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Genetics

पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पुन: प्रयोज्य एकल सेल का उपयोग करके पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए एक एकल-कोशिका विधि का वर्णन करता है। पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका एक ही कोशिका में कई एपिजेनेटिक चिह्नों के विश्लेषण और परिणामों के सांख्यिकीय सत्यापन की अनुमति देती है।

Abstract

वर्तमान एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण एकल उपयोग के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। एकल उपयोग के बाद सेल को त्याग दिया जाता है, एक एकल सेल में कई एपिजेनेटिक चिह्नों के विश्लेषण को रोकता है और एकल सेल में प्रयोगात्मक पृष्ठभूमि शोर से सिग्नल को अलग करने के लिए अन्य कोशिकाओं से डेटा की आवश्यकता होती है। यह पेपर पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए एक ही एकल कोशिका का पुन: उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करता है।

इस प्रयोगात्मक विधि में, सेलुलर प्रोटीन को पहले प्रोटीन और डीएनए से क्रॉसलिंक करने के बजाय पॉलीक्रिलामाइड बहुलक में लंगर डाला जाता है, जिससे संरचनात्मक पूर्वाग्रह कम होता है। यह महत्वपूर्ण कदम एक ही एकल कोशिका के साथ बार-बार प्रयोगों की अनुमति देता है। इसके बाद, निकटता बंधाव के लिए एक मचान अनुक्रम के साथ एक यादृच्छिक प्राइमर को जीनोमिक डीएनए में लगाया जाता है, और जीनोमिक अनुक्रम को डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके विस्तार से प्राइमर में जोड़ा जाता है। इसके बाद, एक एपिजेनेटिक मार्कर और नियंत्रण आईजीजी के खिलाफ एक एंटीबॉडी, प्रत्येक को अलग-अलग डीएनए जांच के साथ लेबल किया जाता है, एक ही एकल कोशिका में संबंधित लक्ष्यों से बंधे होते हैं।

यादृच्छिक प्राइमर और एंटीबॉडी-डीएनए जांच के मचान अनुक्रम में पूरक अनुक्रमों के साथ एक कनेक्टर डीएनए जोड़कर यादृच्छिक प्राइमर और एंटीबॉडी के बीच निकटता बंधाव को प्रेरित किया जाता है। यह दृष्टिकोण निकटता बंधाव के एकल डीएनए उत्पाद में एंटीबॉडी जानकारी और आस-पास के जीनोम अनुक्रमों को एकीकृत करता है। एक ही एकल सेल के साथ बार-बार प्रयोगों को सक्षम करके, यह विधि एक दुर्लभ सेल से डेटा घनत्व में वृद्धि और एक ही सेल से केवल आईजीजी और एंटीबॉडी डेटा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देती है। इस विधि द्वारा तैयार पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को कम से कम कुछ महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में एपिजेनेटिक लक्षण वर्णन को व्यापक बनाने और डेटा घनत्व बढ़ाने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। यह विधि शोधकर्ताओं और उनकी परियोजनाओं को लचीलापन प्रदान करती है।

Introduction

सिंगल-सेल तकनीक सिंगल-सेल मल्टीओमिक्स के युग में प्रवेश कर रही है, जो व्यक्तिगत एकल-सेल ओमिक्सप्रौद्योगिकियों को एकीकृत करती है। हाल ही में, एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स को क्रोमैटिन पहुंच (एससीएनएमटी-सेक2 और शेयर-सेक3) या हिस्टोन संशोधनों (युग्मित-सेक4 और युग्मित-टैग5) का पता लगाने के तरीकों के साथ जोड़ा गया है। हाल ही में, एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स को क्रोमैटिन पहुंच (डोगमा-सेक6) के साथ एकीकृत किया गया था। ये विधियां क्रोमैटिन पहुंच या हिस्टोन संशोधनों का पता लगाने के लिए ट्रांसपोसेस-आधारित टैगिंग का उपयोग करती हैं।

ट्रांसपोसेस-आधारित दृष्टिकोण जीनोमिक डीएनए को छोड़ देते हैं और जीनोमिक डीएनए टुकड़े के अंत में एक डीएनए बारकोड जोड़ते हैं। प्रत्येक क्लीवर जीनोमिक टुकड़ा केवल दो डीएनए बारकोड (= एक एपिजेनेटिक मार्क प्रति दरार साइट) तक स्वीकार कर सकता है, और दरार साइट पर जीनोमिक डीएनए खो जाता है। इसलिए, क्लीवेज-आधारित दृष्टिकोणों में परीक्षण किए गए एपिजेनेटिक निशान की संख्या और सिग्नल घनत्व के बीच एक व्यापार-बंद है। यह एक ही कोशिका में कई एपिजेनेटिक निशान के विश्लेषण में बाधा डालता है। एक एकल-कोशिका एपिजेनोमिक विधि जो जीनोमिक डीएनए को नहीं छोड़ती है,इस मुद्दे को दूर करने के लिए विकसित की गई थी।

ऊपर उल्लिखित दरार-व्युत्पन्न मुद्दे के अलावा, ट्रांसपोसेज़-आधारित दृष्टिकोणों की अन्य सीमाएं हैं। एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण में, जीनोम पर हिस्टोन और डीएनए से जुड़े प्रोटीन के स्थान को जानना महत्वपूर्ण है। वर्तमान दृष्टिकोण ों में, यह अनिर्धारित एकल कोशिकाओं का उपयोग करके और प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रतिधारण द्वारा पूरा किया जाता है। हालांकि, यह सुलभ क्रोमैटिन क्षेत्रों के लिए मजबूत पूर्वाग्रह उत्पन्न करता है, यहां तक कि हिस्टोन संशोधनों के विश्लेषण में भी। जीनोम पर हिस्टोन और जीनोम से जुड़े प्रोटीन के स्थान को क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन के बिना संरक्षित किया जा सकता है, एक पॉलीक्रिलामाइड मचान 7,8 का उपयोग करके। यह दृष्टिकोण वर्तमान दृष्टिकोणों में देखे गए संरचनात्मक पूर्वाग्रह को कम करता है जो प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर निर्भर करता है।

ट्रांसपोसेस-आधारित दृष्टिकोण एक ही सेल से केवल एक बार संकेत प्राप्त कर सकते हैं। इसलिए, संकेतों के ड्रॉप-ऑफ के कारण एकल कोशिका के पूर्ण एपिजीनोम को चित्रित करना मुश्किल है। एक ही एकल कोशिका में पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण की अनुमति देकर वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को विकसित किया गया है।

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Protocol

नोट: विधि का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चरण 7.2-13 को योजनाबद्ध अभ्यावेदन के माध्यम से समझाया गया है। प्रत्येक पंक्ति प्रोटोकॉल में एक चरण इंगित करती है। हरे रंग में रंगीन एक सेलुलर प्रोटीन एक मानव न्यूक्लियोसोम है जो क्रिस्टल संरचना (पीडीबी: 6 एम 4 जी) के आधार पर उत्पन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. डिसाल्टिंग कॉलम का संतुलन

नोट: डीसाल्टिंग स्पिन कॉलम निम्नलिखित चरणों में वर्णित के रूप में समतुल्य हैं। समतुल्य डिसाल्टिंग कॉलम का उपयोग चरण 2.1, 3.4 और 4.6 में किया जाता है।

  1. एक डीसाल्टिंग कॉलम (7 केडीए कट-ऑफ, 0.5 एमएल राल मोती की मात्रा, सामग्री की तालिका देखें) के निचले बंद को हटा दें और डीसाल्टिंग कॉलम के शीर्ष पर कैप को ढीला करें।
  2. कॉलम को 1.5 एमएल प्रोटीन लो-बाइंडिंग ट्यूब (एक संग्रह ट्यूब, सामग्री की तालिका देखें) में रखें और कॉलम में भंडारण समाधान को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: मोती बिस्तर के शीर्ष को समतल करने के लिए स्विंग रोटर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
  3. 1.5 एमएल ट्यूब में फ्लोथ्रू को हटा दें और राल बेड के शीर्ष पर 150 एमएम एनएसीएल / 100 एमएम फॉस्फेट बफर, पीएच 8.0 (तालिका 1 देखें) के 300 μL जोड़ें।
  4. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और संग्रह ट्यूब में प्रवाह को हटा दें।
  5. चरण 1.3-1.4 को तीन अतिरिक्त बार दोहराएँ।
  6. संग्रह ट्यूब से बफर को छोड़ दें और स्तंभ को एक नई संग्रह ट्यूब में रखें।
  7. चरण 2.1, 3.4, और 4.4 में समतुल्य डीसाल्टिंग स्तंभ का उपयोग करें।

