Summary
I denne artikel præsenterer vi en protokol til påvisning af mikrotubulusbelastede oligodendrocytter i en model af tubulinopati gennem en simpel, innovativ anden harmonisk generations mikroskopi-tilgang.
Abstract
Den tilfredsstillende visualisering af cytoskeletale komponenter i hjernen er udfordrende. Den allestedsnærværende fordeling af netværkene af mikrotubuli, mikrofilamenter og mellemliggende filamenter i alle neurale væv sammen med variabiliteten i resultaterne af fluorescerende proteinfusionsstrategier og deres begrænsede anvendelighed til dynamiske undersøgelser af antistoffer og lægemidler som kromoforkøretøjer gør klassiske optiske tilgange ikke så effektive som for andre proteiner. Når tubulin skal undersøges, er den etiketfrie generering af anden harmonisk en meget passende mulighed på grund af molekylets ikke-centrosymmetriske organisation. Denne teknik, når den konjugeres til mikroskopi, kan kvalitativt beskrive den volumetriske fordeling af parallelle bundter af mikrotubuli i biologiske prøver med den yderligere fordel at arbejde med friske væv, der er ufikserede og upermeabiles. Dette arbejde beskriver, hvordan man afbilder tubulin med en kommerciel anden harmonisk generations mikroskopiopsætning for at fremhæve mikrotubuli i de tubulinberigede strukturer af oligodendrocytterne, som i hypomyelinering med atrofi af basalganglierne og cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nyligt beskrevet myelinforstyrrelse.
Introduction
Den optiske billeddannelse af cytoskeletale strukturer i væv og organpræparater er ikke en nem opgave. Cytoskeletale filamenter er allestedsnærværende, så hvis generisk farvning udføres, for eksempel mod alfa-tubulin eller beta-actin eller potentielt keratin i en epitelprøve, vil signalet sandsynligvis blive fordelt ret homogent over hele prøven. For at begrænse farvningen til en mere meningsfuld delmængde af cellulære komponenter kan man enten bruge transgene mus med målrettet ekspression1 eller planlægge at bruge isoformspecifikke antistoffer. Mens meget få af sidstnævnte er på markedet (og meget få findes overhovedet 2,3,4), kan en transgen dyremodel være tilgængelig. Det skal dog erhverves af laboratoriet og have det ordentligt til huse med alle de udgifter, der er involveret i processen. Visse antistoffer eller kemikalier, f.eks. fluoroforkonjugerede lægemidler som phalloidin eller paclitaxel, kan være helt eller delvist uforenelige med anvendelse i levende celler eller væv, hvilket begrænser deres anvendelighed til kun at omfatte undersøgelser af faste prøver.
I tilfælde af tubulin skal der tages hensyn til et yderligere aspekt, som er polymerens følsomhed over for fiksering. Konventionel kemisk fiksering med formaldehyd er kendt for ikke at være tilstrækkelig til optimalt at bevare integriteten af mikrotubuli5. Derudover bekræfter en nylig rapport, at formaldehydtværbinding inducerer subtile ændringer i mikrotubuliens ultrastruktur, svarende til hvad der sker med bindingen af nogle lægemidler eller fysiologiske molekyler såsom GTP6.
Den direkte visualisering af mikrotubuli i ufarvede, ikke-fikserede prøver er derfor ofte ønskelig. For at opnå dette er en teknisk løsning anden harmonisk generation (SHG) mikroskopi7, som er baseret på evnen af bundter af parallelle mikrotubuli til at fungere som harmonoforer og udsende frekvensfordoblet lys, når det belyses korrekt med en intens, pulserende infrarød laser. Selvom et stærkere og mere stabilt andet harmonisk signal kan genereres fra kollagen og myosin, som er de eneste to andre biologiske materialer, der vides at være i stand til frekvensfordobling, er signalet fra tubulin hidtil blevet brugt mest til at studere mitotiske spindelomlægninger 8,9,10 og aksonal mikrotubulusmorfologi11,12,13.
