Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Многоразовая одиночная клетка для итеративного эпигеномного анализа

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

Настоящий протокол описывает одноклеточный метод итеративного эпигеномного анализа с использованием многоразовой одиночной клетки. Многоразовая одиночная клетка позволяет анализировать несколько эпигенетических меток в одной и той же отдельной клетке и статистически проверять результаты.

Abstract

Современные анализы одноклеточного эпигенома предназначены для одноразового использования. Клетка выбрасывается после однократного использования, предотвращая анализ нескольких эпигенетических меток в одной клетке и требуя данных от других клеток, чтобы отличить сигнал от экспериментального фонового шума в одной клетке. В этой статье описывается метод повторного использования одной и той же отдельной клетки для итеративного эпигеномного анализа.

В этом экспериментальном методе клеточные белки сначала прикрепляются к полиакриламидному полимеру вместо того, чтобы сшивать их с белком и ДНК, смягчая структурное смещение. Этот критический шаг позволяет проводить повторные эксперименты с одной и той же клеткой. Затем случайный праймер с последовательностью каркаса для бесконтактного лигирования отжигают на геномную ДНК, и геномная последовательность добавляется к праймеру путем расширения с использованием ДНК-полимеразы. Впоследствии антитело против эпигенетического маркера и контрольный IgG, каждый из которых помечен различными ДНК-зондами, связываются с соответствующими мишенями в одной и той же отдельной клетке.

Бесконтактное лигирование индуцируется между случайным праймером и антителом путем добавления соединительной ДНК с комплементарными последовательностями к каркасной последовательности случайного праймера и зонда антитело-ДНК. Этот подход объединяет информацию об антителах и близлежащие последовательности генома в один продукт ДНК непрямого лигирования. Позволяя проводить повторные эксперименты с одной и той же отдельной клеткой, этот метод позволяет увеличить плотность данных из редкой клетки и статистического анализа с использованием только данных IgG и антител из той же клетки. Многоразовые одиночные клетки, полученные с помощью этого метода, могут храниться в течение, по крайней мере, нескольких месяцев, а затем повторно использоваться для расширения эпигенетической характеристики и увеличения плотности данных. Этот метод обеспечивает гибкость исследователям и их проектам.

Introduction

Одноклеточная технология вступает в эру одноклеточной мультиомики, которая объединяет отдельные одноклеточные омические технологии1. В последнее время одноклеточная транскриптомика была объединена с методами определения доступности хроматина (scNMT-seq2 и SHARE-seq3) или модификаций гистонов (Paired-seq4 и Paired-Tag5). Совсем недавно одноклеточная транскриптомика и протеомика были интегрированы с доступностью хроматина (DOGMA-seq6). Эти методы используют мечение на основе транспозазы для обнаружения доступности хроматина или модификаций гистонов.

Подходы, основанные на транспозазе, расщепляют геномную ДНК и добавляют штрих-код ДНК в конце фрагмента геномной ДНК. Каждый расщепленный фрагмент генома может принимать только до двух штрих-кодов ДНК (= одна эпигенетическая метка на сайт расщепления), и геномная ДНК в месте расщепления теряется. Таким образом, подходы, основанные на расщеплении, имеют компромисс между количеством протестированных эпигенетических меток и плотностью сигнала. Это затрудняет анализ нескольких эпигенетических меток в одной и той же клетке. Для решения этой проблемы был разработан одноклеточный эпигеномный метод, который не расщепляет геномную ДНК 7,8.

В дополнение к упомянутой выше проблеме, связанной с расщеплением, подходы, основанные на транспозазе, имеют и другие ограничения. При анализе одноклеточного эпигенома очень важно знать расположение гистонов и ДНК-ассоциированных белков в геноме. В современных подходах это достигается за счет использования нефиксированных одиночных клеток и сохранения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий. Однако это приводит к сильному смещению в отношении доступных областей хроматина даже при анализе модификаций гистонов 9. Расположение гистонов и геном-ассоциированных белков на геноме может быть сохранено без сшивания белок-ДНК и белок-белок, используя полиакриламидный каркас 7,8. Этот подход уменьшает структурное смещение, наблюдаемое в современных подходах, которые зависят от белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий.

Подходы, основанные на транспозазе, могут получать сигналы только один раз от одной клетки. Поэтому трудно очертить полный эпигеном одной клетки из-за падения сигналов. Многоразовые одиночные клетки были разработаны для преодоления текущих ограничений, позволяя проводить итеративный эпигеномный анализ в одной и той же отдельной клетке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое изображение метода показано на рисунке 1.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение рабочего процесса протокола. Этапы 7.2-13 объясняются с помощью схематических изображений. Каждая строка указывает шаг в протоколе. Клеточный белок, окрашенный в зеленый цвет, представляет собой нуклеосому человека, созданную на основе кристаллической структуры (PDB: 6M4G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Уравновешивание обессоливающих колонн

ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливание спиновых колонн уравновешивается, как описано в следующих шагах. Уравновешенные обессоливающие колонны используются на этапах 2.1, 3.4 и 4.6.

