둘러싸여있다), (C) 두개골의 개구부, 및 (D) 뇌의 제거, 뇌하수체 노출(둘러싸임)에 이어 연속적으로 촬영된다. 화살표는 폐기되는 PL을 가리키며(연관된 IL과 함께), AL은 분리 및 해리를 위해 남겨둔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: AL 유래 오가노이드의 확립 및 검증. (A) 표시된 날(계대 0)에 PitOM에서의 AL 세포 시딩 및 오가노이드 발달. 맨 윗줄은 유리한 오가노이드 성장을 보여 주며 낭포 성 구조 만 발달합니다. 하단 행은 큰 조밀 한 구조가 나타나는 불리한 성장을 보여줍니다 (박스형). 흰색 화살촉은 파편을 나타내고, 검은 화살촉은 단일 세포 (삽입으로 확대)를 나타냅니다. (B) 계대배양(Day 0)에 시딩된 오가노이드 단편(삽입물에서 확대됨) 및 7일 후에 관찰된 오가노이드의 재성장. 맨 위 줄은 유리한 오가노이드 재성장을 보여 주며 낭포 성 구조 만 자랍니다. 맨 아래 줄은 조밀 한 오가노이드가 문화를 장악하면서 불리한 재성장을 보여줍니다. (c) AL 유래 오가노이드에서 E-Cad, SOX2, TROP2 (올 레드), CK8/18, LHX3 및 Ki67 (모두 녹색)의 면역형광 염색. 핵은 Hoechst33342 (파란색)로 표시되어 있습니다. 화살촉은 Ki67+ 세포를 나타냅니다. 배율 막대가 표시됩니다. (d) RT-qPCR(평균 ± SEM)에 의해 결정된 1차 AL 및 AL 유래 오가노이드(계대 0은 세포 시딩 후 14일을 의미함)에서 줄기 마커(Sox2, Cdh1, Krt8, Krt8, Krt18, Trop2) 및 발달 전사 인자(Pitx1, Pitx2)의 유전자 발현 분석 결과. 데이터 포인트는 생물학적 반복실험을 나타냅니다. 델타 사이클 역치 (dCT) 값은 CT (관심있는 유전자) - CT (하우스 키핑 유전자 Actb)의 공식을 사용하여 계산됩니다. dCT 값이 양성일수록(이는 0 X축 아래의 Y축에 제시됨), 관심 유전자의 발현 수준이 낮아진다. dCT 값이 낮을수록(또는 그 이상) 발현 수준이 14,18,21,22로 높아진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 뇌하수체 오가노이드 배지 (PitOM) | |
| 구성 요소 | 농도 |
| 고급 DMEM/F12 | |
| 헤프 | 1% |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 1% |
| 글루타맥스 | 1% |
| B-27 보충제 (50X), 비타민 A 제외 | 1배 |
| L- 글루타민 (200 mM) | 2 밀리지미터 |
| 재조합 인간 FGF 염기성/FGF2/bFGF (157 aa) 단백질 | 20 ng/mL |
| 재조합 인간 IGF-1 | 100 ng/mL |
| N-2 보충 교재 (100X) | 1배 |
| N- 아세틸 시스테인 | 1.25 밀리지미터 |
| 재조합 인간/뮤린 FGF-8b | 200 ng/mL |
| 재조합 인간 FGF-10 | 100 ng/mL |
| A83-01 (액티빈 수용체-유사 키나아제 4/5/7 억제제) | 0.50 μM |
| 재조합 마우스 소닉 헤지호그/쉬(C25II) N-말단 | 100 ng/mL |
| 재조합 인간 EGF 단백질, CF | 50 ng/mL |
| SB202190 (p38 미토겐 활성화 단백질 키나제 억제제) | 10 μM |
| 재조합 인간 노긴 | 100 ng/mL |
| 비브리오 콜레라의 콜레라 독소 | 100 ng/mL |
| 재조합 인간 R-스폰딘-1 | 200 ng/mL |
| 재조합 인간 IL-6 | 20 ng/mL |
표 1. PitOM의 구성. PitOM은 0.22 μm 메쉬 필터를 통해 여과되고 최대 2주 동안 4°C에서 저장된다.
