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Biology

संयंत्र-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए डबल-स्टेनिंग विधि

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

यह प्रोटोकॉल कॉफी-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए एक माइक्रोस्कोपिक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

पौधे की कोशिकाएं फंगल संक्रमण से खुद को बचाने के लिए विभिन्न संरचनात्मक तंत्रों का उपयोग करती हैं, या तो संवैधानिक या अपरिवर्तनीय। Encapsulation संयंत्र सेल protoplast से कवक haustoria को अलग करने के लिए एक कुशल inducible तंत्र है। इसके विपरीत, पेक्टिन, सेल की दीवार के बहुलक घटकों में से एक, नेक्रोट्रॉफिक इंटरैक्शन में कई पेक्टोलाइटिक एंजाइमों का लक्ष्य है। यहां, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पेक्टिन और फंगल हाइफे का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। जंग कवक Hemileia vastatrix और Mesophyll सेल दीवार संशोधन Cercospora coffeicola द्वारा प्रेरित द्वारा संक्रमित कॉफी पत्तियों की कोशिकाओं में पेक्टिन समृद्ध encapsulation की जांच कर रहे हैं. घाव वाले पत्ती के नमूनों को कार्नोव्स्की समाधान के साथ तय किया गया था, निर्जलित किया गया था, और 2-4 दिनों के लिए ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट में एम्बेडेड किया गया था। अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में हवा को हटाने और एम्बेडिंग प्रक्रिया में सुधार करने के लिए वैक्यूम-पंपिंग द्वारा सभी चरणों का पालन किया गया था। एम्बेडेड ब्लॉकों को 5-7 μm मोटे वर्गों में विभाजित किया गया था, जिन्हें पानी से ढके हुए ग्लास स्लाइड पर जमा किया गया था और बाद में 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया था। इसके बाद, स्लाइड को कवक का पता लगाने के लिए लैक्टोफेनोल में 5% कपास नीले रंग के साथ डबल-दाग दिया गया था और पेक्टिन (पेक्टिन के पॉलीयूरोनिक एसिड के अम्लीय समूह) का पता लगाने के लिए पानी में 0.05% रूथेनियम लाल था। हेमिलिया वास्टाट्रिक्स के फंगल हौस्टोरिया को पेक्टिन द्वारा समझाया गया पाया गया था। कॉफी cercosporiosis में, मेसोफिल कोशिकाओं ने सेल की दीवारों के विघटन का प्रदर्शन किया, और अंतरकोशिकीय हाइफे और कोनिडियोफोर देखे गए। यहां प्रस्तुत विधि पौधे-कवक बातचीत में पेक्टिन से जुड़ी प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए प्रभावी है।

Introduction

कवक संक्रमण को रोकने के लिए पौधों में सेल की दीवार रक्षा तंत्र महत्वपूर्ण हैं। अध्ययनों ने 19वीं शताब्दी 1,2 के बाद से सेल की दीवार की मोटाई और संरचना में परिवर्तनकी सूचना दी है। इन परिवर्तनों को एक कवक रोगज़नक़ द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जो एक पैपिला के गठन को उत्तेजित करता है, जो कवक को सेल में प्रवेश करने से रोकता है या इसका उपयोग फंगल हौस्टोरिया से मेजबान सेल प्रोटोप्लास्ट को अलग करने के लिए हाइफे को समाहित करने के लिए किया जा सकता है। एक गतिशील सेल दीवार बाधा का उत्पादन (यानी, पैपिले और एक पूरी तरह से encased haustorium) संयंत्र प्रतिरोध3 को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है। कवक से संबंधित बीमारियों पर हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों ने इन तंत्रों की घटना की जांच की है और सेल की दीवार पॉलिमर, सेल्यूलोज, हेमीसेल्युलोज (अरबिनोक्सिलन्स), और कैलोज़ को फंगल हमले के प्रतिरोध तंत्र के रूप में वर्णित कियाहै 4,5,6,7।

सेल की दीवार सूक्ष्मजीवीय हमले के खिलाफ पहली बाधा है, जो पौधे-कवक बातचीत को खराब करती है। पेक्टिक पॉलीसेकेराइड सेल की दीवार की रचना करते हैं और यूडिकोट पौधों की प्राथमिक कोशिकाओं में सेल की दीवार संरचना के लगभग 30% के लिए खाते हैं जिसमें होमोगैलेक्टुरोनन सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक (लगभग 60%) हैं। गोल्गी जटिल पेक्टिन यौगिकों का स्राव करता है जिसमें गैलेक्टुरोनिक एसिड चेन शामिल होते हैं, जिन्हेंमिथाइलेटेड 8,9 हो सकता है या नहीं भी हो सकता है। 2012 के बाद से, साहित्य ने बताया है कि पेक्टिन मिथाइल एस्टरिफिकेशन की डिग्री माइक्रोबियल पेक्टिक एंजाइमों द्वारा संक्रमण के दौरान संगतता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है10,11,12। इस प्रकार, पौधे-कवक पैथोसिस्टम में पेक्टिक यौगिकों की उपस्थिति और वितरण को सत्यापित करने के लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