  1. Снимите нижнюю крышку обессоливающей колонны (отсечка 7 кДа, объем шарика смолы 0,5 мл, см. Таблицу материалов) и ослабьте крышку в верхней части обессоливающей колонны.
  2. Поместите колонку в пробирку с низким связыванием белка объемом 1,5 мл (пробирку для сбора, см. Таблицу материалов) и центрифугу при 1,500 × г в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы удалить раствор для хранения в колонке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугу с поворотным ротором, чтобы сгладить верхнюю часть слоя борта.
  3. Удалите проточный фильтр в пробирке объемом 1,5 мл и добавьте 300 мкл 150 мМ фосфатного буфера NaCl/100 мМ с pH 8,0 (см. Таблицу 1) поверх слоя смолы.
  4. Центрифугу при 1 500 × г в течение 1 мин при комнатной температуре и удаляют проточные отверстия в сборную трубку.
  5. Повторите шаги 1.3-1.4 еще три раза.
  6. Избавьтесь от буфера из сборной трубки и поместите колонку в новую сборную трубку.
  7. Используйте уравновешенную колонну обессоливания на шагах 2.1, 3.4 и 4.4.

2. Буферный обмен антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите глицерин, аргинин и азид натрия из анти-H3K27ac 10, анти-H3K27me3 10, анти-Med111 и анти-Pol II10 (см. Буферную композицию, показанную в таблице 1). Все последующие процедуры выполняются под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1 час

  1. Наносят раствор антитела (100 мкл, см. Таблицу 2) на уравновешенную обессоливающую колонну, приготовленную после шага 1.
  2. Центрифугу при 1 500 × г в течение 2 мин при 4 °C и перенос потока из сборной пробирки в пробирку с низким связыванием белка объемом 1,5 мл.
  3. Измерьте концентрацию IgG с помощью абсорбции на длине волны280 нм 12 (используйте микрообъемный спектрофотометр).
  4. Переносят раствор антитела в ультрафильтрационную кассету (отсечка молекулярной массы 100 кДа, 0,5 мл, см. Таблицу материалов) и центрифугу при 12 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Измерьте концентрацию IgG, используя коэффициент поглощения на длине волны 280 нм.
  6. Повторяйте шаги 2,4-2,5 до тех пор, пока концентрация IgG не достигнет 1 мг / мл.

3. Активация антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Растворите 1 мг сукцинимидил-6-гидразиноникотината ацетонгидразона гидразона (S-HyNic, см. Таблицу материалов) 100 мкл безводного N,N-диметилформамида (ДМФ, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДМФА является легковоспламеняющимся органическим растворителем и мощным токсином печени, всасывающимся через кожу. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Добавьте 0,6 мкл S-HyNic / DMF к 100 мкл раствора антитела (1 мг / мл в 150 мМ NaCl / 100 мМ фосфата натрия, pH8,0. В таблице 2 приведены используемые антитела и контрольный IgG.
  3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч (беречь от света).
  4. Нанесите 100 мкл антитела, реагирующего на S-HyNic, в верхнюю часть уравновешенной обессоливающей колонны (см. шаг 1) и центрифугу при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 °C для сбора образца.
  5. Выбросьте обессоливающую колонну после использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильность групп HyNic на белках и других биомолекулах варьируется. Рекомендуется немедленно конъюгировать биомолекулы, модифицированные HyNic.

4. Активация ДНК-зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Растворите гранулу модифицированного амином ДНК-зонда для антител или контрольного IgG (зонд антител, таблица 3) 20 мкл 150 мМ NaCl / 100 мМ буфера фосфата натрия, pH 8,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите тонкие прозрачные гранулы / пленку на дне тюбика. Нанесите буфер непосредственно на гранулы. Если гранула не видна, возможно, гранула отсоединилась и прилипла к стене или крышке. В этом случае центрифугируйте пробирку и ищите гранулы на дне пробирки.
  2. Растворите 1 мг сукцинимидил-4-формилбензоата (S-4FB, см. Таблицу материалов) 50 мкл безводного ДМФА и добавьте 10 мкл ДМФА к растворенному зонду антител.
  3. Добавьте 4 мкл S-4FB/DMF, приготовленного на этапе 4.2, перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч (защищая от света).
  4. Нанесите 34 мкл зонда антител, реагирующего на S-4FB, в верхнюю часть уравновешенной обессоливающей колонны (см. шаг 1).
  5. Нанесите 15 мкл 150 мМ NaCl/100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 8,0, на верхнюю часть слоя геля после того, как образец полностью впитается, и центрифугу при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 ° C для сбора модифицированного S-4FB зонда антител.
  6. Используйте проточный канал для последующего спряжения; измерить коэффициент поглощения на длине волны 260 нм; и рассчитайте скорость восстановления зонда антител.