I dette arbejde introducerer vi en ny anvendelse af SHG-mikroskopi som et diagnostisk værktøj til at skelne centralnervesystem (CNS) væv, der er påvirket af tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati fra deres raske modstykker14. Nogle af de mutationer, der forekommer i denne overvejende neurale isoform af tubulin, som dem, der forårsager hypomyelinering og atrofi af de basale ganglier og cerebellum (H-ABC), inducerer mikrotubulusoverfyldning i oligodendrocytterne15,16; De cytoskeletale ændringer er igen forbundet med nedstrøms effekter som dysmyelinisering, med dyb svækkelse af de motoriske og sensoriske veje16,17,18,19. Taiep-murinmodellen, der anvendes i dette arbejde, viser unormalt mikrotubulusindhold i oligodendrocytterne og rekapitulerer de fleste af de sensorisk-motoriske symptomer hos H-ABC-patienter17. Protokollen forklarer, hvordan man afbilder strukturer som corpus callosum og cerebellum, som normalt er stærkt myelinerede, og som er alvorligt påvirket hos humane patienter såvel som hos taiep rotte19, for at fremhæve forskellene i SH-signaler mellem sundt og mutant væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne procedurer blev udført i overensstemmelse med de love og koder, der er godkendt i den syvende titel i forordningen om den mexicanske regerings generelle sundhedslov vedrørende sundhedsforskning (NOM-062-ZOO-1999) og i overensstemmelse med anbefalingerne fra National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af det institutionelle udvalg for bioetik i forskning ved Universidad de Guanajuato og Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Indstillinger for mikroskop
- Tænd mikroskopisystemet.
- Tænd pulslaseren for at sikre, at den er klar til at lase ved et optimalt og stabilt effektniveau efter prøveekstraktion og klargøring.
- Indstil laseren til 810 nm. For at studere tissulære mikrotubuli anvendes 10% -20% af den tilgængelige lasereffekt, hvilket i det beskrevne system svarer til 13-26 mW målt ved målets bageste brændplan.
- Sørg for, at mikroskopet er Köhler-justeret (supplerende fil 1) med det formål, der vil blive brugt til SHG-billeddannelsen.
BEMÆRK: Dette er vigtigt, da detektionen i den kommercielle opsætning, der bruges i dette arbejde, udføres i transmissionstilstand og gennem kondensatoren. - Fjern uønskede filtre fra den optiske registreringssti (figur 1A).
- Sørg for, at kondensatormembranen er helt åben for at sikre, at intet lys stoppes unødigt på dette niveau.
- Forbered et 25x/0,8 numerisk blænde (NA) olienedsænkningsmål med en lille dråbe nedsænkningsolie i objektivet.
BEMÆRK: Dette mål blev brugt til bedst at matche kondensatorens NA, som var 0,55 (ideelt set NAcond≥ NAobj).
2. Indledende mikroskopkontrol
BEMÆRK: Udfør de indledende mikroskopkontroller én gang, medmindre opsætningen ændres.
- Billede tør majsstivelse klemt inde mellem glasglas med SHG-parametre for at generere SHG-billeder, der afslører laserpolarisationsretningen. Følg de trin, der er rapporteret i supplerende fil 2, bortset fra lasereffekten, som er mindre end 5% for majsstivelse.
- Tag et billede af sparsomme majsstivelseskorn, og markér orienteringen af SHG-lobulerne i x-y-planet. Denne retning svarer til laserretningen (figur 2A).
- Som kontrol skal du tage et andet billede af den samme prøve og indsætte en halvbølgeplade i den optiske sti (position vist i figur 1A) for at ændre laserens svingningsretning. Det resulterende billede viser roterede SHG-signallobuler (figur 2B, C).
- Hvis du bruger en anden type båndpasfilter til SHG, skal du sørge for, at det har optimale transmissionsegenskaber ved at sammenligne billederne (figur 2D, E) og signalintensiteterne pixel for pixel langs en linjescanning (figur 2F).
3. Ekstraktion af væv
BEMÆRK: Brug altid rene værktøjer til at udføre de kirurgiske procedurer.
- Brug 6-12 måneder gamle taiep rotter og aldersmatchede Sprague-Dawley kontroller (WT).
- Bedøv dyrene med en i.p. injektion af en blanding af ketamin-xylazin (0,125 mg / kg og 5 mg / kg) fortyndet i en 0,9% steril NaCl-opløsning.