पैपिले या हॉस्टोरिया के एनकैप्सुलेशन का पता लगाने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया गया है। उपयोग की जाने वाली संदर्भ विधियां निश्चित ऊतकों की संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और जीवित और स्थिर ऊतकों की प्रकाश माइक्रोस्कोपी हैं। टीईएम के बारे में, कई अध्ययनों ने फंगल प्रतिरोध 13,14,15,16 में सेल दीवार एपोज़िशन की संरचनात्मक भूमिका का प्रदर्शन किया है, और लेक्टिन और एंटीबॉडी का उपयोग कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर16 का पता लगाने के लिए एक जटिल विधि है। हालांकि, अध्ययनों से पता चलता है कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है और हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल उपकरण पैपिले और हॉस्टोरियम एनकेसमेंट 6,7 की संरचना की बेहतर समझ की अनुमति देते हैं।

रोगजनक कवक जीवन शैली के दो मुख्य प्रकार दिखाते हैं: बायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक। बायोट्रॉफिक कवक अपने पोषण के लिए जीवित कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं जबकि नेक्रोट्रॉफिक कवक मेजबान कोशिकाओं को मारते हैं, और फिरमृत ऊतकों में रहते हैं। लैटिन अमेरिका में, कॉफी पत्ती जंग, कवक Hemileia vastatrix के कारण, कॉफी फसलों में एक महत्वपूर्ण बीमारी है18,19. Hemileia vastatrix एक biotrophic व्यवहार प्रस्तुत करता है और, प्रतिरोधी कॉफी प्रजातियों या cultivars में मनाया संरचनात्मक परिवर्तनों के बीच, एक अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया, सेलोस, सेल्यूलोज, और सेल की दीवारों पर लिग्निन के जमाव, साथ ही साथ सेल hypertrophy14 की सूचना दी गई है। लेखकों के ज्ञान के लिए, साहित्य कॉफी जंग प्रतिरोध में पेक्टिन के महत्व पर जानकारी की रिपोर्ट नहीं करता है। दूसरी ओर, नेक्रोट्रोफिक कवक जो सेरकोस्पोरियोसिस का कारण बनता है, सेल की दीवार गिरावट से जुड़े एंजाइमों के एक सेट के माध्यम से पेक्टिन को लक्षित करता है, जैसे कि पेक्टिनेस और पॉलीगैलेक्टुरोनेज20। कवक के कारण कॉफी में Cercosporiosis Cercospora coffeicola भी कॉफी फसलों के लिए एक बड़ा खतरा है21,22. यह कवक पत्तियों और जामुन दोनों में परिगलित घावों का कारण बनता है। प्रवेश के बाद, C. c. coffeicola इंट्रासेल्युलर और इंटरसेलुलर मार्गों23,24,25 के माध्यम से पौधे के ऊतकों का उपनिवेश करता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल सेल की दीवारों पर कवक संरचनाओं और पेक्टिन की उपस्थिति की जांच करता है। यह प्रोटोकॉल पेक्टिन से जुड़ी पौधों की प्रतिक्रिया की पहचान करने के लिए उपयोगी है (रूथेनियम लाल डाई के साथ दाग, जो पेक्टिन के पॉलीयूरोनिक एसिड के अम्लीय समूहों के लिए विशिष्ट है), कवक के साथ बायोट्रोफिक इंटरैक्शन में मेजबान द्वारा प्रेरित। यह पेक्टिक सेल दीवारों के क्षरण पर नेक्रोट्रोफिक कवक के प्रभाव को सत्यापित करने में भी मदद करता है। वर्तमान परिणाम इंगित करते हैं कि डबल स्टेनिंग विधि संरचनाओं और कवक के प्रजनन चरण में भेदभाव करने के लिए प्रभावी है।

