Summary
Dans cet article, nous présentons un protocole pour détecter les oligodendrocytes chargés de microtubules dans un modèle de tubulopathie grâce à une approche simple et innovante de microscopie de deuxième génération harmonique.
Abstract
La visualisation satisfaisante des composants du cytosquelette dans le cerveau est difficile. La distribution omniprésente des réseaux de microtubules, de microfilaments et de filaments intermédiaires dans tous les tissus neuraux, ainsi que la variabilité des résultats des stratégies de fusion de protéines fluorescentes et leur applicabilité limitée aux études dynamiques des anticorps et des médicaments en tant que véhicules chromophores, rendent les approches optiques classiques moins efficaces que pour d’autres protéines. Lorsque la tubuline doit être étudiée, la génération sans étiquette de secondes harmoniques est une option très appropriée en raison de l’organisation non centrosymétrique de la molécule. Cette technique, lorsqu’elle est conjuguée à la microscopie, peut décrire qualitativement la distribution volumétrique de faisceaux parallèles de microtubules dans des échantillons biologiques, avec l’avantage supplémentaire de travailler avec des tissus frais non fixés et non perméabilisés. Ce travail décrit comment imager la tubuline avec une installation commerciale de microscopie de deuxième génération d’harmoniques pour mettre en évidence les microtubules dans les structures enrichies en tubuline des oligodendrocytes, comme dans l’hypomyélinisation avec atrophie des noyaux gris centraux et la tubulinopathie du cervelet (H-ABC), un trouble de la myéline récemment décrit.
Introduction
L’imagerie optique des structures cytosquelettiques dans les tissus et les préparations d’organes n’est pas une tâche facile. Les filaments cytosquelettiques sont omniprésents, donc si une coloration générique est effectuée, par exemple, contre l’alpha-tubuline ou la bêta-actine ou potentiellement la kératine dans un échantillon épithélial, le signal sera probablement distribué de manière assez homogène dans tout l’échantillon. Pour limiter la coloration à un sous-ensemble plus significatif de composants cellulaires, on peut soit utiliser des souris transgéniques avec une expression ciblée1, soit envisager d’utiliser des anticorps spécifiques aux isoformes. Bien que très peu de ces derniers soient sur le marché (et très peu existent 2,3,4), un modèle animal transgénique pourrait être disponible. Cependant, il doit être acquis par le laboratoire et correctement logé, avec toutes les dépenses impliquées dans le processus. Certains anticorps ou produits chimiques, par exemple les médicaments conjugués au fluorophore comme la phalloïdine ou le paclitaxel, peuvent être partiellement ou totalement incompatibles avec l’utilisation dans des cellules ou des tissus vivants, limitant ainsi leur applicabilité aux seules études d’échantillons fixes.
Dans le cas de la tubuline, un aspect supplémentaire doit être pris en considération, à savoir la sensibilité du polymère à la fixation. La fixation chimique conventionnelle avec le formaldéhyde est connue pour ne pas être adéquate pour préserver de manière optimale l’intégrité des microtubules5. De plus, un rapport récent confirme que la réticulation du formaldéhyde induit des changements subtils dans l’ultrastructure du microtubule, similaires à ce qui se passe avec la liaison de certains médicaments ou molécules physiologiques tels que GTP6.
La visualisation directe des microtubules dans des échantillons non colorés et non fixés est donc souvent souhaitable. Pour y parvenir, une solution technique est la microscopie de deuxième génération harmonique (SHG) 7, qui repose sur la capacité de faisceauxde microtubules parallèles à agir comme des harmonophores et à émettre une lumière doublée en fréquence lorsqu’ils sont correctement éclairés avec un laser infrarouge intense et pulsé. Bien qu’un second signal harmonique plus fort et plus stable puisse être généré à partir du collagène et de la myosine, qui sont les deux seuls autres matériaux biologiques connus pour être capables de doubler la fréquence, le signal de la tubuline a été utilisé jusqu’à présent principalement pour étudier les réarrangements mitotiquesdu fuseau 8,9,10 et la morphologie des microtubules axonaux11,12,13.
Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle utilisation de la microscopie SHG comme outil de diagnostic pour distinguer les tissus du système nerveux central (SNC) affectés par la tubuline bêta 4 A (TUBB4A) tubulopathie de leurs homologues sains14. Certaines des mutations survenant dans cette isoforme principalement neurale de la tubuline, comme celles provoquant l’hypomyélinisation et l’atrophie des noyaux gris centraux et du cervelet (H-ABC), induisent un surremplissage des microtubules dans les oligodendrocytes15,16; Les altérations du cytosquelette, à leur tour, sont associées à des effets en aval comme la dysmyélinisation, avec une altération profonde des voies motrices et sensorielles16,17,18,19. Le modèle murin de taiep utilisé dans ce travail présente une teneur anormale en microtubules dans les oligodendrocytes et récapitule la plupart des symptômes sensori-moteurs des patients H-ABC17. Le protocole explique comment imager des structures comme le corps calleux et le cervelet, qui sont généralement fortement myélinisés et qui sont gravement affectés chez les patients humains ainsi que chez le rat taiep 19, pour mettre en évidence les différences dans les signaux SH entre les tissus sains et mutants.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux lois et codes approuvés dans le septième titre du règlement de la loi générale sur la santé concernant la recherche en santé du gouvernement mexicain (NOM-062-ZOO-1999) et conformément aux recommandations du Guide des instituts nationaux de santé pour le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation et ont été approuvées par le comité institutionnel de bioéthique dans la recherche de l’Université de Guanajuato et de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Réglages du microscope
- Allumez le système de microscopie.
- Allumez le laser pulsé pour garantir qu’il sera prêt à être lasé à un niveau de puissance optimal et constant après l’extraction et la préparation de l’échantillon.
- Réglez le laser à 810 nm. Pour étudier les microtubules tissulaires, 10% à 20% de la puissance laser disponible est utilisée, ce qui, dans le système décrit, correspond à 13-26 mW mesurée au plan focal arrière de l’objectif.
- Assurez-vous que le microscope est aligné sur Köhler (dossier supplémentaire 1), avec l’objectif qui sera utilisé pour l’imagerie SHG.
NOTE: Ceci est important car, dans la configuration commerciale utilisée dans ce travail, la détection est effectuée en mode transmission et à travers le condensateur. - Retirez les filtres indésirables du chemin de détection optique (Figure 1A).
- Assurez-vous que le diaphragme du condensateur est complètement ouvert pour vous assurer qu’aucune lumière n’est inutilement arrêtée à ce niveau.
- Préparez un objectif d’immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 25x/0,8 avec une petite goutte d’huile d’immersion dans l’objectif.
REMARQUE: Cet objectif a été utilisé pour correspondre au mieux au condensateur NA, qui était de 0,55 (idéalement, NAcond≥ NAobj).
2. Contrôles préliminaires au microscope
REMARQUE: Effectuez les contrôles préliminaires du microscope une fois, sauf si la configuration est modifiée.
- Image amidon de maïs sec pris en sandwich entre des lames de verre avec des paramètres SHG pour générer des images SHG qui révèlent la direction de polarisation laser. Suivez les étapes indiquées dans le dossier supplémentaire 2, sauf pour la puissance laser, qui est inférieure à 5 % pour l’amidon de maïs.
- Prenez une image de grains clairsemés d’amidon de maïs et marquez l’orientation des lobules SHG dans le plan x-y. Cette orientation correspond à l’orientation laser (Figure 2A).
- Comme contrôle, prendre une autre image du même échantillon, en insérant dans le chemin optique une plaque demi-onde (position montrée à la figure 1A) pour modifier la direction d’oscillation du laser. L’image résultante montre des lobules de signal SHG tournés (Figure 2B, C).
- Si vous utilisez un autre type de filtre passe-bande pour le SHG, assurez-vous qu’il possède des propriétés de transmission optimales en comparant les images (Figure 2D, E) et les intensités du signal pixel par pixel le long d’un balayage linéaire (Figure 2F).
3. Extraction tissulaire
REMARQUE: Utilisez toujours des outils propres pour effectuer les interventions chirurgicales.
- Utilisez des rats taiep âgés de 6 à 12 mois et des témoins Sprague-Dawley appariés selon l’âge (WT).
- Anesthésier les animaux par injection intraveineuse d’un mélange de kétamine-xylazine (0,125 mg/kg et 5 mg/kg) dilué dans une solution de NaCl stérile à 0,9 %.