2. एंटीबॉडी का बफर एक्सचेंज

नोट: ग्लिसरॉल, आर्जिनिन, और सोडियम एज़ाइड को एंटी-एच 3 के 27 एसी 10, एंटी-एच 3 के 27 एमई 3 10, एंटी-मेड 111, और एंटी-पोल II10 से हटा दें (तालिका 1 में दिखाया गया बफर संरचना देखें)। DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित सभी प्रक्रियाओं को एक साफ हुड के तहत किया जाता है। समय: 1 घंटे

  1. चरण 1 के बाद तैयार किए गए एक समतुल्य डीसाल्टिंग कॉलम पर एंटीबॉडी समाधान (100 μL, तालिका 2 देखें) लागू करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को संग्रह ट्यूब से 1.5 एमएल प्रोटीन कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 280 एनएम12 पर अवशोषण का उपयोग करके आईजीजी एकाग्रता को मापें (माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें)।
  4. एंटीबॉडी समाधान को अल्ट्राफिल्ट्रेशन कैसेट (आणविक भार कट-ऑफ 100 केडीए, 0.5 एमएल, सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. 280 एनएम पर अवशोषण का उपयोग करके आईजीजी एकाग्रता को मापें।
  6. चरण 2.4-2.5 को दोहराएं जब तक कि आईजीजी एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल तक न पहुंच जाए।

3. एंटीबॉडी सक्रियण

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2.5 घंटे

  1. 1 मिलीग्राम सक्सिनिमिडिल 6-हाइड्राज़िनोनिकोटिनेट एसीटोन हाइड्राज़ोन (एस-हाइनिक, सामग्री की तालिका देखें) को 100 μL निर्जल एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ, सामग्री की तालिका देखें) के साथ घोलें।
    नोट: डीएमएफ एक ज्वलनशील कार्बनिक विलायक और त्वचा के माध्यम से अवशोषित एक शक्तिशाली यकृत विष है। दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एक लैब कोट पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  2. एंटीबॉडी समाधान के 100 μL में S-HyNic / DMF के 0.6 μL जोड़ें (150 mM NaCl / 100 mM सोडियम फॉस्फेट, pH8.0 में 1 मिलीग्राम / उपयोग किए गए एंटीबॉडी और आईजीजी को नियंत्रित करने के लिए तालिका 2 देखें।
  3. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें (प्रकाश से बचाव)।
  4. नमूना एकत्र करने के लिए समतुल्य डीसाल्टिंग कॉलम (चरण 1 देखें) के शीर्ष पर एस-हाइनिक-रिएक्शन एंटीबॉडी के 100 μL लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. उपयोग के बाद डीसाल्टिंग कॉलम को छोड़ दें।
    नोट: प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स पर हाइनिक समूहों की स्थिरता भिन्न होती है। हाइनिक-संशोधित बायोमोलेक्यूल्स को तुरंत संयुग्मित करने की सिफारिश की जाती है।

4. डीएनए जांच की सक्रियता

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2.5 घंटे

  1. एंटीबॉडी के लिए एक अमाइन-संशोधित डीएनए जांच के एक गोली को भंग करें या आईजीजी (एंटीबॉडी प्रोब, टेबल 3) को 150 एमएम एनएसीएल / 100 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 8.0 के 20 μL के साथ नियंत्रित करें।
    नोट: ट्यूब के निचले भाग में एक पतली, पारदर्शी गोली / फिल्म की तलाश करें। बफर को सीधे गोली पर लागू करें। यदि गोली दिखाई नहीं दे रही है, तो गोली अलग हो सकती है और दीवार या ढक्कन से चिपक गई हो सकती है। इस मामले में, ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और ट्यूब के निचले हिस्से में एक गोली की तलाश करें।
  2. 1 मिलीग्राम सक्सिनिमिडिल 4-फॉर्माइलबेंजोएट (एस -4एफबी, सामग्री की तालिका देखें) को 50 μL निर्जल डीएमएफ के साथ घोलें, और विघटित एंटीबॉडी जांच में डीएमएफ के 10 μL जोड़ें।
  3. चरण 4.2 में तैयार एस -4एफबी / डीएमएफ के 4 μL जोड़ें, मिश्रण करें, और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें (प्रकाश से बचाव)।
  4. एस -4एफबी-प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी प्रोब के 34 μL को समतुल्य डीसाल्टिंग कॉलम के शीर्ष पर लागू करें (चरण 1 देखें)।
  5. नमूना पूरी तरह से अवशोषित होने के बाद जेल बेड के शीर्ष पर 150 एमएम एनएसीएल / 100 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 8.0 के 15 μL लागू करें, और एस -4एफबी-संशोधित एंटीबॉडी जांच को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. बाद के संयुग्मन के लिए प्रवाह का उपयोग करें; 260 एनएम पर अवशोषण को मापें; और एंटीबॉडी जांच की वसूली दर की गणना करें।

5. एस-हाइनिक-संशोधित एंटीबॉडी और एस -4एफबी-संशोधित एंटीबॉडी जांच का संयुग्मन

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2 घंटे

  1. एस-हाइनिक-संशोधित एंटीबॉडी और एस -4एफबी-संशोधित एंटीबॉडी जांच को मिलाएं, और मिश्रण करने के लिए समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (प्रकाश से बचाव)।
  3. प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए, शमन और भंडारण समाधान के 478.8 μL जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
  4. एंटीबॉडी प्रोब-संयुग्मित एंटीबॉडी समाधान को अल्ट्राफिल्ट्रेशन कैसेट (आणविक भार कट-ऑफ 100 केडीए) में स्थानांतरित करें।
  5. 12,000 × जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  6. पाइपिंग द्वारा कैसेट के अंदर समाधान की मात्रा की जांच करें।
  7. चरण 5.5-5.6 को तब तक दोहराएं जब तक कि मात्रा 100 μL तक न पहुंच जाए और -20 °C पर स्टोर करें।
    नोट: आईजीजी एकाग्रता को आईजीजी मानक का उपयोग करके सैंडविच एलिसा13,14,15 द्वारा मापा जाता है।

6. कोर चुंबकीय मोतियों की तैयारी

नोट: इस विधि में, एक एकल कोशिका को एक बाईलेयर एक्रिलामाइड मोती में एम्बेडेड किया जाता है ( चित्रा 2 देखें)। कोर एक चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोती है। बाहरी परत अकेले पॉलीक्रिलामाइड है। इस खंड में कोर चुंबकीय मोती उत्पन्न होते हैं। यह खंड प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं है। समय: 3 घंटे

Figure 2
चित्रा 2: आरईपीआई-सेक प्रयोगों में दृश्यता और आसान हैंडलिंग के लिए एक बाईलेयर पॉलीक्रिलामाइड मोती की संरचना । (ए) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद चरण 6.6 से चुंबकीय नैनोकणों। चुंबकीय नैनोकणों को मोनोमेरिक एक्रिलामाइड के साथ संशोधित किया जाता है और बी में दिखाए गए पॉलीक्रिलामाइड चुंबकीय मोती में एकीकृत किया जाता है। (बी) पॉलीक्रिलामाइड चुंबकीय मोती के साथ एक पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर, पीएच 8.5, और 40% एक्रिलामाइड समाधान के 450 μL के 50 μL मिलाएं।
    नोट: एक्रिलामाइड एक न्यूरोटॉक्सिन है। दस्ताने, एक आंख रक्षक और एक प्रयोगशाला कोट पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  2. सोडियम बाइकार्बोनेट बफर में एनएचएस एस्टर-कार्यात्मक 30 एनएम आयरन ऑक्साइड पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 ग्राम को निलंबित करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: क्योंकि एक्रिलामाइड मोती पारदर्शी हैं, इसलिए मोतियों की स्थिति को देखना और हेरफेर करना मुश्किल हो सकता है। लोहे के ऑक्साइड से बने कोर मोती को शामिल करने से दृश्यता में सुधार होता है और हेरफेर की सुविधा होती है क्योंकि चुंबक का उपयोग करके मोतियों की स्थिति को नियंत्रित किया जा सकता है। हालांकि, यदि उपयोगकर्ता आरईपीआई-सेक प्रयोगों से परिचित हैं, तो कोर चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोतियों का उपयोग छोड़ा जा सकता है।
  3. नैनोबीड सस्पेंशन को 2 ट्यूबों (1.5 एमएल) में स्थानांतरित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 21,300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें (एक कोण वाले रोटर का उपयोग करें), और सुपरनैटेंट को हटा दें।
  4. 40% एक्रिलामाइड / बिस्-एक्रिलामाइड के 1 एमएल के साथ नीचे के घोल को निलंबित करें (19: 1, सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: बिस-एक्रिलामाइड एक न्यूरोटॉक्सिन है। दस्ताने और लैब कोट पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 21,300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज (एक कोण रोटर का उपयोग करें)।
  6. 30 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज (ब्रेक के बिना स्विंग रोटर का उपयोग करें) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. धीमी गति की आकांक्षा के साथ पी 1000 पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  8. मात्रा को 40% एक्रिलामाइड / बिस्-एक्रिलामाइड के 400 μL में समायोजित करें (19: 1, सामग्री की तालिका देखें)।
  9. 10% अमोनियम परसल्फेट समाधान के 25 μL जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: अमोनियम परसल्फेट एक मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट है। अमोनियम परसल्फेट युक्त वायुजनित धूल संपर्क पर आंख, नाक, गले, फेफड़े और त्वचा को परेशान कर सकती है। दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एक लैब कोट पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  10. कोर चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोती उत्पन्न करने के लिए, एक्रिलामाइड-संशोधित आयरन ऑक्साइड निलंबन के 0.5 μL को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  11. 4% एन, एन, एन', एन-टेट्रामेथिलइथिलीनडायमाइन / खनिज तेल (टीईएमईडी , तालिका 1 देखें) के 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: टीईएमईडी एक ज्वलनशील विलायक है। एक हुड के नीचे काम करें। श्वास न लें। खुली लपटों, गर्म सतहों और प्रज्वलन के स्रोतों से दूर रखें। दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एक लैब कोट पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।