| 중간 A | |
| 구성 요소 | 양 |
| DMEM, 분말, 고 포도당 | 13.38 지 |
| 헤페스 | 5.96 지 |
| 나트륨 피루베이트 (C3H3NaO3) | 0.11 지 |
| 페니실린 G 나트륨 염 | 35.00 밀리그램 |
| 스트렙토마이신 설페이트 염 | 50.00 밀리그램 |
| 염화나트륨 (NaCl) | 0.50 지 |
| 탄산수소나트륨 (NaHCO3) | 1.00 지 |
| 알부민 소 (세포 배양 등급) | 3.00 지 |
| 멸균수 | 1.00 리터 |
| 중간 C | |
| 구성 요소 | 양 |
| 염화나트륨 (NaCl) | 7.50 지 |
| 염화칼륨 (KCl) | 0.40 지 |
| 인산이 수소 나트륨 1- 수화물 | 0.14 지 |
| D-글루코스 | 1.00 지 |
| 헤페스 | 4.76 지 |
| 스트렙토마이신 설페이트 염 | 50.00 밀리그램 |
| 페니실린 G 나트륨 염 | 35.00 밀리그램 |
| 페놀 레드 | 10.00 밀리그램 |
| 알부민 소 (세포 배양 등급) | 3.00 지 |
| 탄산수소나트륨 (NaHCO3) | 1.00 지 |
| 멸균수 | 1.00 리터 |
| 중간 B | |
| 구성 요소 | 양 |
| 티트리플렉스 III (에데테이트 이나트륨 염 이수화물) | 0.74 지 |
| 중간 C | 100 mL |
표 2. 배지 A, B 및 C의 조성. 모든 매질은 0.22 μm 메쉬 필터를 통해 여과되고 최대 4개월 동안 4°C에서 저장된다. 배지 A 및 C의 pH는 7.3으로 조정되어야 한다.
| 동결 보존 매체 | |
| 구성 요소 | 농도 |
| 고급 DMEM/F12 | 60% |
| FBS | 30% |
| 증권 시세 표시기 | 10% |
표 3. 동결보존 배지의 조성.
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Discussion
여기에 기술된 바와 같이 AL 유래 오가노이드는 시험관내에서 뇌하수체 줄기 세포를 연구하는 강력한 연구 모델을 나타낸다. 현재이 오가노이드 접근법은 일차 뇌하수체 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래 된 뇌하수체 오가노이드 모델이 이전에 보고되었으며, 이는 뇌하수체 배아 유기발생을 밀접하게 재요약한다23; 그러나 뇌하수체 발달을 연구하거나 뇌하수체 질환 23,24,25를 모델링하는 데 매우 유용하지만 ESC / iPSC에서 시작하여보고 된 프로토콜은 여기에 설명 된 프로토콜에 비해 매우 시간이 많이 걸리며 결과 오가노이드도 확장 할 수 없습니다.
뇌하수체 줄기 세포 오가노이드의 성공적인 배양은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 초기 세포 시딩시 적절한 수의 세포를 플레이트하는 것이 중요합니다. 매우 높은 숫자는 과밀 배양을 일으켜 오가노이드의 생존 가능성을 악화시키고 완전한 오가노이드 확장을 방해하는 반면, 매우 적은 수의 세포는 제한된 오가노이드 형성을 초래합니다. 또한, ECM 돔의 무결성을 한 번 배양하지 않는 것이 중요합니다. 매체를 추가하고 제거하는 것은 젤 방울을 만지지 않고 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 또한, 배양 배지를 예열하면 겔의 탈중합 위험이 감소한다. 마지막으로, 오가노이드를 정확하게 통과시키는 것(즉, 단일 세포가 아닌 단편으로 해리시키는 것)은 배양물의 효율적인 확장을 위해 결정적이다.