5. Конъюгация S-HyNic-модифицированного антитела и S-4FB-модифицированного зонда антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2 часа

  1. Смешайте антитело, модифицированное S-HyNic, и зонд антитела, модифицированное S-4FB, и нанесите раствор пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать.
  2. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (беречь от света).
  3. Чтобы погасить реакцию, добавьте 478,8 мкл раствора для тушения и хранения (см. Таблицу 1).
  4. Перенесите раствор антитела, конъюгированного с зондом антитела, в ультрафильтрационную кассету (отсечка молекулярной массы 100 кДа).
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 12 000 × г, 4 °C.
  6. Проверьте объем раствора внутри кассеты пипеткой.
  7. Повторяйте шаги 5,5-5,6 до тех пор, пока объем не достигнет 100 мкл, и храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация IgG измеряется с помощью сэндвич-ИФА13,14,15 с использованием стандарта IgG.

6. Подготовка магнитных шариков сердечника

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе одна ячейка встроена в двухслойный акриламидный шарик (см. рис. 2). Ядро представляет собой магнитную полиакриламидную бусину. Внешний слой состоит только из полиакриламида. В этом разделе генерируются магнитные шарики с сердечником. Этот раздел не является обязательным для эксперимента. Время: 3 часа

Figure 2
Рисунок 2: Структура двухслойного полиакриламидного шарика для видимости и простоты обращения в экспериментах REpi-seq . (A) Магнитные наночастицы со стадии 6.6 после центрифугирования. Магнитные наночастицы модифицированы мономерным акриламидом и интегрированы в полиакриламидный магнитный шарик, показанный на B. (B) Схематическое изображение многоразовой одиночной ячейки с полиакриламидным магнитным шариком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Смешайте 50 мкл 1 М буфера бикарбоната натрия с pH 8,5 и 450 мкл 40% раствора акриламида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акриламид является нейротоксином. Наденьте перчатки, защиту глаз и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Суспендировать 1 г 30 нм порошка оксида железа, функционализированного эфиром NHS (см. Таблицу материалов), в буфере из акриламида/бикарбоната натрия и инкубировать при 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку акриламидные шарики прозрачны, может быть трудно увидеть и манипулировать положением бусин. Включение стержня из оксида железа улучшает видимость и облегчает манипуляции, поскольку положение шариков можно контролировать с помощью магнита. Однако, если пользователи знакомы с экспериментами REpi-seq, использование магнитных полиакриламидных шариков с сердечником можно пропустить.
  3. Перенесите суспензию наногранул в 2 пробирки (1,5 мл), центрифугу при 21 300 × г в течение 1 ч (используйте угловой ротор) при 4 ° C и удалите надосадочную жидкость.
  4. Суспендировать донную суспензию 1 мл 40% акриламида / бис-акриламида (19: 1, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бис-акриламид является нейротоксином. Наденьте перчатки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  5. Центрифуга при 21 300 × г в течение 1 ч (используйте угловой ротор) при 4 °C.
  6. Центрифуга при 5 000 × г в течение 30 мин (используйте поворотный ротор без тормоза) при 4 °C.
  7. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 с медленной аспирацией.
  8. Отрегулируйте объем 400 мкл 40% акриламида/бис-акриламида (19:1, см. Таблицу материалов).
  9. Добавьте 25 мкл 10% раствора персульфата аммония (см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Персульфат аммония является сильным окислителем. Переносимая по воздуху пыль, содержащая персульфат аммония, может раздражать глаза, нос, горло, легкие и кожу при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  10. Чтобы получить магнитные полиакриламидные шарики с сердечником, перенесите 0,5 мкл суспензии оксида железа, модифицированной акриламидом, в пробирку для ПЦР.
  11. Добавьте 50 мкл 4% N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина/минерального масла (TEMED, см. Таблицу 1) и выдержите в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TEMED является легковоспламеняющимся растворителем. Работа под капотом. Не вдыхайте. Хранить вдали от открытого огня, горячих поверхностей и источников возгорания. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.

7. Модификация аминогруппы клеточных белков мономеракриламидом

ПРИМЕЧАНИЕ: REpi-seq был разработан для анализа эпигенома клеток мыши и человека на уровне отдельных клеток. Каждый шаг должен быть оптимизирован при использовании этого метода на клетках видов, отличных от мыши или человека.

  1. Заготовка клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время: 30 мин
    1. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью счетчика клеток (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток на этом этапе влияет на то, сколько клеток являются живыми клетками в анализе данных.
    2. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 ×10,5 клеток/мл с питательной средой (*), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: * Питательная среда является оптимальной питательной средой для интересующих клеток.
    3. Перенесите 1 мл клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Центрифугируют клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют надосадочную жидкость.
    5. Добавьте 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), перемешайте клетки мягким пипетированием и центрифугируйте клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 ° C.
    6. Удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все вышеперечисленные шаги следует выполнять в чистом колпаке с ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение.
  2. Модификация аминогруппы клеточных белков мономерным акриламидом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч
    1. Добавьте 1 мл раствора для модификации аминогруппы (см. Таблицу 1) в клеточную гранулу и суспендируйте клеточную гранулу путем осторожного пипетирования.
    2. Инкубируют пробирку на льду в течение 1 ч и центрифугу клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С.
    3. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 100 мл 4% акриламида / 1 мМ ЭДТА / PBS, содержащего интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1, 1 клетка / мкл).