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Protocol

1. बफरिंग समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. आसुत जल के 100 मिलीलीटर में 4.28 ग्राम सोडियम कैशोडिलेट जोड़कर 2 एम कॉकोडिलेट बफर तैयार करें और पीएच को 0.2 एन एचसीएल के साथ 7.25 पर समायोजित करें।
  2. 25% जलीय ग्लूटाराल्डिहाइड के 10 मिलीलीटर, 10% जलीय फॉर्मेल्डिहाइड के 10 मिलीलीटर, 2 एम कैसोडिलेट बफर के 25 एमएल, और 0.5 एमसीएसीएल 226 के 0.5 एमएल को मिलाकर कर्णोव्स्की फिक्सेटिव समाधान का 100 मिलीलीटर तैयार करें। आसुत पानी के साथ 100 मिलीलीटर तक मात्रा बनाएं।
    नोट: समाधान को 6 महीने के लिए रेफ्रिजरेटर में रखा जा सकता है।
    सावधानी: cacodylate बफरिंग समाधान विषाक्त है; इसलिए, एक धुएं हुड या एक खुले क्षेत्र में fixative समाधान संभाल. समाधान वाष्पों को साँस लेने से बचें और हैंडलिंग करते समय दस्ताने पहनें।
  3. निम्नलिखित को मिलाकर जलीय होग्लैंड पोषक तत्व समाधान तैयार करें: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mM Na2MoO4. H2O, 0.01 mM CuSO4, और 36 mM FeSO4.7H 2O आयरन-EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) के रूप में 27.

2. पौधे के नमूने और कवक टीका

नोट: कॉफी जंग से प्रभावित पत्तियों पर प्रयोगों के लिए, कॉफी अरेबिका सीवी के पांच 2 महीने पुराने रोपाई। Catuaí उगाया गया था और साओ पाउलो, Piracicaba, साओ पाउलो राज्य, ब्राजील के विश्वविद्यालय के कृषि में परमाणु ऊर्जा के केंद्र (CENA) में एक ग्रीनहाउस में रखा गया था।

  1. 500 मिलीलीटर प्लास्टिक के बर्तनों में कॉफी के पौधों को जलीय होग्लैंड पोषक तत्व समाधान (~ 5.5 का पीएच) से भरा हुआ है, जो 27 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर 27 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए विकास कक्ष में 250 μmol फोटॉनों s-1 m-2 के फोटॉन फ्लक्स पर एलईडी लैंप द्वारा बनाई गई 12 h photoperiod के साथ रखा गया है। 4 महीने के लिए हर हफ्ते Hoagland पोषक तत्व समाधान की जगह लें।
  2. संदर्भ28 में वर्णित विधि के बाद 1 x 103H. vastatrix uredospores के साथ उनके abaxial सतहों पर पांच पौधों से चार विस्तारित पत्तियों को संक्रमित करें। टीका लगाने के बाद, पौधों को काले प्लास्टिक बैग के साथ कवर करके अंधेरे में 48 घंटे के लिए रखें। टीका लगाने के 30 दिनों के बाद घावों की कटाई करें। 
  3. Coffea arabica cv से Cercospora coffeicola के कारण फसल विशेषता घावों. Obatâ पौधों स्थित (निर्देशांक: -22.906506126269942, -47.015075902025266) जैविक संस्थान, Campinas, साओ पाउलो राज्य, ब्राजील में स्थित. नमूने को संसाधित करने से पहले, कॉफी सी. कॉफिकोला कोनिडिया की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में घावों का विश्लेषण करें। फिर, रोग एटियलजि22 की पुष्टि करने के लिए कोनिडिया के साथ कुछ स्लाइड माउंट करें।

3. नमूना कटाई, निर्धारण, और निर्जलीकरण

  1. एक स्केलपेल और चिमटी का उपयोग करते हुए, घाव के मध्य क्षेत्र (पीले धब्बे) पर एक ~ 10 मिमी2 पत्ती के नमूने की कटाई; चित्र 1) और इसे 30 मिलीलीटर कार्नोव्स्की फिक्सेटिव समाधान (चित्रा 1 और चित्रा 2 ए) में विसर्जित करें। निर्धारण चरण 48 घंटे के लिए एक रेफ्रिजरेटर में हो सकता है।
  2. कम से कम चार बार के लिए, पत्ती के ऊतकों में फिक्सेटिव समाधान की पारगम्यता को बढ़ाने के लिए प्रत्येक 15 मिनट के लिए एक तेल पंप का उपयोग करके पत्ती के नमूने को कम वैक्यूम (500-600 mBar) के अधीन करें। नमूना रोटेशन (चित्र1) के साथ इस चरण को निष्पादित करें।
  3. निर्धारण के बाद, पत्ती के नमूने को 0.5 एम कैसोडिलेट बफर (पीएच 7.2) में तीन बार धोएं, प्रत्येक 5 मिनट के लिए आसुत पानी में पतला हो गया और फिर इसे एक वर्गीकृत इथेनॉलिक श्रृंखला (30%, 50%, 70%, 90% (2x), और 100% (2x)) में स्थानांतरित करें, प्रत्येक इथेनॉल एकाग्रता (चित्रा 1 और चित्रा 2 बी) पर 15 मिनट के लिए।