7. मोनोमर एक्रिलामाइड के साथ सेलुलर प्रोटीन के अमीनो समूह को संशोधित करना

नोट: आरईपीआई-सेक को एकल-कोशिका स्तर पर माउस और मानव कोशिकाओं के एपिजीनोम का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। माउस या मानव के अलावा अन्य प्रजातियों की कोशिकाओं पर इस विधि का उपयोग करते समय प्रत्येक चरण को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. कोशिकाओं की कटाई
    नोट: समय: 30 मिनट
    1. सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: इस चरण में कोशिकाओं की व्यवहार्यता प्रभावित करती है कि डेटा विश्लेषण में कितनी कोशिकाएं जीवित कोशिकाएं हैं।
    2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त कल्चर माध्यम (*) के साथ सेल एकाग्रता को 1 ×10 5 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
      नोट: * संस्कृति माध्यम रुचि की कोशिकाओं के लिए एक इष्टतम संस्कृति माध्यम है।
    3. सेल सस्पेंशन के 1 एमएल को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. सेल निलंबन को 240 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    5. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 1 एमएल जोड़ें, कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं, और सेल निलंबन को 240 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
      नोट: संदूषण को रोकने के लिए उपरोक्त सभी चरणों को एक लामिनर प्रवाह साफ हुड में किया जाना चाहिए।
  2. मोनोमेरिक एक्रिलामाइड के साथ सेलुलर प्रोटीन के अमीनो समूह को संशोधित करना
    नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 1.5 घंटे
    1. सेल पेलेट में एमिनो ग्रुप मॉडिफिकेशन सॉल्यूशन (तालिका 1 देखें) के 1 एमएल जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा सेल पेलेट को निलंबित करें।
    2. ट्यूब को 1 घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें और सेल सस्पेंशन को 240 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और डीएनए के लिए एक इंटरकेलेटर डाई युक्त 100 एमएल 4% एक्रिलामाइड/ 1 एमएम ईडीटीए / पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (देखें तालिका 1, 1 सेल /

8. पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं की तैयारी

  1. पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं की तैयारी (मैनुअल संस्करण)
    नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 9 घंटे / 96 कोशिकाएं
    1. सेल सस्पेंशन (1 सेल/μL) के 1 mL और 1 mM EDTA/PBS के 199 mL मिश्रण करें जिसमें DNA के लिए एक इंटरकेलेटर डाई हो ( तालिका 1 देखें)।
    2. सेल सस्पेंशन के 200 μL को फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें (कुल 10 प्लेटें, सामग्री की तालिका देखें)।
    3. कवर को 96-वेल प्लेट पर रखें और एक एकल सेल वाले कुओं की पहचान करने के लिए स्कैनिंग माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 10 प्लेटों को स्कैन करें।
    4. एक एकल सेल वाले कुएं की सामग्री को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      1. प्लेट को झुकाएं (ऑपरेटर की ओर), और कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि एकल कोशिका कुएं के निचले किनारे पर डूब न जाए।
      2. पिपेट टिप को निचले कोने पर रखें और एकल सेल और बफर (एस्पिरेट 210 μL/well = 200 μL बफर + 10 μL हवा) को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
        नोट: P200 कम-अवधारण टिप का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
      3. स्थानांतरण की पुष्टि करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कुएं की जांच करें।
      4. यदि एक एकल कोशिका अभी भी कुएं में है, तो डीएनए के लिए एक इंटरकेलेटर डाई युक्त 1 एमएम ईडीटीए / पीबीएस के 200 μL / कुएं जोड़ें।
      5. फिर, स्थानांतरण दोहराएँ।
    5. ब्रेक के बिना स्विंग रोटर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 240 × ग्राम पर पीसीआर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: ब्रेकिंग ट्यूब में पानी के एक चक्करदार प्रवाह का कारण बनता है, जो एकल कोशिका की वर्षा को बाधित करता है। ब्रेक के बिना स्विंगिंग रोटर के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग करते समय, एकल कोशिका हमेशा ट्यूब के नीचे डूब जाएगी। हालांकि, अगर एक कोण वाले रोटर का उपयोग किया जाता है, तो एकल कोशिका पीसीआर ट्यूब की साइडवॉल से जुड़ जाती है और खो सकती है।
    6. बहुत धीमी पाइपिंग गति के साथ सतह पर तैरनेवाला के 195 μL निकालें।
    7. एक्रिलामाइड/बिस्-एक्रिलामाइड/एपीएस समाधान के 195 μL/ट्यूब जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
    8. ब्रेक के बिना स्विंग रोटर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 240 × ग्राम पर पीसीआर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. बहुत धीमी पाइपिंग गति के साथ सुपरनैटेंट के 195 μL निकालें।
    10. खनिज तेल और एक चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोती (चरण 6 में उत्पन्न) युक्त पीसीआर ट्यूब में नीचे 3 μL को स्थानांतरित करें।
      नोट: पी 10 कम-प्रतिधारण टिप का उपयोग करना सुनिश्चित करें। चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोती के पास कोशिका को वितरित करें। खनिज तेल में, एकल कोशिका युक्त तरल सतह तनाव द्वारा चुंबकीय पॉलीक्रिलामाइड मोती की सतह का पालन करता है।
    11. कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह प्रक्रिया एक बाइलेयर एक्रिलामाइड जेल बीड उत्पन्न करती है। कोर एक चुंबकीय जेल मोती है। बाहरी परत पॉलीक्रिलामाइड जेल है जिसमें एक एकल कोशिका होती है। एकल कोशिका जेल की बाहरी परत में एम्बेडेड होती है। सुरक्षित रोक बिंदु: पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 50% ग्लिसरॉल / 1 एमएम ईडीटीए / 0.05% ट्वीन 20/0.5% बीएसए / टीबीएस बफर के साथ धोने के बाद, पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं की तैयारी (अर्ध-स्वचालित संस्करण)
    नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 3 घंटे / 96 कोशिकाएं
    1. 1 एमएल सेल सस्पेंशन (1 सेल/μL) और 199 एमएल 1 mM EDTA/PBS को मिलाएं जिसमें डीएनए के लिए एक इंटरकेलेटर डाई हो ( तालिका 1 देखें)।
    2. सेल सस्पेंशन के 200 μL को 4 nL नैनोवेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें (चित्र 3 और सामग्री की तालिका देखें) और 4 nL नैनोवेल प्लेट को एक स्वचालित एकल-सेल-पिकिंग रोबोट पर रखें (सामग्री की तालिका देखें)।
    3. स्वचालित एकल-सेल-पिकिंग रोबोट पर गंतव्य प्लेट के रूप में 96-वेल पीसीआर प्लेट रखें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में 200 μL/वेल एक्रिलामाइड/Bis-acrylamid/APS समाधान हो ( तालिका 1 देखें)।
    4. एक एकल सेल को 4 एनएल नैनोवेल से 96-वेल पीसीआर प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें ( पूरक वीडियो एस 1 देखें)।
    5. 96-वेल पीसीआर प्लेट के शीर्ष पर एक कवर रखें और ब्रेक के बिना स्विंग रोटर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 240 × ग्राम पर 96-वेल प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. 96-वेल पीसीआर प्लेट को एक स्वचालित तरल-हैंडलिंग रोबोट के डेक पर रखें ( सामग्री की तालिका, चित्रा 4 और पूरक कोड 1 देखें)।
    7. तरल-हैंडलिंग रोबोट के सॉफ़्टवेयर विंडो (सामग्री की तालिका देखें) में पूरक कोड 1 को खींचें और छोड़ें।
    8. स्वचालित तरल-हैंडलिंग रोबोट पर प्रोग्राम चलाएँ ( पूरक वीडियो S2 और पूरक वीडियो S3 देखें)।
      1. बहुत धीमी पाइपिंग गति के साथ सतह पर तैरनेवाला के 195 μL निकालें।
      2. खनिज तेल के 50 μL 4% TEMED / खनिज तेल जोड़ें।
        नोट: चरण 8.2.8.1-8.2.8.2 मैन्युअल पाइपिंग द्वारा किया जा सकता है।
    9. कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें (चित्रा 5)। सुरक्षित रोक बिंदु: पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 50% ग्लिसरॉल / 1 एमएम ईडीटीए / 0.05% ट्वीन 20/0.5% बीएसए / टीबीएस बफर के साथ धोने के बाद, पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें।