- Kontroller smertereflekserne, og fortsæt kun, hvis de er fraværende.
- Ofre dyret via halshugning.
- Når hovedet er isoleret, skal du åbne knoglerne i kraniehvelvet forsigtigt langs midterlinjen, startende fra det mest kaudale punkt øverst mod næsen, fra orbitalhulrummene mod midterlinjen og derefter fra det mest kaudale punkt til under hjernen og lillehjernen.
BEMÆRK: Bone cutters og Rongeurs giver mulighed for korrekt fjernelse af hovedbenene uden at beskadige hjernens strukturer. - Frigør hjernen og lillehjernen fra knoglen. De to halvkugler kunne adskilles. Hvis halvkuglerne er delt, skal du bruge den ene halvdel til SHG-billeddannelse og fastgøre den anden halvdel i 3,7% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvand (PBS) i 20 minutter inde i en kemisk hætte til efterfølgende sektionering og farvning.
4. Vibratomsektionering
- Forbered en vibratombufferbakke fyldt med varm (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Fastgør hjernen til prøvepladen ved hjælp af cyanoacrylatlim via et stykke maskeringstape. Den mest kaudale del/region kommer i kontakt med limen, så de anvendelige koronale sektioner fra den modsatte, rostrale del kan skæres.
- Tillad ~ 10 s for limen at polymerisere for at opnå effektiv fastgørelse af prøven.
BEMÆRK: De bedste resultater opnås, når hjernen er orienteret, så bladet skærer "fra top til bund" i stedet for "fra side til side" (figur 1B).
- Tillad ~ 10 s for limen at polymerisere for at opnå effektiv fastgørelse af prøven.
- Overfør prøvepladen til dens magnetiske understøtning inde i bufferbakken.
- Begynd at skære 300-500 μm sektioner, indtil de producerede skiver omfatter hele hjernens overflade.
- På dette tidspunkt reduceres sektionens tykkelse til 160 μm.
- Når en komplet sektion på 160 μm er skåret på niveau med corpus callosum, genvindes den med en modificeret Pasteur-pipette af glas med en stor, flammet åbning (figur 1C).
- Overfør den til en ren petriskål med ny varm HBSS eller direkte på glasstøtten til mikroskopi (coverslip eller glasbundskål).
BEMÆRK: For de beskrevne eksperimentelle betingelser er tilføjelse af en dækseddel over prøven skadelig for billeddannelsen.
5. Overførsel til mikroskopet
- Hvis mikroskopet er i et andet rum, skal du forberede en isoleret kasse med opvarmede gelpakker for at overføre vævssektionerne, samtidig med at temperaturen opretholdes. Kassen tjener også til at holde sektionerne varme, indtil de er afbildet.
- Sæt prøven under mikroskopet, og sørg for, at den er placeret korrekt under målet ved direkte observation gennem okularen med transmitteret lys.
BEMÆRK: Målet er at justere de forudsagte emitterende strukturer med laserens svingningsretning for at maksimere det udsendte (og derfor detekterede) SHG-signal. - Fjern overskydende HBSS, så en tynd flydende film dækker hele prøven. Kontroller visuelt den flydende film hvert par minutter for at undgå overdreven fordampning og tørring af prøven.
BEMÆRK: Under de beskrevne forhold anvendes et afsnit i højst 20 min. Tørring af prøven forårsager drastiske kunstige virkninger (supplerende figur 1A). I stedet for at tilføje mere HBSS anbefales periodisk iblødsætning af sektionen i varmt, frisk medium, hvis der er behov for længere billedbehandlingstider. Brug af perfusionskamre og lim eller lavsmeltende agarose til immobilisering af vævet anbefales også, når længere forsøg skal udføres. - Forbered mikroskoptrinnet til ikke-desscannet billeddannelse, hvilket kan omfatte lukning af alle dørene til det mørke inkubationskammer eller dækning af inkubationskammeret med et sort nylonpolyurethanbelagt stof.
6. Billedbehandling
- Vælg den "ikke-afscannede" billedbehandlingstilstand langs transmissionsstien. På denne måde optimeres optagelsen af det svage SH-signal fra tubulin.