4. हिस्टोरेसिन एम्बेडिंग प्रक्रिया

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए धीरे-धीरे नमूनों को तीन चरणों में ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट (जीएमए) में स्थानांतरित करें। सबसे पहले, जीएमए पाउडर (1 ग्राम) को मूल राल (हिस्टोरेसिन किट) के 100 मिलीलीटर के साथ मिलाकर समाधान ए बनाएं; सामग्री की तालिका) चुंबकीय आंदोलन के तहत, और फिर नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. 1: 2 समाधान ए में नमूनों को विसर्जित करें: 3 घंटे के लिए 100% इथेनॉल।
    2. 1: 1 समाधान ए में नमूनों को विसर्जित करें: 3 घंटे के लिए 100% इथेनॉल।
    3. 2-4 दिनों के लिए एक शुद्ध बुनियादी राल में नमूनों विसर्जित करें। इस चरण के दौरान, नमूनों को 15 मिनट के लिए दिन में कम से कम चार बार कम वैक्यूम के अधीन करें, इसके बाद रोटेशन किया जाए।

5. पोलीमराइजेशन

नोट: पोलीमराइजेशन प्रक्रिया के लिए 1.2 मिलीलीटर प्लास्टिक मोल्ड्स, मूल राल और हार्डनर की आवश्यकता होती है (वाणिज्यिक किट के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

  1. पोलीमराइजेशन समाधान (समाधान बी) का उत्पादन करने के लिए 2 मिनट के लिए रोटेशन के साथ एक बीकर में हार्डनर के 1 मिलीलीटर के साथ समाधान A (चरण 4.1) के 15 मिलीलीटर को मिलाएं।
  2. प्लास्टिक मोल्ड्स में पोलीमराइजेशन समाधान (समाधान बी) के 1.2 मिलीलीटर रखो। एक लकड़ी के पिक का उपयोग करते हुए, घाव वाले पत्ती के नमूनों को शुद्ध मूल राल से समाधान बी (चित्रा 2 सी) में स्थानांतरित करें। चिमटी का उपयोग करने से बचें क्योंकि वे ऊतक कुचलने का कारण बन सकते हैं।
  3. जल्दी से प्लास्टिक molds के लिए लंबवत पत्ती के नमूनों उन्मुख करने के लिए सुनिश्चित करें के रूप में समाधान बी जल्दी से 5 मिनट के भीतर चिपचिपा हो जाता है. एक से अधिक घाव वाले पत्ती के नमूने को एक ही मोल्ड में रखा जा सकता है।
    नोट:: यह कई नमूनों के लिए आवेदन करने से पहले कई बार उपरोक्त चरण का अभ्यास करने के लिए अनुशंसित है। जब कई नमूने होते हैं, तो पोलीमराइजेशन का समय मोल्ड्स के बीच अलग होता है और पत्ती के नमूनों के लंबवत अभिविन्यास को प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है।
  4. जब पत्ती के नमूनों का लंबवत अभिविन्यास प्राप्त किया जाता है, तो 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर नमी को रोकने के लिए सिलिका जेल युक्त प्लास्टिक या ग्लास चैंबर में प्लास्टिक मोल्ड को स्थानांतरित करें। पोलीमराइजेशन के लिए 2-3 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  5. एक बार राल और पत्ती के नमूने को 2-3 घंटे की अवधि के बाद पॉलिमराइज़ किया जाता है, तो एक सैंडिंग फ़ाइल के साथ ब्लॉक बेस को सैंड करके प्लास्टिक मोल्ड से परिणामी ब्लॉक को अलग करें। फिर, ब्लॉक को लकड़ी के एक टुकड़े (चित्रा 2 डी) पर गोंद करें।

6. अनुभाग

  1. 8 सेमी स्टील ब्लेड (चित्रा 2ई) से लैस एक रोटेटिव माइक्रोटोम का उपयोग करके, ब्लॉक को 5 μm मोटे वर्गों में काट लें। आसुत पानी से ढके कांच की स्लाइड्स पर अनुभागों को रखें। सूखी और कांच स्लाइड करने के लिए वर्गों के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट के लिए पानी पर तैरने वाले वर्गों के साथ स्लाइड्स को स्थानांतरित करें।
  2. सूखने के बाद (चित्रा 2F), ब्लॉक संदर्भ नाम और स्लाइड संख्या के साथ ग्लास स्लाइड लेबल करें।