8. Подготовка многоразовых одиночных ячеек

  1. Подготовка многоразовых одиночных ячеек (ручная версия)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 9 ч/96 ячеек
    1. Смешайте 1 мл клеточной суспензии (1 клетка/мкл) и 199 мл 1 мМ ЭДТА/ПБС, содержащей интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1).
    2. Перенесите 200 мкл суспензии ячейки в каждую лунку с плоским дном 96-луночных пластин (всего 10 пластин, см. Таблицу материалов).
    3. Наденьте крышку на 96-луночную пластину и отсканируйте 10 пластин с помощью сканирующего микроскопа (см. Таблицу материалов), чтобы идентифицировать лунки, содержащие одну ячейку.
    4. Перенесите содержимое лунки, содержащей одну клетку, в ПЦР-пробирку.
      1. Наклоните пластину (в сторону оператора) и подождите несколько минут, пока одиночная ячейка не опустится до нижнего края колодца.
      2. Поместите наконечник пипетки в нижний угол и перенесите одну клетку и буфер (аспирация 210 мкл / лунка = 200 мкл буфера + 10 мкл воздуха) в пробирку для ПЦР.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте наконечник P200 с низким уровнем удержания.
      3. Проверьте лунку с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы подтвердить перенос.
      4. Если одна клетка все еще находится в лунке, добавьте 200 мкл / лунку 1 мМ ЭДТА / PBS, содержащую интеркаляторный краситель для ДНК.
      5. Затем повторите передачу.
    5. Центрифугируют ПЦР-пробирку при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С с помощью поворотного ротора без тормоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Торможение вызывает закрученный поток воды в трубке, который нарушает осаждение одиночной ячейки. При центрифугировании с качающимся ротором без тормоза одиночная ячейка всегда будет опускаться на дно трубки. Однако, если используется угловой ротор, одиночная ячейка прикрепляется к боковой стенке ПЦР-пробирки и может быть потеряна.
    6. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
    7. Добавьте 195 мкл / тюбик раствора акриламида / бис-акриламида / APS (см. Таблицу 1).
    8. Центрифугируют ПЦР-пробирку при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С с помощью поворотного ротора без тормоза.
    9. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
    10. Перенесите нижние 3 мкл в пробирку для ПЦР, содержащую 4% TEMED/минерального масла и магнитный полиакриламидный шарик (полученный на этапе 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте наконечник P10 с низким уровнем удержания. Распределите ячейку рядом с магнитным полиакриламидным шариком. В минеральном масле жидкость, содержащая одиночную ячейку, прилипает к поверхности магнитного полиакриламидного шарика за счет поверхностного натяжения.
    11. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате этого процесса образуется двухслойный шарик акриламидного геля. Сердцевина представляет собой магнитный гелевый шарик. Внешний слой представляет собой полиакриламидный гель, содержащий одну ячейку. Одиночная клетка встроена во внешний слой геля. Безопасная точка остановки: После промывки многоразовых одиночных ячеек 50% глицерином/1 мМ ЭДТА/0,05% буфером Tween 20/0,5% BSA/TBS многоразовые одиночные ячейки можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
  2. Подготовка многоразовых одиночных ячеек (полуавтоматическая версия)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 3 ч/96 ячеек
    1. Смешайте 1 мл клеточной суспензии (1 клетка/мкл) и 199 мл 1 мМ ЭДТА/ПБС, содержащей интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1).
    2. Перенесите 200 мкл суспензии ячеек в каждую лунку пластины с нанолункой 4 нл (см. Рисунок 3 и Таблицу материалов) и поместите пластину с наноячейкой 4 нл на автоматизированного робота-сборщика одной ячейки (см. Таблицу материалов).
    3. Поместите ПЦР-планшет на 96 лунок в качестве целевой пластины на автоматизированном роботе для сбора отдельных клеток. Убедитесь, что каждая лунка содержит 200 мкл / лунку раствора акриламида / бис-акриламида / APS (см. Таблицу 1).
    4. Перенесите одну ячейку из нанолунки 4 нл в лунку 96-луночной ПЦР-пластины (см. Дополнительное видео S1).
    5. Накройте 96-луночную ПЦР-пластину крышкой и центрифугируйте 96-луночную пластину при 240 × г в течение 5 мин при 4 °C, используя поворотный ротор без тормоза.
    6. Поместите ПЦР-планшет с 96 лунками на палубу автоматического робота для работы с жидкостями (см. Таблицу материалов, рис. 4 и дополнительный код 1).
    7. Перетащите дополнительный код 1 в окно программного обеспечения (см. Таблицу материалов) робота для работы с жидкостями.
    8. Запустите программу на автоматическом роботе для работы с жидкостями (см. Дополнительное видео S2 и Дополнительное видео S3).
      1. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
      2. Добавьте 50 мкл 4% TEMED/минерального масла.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 8.2.8.1-8.2.8.2 могут быть выполнены с помощью ручного пипетирования.
    9. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 5). Безопасная точка остановки: после промывки многоразовых одиночных ячеек 50% глицерином/1 мМ ЭДТА/0,05% буфером Tween 20/0,5% BSA/TBS храните многоразовые одиночные ячейки при -20 °C до 6 месяцев.