- Vælg målsætningen LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
- Indstil en lasereffekt mellem 13 mW og 26 mW med en pixelopholdstid på 12,6 μs. Tag billeder, der ikke er større end 512 pixels x 512 pixels, med hastighed 5 og gennemsnit 2, for en gennemsnitlig anskaffelsestid på ca. 15 s.
BEMÆRK: Brug af højere lasereffekt og/eller længere opholdstider kan beskadige prøven (supplerende figur 1B). - Tag billeder først ved hjælp af et 485 nm kortpasfilter (SP485), og tilføj i et andet trin et skarpt 405 nm båndpasfilter (BP405; Figur 3). Følg de trin, der er rapporteret i supplerende fil 2.
BEMÆRK: Pseudo-brightfield-billeder kan tages gennem den samme detektor ved hjælp af det resterende laserlys på en synlig linje (405 nm eller 488 nm lasere fungerer bedst).
7. Behandling af cerebellum
- Skær først lillehjernen med en skalpel i to halvkugler, og lim dem derefter på vibratomstøtten ved den midterste del (den flade del opnået efter skæring).
- Snit og billede lillehjernen på samme måde som beskrevet for hjernen (160 μm sektioner, samme vibratomindstillinger, samme blad, samme mikroskopindstillinger osv.).
BEMÆRK: På grund af lillehjernens anatomi er dens orientering i øjeblikket af sektionering ikke kritisk; I de fleste af de skiver, der genereres væk fra overfladen, vil der være folia snittet godt ind i den hvide substans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billederne opnået med denne metode har et iboende lavt baggrundsniveau på grund af det meget begrænsede antal harmonoforer, der er til stede i biologiske væv, hvilket er en af de væsentlige fordele ved metoden.
Når fibrene i corpus callosum er afbildet, kan fiberlignende korte strukturer og afrundede elementer konsekvent findes i taiephjernen (figur 3B), mens corpus callosum i kontrolhjernen viser et meget mere heterogent og isotropt signal i hele hjerneområdet (figur 3A). Oprindelsen til differentialsignalet ligger specifikt i fænomenet anden harmonisk generation, da tilføjelse af det smalle båndpasfilter kun reducerer den ikke-specifikke signalintensitet fra kontrolbillederne (figur 3C-D), mens selektivt fjerner dette lave, diffuse signal fra omkring de soma-lignende og de korte, aflange strukturer i taiep-billederne, som altid genererer intenst SH-lys (figur 3E-F).
Den anden analyserede struktur, cerebellær hvid substans, giver sammenlignelige resultater. Specifikt, mens der i kontrolvæv er et næsten fuldstændigt fravær af SH-signal (figur 4B), og Purkinje-cellerne næppe er synlige, når man bruger kortpasfilteret, fortsætter de aflange og afrundede strukturer i SH-billedet fra taiep-vævet (figur 4D).
Figur 1: Mikroskop og sektionering . (A) Skematisk oversigt over det anvendte mikroskop med relevante komponenter fremhævet. Pile: 1 = NDD-port, hvor SP485 er placeret tæt på detektoren; 2 = aftagelige rammer, hvor BP405 er placeret; 3 = position under målet, hvor halvbølgepladen (HWP) anbringes til kontrolforsøg. Indsatsen viser rammen, hvor HWP kunne indsættes. (B) Set ovenfra vibratombufferbakken med den limede hjerne klar til at blive finsnittet. (C) Den originale (øverste) og modificerede (nederste) Pasteur-pipette, der blev brugt til at overføre sektionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Indledende kontrol. (A) SHG-signalet, der udsendes af majsstivelseskorn, viser en fremherskende orientering, der falder sammen med laserens svingningsretning (vandret i dette tilfælde). (B) Efter indsættelse af en halvbølgeplade med sin hurtige akse orienteret 45° i forhold til vandret, drejes signalet 90°. C) Fletning af signalet før og efter indsættelsen af halvbølgepladen. D) Det signal under 485 nm, der udsendes fra majsstivelseskornene. E) SHG-signalet fra stivelseskornene detekteret ved 405/10 nm. (F) Graf, der viser en sammenligning af de to signaler svarende til linjescanningerne vist i de zoomede indsatser i D og E. Det anvendte SHG-filter forårsager ubetydeligt signaltab. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: SHG billeder fra taiep og WT corpus callosum. Repræsentative eksempler på (A) WT og (B) taiep signaler opnået fra corpus callosum. (C) SP485-filtreret billede fra et WT-korpus callosum. (D) BP405-filtreret billede fra samme prøve som i C. (E) SP485-filtreret billede fra et taiep corpus callosum. (F) BP405 filtreret billede af samme prøve som i E. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: SHG billeder fra taiep og WT cerebellums. Repræsentative eksempler på (A-B) WT og (C-D) taiep signaler opnået fra cerebellar folia. (A) Et SP485-filtreret billede fra et WT-folium; kun nogle Purkinje-celler er synlige. (B) Et BP405-filtreret billede fra samme prøve som i A. (C) Et SP485-filtreret billede fra et taiep folium. D) Et BP405-filtreret billede af samme prøve som i C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Eksempler på artefakter. (A) Artefakt på grund af tørring af prøven. (B) Artefakt på grund af overdreven eksponering. Skalabjælker: 30 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Köhler-linjeføring. Filen præsenterer trinnene til udførelse af Köhler-justeringen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: ZEN-softwaretrin til SHG-billedoptagelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHG-mikroskopi er en del af en gruppe af ikke-lineære optiske teknikker, som omfatter to-foton excitationsmikroskopi, tredje harmonisk generationsmikroskopi og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredningsmikroskopi, der har bidraget til at udvide anvendelsesområdet for konventionel optisk mikroskopi til biovidenskab20.
Specifikt vedrører den største styrke og svaghed ved SHG-mikroskopi den samme tilstand: signalgeneratoren er ikke-centrosymmetrisk21. En sådan specifik arkitektonisk tilstand findes ofte inden for uorganiske og organiske krystaller, men er sjælden blandt biologiske objekter. Sammen med kollagen og muskulært myosin er mikrotubuli i stand til at generere et andet harmonisk signal22, som kan detekteres med et mikroskop, hvis der forekommer tilstrækkelig summation i bundterne af parallelle polymerer. Inde i cellerne associerer tubulin til dannelse af parallelle bundter i kernerne af axoner (en celletypespecifik placering), i mitotiske spindler (en tidsspecifik fordeling) og, som præsenteret i dette arbejde, i varemærket mikrotubulusforening af en nyligt beskrevet tubulinopati-hypomyelinering med atrofi af basale ganglier og cerebellum eller H-ABC (som repræsenterer den første rapporterede patologiske fordeling af denne art)14, 16,23.
Dette sensorisk-motoriske syndrom er stadig en forældreløs sygdom, da mange neurologer endnu ikke er bekendt med alle symptomerne og / eller ikke har råd til genetisk screening af mistænkte patienter for at bekræfte diagnosen, hvilket meget sandsynligt forårsager underdiagnose, i det mindste i nogle populationer. Derudover er der ikke meget kendt om patologien på molekylært og cellulært niveau, så de teknikker, der kan hjælpe med at kaste lys over de specifikke mekanismer i denne degenerative proces, er meget værdifulde, også på et grundlæggende niveau.
Derfor foreslås to anvendelser af SHG-mikroskopi vedrørende denne myelinforstyrrelse. På lang sigt kan SHG-mikroskopi integreres i diagnostiske tilgange til biopsiscreening eller direkte intrakraniel analyse, men den største indvirkning kan være forbundet med at forsøge at dechiffrere sygdommens molekylære grundlag.
Der er mange fordele ved SHG-mikroskopi i forhold til andre mikroskopiteknikker. Faktisk kræver SHG-mikroskopi ikke fiksering af vævet, hvilket er et særligt delikat trin i prøveforberedelsen i tilfælde af mikrotubuli og kræver ikke farvning af nogen art. Den største fordel er relateret til det involverede fysiske fænomen. På den ene side giver den på grund af den næsten fraværende baggrund høj kontrast på trods af de svage genererede signaler, og på den anden side, da de lysintensiteter, der er nødvendige for frekvensfordobling, er meget høje, og disse intensiteter kun opfyldes i et meget begrænset volumen af prøven, giver teknikken iboende optisk sektionering, hvilket muliggør 3D-rekonstruktioner.