- Vérifiez les réflexes douloureux et ne procédez que s’ils sont absents.
- Sacrifiez l’animal par décapitation.
- Une fois la tête isolée, ouvrez soigneusement les os de la voûte crânienne le long de la ligne médiane, en partant du point le plus caudale en haut vers le nez, des cavités orbitaires vers la ligne médiane, puis du point le plus caudale au-dessous du cerveau et du cervelet.
REMARQUE: Les coupe-os et les rongeurs permettent d’enlever correctement les os de la tête sans endommager les structures cérébrales. - Libérez le cerveau et le cervelet de l’os. Les deux hémisphères pourraient être séparés. Si les hémisphères sont divisés, utiliser une moitié pour l’imagerie SHG et fixer l’autre moitié dans du paraformaldéhyde à 3,7% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 20 minutes à l’intérieur d’une hotte chimique pour la section et la coloration ultérieures.
4. Sectionnement du vibratome
- Préparez un plateau tampon vibratome rempli de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) tiède (37 °C).
- Fixez le cerveau à la plaque d’échantillon à l’aide de colle cyanoacrylate via un morceau de ruban de masquage. La partie / région la plus caudale entre en contact avec la colle afin que les sections coronales utilisables de la partie opposée, rostrale, puissent être coupées.
- Laisser ~10 s pour que la colle polymérise afin d’obtenir une fixation efficace de l’échantillon.
REMARQUE : Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le cerveau est orienté de manière à ce que la lame coupe « de haut en bas » plutôt que « d’un côté à l’autre » (Figure 1B).
- Laisser ~10 s pour que la colle polymérise afin d’obtenir une fixation efficace de l’échantillon.
- Transférer la plaque d’échantillon sur son support magnétique à l’intérieur du plateau tampon.
- Commencez à couper des sections de 300 à 500 μm jusqu’à ce que les tranches produites englobent toute la surface du cerveau.
- À ce stade, réduisez l’épaisseur de la section à 160 μm.
- Une fois qu’une section complète de 160 μm est découpée au niveau du corps calleux, la récupérer à l’aide d’une pipette Pasteur en verre modifiée avec un grand orifice enflammé (figure 1C).
- Transférez-le dans une boîte de Petri propre avec un nouveau HBSS chaud ou directement sur le support en verre pour la microscopie (lamelle de couverture ou boîte à fond de verre).
REMARQUE : Pour les conditions expérimentales décrites, l’ajout d’une lamelle de couverture au-dessus de l’échantillon est préjudiciable à l’imagerie.
5. Transfert au microscope
- Si le microscope se trouve dans une autre pièce, préparez une boîte isotherme avec des sachets de gel chauffés pour transférer les sections de tissu tout en maintenant la température. La boîte sert également à garder les sections au chaud jusqu’à ce qu’elles soient imagées.
- Placez l’échantillon au microscope et assurez-vous qu’il est correctement positionné sous l’objectif par observation directe à travers les oculaires avec lumière transmise.
REMARQUE: L’objectif est d’aligner les structures émettrices prévues avec la direction d’oscillation du laser afin de maximiser le signal SHG émis (et, par conséquent, détecté). - Retirez l’excès HBSS de sorte qu’un film liquide mince recouvre tout l’échantillon. Vérifiez visuellement le film liquide toutes les quelques minutes pour éviter une évaporation et un séchage excessifs de l’échantillon.
NOTE: Dans les conditions décrites, une section est utilisée pendant 20 minutes au maximum. Le séchage de l’échantillon provoque des effets artificiels drastiques (figure supplémentaire 1A). Plutôt que d’ajouter plus de HBSS, un trempage périodique de la section dans un milieu chaud et frais est recommandé si des temps d’imagerie plus longs sont nécessaires. L’utilisation de chambres de perfusion et de colle ou d’agarose à bas point de fusion pour immobiliser le tissu est également recommandée lorsque des expériences plus longues doivent être effectuées. - Préparez l’étape du microscope pour l’imagerie non numérisée, ce qui peut inclure la fermeture de toutes les portes de la chambre d’incubation sombre ou le recouvrement de la chambre d’incubation avec un tissu enduit de polyuréthane en nylon noir.