Figure 3
Рисунок 3: Автоматический отбор и перенос отдельных ячеек в 96-луночный планшет для ПЦР на шаге 8.2 . (A) Обзор системы отбора с одной ячейкой. Один робот для сбора ячеек находится в чистом колпаке с ламинарным потоком, чтобы избежать загрязнения. (B) 24-луночная пластина с нанолунками 4 нл внутри лунки. (C) Распределение ячеек в скважине из 24-луночного планшета. Зеленые точки - это клетки, идентифицированные как одна клетка в каждой нанояме объемом 4 нл. Пурпурные точки - это клетки, идентифицированные как дублеты или мультиплеты клеток. (D) Изображение скважины в светлом поле на 24-луночной пластине. Зеленый квадрат представляет собой нанолунку объемом 4 нл, содержащую одну ячейку. Пурпурный квадрат представляет собой нанолунку объемом 4 нл, содержащую несколько ячеек. (E) Увеличенное поле нанолунок объемом около 4 нл. Яркие точки представляют собой одиночные клетки в нанолунках 4 нл. Система отбора одиночных клеток идентифицирует нанолунки, содержащие одну клетку, путем получения яркого поля и флуоресцентных изображений клеток с окрашиванием DAPI. Идентифицированные одиночные клетки переносятся из нанолунки 4 нл в лунку 96-луночной ПЦР-пластины. Масштабные линейки = 2 мм (C, D), 100 мкм (E). Аббревиатура = DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Создание многоразовых одиночных ячеек с использованием робота для обработки жидкостей. (А) Палуба робота для обработки жидкостей. Колода имеет 11 слотов для стоек для наконечников пипеток (наконечник P300: слоты 1-3, наконечник P20: слоты 5-6), планшет для глубоких скважин объемом 2 мл на 96 лунок (слот 4), два планшета для ПЦР на 96 лунок, содержащие по одной ячейке на лунку (слоты 7 и 10), и два планшета с плоским дном на 96 лунок для жидких отходов (слоты 8 и 11). (B) Палуба после размещения лабораторной посуды. (C) Схематическое изображение роботизированного пипетирования на этапе 8.8.1. Программа удаляет надосадочную жидкость без аспирации ни одной клетки со дна 96-луночной ПЦР-пластины. (D) Многоразовые одиночные ячейки, созданные с использованием Дополнительного кода 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

9. Случайный отжиг и удлинение грунтовки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Звездочки (*) на следующих этапах указывают на то, что магнитный сепаратор может быть использован для управления положением полиакриламидных шариков, содержащих многоразовую одиночную ячейку в пробирке. Однако использование магнитного сепаратора не является обязательным. Медленно двигаясь вниз по наконечнику пипетки вдоль стенки трубки, шарики выталкиваются вверх для промывки или буферной замены. Время: 9 ч

  1. Удалите минеральное масло пипеткой (*) и промойте (*) 5 раз 200 мкл 1x TP Mg(-) буфера (разбавьте 10x TP Mg(-) буфер до 1x буфера сверхчистой водой, см. Таблицу 1).
  2. Удалите надосадочную жидкость (*) и добавьте 15 мкл буфера для отжига (см. Таблицу 1).
  3. Инкубировать в течение 1 ч на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой инкубации является проникновение плазматической и ядерной мембран и доставка случайного праймера в ядро клетки.
  4. Поместите пробирки для ПЦР на термоциклер и нагревайте при температуре 94 °C в течение 3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 20 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  5. Переложите трубки в охлажденный льдом металлический блок и выдерживайте в течение 2 минут.
  6. Добавьте 4 мкл смеси MgSO4/NaCl/dNTP (см. Таблицу 1) и перемешайте вихревым смесителем на средней скорости.
  7. Добавьте 1 мкл Bst-полимеразы, крупный фрагмент (см. Таблицу материалов) и перемешайте с помощью вихревого смесителя на средней скорости.
  8. Инкубировать в течение 4 ч на шейкере (600 об/мин при 4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой инкубации является доставка Bst-полимеразы в ядро клетки.
  9. Поместите ПЦР-пробирку на термоциклер и запустите одну из следующих программ.
    1. Запустите 4-часовую программу: 10 °C в течение 30 мин, 20 °C в течение 30 мин и 25 °C в течение 180 мин.
    2. В качестве альтернативы запустите ночную программу: 4 ° C в течение 4 ч, 10 ° C в течение 2 ч, 20 ° C в течение 2 ч, 25 ° C в течение 4 ч и удерживайте при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 °C.