De største begrænsninger ved denne mikroskopiteknik er relateret til omkostningerne ved udstyret. Et godt konfokalmikroskop sammen med en pulserende infrarød (IR) laser er nødvendig til denne applikation, og selvom et to-foton excitationssystem er tilgængeligt i mange neurovidenskabslaboratorier, som let kan ændres til en SHG-opsætning, er forskellen i omkostninger sammenlignet med en konventionel epifluorescensopsætning stadig betydelig. Derudover påvirkes dens opløsning som en diffraktionsbegrænset teknik af brugen af IR-lys til belysning.
Som med mange banebrydende applikationer var de opsætninger, der blev brugt til de tidlige eksperimenter med SHG-mikroskopi anvendt til biovidenskaben, helt tilpassede optiske opsætninger bygget som åbne systemer 11,24,25, hvilket gav eksperimenterne mulighed for at optimere hver enkelt komponent. Da det i life science-laboratorier er mere almindeligt at have adgang til et kommercielt setup, ønskede vi at teste, om et af disse systemer er følsomt nok til at detektere det svage signal, der udsendes af bundter af tisulære mikrotubuli, som vides ikke at være så stærke harmonoforer som kollagen. LSM710 NLO-systemet fra Zeiss består af et omvendt konfokalmikroskop med moduler til ikke-scannet detektion i transmission og "epi" -tilstand og med en sammenhængende kamæleonjusterbar IR-laser. På grund af den sammenhængende karakter af SHG-fænomenet er det afgørende at vælge transmissionsvejen for at maksimere indsamlingen af frekvensfordoblet lys fra prøven, og derfor blev detektionen udført gennem 0,55 NA-kondensatoren ved integration. Et LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA nedsænkningsmål blev brugt til at belyse prøven fra bunden og tilnærme kondensatorens NA. Med de betingelser, der er beskrevet i dette papir, kunne vi pålideligt registrere et signal fra vævet, der bærer TUBB4A-mutationen, og dette signal var altid fraværende i kontrollerne.
I den rapporterede protokol krævede to trin justeringer for at opnå de bedste billeddannelsesforhold: tykkelsen af vævssektionen og åbningen af kondensatormembranen. Sektionerne skal være så tynde som muligt for at forhindre overdreven absorption, spredning og tab af SH-fotoner, især da målet er at afbilde i transmission på grund af det fysiske fænomens sammenhængende karakter. I vores tilfælde var den begrænsende faktor konsistensen af taiepvævet , hvilket forhindrede sektionering i homogent tykke sektioner under 160-180 μm. Med den konventionelle Köhler-justering lukkes kondensatormembranen normalt til ca. 60% af sit areal for at generere kontrast i det transmitterede lysbillede; Omvendt er målet for denne applikation at indsamle så mange fotoner som muligt, derfor den samlede åbning af membranen.
Denne anvendelse af SHG-mikroskopi er vigtig, da den giver mulighed for at skelne tubulinrig versus tubulin-normalt væv, hvor det tubulinrige væv udsender et detekterbart signal. Det er også muligt, at andre endnu ikke beskrevne tubulinopatimutationer forårsager cytoskeletale lidelser i andre væv26, hvilket også kan involvere tubulinberigelse.
Med hensyn til andre mulige anvendelser kunne SHG-mikroskopi udvides til undersøgelse af svagere signaler, som dem, der er til stede i tubulin-normalt væv, i fine, dissocierede axoner eller i intracellulære bundter med blandet polaritet. For at gøre dette kan opsætningsændringer, såsom udskiftning af luftkondensatoren med en med en højere numerisk blænde og / eller med nedsænkning eller brug af en mere følsom detektor, gøre en vigtig forskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) gennem følgende tilskud: infraestructura 226450 til VP-CIO, infraestructura 255277 til VP og FORDECYT-PRONACES/194171/2020 til V.H. Vi anerkender støtten fra Juvenal Hernández Guevara hos CIO i videofremstillingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