Figure 3
चित्रा 3: चरण 8.2 में स्वचालित एकल-सेल चुनना और 96-वेल पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करना। (ए) एकल सेल-पिकिंग सिस्टम का अवलोकन। संदूषण से बचने के लिए एक एकल सेल-पिकिंग रोबोट एक लामिनर प्रवाह साफ हुड में है। (बी) कुएं के अंदर 4 एनएल नैनोवेल के साथ एक 24-वेल प्लेट। (सी) 24-वेल प्लेट से एक कुएं में सेल वितरण। हरे बिंदु प्रत्येक 4 एनएल नैनोवेल में एक एकल कोशिका के रूप में पहचाने जाने वाले सेल हैं। मैजेंटा डॉट्स कोशिकाओं के डबलया मल्टीपल के रूप में पहचाने जाने वाले सेल होते हैं। (डी) 24-वेल प्लेट में कुएं की ब्राइटफील्ड छवि। एक हरा वर्ग एक 4 nL नैनोवेल है जिसमें एक एकल कोशिका होती है। एक मैजेंटा वर्ग एक 4 एनएल नैनोवेल है जिसमें कई कोशिकाएं होती हैं। (ई) कुछ 4 एनएल नैनोवेल का आवर्धित क्षेत्र। उज्ज्वल बिंदु 4 एनएल नैनोवेल में एकल कोशिकाएं हैं। एकल सेल-पिकिंग सिस्टम डीएपीआई धुंधला होने वाली कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करके एकल कोशिका वाले नैनोवेल की पहचान करता है। पहचान की गई एकल कोशिकाओं को 4 एनएल नैनोवेल से 96-वेल पीसीआर प्लेट के कुएं में स्थानांतरित किया जाता है। स्केल बार = 2 मिमी (सी, डी), 100 μm (E)। संक्षिप्त नाम = DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: तरल-हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं का निर्माण। (ए) तरल-हैंडलिंग रोबोट का एक डेक। डेक में पिपेट टिप रैक के लिए 11 स्लॉट (पी 300 टिप: स्लॉट 1-3, पी 20 टिप: स्लॉट 5-6), 2 एमएल डीप-वेल 96-वेल प्लेट (स्लॉट 4), दो 96-वेल पीसीआर प्लेटें हैं जिनमें प्रति कुएं एक एकल सेल (स्लॉट 7 और 10) और तरल कचरे के लिए दो फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट्स (स्लॉट 8 और 11) हैं। (बी) लैबवेयर रखने के बाद डेक। (सी) चरण 8.8.1 में रोबोटिक पाइपिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कार्यक्रम 96-वेल पीसीआर प्लेट के नीचे से एक भी कोशिका को हटाने के बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा देता है। (डी) पूरक कोड 1 का उपयोग करके उत्पन्न पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

9. रैंडम प्राइमर एनीलिंग और एक्सटेंशन

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। निम्नलिखित चरणों में तारांकन (*) इंगित करता है कि ट्यूब में पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका वाले पॉलीक्रिलामाइड मोतियों की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय विभाजक का उपयोग आवश्यक नहीं है। ट्यूब की दीवार के साथ धीरे-धीरे पिपेट टिप को नीचे ले जाने से, मोतियों को धोने या बफर एक्सचेंज के लिए धक्का दिया जाता है। समय: 9 घंटे

  1. खनिज तेल को पाइपटिंग (*) द्वारा निकालें और (*) 1x TP Mg (-) बफर के 200 μL के साथ 5 बार धोएं (10x TP Mg(-) बफर को अल्ट्राप्योर पानी के साथ 1x बफर में पतला करें, तालिका 1 देखें)।
  2. सुपरनैटेंट (*) को हटा दें और एनीलिंग बफर के 15 μL जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
  3. बर्फ पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस इनक्यूबेशन का उद्देश्य प्लाज्मा और परमाणु झिल्ली को स्थिर करना और सेल नाभिक को यादृच्छिक प्राइमर प्रदान करना है।
  4. पीसीआर ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर रखें और 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 20 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।
  5. ट्यूबों को आइस-कूल्ड मेटल ब्लॉक में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 4 μL MgSO4/NaCl/dNTP मिश्रण ( तालिका 1 देखें) जोड़ें और मध्यम गति से एक भंवर मिक्सर के साथ मिलाएं।
  7. बीएसटी पोलीमरेज़ के 1 μL, बड़े टुकड़े ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और मध्यम गति पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं।
  8. एक शेकर पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 600 आरपीएम)।
    नोट: इस इनक्यूबेशन का उद्देश्य बीएसटी पोलीमरेज़ को सेल न्यूक्लियस तक पहुंचाना है।
  9. पीसीआर ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और निम्न कार्यक्रमों में से एक चलाएं।
    1. 4 घंटे का कार्यक्रम चलाएं: 30 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस और 180 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक रात भर का कार्यक्रम चलाएं: 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 2 घंटे के लिए 10 डिग्री सेल्सियस, 2 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 4 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 25 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है। सुरक्षित रोक बिंदु: पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करके 1 दिन तक प्रयोग को यहां रोकें।

10. एंटीबॉडी बाइंडिंग

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 1.5 घंटे

  1. NaCl/EDTA/BSA समाधान के 1.625 μL जोड़ें ( तालिका 1 देखें) और कम गति पर भंवर द्वारा मिलाएं।
    नोट: इस कदम का उद्देश्य 1) ईडीटीए द्वारा एमजी 2 + के चेलेशन की सुविधा प्रदान करना है,2 ) 300 एमएम एनएसीएल द्वारा विस्तारित 1यादृच्छिक प्राइमर के बंधन को स्थिर करना, और 3) बाद की प्रतिक्रिया में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का उपयोग करके एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करना।
  2. बर्फ पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और एंटीबॉडी के प्रत्येक 0.1 μg / mL जोड़ें और एंटीबॉडी प्रोब (चरण 5 में तैयार) के साथ संयुग्मित आईजीजी को नियंत्रित करें।
  3. शेकर पर हल्के झटकों के साथ बर्फ पर रात भर इनक्यूबेट करें।

11. एंटीबॉडी जांच और समीपस्थ रूप से विस्तारित यादृच्छिक प्राइमर की निकटता बंधाव।

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। निम्नलिखित चरणों में तारांकन (*) इंगित करता है कि ट्यूब में पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका वाले पॉलीक्रिलामाइड मोतियों की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग कहां किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय विभाजक का उपयोग आवश्यक नहीं है। ट्यूब की दीवार के साथ धीरे-धीरे पिपेट टिप को नीचे ले जाकर, मोतियों को धोने या बफर एक्सचेंज के लिए धक्का दिया जा सकता है। समय: 6 घंटे

  1. बर्फ पर 200 μL 1x TPM-T बफर (प्रत्येक धोने में 20 मिनट इनक्यूबेशन) के साथ दो बार (*) धोएं। 10x TPM-T बफर (Tris-HCl/पोटेशियम क्लोराइड/मैग्नीशियम सल्फेट/ट्राइटन X-100) को अल्ट्राप्योर पानी के साथ 1x तक पतला करें।
  2. सतह पर तैरनेवाला (*) निकालें और 1x T4 डीएनए लिगेज बफर के साथ एक बार (*) धो लें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. (*) सतह पर तैरनेवाला निकालें और लिगेशन एडाप्टर समाधान के 19 μL जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
  4. 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 1 μL T4 डीएनए लिगेज जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और ट्यूब को मध्यम गति से भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  6. ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: निकटता बंधाव कार्यक्रम, 16 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 25 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान कमरे का तापमान है।
  7. 1x Bst Mg(-) EDTA (+) बफर के 200 μL के साथ (*) दो बार संक्षेप में धोएं (तालिका 1 देखें; 10x स्टॉक बफर से 1x बफर तैयार करें) और सेल को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सुरक्षित रोक बिंदु: पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करके 1 दिन तक प्रयोग को यहां रोकें।