10. Связывание антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч

  1. Добавьте 1,625 мкл раствора NaCl/EDTA/BSA (см. Таблицу 1) и перемешайте вихревым движением на низкой скорости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на то, чтобы: 1) облегчить хелатирование Mg2+ ЭДТА, 2) стабилизировать связывание расширенного1-го случайного праймера 300 мМ NaCl и 3) блокировать неспецифическое связывание антител с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в последующей реакции.
  2. Инкубируют в течение 1 ч на льду и добавляют по 0,1 мкг/мл каждого антитела и контрольного IgG, конъюгированного с зондом антител (приготовленным на шаге 5).
  3. Инкубировать в течение ночи на льду, слегка встряхивая шейкер.

11. Бесконтактное лигирование зонда антител и проксимально расширенного случайного праймера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Звездочки (*) на следующих этапах указывают, где можно использовать магнитный сепаратор для управления положением полиакриламидных шариков, содержащих многоразовую одиночную ячейку в пробирке. Однако использование магнитного сепаратора не является обязательным. Медленно двигаясь вниз по кончику пипетки вдоль стенки трубки, шарики можно выталкивать вверх для промывки или замены буфера. Время: 6 ч

  1. Промыть (*) дважды 200 мкл 1x буфера TPM-T (20-минутная инкубация при каждой промывке) на льду. Разбавьте 10x буфер TPM-T (Tris-HCl / хлорид калия / сульфат магния / Triton X-100) до 1x сверхчистой водой).
  2. Удалите (*) надосадочную жидкость и промойте (*) один раз 1x буфером ДНК-лигазы Т4 (см. Таблицу материалов).
  3. Удалите (*) надосадочную жидкость и добавьте 19 мкл раствора адаптера лигирования (см. Таблицу 1).
  4. Инкубировать 1 ч при 25 °C.
  5. Добавьте 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (см. Таблицу материалов) и перемешайте пробирку на вихревой смесителе на средней скорости.
  6. Поместите пробирку на термоциклер и запустите следующую программу: программа бесконтактного лигирования, 4 ч при 16 °C и 30 мин при 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера комнатная.
  7. Дважды ненадолго промойте (*) 200 мкл 1x буфера Bst Mg(-) EDTA(+) (см. Таблицу 1; приготовьте 1x буфер из 10x запасного буфера) и храните ячейку при температуре 4 °C на ночь. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 ° C.

12. Полное расширение 1-го случайного праймера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 4,5 часа

  1. Дважды промойте 200 мкл 1x Bst Mg(-) EDTA(-) буфером (см. Таблицу 1, приготовьте 1x буфер из 10x исходного буфера), удалите надосадочную жидкость и добавьте 20 мкл смеси Bst/dNTPs/MgSO4 (см. Таблицу 1).
  2. Смешайте с помощью вихревого смесителя на средней скорости и выдерживайте в течение 4 ч на орбитальном шейкере (при 6 °C и 500 об/мин).
  3. Поместите трубку на термоциклер и запустите следующую программу: программа полного расширения: 10 °C в течение 1 ч, 20 °C в течение 1 ч, 30 °C в течение 1 ч, 40 °C в течение 1 ч, 50 °C в течение 1 ч, 65 °C в течение 1 ч, 94 °C в течение 10 мин и держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: эксперимент можно остановить здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые одиночные ячейки при температуре 4 ° C.

13. Многократное усиление смещения

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 ч (шаги 13.1-13.2) + 15 мин (шаги 13.3-13.4) + 1 день (шаги 13.5-13.10)

  1. Добавьте 0,4 мкл 100 мкМ2-й случайной грунтовки (см. Таблицу 3) и перемешайте вихревым смесителем на средней скорости.
  2. Инкубировать в течение 2 ч при 6 °C и 500 об/мин на орбитальном шейкере, поместить трубку в термоциклер и нагревать при 94 °C в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25,4 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  3. Поместите пробирки в металлический блок с ледяным охлаждением и добавьте 1 мкл / пробирку ДНК-полимеразы Bst.
  4. Закрутите вихрь на медленной скорости, поместите трубки на термоциклер и запустите следующую программу:
    4 °C в течение 4 ч, 10 °C в течение 30 мин, 20 °C в течение 30 мин, 30 °C в течение 30 мин, 40 °C в течение 30 мин, 50 °C в течение 30 мин, 65 °C в течение 60 мин, 94 °C в течение 3 мин и держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 26,4 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 °C.
  5. Соберите надосадочную жидкость (примерно 20 мкл) и перенесите ее в ПЦР-пробирку.
  6. Храните собранную надосадочную жидкость при температуре -80 °C.
  7. Добавьте 20 мкл / пробирку 0,05% буфера Tween 20/0,1x TE в пробирку для ПЦР, содержащую многоразовую одиночную клетку (см. Таблицу 1), и инкубируйте многоразовую одиночную клетку при 4 ° C в течение ночи. Безопасная точка остановки: остановите эксперимент здесь на несколько дней, продлив время инкубации.
  8. Соберите надосадочную жидкость и объедините надосадочную жидкость с образцом, собранным на шаге 13.5.
  9. Повторите шаги 13.7-13.8 еще раз. Замочите многоразовую одиночную ячейку в 50% глицерине/5 мМ ЭДТА/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS буфера и инкубируйте в течение 30 минут на орбитальном шейкере (4 °C, 600 об/мин). Храните многоразовую одиночную ячейку при температуре -20 °C до следующего эксперимента.
  10. Добавьте 40 мкл смеси Exo-master (см. Таблицу 1), поместите пробирку на термоциклер и запустите следующую программу: i) 95 °C в течение 5 мин, ii) 95 °C в течение 30 с, iii) 60 °C 30 с, iv) 72 °C в течение 30 с, v) повторить шаги ii-iv 19 раз, vi) 72 °C в течение 5 мин, vii) хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 45 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: эксперимент можно остановить здесь, по крайней мере, на несколько дней, если хранить образец при температуре -80 °C.