7. डबल धुंधला प्रक्रिया

  1. लैक्टोफेनॉल (40% ग्लिसरॉल, 20% फिनोल, और पानी में 20% लैक्टिक एसिड) में 5% कपास नीले रंग के 2 मिलीलीटर के साथ वर्गों को कवर करें और उन्हें 5 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर गर्म करें (चित्रा 3 ए)।
  2. आसुत पानी से भरे बीकर में स्लाइड को तीन बार धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें (चित्रा 3 बी-डी)।
  3. 1 मिनट के लिए पानी में 0.01% रूथेनियम लाल के 2 मिलीलीटर के साथ दाग (चित्रा 3ई)।
  4. आसुत पानी से भरे बीकर में स्लाइड को तीन बार धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें (चित्रा 3 एफ, जी)।
  5. वर्गों पर आसुत पानी की एक बूंद रखो और प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण करने के लिए एक 24 मिमी x 60 मिमी coverslip के साथ वर्गों को कवर।

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Representative Results

जीएमए-एम्बेडेड अनुभाग पर कपास नीले लैक्टोफेनोल धुंधला होने से बायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रोफिक फंगल इंटरैक्शन दोनों में कॉफी मेसोफिल कोशिकाओं के बीच और अंदर कई कवक संरचनाओं की उपस्थिति का पता चला।

बायोट्रॉफिक पैथोसिस्टम में, जब डबल-स्टेनिंग विधि का उपयोग करके दाग दिया जाता है, तो हेमिलिया वास्टाट्रिक्स हाइफे जिसमें सेल की दीवारें होती हैं और घने प्रोटोप्लास्ट सामग्री स्पंजी और पैलिसेड पैरेन्काइमा (चित्रा 4 ए, बी) दोनों में गहरे नीले रंग में दिखाई देती है। हॉस्टोरियम मदर सेल (एचएमसी) और हौस्टोरिया भी एक मजबूत गहरे नीले रंग (चित्रा 4 सी) का प्रदर्शन करते हैं। जब रूथेनियम लाल के साथ काउंटर दाग दिया जाता है, तो अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में कवक वितरण को स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाता है (चित्रा 4 डी)। गहरे नीले रंग के एचएमसी की उपस्थिति संक्रमण क्षेत्र का पता लगाने में मदद करती है। बातचीत के दौरान, एच vastatrix Hmc मेजबान सेल की दीवार को तोड़ दिया और एक haustorial गर्दन है कि पेक्टिक यौगिकों (चित्रा 4E, एफ) से घिरा हो सकता है विकसित किया। फिर भी, हॉस्टोरियल गर्दन का पेक्टिन-समृद्ध एनकैप्सुलेशन (गुलाबी-लाल रंग) हौस्टोरियल गठन को रोकने में सक्षम नहीं है (चित्रा 4 ई, एफ)। कुछ मामलों में, पेक्टिन-समृद्ध एनकैप्सुलेशन ने हॉस्टोरियम को अपूर्ण रूप से घेर लिया (चित्रा 4 जी) और कुछ मामलों में, हॉस्टोरियम पूरी तरह से एनकैप्सुलेटेड है (चित्रा 4 एच)।

नेक्रोट्रॉफिक इंटरैक्शन में, डबल स्टेनिंग प्रोटोकॉल कॉफी मेसोफिल ऊतकों के साथ सरकोस्पोरा कॉफिकोला की बातचीत को सत्यापित करने के लिए भी उपयोगी था। घाव की सीमा पर, जहां कवक मौजूद नहीं है, पेक्टिन-समृद्ध सेल दीवार ने अपनी अखंडता रखी (चित्रा 5 ए)। डबल स्टेनिंग विधि ने अंतरकोशिकीय हाइफे (चित्रा 5 बी, सी) की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। इंटरैक्शन ज़ोन में, पेक्टिन सेल की दीवारें विघटन के कारण अपनी अखंडता खो देती थीं (चित्रा 5 बी, सी)। प्रजनन संरचनाएं, जैसे कि कोनिडियोफोर, एडैक्सियल एपिडर्मिस (चित्रा 5 डी) में पाई गई थीं। सबस्टोमैटिक चैंबर में, C. c. coffeicola hyphae कर्लिंग संरचनाओं के रूप में पाए गए थे। घाव वाले क्षेत्र में पैलिसेड पैरेन्काइमा सेल दीवार लाइसिस (चित्रा 5 ई) से गुजरना प्रतीत होता है।