12. पहले यादृच्छिक प्राइमर का पूर्ण विस्तार

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 4.5 घंटे

  1. 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA (-) बफर के साथ दो बार धोएं (तालिका 1 देखें, 10x स्टॉक बफर से 1x बफर तैयार करें), सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और 20 μL Bst/dNTPs/MgSO4 मिश्रण जोड़ें (तालिका 1 देखें)।
  2. मध्यम गति पर एक भंवर मिक्सर के साथ मिलाएं और एक कक्षीय शेकर (6 डिग्री सेल्सियस और 500 आरपीएम पर) पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: पूर्ण-विस्तार कार्यक्रम: 1 घंटे के लिए 10 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: सुरक्षित रोक बिंदु: प्रयोग को 4 डिग्री सेल्सियस पर पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को संग्रहीत करके 1 दिन तक यहां रोका जा सकता है।

13. एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2.5 घंटे (चरण 13.1-13.2) + 15 मिनट (चरण 13.3-13.4) + 1 दिन (चरण 13.5-13.10)

  1. 100 μM 2nd यादृच्छिक प्राइमर का 0.4 μL जोड़ें ( तालिका 3 देखें) और मध्यम गति पर एक भंवर मिक्सर के साथ मिलाएं।
  2. ऑर्बिटल शेकर पर 6 डिग्री सेल्सियस और 500 आरपीएम पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, और ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 25.4 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।
  3. ट्यूबों को एक आइस-कूल्ड मेटल ब्लॉक में रखें और बीएसटी डीएनए पोलीमरेज़ के 1 μL / ट्यूब जोड़ें।
  4. धीमी गति पर भंवर, ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर रखें, और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं:
    4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 60 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 26.4 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है। सुरक्षित रोक बिंदु: पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करके 1 दिन तक प्रयोग को यहां रोकें।
  5. सतह पर तैरनेवाला (लगभग 20 μL) एकत्र करें, और इसे पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. एकत्र किए गए सतह पर तैरनेवाला को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका वाले पीसीआर ट्यूब में 0.05% ट्वीन 20/0.1x टीई बफर के 20 μL/ट्यूब जोड़ें ( तालिका 1 देखें) और पुन: प्रयोज्य एकल सेल को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट: इनक्यूबेशन समय बढ़ाकर कुछ दिनों के लिए यहां प्रयोग को रोक दें।
  8. सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें और चरण 13.5 पर एकत्र किए गए नमूने के साथ सतह पर तैरनेवाला को मिलाएं।
  9. चरण 13.7-13.8 को एक बार और दोहराएँ। पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका को 50% ग्लिसरॉल / 5 एमएम ईडीटीए / 0.5% बीएसए / 0.05% ट्वीन 20 / टीबीएस बफर में भिगोएं और इसे ऑर्बिटल शेकर (4 डिग्री सेल्सियस, 600 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अगले प्रयोग तक पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. एक्सो-मास्टर मिश्रण के 40 μL जोड़ें (तालिका 1 देखें) और ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: i) 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, ii) 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, iii) 60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, iv) 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, v) चरण ii-iv 19 बार दोहराएं, vi) 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, vii) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा लगभग 45 μL है, जिसमें पॉलीक्रिलामाइड मोती की मात्रा भी शामिल है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है। सुरक्षित रोक बिंदु: -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को संग्रहीत करके प्रयोग को कम से कम कुछ दिनों के लिए यहां रोका जा सकता है।

14. फिनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण और पॉलीथीन ग्लाइकॉल वर्षा

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 1.5 घंटे

  1. उत्पाद को 0.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल के 100 μL जोड़ें।
    नोट: फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमाइल अल्कोहल जलन का कारण बनता है और संभवतः संपर्क से जलता है। दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एक लैब कोट पहनें। केवल पर्याप्त वेंटिलेशन के साथ उपयोग करें, या एक उपयुक्त श्वासयंत्र पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  2. हाथ से 30 सेकंड के लिए हिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. जलीय चरण (80 μL) को 0.5 mL डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में इकट्ठा करें, और रैखिक एक्रिलामाइड / MgCl2 मिश्रण के 40.84 μL / ट्यूब जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
  4. 50% (w/v) PEG8000 (RNase-मुक्त) का 47.06 μL/ट्यूब जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 240 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 80% इथेनॉल (ईटीओएच) के 400 μL / ट्यूब जोड़ें।
  7. 80% ईटीओएच से धोएं, एस्पिरेटर का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और गोली को हवा से सुखाएं।
  8. 10 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7.4 बफर के 20 μL के साथ गोली को निलंबित करें, और घोल को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: डबल-फंसे डीएनए-विशिष्ट इंटरकेलेटर डाई का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट: प्रयोग को कम से कम एक सप्ताह के लिए सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है।

15. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन।

नोट: DNase और RNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 5 घंटे

  1. एकल सेल-व्युत्पन्न उत्पादों के डीएनए को पिघलाएं (चरण 14 से) और डीएनए उत्पादों के 2 μL / सेल (कुल मात्रा 20 μL) को मिलाकर एकल सेल-व्युत्पन्न उत्पादों की एक मिश्रित लाइब्रेरी तैयार करें।
  2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिक्स के 26 μL जोड़ें (सामग्री की तालिका और निर्माता के प्रोटोकॉल देखें) और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  3. पीसीआर ट्यूब को थर्मल साइकलर पर रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा 46 μL है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।
  4. 10x DNase I बफर का 5 μL जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें) और DNase I के 4 μL जोड़ें (RNase-मुक्त, 4 U, सामग्री की तालिका देखें)।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें, और नमूने को 0.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. गुआनिडिनियम थायोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 300 μL / ट्यूब जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और कोमल भंवर द्वारा मिलाएं।
    नोट: गुआनिडिनियम थायोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म संपर्क से गंभीर रासायनिक जलन का कारण बन सकता है। दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एक लैब कोट पहनें। केवल पर्याप्त वेंटिलेशन के साथ उपयोग करें या एक उपयुक्त श्वासयंत्र पहनें। संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग किए गए लैबवेयर को छोड़ दें।
  7. एक शेकर पर आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर 3 दिनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
    नोट: सुरक्षित रोक बिंदु: प्रयोग को सुरक्षित रूप से 3 दिनों तक यहां रोका जा सकता है।

16. आरएनए शुद्धिकरण

नोट: DNase और RNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2 घंटे

  1. चरण 15.7 से नमूने में क्लोरोफॉर्म के 80 μL / ट्यूब जोड़ें और ट्यूब को 15 सेकंड के लिए हाथ से जोर से हिलाएं।
  2. कमरे के तापमान पर 2-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. नमूने के जलीय चरण (~ 200 μL) को एक नई 1.5 mL ट्यूब में एकत्र और स्थानांतरित करें।
  4. गुआनिडिनियम थायोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 600 μL / ट्यूब जोड़ें और नमूने को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. क्लोरोफॉर्म के 180 μL/ट्यूब जोड़ें और ट्यूब को 15 सेकंड के लिए हाथ से जोर से हिलाएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. नमूने के जलीय चरण (~ 450 μL) को 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र और स्थानांतरित करें।
  8. रैखिक एक्रिलामाइड (5 μg / μL) के 60 μL / ट्यूब जोड़ें और जलीय चरण में 100% आइसोप्रोपेनोल के 400 μL / ट्यूब जोड़ें।
  9. ट्यूब को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से हटा दें।
  11. आरएनए गोली को 75% इथेनॉल के 200 μL (EtOH / RNase-मुक्त पानी) के साथ 3 बार धोएं, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और आरएनए गोली को हवा से सुखाएं।
    नोट: आरएनए को पूरी तरह से सूखने की अनुमति न दें क्योंकि गोली घुलनशीलता खो सकती है।
  12. आरएनए गोली को आरएनएस-मुक्त पानी के 20 μL में पुन: निलंबित करें जिसमें एक RNAse अवरोधक (1 μL / 20 μL) होता है और पाइपिंग द्वारा गोली को भंग करें।
  13. 260 एनएम पर अवशोषण को मापें।

17. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 1 घंटे

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर + डीएनटीपी मिश्रण के 7 μL/ट्यूब जोड़ें (तालिका 1 और तालिका 3 देखें) और ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर रखें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा 27 μL है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।
  2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और ट्यूबों को कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मास्टर मिक्स के 14 μL/ट्यूब जोड़ें ( तालिका 1 देखें) और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  4. ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर रखें, और उन्हें 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा 60 μL है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।

18. दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण।

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 2.5 घंटे

  1. अल्ट्राप्योर पानी के 40 μL / ट्यूब जोड़ें और 100 μL समाधान को दो 0.2 mL PCR ट्यूबों (50 μL / ट्यूब) में विभाजित करें।
  2. दूसरे स्ट्रैंड सिंथेसिस मिक्स के 60 μL/ट्यूब जोड़ें ( तालिका 1 देखें) और ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: i) 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, ii) 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, iii) 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, iv) 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, v) चरण ii-iv 20 बार दोहराएं, और vi) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
    नोट: ट्यूब का आकार 0.2 एमएल है। समाधान की मात्रा 110 μL है। थर्मल साइकलर ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।
  3. 0.5 M EDTA (अंतिम 20 mM) के 4.4 μL / ट्यूब जोड़ें और रात भर -80 °C पर स्टोर करें।
    नोट: सुरक्षित रोक बिंदु: प्रयोग को कुछ दिनों तक यहां सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है।
  4. फिनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण और पॉलीथीन ग्लाइकोल वर्षा (चरण 14 में वर्णित) द्वारा डीएनए को शुद्ध करें।
    नोट: सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट: प्रयोग को कम से कम एक सप्ताह के लिए सुरक्षित रूप से यहां रोका जा सकता है।