6. Imagerie
- Sélectionnez le mode d’imagerie « non numérisé » le long du chemin de transmission. De cette façon, la capture du faible signal SH de la tubuline sera optimisée.
- Sélectionnez l’objectif LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
- Définissez une puissance laser comprise entre 13 mW et 26 mW, avec un temps de séjour en pixels de 12,6 μs. Prenez des images ne dépassant pas 512 pixels x 512 pixels, avec une vitesse de 5 et une moyenne de 2, pour un temps d’acquisition moyen d’environ 15 s.
REMARQUE : L’utilisation de puissances laser plus élevées et/ou de temps de séjour plus longs peut endommager l’échantillon (figure supplémentaire 1B). - Prenez d’abord des images à l’aide d’un filtre passe-court de 485 nm (SP485) et, dans un deuxième temps, ajoutez un filtre passe-bande de 405 nm (BP405; Graphique 3). Suivez les étapes indiquées dans le dossier supplémentaire 2.
REMARQUE: Les images pseudo-fond clair peuvent être prises à travers le même détecteur en utilisant la lumière laser résiduelle d’une ligne visible (les lasers 405 nm ou 488 nm fonctionnent mieux).
7. Traitement du cervelet
- Tout d’abord, coupez le cervelet avec un scalpel en deux hémisphères, puis collez-les au support du vibratome par la partie centrale (la partie plate obtenue après la coupe).
- Couper et imager le cervelet de la même manière que celle décrite pour le cerveau (coupes de 160 μm, mêmes réglages de vibratome, même lame, mêmes réglages de microscope, etc.).
NOTE: En raison de l’anatomie du cervelet, son orientation au moment de la section n’est pas critique; Dans la plupart des tranches générées loin de la surface, il y aura des folias sectionnées bien dans la substance blanche.
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Representative Results
Les images obtenues avec cette méthodologie ont un niveau de fond intrinsèquement bas en raison du nombre très limité de harmonophores présents dans les tissus biologiques, ce qui est l’un des avantages significatifs de la méthode.
Lorsque les fibres du corps calleux sont imagées, des structures courtes ressemblant à des fibres et des éléments arrondis peuvent être trouvés de manière cohérente dans le cerveau taiep (Figure 3B), tandis que le corps calleux du cerveau témoin montre un signal beaucoup plus hétérogène et isotrope dans toute la région du cerveau (Figure 3A). L’origine du signal différentiel réside spécifiquement dans le phénomène de deuxième génération harmonique, puisque l’ajout du filtre passe-bande étroit ne fait que diminuer l’intensité du signal non spécifique des images de contrôle (Figure 3C-D) tout en supprimant sélectivement ce signal faible et diffus autour du soma-like et les structures courtes et allongées dans les images taiep, qui génèrent toujours une lumière SH intense (Figure 3E-F).
L’autre structure analysée, la substance blanche cérébelleuse, donne des résultats comparables. Plus précisément, alors que dans le tissu témoin, il y a une absence presque totale de signal SH (Figure 4B), et que les cellules de Purkinje sont à peine visibles lors de l’utilisation du filtre passe-court, les structures allongées et arrondies persistent dans l’image SH du tissu taiep (Figure 4D).