Figure 1
चित्रा 1: घाव वाले ऊतकों की कटाई के लिए प्रोटोकॉल में अलग-अलग चरणों का विवरण। एक scalpel और एक चिमटी के साथ घाव के टुकड़े की कटाई. पत्ती के नमूनों को फिक्सेटिव समाधान में विसर्जित करें। वैक्यूम पम्पिंग और रोटेशन के लिए नमूनों के विषय. निर्जलीकरण और एम्बेडिंग प्रक्रियाओं के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें। बहुलकीकृत नमूना एक घूर्णनी माइक्रोटोम में विभाजित है। घाव वर्गों के साथ स्लाइड घुड़सवार और डबल धुंधला विधि का उपयोग कर कवक hyphae और पेक्टिन समृद्ध सेल दीवारों को सत्यापित करने के लिए दाग कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डबल धुंधला करने से पहले नमूना अनुभाग के अलग-अलग चरणों का विवरण। (ए) निर्धारण चरण। (बी) श्रेणीबद्ध इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलीकरण; पत्ती ऊतक प्रत्येक एकाग्रता पर 15 मिनट के लिए इथेनॉल में ऊष्मायन किया जाता है। (c) प्लास्टिक मोल्ड के अंदर पोलीमराइजेशन। (d) लकड़ी के एक टुकड़े से चिपके हुए पॉलिमराइज्ड नमूने का ब्लॉक। (ई) लकड़ी से चिपके हुए ब्लॉक को सेक्शनिंग प्रक्रिया के लिए माइक्रोटोम पर तैनात किया गया है। (एफ) स्लाइड पर ऊतक अनुभाग (तीर द्वारा दर्शाया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डबल-स्टेनिंग प्रोटोकॉल के अलग-अलग चरणों का विवरण। (ए) कपास नीले लैक्टोफेनोल की बूंदों के साथ वर्गों को कवर करें और स्लाइड को 45 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर गर्म करें (बी-सी) आसुत पानी में धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें। (डी) धोने के बाद कांच की स्लाइड पर अनुभाग (तीर द्वारा दर्शाया गया)। (ई) रूथेनियम लाल की बूंदों के साथ वर्गों को कवर करें। (F-G) आसुत जल में धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कॉफी जंग घाव में पेक्टिन और कवक संरचनाओं के लिए हिस्टोकेमिकल डबल स्टेनिंग प्रोटोकॉल। (A-C) अनुभागों केवल कपास नीले लैक्टोफेनोल के साथ दाग. कवक hyphae गहरे नीले (तीर) में दाग रहे हैं. हॉस्टोरियम मदर सेल (एचएमसी) और हॉस्टोरियम (हा) में एक गहरा नीला रंग होता है। (D-H) कपास नीले लैक्टोफेनोल और रूथेनियम लाल का उपयोग करके डबल धुंधला। (d) एक पत्ती पर pustule (Pu) का अवलोकन। (E-F) पेक्टिन (गुलाबी-लाल रंग) के साथ Haustorial गर्दन (तीर). (जी) तीर हौस्टोरियम के पेक्टिन-समृद्ध एनकैप्सुलेशन की शुरुआत को इंगित करते हैं। (ज) पेक्टिन (तीर) द्वारा हॉस्टोरियम का पूर्ण एनकैप्सुलेशन। Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; एसपी - स्पंजी पैरेन्काइमा; पीपी - palisade पैरेन्काइमा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कॉफी मेसोफिल ऊतकों में cercosporiosis घावों में पेक्टिन और कवक संरचनाओं के लिए हिस्टोकेमिकल डबल स्टेनिंग प्रोटोकॉल। (ए) कवक के बिना घाव सीमा। (B-F) घाव वाले पत्ते के क्रॉस-सेक्शन। (ए) स्पंजी पैरेन्काइमा की पेक्टिन-समृद्ध सेल दीवारों की अखंडता। (B-D, F) संक्रमित ऊतकों में, Cercospora coffeicola hyphae स्पष्ट (तीर) थे और पेक्टिक सेल की दीवारों में नुकसान का कारण बने। छल्ली (सीटी) (डी) के तहत कोनिडियोफोर को सत्यापित करना संभव था। Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; एसपी - स्पंजी पैरेन्काइमा; पीपी - Palisade पैरेन्काइमा; सेंट - स्टोमेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान कार्य सेल की दीवारों की पेक्टिन संरचना की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक डबल-स्टेनिंग हिस्टोकेमिकल परीक्षण का परिचय देता है जो एक बायोट्रोफिक पैथोसिस्टम में हॉस्टोरिया को समाहित करता है। इसका उद्देश्य इसके द्वारा प्रेरित नेक्रोट्रोफिक कवक और सेल दीवार परिवर्तनों का पता लगाने के लिए विधि की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करना भी है। यहां, कॉफी पैरेन्काइमा सेल की दीवारों का पेक्टिन गर्दन और जंग कवक हेमिलिया वास्टाट्रिक्स के हौस्टोरियम दोनों को समाहित कर सकता है। सिल्वा एट अल ने कॉफी-एच. वास्टाट्रिक्स पैथोसिस्टम 14,29 में सेल्यूलोज और कैलोज़ द्वारा एनकैप्सुलेशनका भी वर्णन किया है। रक्षा तंत्र से जुड़े सेल दीवार पॉलिमर के बीच, पेक्टिन पौधे-रोगज़नक़ प्रणाली10,11,12 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, पेक्टिन कार्यों का ज्ञान महान हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्य का है।