14. Фенол-хлороформная очистка и осаждение полиэтиленгликоля

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч

  1. Перенесите продукт в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 0,5 мл и добавьте 100 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт вызывает раздражение и, возможно, ожоги при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Используйте только при достаточной вентиляции или надевайте соответствующий респиратор. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Встряхните в течение 30 с вручную и центрифугу при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Соберите водную фазу (80 мкл) в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 0,5 мл и добавьте 40,84 мкл / пробирку смеси линейного акриламида / MgCl2 (см. Таблицу 1).
  4. Добавьте 47,06 мкл / пробирку 50% (мас./об.) PEG8000 (без РНКазы) и перемешайте пипеткой.
  5. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре и центрифуге при 240 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 400 мкл / тюбик 80% этанола (EtOH).
  7. Промойте 80% EtOH, удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора и высушите гранулы на воздухе.
  8. Суспендируйте гранулу с 20 мкл 1 мМ ЭДТА / 10 мМ трис-HCl, буфер pH 7,4, и храните раствор при -80 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте концентрацию ДНК с помощью двухцепочечного интеркаляторного красителя, специфичного для ДНК (см. Таблицу материалов). Безопасная точка остановки: Эксперимент можно спокойно остановить здесь как минимум на неделю.

15. Транскрипция in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой и РНКазой. Время: 5 ч

  1. Разморозьте ДНК продуктов, полученных из одной клетки (начиная с этапа 14), и подготовьте смешанную библиотеку продуктов, полученных из одной клетки, путем смешивания 2 мкл / клетка продуктов ДНК (общий объем 20 мкл).
  2. Добавьте 26 мкл мастер-смеси для транскрипции in vitro (см. Таблицу материалов и протокол производителя) и перемешайте пипеткой.
  3. Поместите ПЦР-пробирку в термоциклер и инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 46 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  4. Добавьте 5 мкл 10-кратного буфера ДНКазы I (см. Таблицу материалов) и добавьте 4 мкл ДНКазы I (без РНКазы, 4 ЕД, см. Таблицу материалов).
  5. Смешать и инкубировать в течение 15 мин при 37 °C и перенести образец в пробирку объемом 0,5 мл.
  6. Добавьте 300 мкл / тюбик тиоцианата-фенола-хлороформа гуанидиния (см. Таблицу материалов) и перемешайте легким вихрением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния может привести к серьезным химическим ожогам при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Используйте только при достаточной вентиляции или надевайте соответствующий респиратор. Соблюдайте правила безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  7. Инкубировать в течение 5 минут при R.T. на шейкере, а затем хранить образцы при -80 °C до 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на срок до 3 дней.

16. Очистка РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой и РНКазой. Время: 2 часа

  1. Добавьте 80 мкл хлороформа в образец с этапа 15.7 и энергично встряхните пробирку вручную в течение 15 с.
  2. Инкубируют в течение 2-15 мин при комнатной температуре и центрифугируют образец при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C.
  3. Соберите и перенесите водную фазу образца (~200 мкл) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 600 мкл / пробирку тиоцианата-фенола-хлороформа гуанидиния и перенесите образец в пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Добавьте 180 мкл / тюбик хлороформа и энергично встряхивайте пробирку вручную в течение 15 с.
  6. Центрифугируют образец при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Соберите и перенесите водную фазу образца (~ 450 мкл) в пробирку объемом 1,5 мл.
  8. Добавьте 60 мкл / тюбик линейного акриламида (5 мкг / мкл) и добавьте 400 мкл / тюбик 100% изопропанола в водную фазу.
  9. Инкубируют пробирку при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  10. Удалите надосадочную жидкость аккуратно.
  11. Промойте гранулы РНК 3 раза 200 мкл 75% этанола (вода, не содержащая EtOH/РНКазы), удалите надосадочную жидкость и высушите гранулы РНК на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте РНК полностью высохнуть, потому что гранулы могут потерять растворимость.
  12. Ресуспендировать гранулу РНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы, содержащей ингибитор РНКазы (1 мкл / 20 мкл), и растворить гранулу пипеткой.
  13. Измерьте коэффициент поглощения на длине волны 260 нм.