Figure 1 : Microscope et sectionnement. (A) Schéma du microscope utilisé, avec les composants pertinents mis en évidence. Flèches : 1 = port NDD où se trouve le SP485 à proximité du détecteur ; 2 = cadres amovibles où le BP405 est placé; 3 = position sous l’objectif où la plaque demi-onde (HWP) est placée pour les expériences de contrôle. L’encart montre le cadre où le HWP pourrait être inséré. (B) Vue de dessus du plateau tampon du vibratome avec le cerveau collé prêt à être sectionné finement. (C) La pipette Pasteur originale (en haut) et modifiée (en bas) utilisée pour transférer les profilés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Contrôles préliminaires. (A) Le signal SHG émis par les grains d’amidon de maïs montre une orientation prédominante qui coïncide avec la direction d’oscillation du laser (horizontale dans ce cas). (B) Après insertion d’une plaque demi-onde avec son axe rapide orienté à 45° par rapport à l’horizontale, le signal est tourné de 90°. (C) Fusion du signal avant et après l’insertion de la plaque demi-onde. (D) Le signal en dessous de 485 nm émis par les grains d’amidon de maïs. E) Le signal SHG des grains d’amidon détectés à 405/10 nm. (F) Graphique comparant les deux signaux correspondant aux balayages linéaires montrés dans les inserts zoomés de D et E. Le filtre SHG utilisé entraîne une perte de signal négligeable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images SHG du corps calleux taiep et WT. Exemples représentatifs de signaux (A) WT et (B) taiep obtenus à partir du corps calleux. (C) Image filtrée SP485 à partir d’un corps calleux WT. (D) Image filtrée BP405 à partir du même échantillon que dans C. (E) Image filtrée SP485 à partir d’un corps calleux taiep. (F) Image filtrée BP405 du même échantillon que dans E. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images SHG des cervelets taiep et WT. Exemples représentatifs de signaux taiep (A-B) WT et (C-D) obtenus à partir de folia cérébelleux. A) Une image filtrée SP485 à partir d’un folium WT; seules certaines cellules de Purkinje sont visibles. (B) Une image filtrée BP405 provenant du même échantillon que dans A. (C) Une image filtrée SP485 à partir d’un folium taiep. (D) Une image filtrée BP405 du même échantillon que dans C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Exemples d’artefacts. (A) Artefact dû au séchage de l’échantillon. (B) Artefact dû à une exposition excessive. Barres d’échelle: 30 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 1 : alignement de Köhler. Le fichier présente les étapes pour effectuer l’alignement de Köhler. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : étapes du logiciel ZEN pour l’acquisition d’images SHG. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La microscopie SHG fait partie d’un groupe de techniques d’optique non linéaire, qui comprennent la microscopie à excitation à deux photons, la microscopie de troisième génération harmonique et la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente, qui ont contribué à élargir la gamme d’applications de la microscopie optique conventionnelle aux sciences de la vie20.
Plus précisément, la force et la faiblesse majeures de la microscopie SHG sont liées à la même condition: le générateur de signaux est non centrosymétrique21. Une telle condition architecturale spécifique se trouve souvent dans le domaine des cristaux inorganiques et organiques, mais est rare parmi les objets biologiques. Avec le collagène et la myosine musculaire, les microtubules sont capables de générer un deuxième signal harmonique22, qui peut être détecté au microscope si une sommation suffisante se produit dans les faisceaux de polymères parallèles. À l’intérieur des cellules, la tubuline s’associe pour former des faisceaux parallèles dans les noyaux des axones (un emplacement spécifique au type cellulaire), dans les fuseaux mitotiques (une distribution temporelle spécifique) et, comme présenté dans ce travail, dans l’association microtubule de marque d’une tubulinopathie-hypomyélinisation récemment décrite avec atrophie des noyaux gris centraux et du cervelet, ou H-ABC (qui représente la première distribution pathologique rapportée de ce type)14, 16,23.
Ce syndrome sensori-moteur est encore une maladie orpheline, car de nombreux neurologues ne connaissent pas encore tous les symptômes et/ou ne peuvent pas se permettre le dépistage génétique des patients suspects pour confirmer le diagnostic, ce qui provoque très probablement un sous-diagnostic, du moins dans certaines populations. En plus de cela, on ne sait pas grand-chose sur la pathologie au niveau moléculaire et cellulaire, de sorte que les techniques qui pourraient aider à faire la lumière sur les mécanismes spécifiques de ce processus dégénératif sont très précieuses, également à un niveau fondamental.
Par conséquent, deux utilisations de la microscopie SHG concernant ce trouble de la myéline sont proposées. À long terme, la microscopie SHG pourrait être intégrée dans les approches diagnostiques pour le dépistage par biopsie ou l’analyse intracrânienne directe, mais le plus grand impact pourrait être associé à la tentative de déchiffrer la base moléculaire de la maladie.
La microscopie SHG présente de nombreux avantages par rapport aux autres techniques de microscopie. En effet, la microscopie SHG ne nécessite pas la fixation du tissu, qui est une étape particulièrement délicate de la préparation de l’échantillon dans le cas des microtubules, et ne nécessite aucune coloration d’aucune sorte. Le plus grand avantage est lié au phénomène physique impliqué. D’une part, en raison de l’arrière-plan pratiquement absent, il fournit un contraste élevé malgré les faibles signaux générés, et d’autre part, comme les intensités lumineuses nécessaires au doublement de fréquence sont très élevées et que ces intensités ne sont rencontrées que dans un volume très restreint de l’échantillon, la technique fournit une section optique intrinsèque, permettant ainsi des reconstructions 3D.