कॉफी में Cercosporiosis, Cercospora coffeicola के कारण, पत्ती के ऊतकों को नुकसान पहुंचाता है और अंततः कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। ये लक्षण मुख्य रूप से cercosporin और सेल दीवार अपमानजनक एंजाइमों20 की गतिविधि के कारण होते हैं। रूथेनियम रेड का उपयोग करने वाले अध्ययनों ने सेल की दीवार अखंडता के नुकसान का प्रदर्शन किया, जो स्यूडोसरकोस्पोरा काकी30 से संक्रमित परसिमन पत्तियों पर पिछले अध्ययन के समान था। डबल-स्टेनिंग विधि का उपयोग करके हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण ने फंगल हाइफे की उपस्थिति का प्रदर्शन किया और यह विश्लेषण अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में कवक हाइफे का पता लगाने के लिए प्रभावी है। वैकल्पिक रूप से, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) ने सी. कॉफीकोला हाइफे25 का निरीक्षण करने के लिए प्रभावकारिता दिखाई है; हालांकि, इस तरह के परिष्कृत उपकरणों की उपलब्धता, नमूना तैयारी के श्रमसाध्य काम के साथ, एक सीमित कारक है। इसके अलावा, SEM विश्लेषण सेल दीवारों में पेक्टिन की रासायनिक मान्यता की अनुमति नहीं देता है। इसके विपरीत, पेक्टिन परिवर्तनों का पता लगाने के लिए डबल स्टेनिंग एक महत्वपूर्ण तरीका है। हालांकि, यहां वर्णित विधि में प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प के संबंध में एक सीमा है जो पौधे-फंगल इंटरैक्शन के अल्ट्रास्ट्रक्चर के विवरण में वृद्धि की अनुमति नहीं देती है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत डबल स्टेनिंग विधि कवक प्रजातियों का पता लगाने के लिए विशिष्ट नहीं है और अतिरिक्त आणविक निबंध, इसलिए, आयोजित किए जाने चाहिए।

नमूना तैयारी पौधे के शरीर रचना विज्ञान में नियमित प्रोटोकॉल का पालन करती है; हालांकि, कुछ बिंदुओं पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, निर्धारण एक महत्वपूर्ण कदम है। नमूनों का आकार और उनकी कटाई में देखभाल अच्छे निर्धारण के लिए आवश्यक है। समय, तापमान, पीएच, और osmolarity पौधे के ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण हैं31. घाव वाले पत्ती के ऊतक हवाई अंग हैं और निर्धारण में सुधार करने के लिए हल्के वैक्यूम के अधीन होना चाहिए। ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट (जीएमए) के उपयोग के लिए निर्जलीकरण विलायक के रूप में इथेनॉल की आवश्यकता होती है; ऊतक जो ठीक से निर्जलित नहीं हैं, एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान कठिनाइयों को प्रस्तुत कर सकते हैं। यह स्थिति तब खराब हो जाती है जब पौधे के ऊतकों में कई फेनोलिक यौगिक होते हैं, जैसा कि कॉफी के पत्तों के मामले में होता है। इसके अलावा, ऊतकों के छोटे हिस्सों से निपटना महत्वपूर्ण है; अन्यथा, वैकल्पिक एम्बेडिंग विधियों की आवश्यकता होतीहै 32।