19. प्रतिबंध एंजाइम पाचन और आकार चयन

नोट: DNase संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक साफ हुड के तहत की जाती है। समय: 3 घंटे (चरण 19.1-19.7)

  1. 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर शुद्ध डीएनए (चरण 18.4 से) की डीएनए एकाग्रता को मापें।
  2. 6 μg डीएनए को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें, 10x पाचन बफर के 30 μL जोड़ें, और मात्रा को अल्ट्राप्योर पानी के साथ 294 μL में समायोजित करें।
  3. BCIVI प्रतिबंध एंजाइम के 6 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. रैखिक पॉलीक्रिलामाइड के साथ ईटीओएच वर्षा करें।
    1. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 60 μL/ट्यूब जोड़ें और फिर रैखिक एक्रिलामाइड (5 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें) के 40 μL / ट्यूब जोड़ें।
    2. EtOH के 400 μL / ट्यूब जोड़ें और -20 °C पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट: प्रयोग को एक दिन के लिए यहां सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
    4. गोली को 80% ईटीओएच के साथ दो बार धोएं और गोली को सुखाएं।
    5. 1xTE बफर के 20 μL के साथ गोली को घोलें और ताजा 6x जेल लोडिंग बफर के 4 μL / ट्यूब जोड़ें।
  5. नमूने को 5% एगारोस जेल / 0.5x टीएई बफर में लोड करें और वैद्युतकणसंचलन (40 मिनट के लिए 50 वी) करें।
  6. 50 बीपी से अधिक जेल को काटें और इकट्ठा करें ( चित्रा 6 देखें) और जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए निकालें।
    नोट: सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट: प्रयोग को कम से कम एक सप्ताह के लिए सुरक्षित रूप से यहां रोका जा सकता है।
  7. डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके अनुक्रमण पुस्तकालय का निर्माण करें (सामग्री की तालिका देखें) 16,17।

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Representative Results

K562 एकल कक्ष चरण 8 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे ( चित्र 5 देखें)। एकल कोशिकाओं को पॉलीक्रिलामाइड मोती की बाहरी परत में एम्बेडेड किया गया था। सेल डीएनए को दाग दिया गया था और डीएनए धुंधला करने के लिए एक इंटरकेलेटर डाई का उपयोग करके कल्पना की गई थी।

Figure 5
चित्रा 5: उत्पन्न पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाएं। कोशिकाओं को डीएनए (हरे रंग की प्रतिदीप्ति) के लिए एक इंटरकेलेटर डाई के साथ दाग दिया जाता है। सफेद तीर पॉलीक्रिलामाइड मोतियों की बाहरी परत में एम्बेडेड एकल कोशिकाओं को इंगित करते हैं। पुन: प्रयोज्य एकल सेल को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में रखा गया है। छवियों को एक स्कैनिंग माइक्रोस्कोप, BZ-X710 द्वारा लिया गया था। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6 में दिखाए गए परिणामों ने वांछित डीएनए उत्पादों की पीढ़ी का समर्थन किया। चरण 19.7 से डीएनए उत्पादों को बीसीआईवीआई प्रतिबंध एंजाइम द्वारा 19-20 बीपी, 31-32 बीपी, 49 बीपी और >49 बीपी टुकड़ों में विभाजित किया गया था। इन परिणामों ने इस निष्कर्ष का समर्थन किया कि अधिकांश उत्पादों में एंटीबॉडी प्रोब-व्युत्पन्न अनुक्रम और 2वें यादृच्छिक प्राइमर-व्युत्पन्न अनुक्रम होते हैं। डीएनए उत्पादों को बाद में ट्रूसेक नैनो किट का उपयोग करके इलुमिना एडाप्टर के साथ मिलाया गया और इलुमिना नोवासेक 6000 अनुक्रमक का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया।

Figure 6
चित्रा 6: बीसीआईआई प्रतिबंध एंजाइम पाचन से पहले और बाद में डीएनए उत्पाद। (ए) बीसीआईआई पाचन ने अपेक्षित 19-20 बीपी टुकड़े, 31-32 बीपी टुकड़े और वांछित उत्पाद (>49 बीपी) उत्पन्न किए जिसमें एंटीबॉडी बारकोड, लिगेटेड अनुक्रम, जीनोमिक डीएनए और सेल बारकोड शामिल थे। (बी) चरण 19.7 के अंत में अंतिम उत्पादों का आकार वितरण। निर्मित डीएनए लाइब्रेरी का विश्लेषण केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था। हल्की गुलाबी रेखा वांछित उत्पादों को इंगित करती है जिसमें अनुक्रमण एडाप्टर, एंटीबॉडी बारकोड और सेल बारकोड शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुक्रमण परिणामों ने संकेत दिया कि चरण 7-19 का पालन करके उत्पन्न उत्पादों में एंटीबॉडी प्रोब, लिगेटेड अनुक्रम, जीनोम अनुक्रम और सेल बारकोड शामिल हैं। एंटी-H3K27ac और एंटी-H3K27me3 से अद्वितीय मैप किए गए पाठ नियंत्रण IGG की तुलना में काफी अधिक थे ( चित्रा 7A देखें)। यह इंगित करता है कि एंटी-H3K27ac और एंटी-H3K27me3 के विशिष्ट बंधन से वांछित उत्पादों की संख्या बढ़ जाती है। एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण के लिए सबसे उन्नत तकनीक, पेयर्ड-टैग, H3K27ac के लगभग 2,000 अद्वितीय पठन और H3K27me3 प्रति नाभिक के 1,500 अद्वितीय पठन प्राप्त करता है। हमारे परिणामों ने अद्वितीय रीडिंग (औसत 699,398 H3K27ac सिग्नल / सेल और 505,433 H3K27me3 सिग्नल / सेल) की बहुत अधिक संख्या दिखाई। परिणामों ने इस निष्कर्ष का भी समर्थन किया कि एक ही पुन: प्रयोज्य एकल सेल का उपयोग करके बार-बार प्रयोग सिग्नल के नुकसान को कम करते हैं और सिग्नल घनत्व में वृद्धि करते हैं।

चित्रा 7 ए में दिखाए गए आरईपीआई-सेक संकेतों का मूल्यांकन थोक CHIP-seq डेटा के साथ REpi-seq डेटा की तुलना करके किया गया था। चित्रा 7 बी में, औसतन, आरईपीआई-सेक से एच3के27एसी संकेतों का 91% ± 3.24% थोक CHIP-seq में H3K27ac चोटियों के साथ अतिव्यापी है। यह विश्लेषण एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण18 में "परिशुद्धता" के स्तर को मापता है। सक्रिय हिस्टोन मार्क H3K4me3 के लिए वर्तमान एकल-कोशिका एपिजेनोमिक विधियों की सटीकता 53% है (ड्रॉप-CHIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19, और 60% (ACT-seq; H3K4me3)20. इसके अलावा, निष्क्रिय हिस्टोन मार्क H3K27me3 के लिए REpi-seq की परिशुद्धता औसतन 52.09% ± 3.71% (चित्रा 7C) थी, जबकि H3K27me3 के लिए परिशुद्धता एकल-सेलCHIP-seq 19 में 47% थी। अंत में, REpi-seq H3K27ac और H3K27me3 का पता लगाने में उच्च परिशुद्धता प्रदर्शित करता है।

हमने आरईपीआई-सेक के "संवेदनशीलता" 18 का भी विश्लेषण किया, जो मापता है कि आरईपीआई-सेक रीड (चित्रा 7 डी, ई) द्वारा थोक सीएचआईपी-सेक की कितनी चोटियों का पता लगाया गया था। REpi-seq की संवेदनशीलता H3K27ac में 55.30% और H3K27me3 में 50.94% थी। अन्य एकल-कोशिका एपिजीनोम विधियों में, संवेदनशीलता ड्रॉप-सीएचआईपी (H3K4me3)18 में 5%, ACT-seq (H3K4me3)20 में 5% और scChIC-seq (H3K27me3)19 में 9.5% है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि आरईपीआई-सेक एपिजेनेटिक संकेतों का पता लगाने में संवेदनशील है।