이러한 뇌하수체 줄기 세포 오가노이드는 줄기 세포의 표현형, 생물학 및 기능에 관한 질문에 대답하기 위해 활용 될 수 있습니다. 그들은 이미 새로운 줄기 세포 특징뿐만 아니라 뇌하수체 손상 관련 줄기 세포 활성화의 마커 및 줄기 세포 활성을위한 판독 도구로서 가치가 있음이 입증되었습니다 (그림 1) 14,18. 현재의 노력에는 뇌하수체 기능 저하증 및 PitNETs와 같은 병든 뇌하수체에서 파생된 것이 포함됩니다(그림 1). 결국, 오가노이드는 또한 다른 질병26,27에 대해 성공적으로 확립 된 바와 같이 약물 스크리닝을위한 플랫폼에 종사 할 수 있습니다. 따라서, 높은 처리량 분석에 도달하기 위해 오가노이드 배양물의 추가적인 업스케일링이 필요할 것이다. AL 유래 오가노이드가 96-웰 형식으로 효율적으로 성장할 수 있으며, 또한 더 균질한 배양을 초래할 수 있다는 것이 이미 주목 받았다.
~ 10 계대 후 (배양 3 개월에 해당) 오가노이드가 더 적은 수와 더 작은 크기로 재성장함에 따라 오가노이드 성장 효율이 점차 감소하는 것으로 관찰되었습니다. 이러한 성장 감소는 뇌하수체 줄기 세포의 본질적인 성질에 내재되어 있을 수 있는데, 이는 생체 내에서 여러 번 스스로 갱신할 필요가 없을 수 있으며, 이는 단지 천천히 뒤집어지고, 따라서16,28번의 분할 라운드 후에 고갈된다. 이러한 최종 성장 감소가 한계로 간주 될 수 있지만, 이전 구절 동안의 오가노이드 확장이 광범위한 하류 분석에 충분하기 때문에이 모델은 매우 유용합니다.
제한으로 간주될 수 있는 또 다른 양태는 뇌하수체 줄기 세포 오가노이드가 면역결핍 마우스의 신장 캡슐 하에 이종이식편된 후에도 AL의 내분비 세포 유형에 대해 두드러진 분화 능력을 나타내지 않는다는 것이다(이는 참조18에 상세히 기재된 바와 같이 제한된 수의 GH+ 및 PRL+ 세포를 초래함). 줄기 세포를 분화로 유도하는 오른쪽 시험관 내 조건이 아직 확인되지 않았거나 줄기 세포의 주요 역할 (특히 성체선에서)이 새로운 내분비 세포를 생성하는 데 위치하지 않습니다 (게으른 선에서는 필요하지 않지만 혼란 스럽거나 도전적인 조건에서만 필요하기 때문에)9,10,14, 18. 대신에, 주요 기능은 다른 생물학적 측면들 (예를 들어, 호르몬 전구자/전구체 또는 성숙 세포에 대한 파라크린 신호전달은 기본적이지만, 활성(발달, 수복, 질병) 상태에서는 더 가능성이 높다)13,16. 실제로, 뇌하수체 줄기 세포는 특히 배아 및 신생아 기간에 분화 능력을 보유하는 것으로 밝혀졌지만, 성체의 줄기 세포는 성선의 매우 낮은 회전율을 감안할 때이 능력을 유지하지 못한다고 생각할 수 있습니다16,28. 성체 뇌하수체 줄기 세포는 파라크린 신호 전달 허브로서 더 많이 작용하여 주변 전구 / 전구체 / 내분비 세포13,16을 자극하거나 조절하는 데 관여 할 수 있습니다. 따라서 호르몬 분비에서 절정에 달하는 뇌하수체 줄기 세포 오가노이드의 강력한 분화는 결코 도달하지 못할 잘못된 기대 일 수 있습니다.
종합하면, 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내에서 3D 설정에서 일차 뇌하수체 줄기 세포를 견고하게 확장 할 수있는 신속하게 적용 가능하고 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 뇌하수체 줄기 세포 표현형을 충실하게 포착하는 오가노이드를 발생시킵니다. 이 시스템은 이미 뇌하수체 줄기 세포 생물학 및 활성화14,18을 연구하기 위해 성공적으로 적용되었으며, 연구 결과는 생체 내 상황으로 번역 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 KU Leuven Research Fund와 FWO (Fund for Scientific Research) - Flanders의 보조금으로 지원되었습니다. E.L. (11A3320N) 및 C.N. (1S14218N)은 FWO / FWO-SB 박사 학위 펠로우십의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
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