Les principales limites de cette technique de microscopie sont liées au coût de l’équipement. Un bon microscope confocal, associé à un laser infrarouge pulsé (IR), est nécessaire pour cette application, et bien qu’un système d’excitation à deux photons soit disponible dans de nombreux laboratoires de neurosciences, qui peut être facilement modifié en une configuration SHG, la différence de coût par rapport à une configuration d’épifluorescence conventionnelle est encore significative. De plus, en tant que technique à diffraction limitée, sa résolution est affectée par l’utilisation de la lumière IR pour l’éclairage.
Comme pour de nombreuses applications pionnières, les configurations utilisées pour les premières expériences sur la microscopie SHG appliquée aux sciences de la vie étaient des configurations optiques totalement personnalisées construites en tant que systèmes ouverts 11,24,25, donnant aux expérimentateurs la possibilité d’optimiser chaque composant. Puisque, dans les laboratoires de sciences de la vie, il est plus courant d’avoir accès à une installation commerciale, nous voulions tester si l’un de ces systèmes est suffisamment sensible pour détecter le faible signal émis par les faisceaux de microtubules tissulaires, qui ne sont pas connus pour ne pas être des harmonophores aussi puissants que le collagène. Le système LSM710 NLO de Zeiss se compose d’un microscope confocale inversé avec des modules pour la détection non numérisée en mode transmission et « epi » et avec un laser IR accordable Chameleon cohérent. En raison de la nature cohérente du phénomène SHG, il est crucial de sélectionner le chemin de transmission pour maximiser la collecte de la lumière doublée en fréquence de l’échantillon et, par conséquent, la détection a été effectuée via le condensateur 0,55 NA par intégration. Un objectif d’immersion LCI Plan-Neofluar 25X/0,8 NA a été utilisé pour éclairer l’échantillon par le bas et se rapprocher du condensateur NA. Avec les conditions décrites dans cet article, nous avons pu détecter de manière fiable un signal du tissu portant la mutation TUBB4A, et ce signal était toujours absent dans les contrôles.
Dans le protocole rapporté, deux étapes nécessitaient des ajustements pour obtenir les meilleures conditions d’imagerie : l’épaisseur de la section tissulaire et l’ouverture du diaphragme du condensateur. Les sections doivent être aussi minces que possible pour éviter une absorbance excessive, la diffusion et la perte de photons SH, d’autant plus que l’objectif est d’imager en transmission en raison de la nature cohérente du phénomène physique. Dans notre cas, le facteur limitant était la consistance du tissu taiep , qui empêchait la section en sections homogènes en dessous de 160-180 μm. Avec l’alignement Köhler conventionnel, le diaphragme du condensateur est généralement fermé à environ 60% de sa surface pour générer un contraste dans l’image lumineuse transmise; A l’inverse, pour cette application, l’objectif est de collecter un maximum de photons, d’où l’ouverture totale du diaphragme.
Cette application de la microscopie SHG est importante car elle offre la possibilité de distinguer les tissus riches en tubuline par rapport aux tissus normaux de tubuline, le tissu riche en tubuline émettant un signal détectable. Il est également possible que d’autres mutations de la tubulinopathie encore à décrire provoquent des troubles cytosquelettiques dans d’autres tissus26, qui peuvent également impliquer un enrichissement en tubuline.
En termes d’autres applications possibles, la microscopie SHG pourrait être étendue à l’étude de signaux plus faibles, comme ceux présents dans le tissu tubuline-normal, dans les axones fins dissociés ou dans les faisceaux intracellulaires à polarité mixte. Pour ce faire, des modifications de configuration, telles que le remplacement du condenseur d’air par un condenseur avec une ouverture numérique plus élevée et / ou avec immersion ou l’utilisation d’un détecteur plus sensible, pourraient faire une différence importante.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) à travers les subventions suivantes: infraestructura 226450 à VP-CIO, infraestructura 255277 à V.P., et FORDECYT-PRONACES/194171/2020 à V.H. Nous remercions Juvenal Hernández Guevara de CIO pour son soutien dans la réalisation de vidéos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
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