Figure 7
चित्रा 7: आरईपीआई-सेक में सिग्नल नंबर, परिशुद्धता और संवेदनशीलता। एक ही पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका (एक K562 सेल) के साथ एक ही प्रयोग 3 बार दोहराया गया था। (ए) एक ही आठ एकल कोशिकाओं से प्राप्त संकेत। प्रत्येक बिंदु एक पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका का प्रतिनिधित्व करता है। एक ही एकल कोशिकाओं में नियंत्रण आईजीजी (काला), एंटी-एच 3 के 27 एम 3 (नीला), और एंटी-एच 3 के 27 एसी (लाल) से अद्वितीय संकेतों की गणना की गई थी। एंटी-H3K27me3 और एंटी-H3K27ac सिग्नल नियंत्रित IGG की तुलना में काफी अधिक थे, यह दर्शाता है कि एंटीबॉडी का विशिष्ट बंधन IGG को नियंत्रित करने की तुलना में अधिक कुशलता से संकेत उत्पन्न करता है। बार: माध्य, त्रुटि पट्टी: मानक विचलन। (बी, सी) REpi-seq H3K27ac (B) और H3K27me3 (C) की परिशुद्धता अद्वितीय है। आरईपीआई-सेक से प्राप्त अद्वितीय पठन की सटीकता K562 बल्क सेल विश्लेषण (H3K27ac: SRR3144862; H3K27ac: SRR3144862; H3K27ac) से ज्ञात CHIP-seq चोटियों के साथ अतिव्यापी होने पर आधारित थी। H3K27me3: SRR069083)। CHIP-seq H3K27ac और H3K27me3 रीड के प्रतिशत की गणना प्रत्येक एकल सेल में की गई थी। परिणाम 8 एकल कोशिकाओं के औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। (D, E) H3K27ac (D) और H3K27me3 (E) ज्ञात चोटियों का पता लगाने में REpi-seq की संवेदनशीलता। आरईपीआई-सेक के अद्वितीय पठन का उपयोग किया गया था। H3K27ac और H3K27me3 चोटियों की पहचान ECODE परियोजना में K562 थोक कोशिकाओं के CHIP-seq द्वारा की गई है (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) को REpi-seq अद्वितीय पठन द्वारा मान्यता दी गई थी। परिणामों को आरईपीआई-सेक यूनीक रीड द्वारा मान्यता प्राप्त औसत प्रतिशत सीएचआईपी-सेक चोटियों के रूप में व्यक्त किया जाता है। पैनल बी-ई को ओहनुकी एट अल.7 से पुन: पेश किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और आईजीजी नियंत्रण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड डीएनए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 1: स्वचालित एकल-सेल पिकिंग और 96-वेल पीसीआर प्लेट (चरण 8.2.4) में स्थानांतरण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 2: तरल हैंडलिंग रोबोट (चरण 8.2.8.1) का उपयोग करके एकल कोशिका वाले कुएं से सतह पर तैरनेवाला हटाना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 3: तरल हैंडलिंग रोबोट (चरण 8.2.8.2) का उपयोग करके एकल सेल वाले कुएं में 4% TEMED / खनिज तेल जोड़ना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक कोड 1: चरण 8.2.8.1-8.2.8.2 से तरल हैंडलिंग रोबोट का स्वचालित कार्यक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह आलेख पुन: प्रयोज्यएकल कोशिकाओं 7 का उपयोग करके हाल ही में रिपोर्ट किए गए एकल-सेल मल्टीएपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। बाद के पैराग्राफ में, हम प्रोटोकॉल में संभावित सीमाओं पर जोर देते हुए महत्वपूर्ण बिंदुओं पर चर्चा करते हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक (चरण 7.2-13 से) DNase संदूषण से बचना है। एक एकल कोशिका में जीनोमिक डीएनए की केवल दो प्रतियां होती हैं। इसलिए, हानिकारक जीनोमिक डीएनए गंभीर रूप से सिग्नल संख्या को कम कर देता है। जीनोमिक डीएनए की अखंडता की रक्षा के लिए डीनेस के साथ संदूषण से बचना आवश्यक है।

कोशिका झिल्ली / कोशिका भित्ति में अभिकर्मकों की पारगम्यता भी पूरे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है। आरईपीआई-सेक को एकल-कोशिका स्तर पर माउस और मानव कोशिकाओं के एपिजीनोम का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस प्रयोगात्मक विधि के लिए इष्टतम स्थितियां प्रत्येक अभिकर्मक के लिए सेल प्रकारों और परमाणु झिल्ली की पारगम्यता के आधार पर भिन्न होने की उम्मीद है। इसलिए, जब विधि माउस और मानव कोशिकाओं के अलावा अन्य कोशिकाओं पर लागू होती है, जैसे कि पौधे की कोशिकाएं, खमीर और बैक्टीरिया, तो प्रत्येक चरण की स्थितियों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

हमारा मानना है कि चरण 9.5 (पहले यादृच्छिक प्राइमर को एनीलिंग) के लिए विशिष्ट एक महत्वपूर्ण बिंदु जीनोमिक डीएनए को विकृत करने के बाद ठंडा होने की तेज गति है। विकृत करने के बाद धीमी और क्रमिक शीतलन जीनोमिक डीएनए से बंधे यादृच्छिक प्राइमरों की एनीलिंग दक्षता को कम कर सकती है। इसके अलावा, चरण 11 (निकटता बंधाव) में, एक महत्वपूर्ण बिंदु बफर संरचना है। पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) युक्त बफर का व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में तेजी से बंधाव विधियों के लिए उपयोग किया जाता है। पीईजी की कम सांद्रता (उदाहरण के लिए, <7.5%) डीएनए वर्षा के बिना डबल-फंसे डीएनए के त्वरित गठन को बढ़ावा देती है। हालांकि, हमने देखा कि पीईजी युक्त लिगेशन बफर एकल कोशिका (पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका) युक्त एकल-कोशिका जेल मोती के संकोचन को प्रेरित करता है, जिससे पता चलता है कि पॉलीक्रिलामाइड मचान का जाल आकार सिकुड़ गया था। चूंकि यह सिकुड़न टी 4 डीएनए लिगेज की कम पहुंच का कारण बन सकती है, इसलिए हमने आरईपीआई-सेक के लिए तेज लिगेशन प्रोटोकॉल का उपयोग नहीं करने का फैसला किया।

आरईपीआई-सेक में, परिणामों का मूल्यांकन एक ही एकल कोशिकाओं में संकेतों की पुन: पहचान आवृत्ति द्वारा किया जा सकता है। पुन: पहचान आवृत्ति प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए उपयोगी है, जिसमें एंटीबॉडी जांच और पहले यादृच्छिक प्राइमर के साथ निकटता बंधाव शामिल है। हमनेपहले बताया था कि एक प्रयोग में H3K27ac पढ़ने का 62.03% दो प्रतिकृति प्रयोगों में पुष्टि की गई थी, यह सुझाव देते हुए कि व्यक्तिगत प्रयोगों में निकटता बंधाव की दक्षता दोहराए गए प्रयोगों में समग्र पुन: पहचान प्रतिशत से अधिक है।

हमने पहले पुन: प्रयोज्य एकलकोशिकाओं में डीएनए से जुड़े आरएनए पोलीमरेज़ II (पोल II) का सफल पता लगाने की सूचना दी है। पोल II बाइंडिंग को इस बाइंडिंग की अस्थायी और अस्थिर प्रकृति के कारण वर्तमान एकल-सेल एपिजीनोम विधियों के साथ पकड़ना मुश्किल है।

एकल-सेल एपिजीनोम विश्लेषण के लिए वर्तमान ट्रांसपोसेज-आधारित कट एंड टैग दृष्टिकोण को न्यूक्लियोसोम-डीएनए इंटरैक्शन के संरक्षण की आवश्यकता होती है। एक विशिष्ट एंटीबॉडी एक हिस्टोन संशोधन को बांधता है; फिर, एंटीबॉडी से जुड़ा ट्रांसपोसेस जीनोमिक डीएनए को छोड़ देता है और डीएनए दरार साइट पर एक डीएनए बारकोड डालता है। यह प्रतिक्रिया न्यूक्लियोसोम (हिस्टोन) -डीएनए इंटरैक्शन पर निर्भर करती है। इसलिए, यह आवश्यक है कि न्यूक्लियोसोम-डीएनए इंटरैक्शन और सेलुलर प्रोटीन और क्रोमैटिन की संरचना बरकरार रहे। इसलिए, कट एंड टैग दृष्टिकोण अनिवार्य रूप से हिस्टोन संशोधनों के विश्लेषण में क्रोमैटिन संरचना के सुलभ क्षेत्रों के लिए पक्षपाती हैं।