यहां प्रस्तुत डबल-स्टेनिंग तकनीक मार्क्वेस एट अल.33 द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन है। उस प्रोटोकॉल में, लेखकों ने कवक संरचनाओं और पौधे की कोशिका दीवारों को अलग करने के लिए कपास नीले (5%) और 1% सैफ्रानिन का उपयोग किया। यह तकनीक विभिन्न पैथोसिस्टम में कवक की उपस्थिति का पता लगाने के लिए उपयोगी थी, जैसे कि कोलेटोट्रिकम एक्यूटेटम-साइट्रस पंखुड़ियों और गुइगनार्डिया सिट्रीकार्पा-साइट्रस फल33प्लाज्मोडिओफोरा ब्रासिके में एराबिडोप्सिस थालियाना34, विटिस लैब्रस्का35 में एल्सिनोस एम्पेलिना, और अन्य। हाल ही में, Marques और Soares36ने सूक्ष्म तकनीकों की एक श्रृंखला संकलित की, जिसमें प्रकाश और प्रतिदीप्ति के तरीके शामिल हैं, पौधे और कवक विशेषताओं को अलग करनेके लिए 37। हालांकि, कुछ क्षेत्रों या देशों में, जैसे कि ब्राजील, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और एसईएम उपलब्ध नहीं हो सकते हैं; इसलिए, प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण और सस्ता विकल्प है और यहां तक कि विश्वविद्यालयों और उच्च विद्यालयों में नियोजित उपदेशात्मक तरीके भी हैं। कपास नीले रंग की डाई 36,38,39,40 द्वारा पौधे और पशु ऊतकों दोनों में कवक हाइफे का माइक्रोस्कोपिक रूप से पता लगाया गया है। यह चिटिन-समृद्ध कवक दीवार40 के साथ डाई की सकारात्मक प्रतिक्रिया से संबंधित है। कपास नीले सूत्र में लैक्टोफेनोल शामिल है, जो एक समाधान है जो ऊतक41 के लिए एक मॉर्डेंट के रूप में कार्य करता है, जिससे कपास नीले रंग के साथ मिश्रित होने पर कवक संरचना को संरक्षित किया जाता है। 

यहां, 0.05% रूथेनियम लाल का उपयोग सैफरेनिन को बदलने के लिए किया गया था। इस अध्ययन में प्रस्तुत सकारात्मक पहलू यह है कि पेक्टिन, सेल की दीवार का एक विशिष्ट बहुलक, महत्वपूर्ण गुणात्मक डेटा प्रदान करने के लिए दाग दिया गया था। रुथेनियम रेड एक अभिकर्मक है जिसका उपयोग पेक्टिन पॉलीयूरोनिक एसिड42,43,44 के अम्लीय समूहों का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह पेक्टिन के लिए विशिष्ट है और सेल की दीवार के अन्य कार्बोहाइड्रेट घटकों (यानी, सेल्यूलोज या कैलोज़) को दाग नहीं देता है। विभिन्न संरचनात्मक और जैव रासायनिक रीढ़ में व्यवस्थित गैलेक्टुरोनिक एसिड की श्रृंखलाएं पेक्टिन 8,9,45 की रचना करती हैं। सेल की दीवार के लिए रूथेनियम लाल की प्रतिक्रियाशीलता मिथाइल एस्टरिफिकेशन11 की डिग्री पर निर्भर करती है। मिथाइल एस्टरिफिकेशन की डिग्री पेक्टिन मिथाइल एस्टेरेसेस (पीएमई) की गतिविधि पर निर्भर करती है, और इस प्रकार रूथेनियम लाल का उपयोग पीएमई गतिविधि11 को भेदभाव करने के लिए एक उपकरण के रूप में भी किया गया था।

इस प्रकार, यहां वर्णित डबल-स्टेनिंग विधि पौधे-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन संशोधनों को सत्यापित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। लेखकों के सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह कॉफी जंग कवक के haustorial encapsulation में पेक्टिन की पहली रिपोर्ट है। दिलचस्प बात यह है कि, फंगल संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए, पेक्टिन-समृद्ध सेल की दीवार को होने वाले नुकसान का वर्णन करने और कवक प्रजनन संरचनाओं को सत्यापित करने के लिए डबल-स्टेनिंग विधि भी महत्वपूर्ण थी। जंग, एंथ्राकनोज़, सर्कोस्पोरिओसिस, स्मट्स और अन्य बायोट्रोफिक, हेमीबियोट्रोफिक, और नेक्रोट्रोफिक प्लांट-फंगल इंटरैक्शन पर आगे हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन विभिन्न पैथोसिस्टम में इस तकनीक के संभावित उपयोग की जांच करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक इस काम को विकसित करने के लिए समर्थन के लिए डॉ हडसन डब्ल्यू पी डी कार्वाल्हो को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला के आभारी हैं "प्रोफेसर इलियट वातानाबे किताजिमा" प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा प्रदान करने के लिए। लेखकों ने घावों के साथ पौधे की सामग्री की आपूर्ति के लिए डॉ फ्लाविया रोड्रिग्स अल्वेस पैट्रिसियो को धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

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जीव विज्ञान अंक 180 कॉफी कवक haustorium हिस्टोकेमिस्ट्री पेक्टिन माइक्रोस्कोपी
संयंत्र-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए डबल-स्टेनिंग विधि
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Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

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