सुलभ क्रोमैटिन क्षेत्रों के प्रति अपरिहार्य पूर्वाग्रह एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण में एपिजेनेटिक संकेतों की संख्या में वृद्धि में बाधा डालता है। क्रोमैटिन संरचनाएं कई प्रकार के आणविक इंटरैक्शन द्वारा बनाई जाती हैं, जिनमें न्यूक्लियोसोम से जुड़े प्रोटीन के माध्यम से डीएनए-न्यूक्लियोसोम और न्यूक्लियोसोम-न्यूक्लियोसोम इंटरैक्शन शामिल हैं। इसलिए, हमने सेलुलर प्रोटीन के स्थान को संरक्षित करते हुए पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं में डीएनए-प्रोटीन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को संरक्षित नहीं करने का विकल्प चुना। यह सुविधा मोनोमेरिक एक्रिलामाइड और एक पैराफॉर्मलडिहाइड मिश्रण (प्रोटोकॉल चरण 7) के उपयोग के साथ पूरी की जाती है, जो प्रोटीन को प्रोटीन या प्रोटीन से डीएनए में क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के बजाय सेलुलर प्रोटीन पर अमीनो समूह को संशोधित करती है।

हिस्टोन और जीनोम से जुड़े प्रोटीन का स्थान पॉलीक्रिलामाइड बहुलक के कनेक्शन से बरकरार है। न्यूक्लियोसोम को 71-74 डिग्री सेल्सियस21 के आसपास विकृत किया जाता है। इसलिए, पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका में, हिस्टोन कोपहले यादृच्छिक प्राइमर (94 डिग्री सेल्सियस) के एनीलिंग चरण के बाद एक दूसरे से अलग और शिथिल / अलग किया जाता है। यह हेटरोक्रोमैटिन संरचना को आराम दे सकता है और हेटरोक्रोमैटिन क्षेत्रों में एंटीबॉडी और अन्य अणुओं की पहुंच में सुधार कर सकता है। यह निष्कर्ष हमारे रिपोर्ट किए गए परिणामों7 द्वारा समर्थित है जिसमें दिखाया गया है कि क्रोमैटिन संरचना से जुड़े पूर्वाग्रह कट एंड टैग दृष्टिकोण9 की तुलना में पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं में कम हो जाते हैं।

हिस्टोन एच 3 का पॉलीक्रिलामाइड से संबंध गर्मी के कम से कम 3 राउंड के बाद बनाए रखा जाता है क्योंकि पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका में हिस्टोन का स्थान बार-बारप्रयोगों में संरक्षित होता है। यह सुविधा एक ही एकल सेल का उपयोग करके एक ही प्रयोग की पुनरावृत्ति की अनुमति देती है। बार-बार प्रयोग CUT &Tag दृष्टिकोण की तुलना में एकल सेल से संकेतों की संख्या बढ़ाने में योगदान करते हैं।

विज्ञान में सत्यापनीयता एक मौलिक सिद्धांत है। हालांकि, एक एकल सेल के प्रयोगात्मक परिणामों को सत्यापित करना कट एंड टैग दृष्टिकोण में संभव नहीं है, क्योंकि एक ही सेल के साथ बार-बार प्रयोग संभव नहीं हैं। जीनोमिक डीएनए को ट्रांसपोसेस द्वारा क्लीवर किया जाता है और एक एपिजेनेटिक मार्क के लिए डीएनए बारकोड प्राप्त होता है। क्लीवर जीनोमिक डीएनए अपने मूल स्थान से जारी किया जाता है। इसलिए, एक ही कोशिका में कई एपिजेनेटिक चिह्नों के विश्लेषण के लिए कट एंड टैग दृष्टिकोण एक नुकसान में है। कट एंड टैग विधियों की यह विशेषता प्रति एकल सेल में एपिजेनेटिक चिह्नों की बढ़ती संख्या के साथ कम सिग्नल घनत्व के व्यापार-बंद को रेखांकित करती है।

इस मुद्दे से बचने के लिए, हमने जीनोम को काटने के बजाय जीनोमिक डीएनए की प्रतिलिपि बनाई और फिर कॉपी किए गए जीनोमिक डीएनए को एंटीबॉडी डीएनए जांच के साथ टैग किया। आरईपीआई-सेक एक ही एकल कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है और सिग्नल घनत्व बढ़ाता है। यह प्रयोगात्मक परिणामों की सत्यापनीयता, एपिजेनोमिक विश्लेषण को मल्टीप्लेक्स करने और कट एंड टैग दृष्टिकोण में ट्रेड-ऑफ मुद्दे को हल करने के लिए एक साधन भी प्रदान करता है। यद्यपि विधि ट्रांसपोसेज़-आधारित एपिजेनोमिक विश्लेषण की सीमाओं को पार करती है, लेकिन यह अभी तक एकल-कोशिका स्तर पर बड़ी संख्या में कोशिकाओं का विश्लेषण करने में सक्षम नहीं है। आगे के विकास की आवश्यकता है।

निष्कर्ष में, आरईपीआई-सेक जीनोम को काटने के बजाय जीनोमिक डीएनए की प्रतिलिपि बनाता है और फिर एंटीबॉडी डीएनए जांच के साथ कॉपी किए गए जीनोमिक डीएनए को टैग करता है। आरईपीआई-सेक अभी भी प्रारंभिक अवस्था में है और कोशिकाओं के थ्रूपुट को बढ़ाने की आवश्यकता है। हालांकि, आरईपीआई-सेक में ताकत है, जो वर्तमान एकल-सेल एपिजीनोम विधियों में सीमाओं को दूर करती है: 1) एक ही एकल कोशिकाओं में बार-बार प्रयोगों के माध्यम से संकेतों के ड्रॉप-आउट को कम करके सिग्नल घनत्व में वृद्धि; 2) क्रोमैटिन संरचना के आधार पर दुर्गम क्षेत्रों को कम करके संरचनात्मक पूर्वाग्रह को कम करना; 3) एक ही एकल सेल में बार-बार प्रयोगों द्वारा प्रयोगात्मक परिणामों की सत्यापनीयता प्रदान करना, 4) हर एक सेल में एक ही सिग्नल की पुन: पहचान संभावना के आधार पर सिग्नल पहचान; 5) एपिजेनेटिक चिह्नों के बीच प्रतिस्पर्धा के बिना एक ही एकल कोशिका में कई एपिजेनेटिक चिह्नों का विश्लेषण करना। ये प्रगति एक एकल कोशिका में एपिजेनेटिक तंत्र का विश्लेषण करने की अनुमति देती है, जो एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग है और अन्य एकल-सेल एपिजेनोमिक विधियों के साथ संभव नहीं है।

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Disclosures

ओहनुकी और टोसाटो एक पेटेंट पर सह-आविष्कारक हैं जिसका शीर्षक है "पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका तैयार करने के तरीके और एक एकल कोशिका के एपिजीनोम, ट्रांसस्क्रिप्टम और जीनोम का विश्लेषण करने के तरीके" (ईपी 3619307 और यूएस 20200102604)। पेटेंट आवेदन वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित तकनीक से संबंधित प्रारंभिक परिणामों के आधार पर दायर किया गया था। इस पेटेंट आवेदन में वर्णित और दावा किए गए आविष्कार या आविष्कार तब किए गए थे जब आविष्कारक अमेरिकी सरकार के पूर्णकालिक कर्मचारी थे। इसलिए, संघीय विनियम भाग 7 की संहिता 45 के तहत, इस पेटेंट आवेदन के सभी अधिकार, शीर्षक और हित कानून द्वारा अमेरिकी सरकार को सौंपे गए हैं या सौंपे जाने चाहिए। अमेरिकी सरकार 15 अमेरिकी कोड § 3710 सी के तहत अपने कर्मचारी आविष्कारकों को प्राप्त रॉयल्टी का एक हिस्सा बताती है।

Acknowledgments

हम परियोजना के अवधारणा चरण के दौरान टिप्पणियों के लिए डॉ डेविड सांचेज-मार्टिन और क्रिस्टोफर बी बक को धन्यवाद देते हैं। हम प्रारंभिक प्रयोगों में मदद के लिए जीनोमिक्स कोर, सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च, नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण में सलाह के लिए सहयोगी जैव सूचना विज्ञान संसाधन, सीसीआर, एनसीआई, एनआईएच को भी धन्यवाद देते हैं। हम विधि में उपयोग किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़ के अनुकूलन में मदद करने के लिए सुश्री अन्ना वर्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम ने एनआईएचएचपीसी बायोवुल्फ क्लस्टर (http://hpc.nih.gov) के कम्प्यूटेशनल संसाधनों का उपयोग किया। यह परियोजना सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च, नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, एनसीआई डायरेक्टर इनोवेशन अवार्ड (# 397172) के इंट्राम्यूरल प्रोग्राम और अनुबंध संख्या एचएचएसएन 261200800001ई के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से संघीय धन द्वारा समर्थित है। टॉम मिस्टली, कैरोल थिएले, डगलस आर लोवी, और सेलुलर ऑन्कोलॉजी प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उत्पादक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

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References

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वापसी अंक 180
पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका
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Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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