17. Обратная транскрипция

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1 час

  1. Добавьте 7 мкл / тюбик праймера обратной транскрипции + смесь dNTP (см. Таблицу 1 и Таблицу 3) и поместите пробирки на термоциклер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 27 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  2. Нагрейте до 65 ° C в течение 5 минут и поместите трубки на лед не менее чем на 1 минуту.
  3. Добавьте 14 мкл / тюбик основной смеси обратной транскриптазы (см. Таблицу 1) и перемешайте пипеткой.
  4. Поместите трубки на термоциклер и инкубируйте их при 55 ° C в течение 10 минут, а затем при 80 ° C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 60 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.

18. Синтез второй нити

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Добавьте 40 мкл / пробирку сверхчистой воды и разделите раствор 100 мкл на две пробирки для ПЦР по 0,2 мл (50 мкл / пробирка).
  2. Добавьте 60 мкл на пробирку смеси Second Strand Synthesis (см. Таблицу 1), поместите пробирки на термоциклер и запустите следующую программу: i) 95 °C в течение 5 мин, ii) 95 °C в течение 30 с, iii) 60 °C в течение 30 с, iv) 72 °C в течение 30 с, v) повторить шаги ii-iv 20 раз и vi) держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 110 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  3. Добавьте 4,4 мкл на тюбик 0,5 М ЭДТА (конечные 20 мМ) и храните при температуре -80 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на срок до нескольких дней.
  4. Очистите ДНК фенол-хлороформной очисткой и осаждением полиэтиленгликолем (описано на шаге 14).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь как минимум на одну неделю.

19. Переваривание ферментов рестрикции и выбор размера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 3 часа (шаги 19.1-19.7)

  1. Измерьте концентрацию ДНК очищенной ДНК (начиная с шага 18.4) путем измерения абсорбции при 260 нм.
  2. Перенесите 6 мкг ДНК в пробирку для ПЦР, добавьте 30 мкл 10-кратного буфера для разложения и отрегулируйте объем до 294 мкл сверхчистой водой.
  3. Добавьте 6 мкл фермента рестрикции BciVI и инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа.
  4. Выполните осаждение EtOH с линейным полиакриламидом.
    1. Добавьте 60 мкл / тюбик 3 М ацетата натрия (pH 5,2), а затем добавьте 40 мкл / тюбик линейного акриламида (5 мг / мл, см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте 400 мкл / тюбик EtOH и выдерживайте в течение ночи при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на один день.
    3. Центрифугу 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °С и удалить надосадочную жидкость.
    4. Дважды промойте гранулы с 80% EtOH и высушите гранулы.
    5. Растворите гранулу 20 мкл буфера 1xTE и добавьте 4 мкл / тюбик свежего буфера 6x Gel Loading.
  5. Загрузите образец в 5% агарозный гель / 0,5-кратный буфер TAE и проведите электрофорез (50 В в течение 40 мин).
  6. Разрежьте и соберите гель с содержанием более 50.н. (см. рис. 6) и извлеките ДНК с помощью набора для экстракции геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь как минимум на одну неделю.
  7. Создайте библиотеку секвенирования, используя набор для подготовки библиотеки ДНК (см. Таблицу материалов)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одиночные ячейки K562 были сгенерированы с использованием протокола, описанного на шаге 8 (см. рис. 5). Отдельные ячейки были встроены во внешний слой полиакриламидной гранулы. Клеточную ДНК окрашивали и визуализировали с помощью интеркаляторного красителя для окрашивания ДНК.

Figure 5
Рисунок 5: Сгенерированные многоразовые одиночные ячейки. Клетки окрашивают интеркаляторным красителем для ДНК (зеленая флуоресценция). Белыми стрелками обозначены отдельные ячейки, встроенные во внешний слой полиакриламидных шариков. Многоразовая одиночная ячейка помещена в 96-луночную пластину с плоским дном. Изображения были сделаны сканирующим микроскопом BZ-X710. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты, показанные на рисунке 6 , подтвердили генерацию желаемых продуктов ДНК. Продукты ДНК с этапа 19.7 расщеплялись ферментом рестрикции BciVI на фрагменты 19-20.н., 31-32.н., 49.н. и >49.н. Эти результаты подтвердили вывод о том, что большинство продуктов содержат последовательности, полученные из зонда антител, и последовательности, полученные из2-го случайного праймера. Затем продукты ДНК были лигированы с адаптером Illumina с помощью набора TruSeq Nano и секвенированы с помощью секвенатора Illumina NovaSeq6000.

Figure 6
Рисунок 6: Продукты ДНК до и после переваривания фермента рестрикции BciVI . (A) При расщеплении BciVI были получены ожидаемые фрагменты 19-20.н., фрагменты 31-32.н. и желаемые продукты (>49.н.), содержащие штрих-код антитела, лигированную последовательность, геномную ДНК и штрих-код клетки. (B) Распределение конечных продуктов по размерам в конце этапа 19.7. Построенную библиотеку ДНК анализировали методом капиллярного электрофореза. Светло-розовая линия указывает на желаемые продукты, содержащие адаптеры секвенирования, штрих-код антител и штрих-код клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты секвенирования показали, что продукты, полученные на следующих этапах 7-19, содержат зонд антител, лигированную последовательность, последовательность генома и штрих-код клетки. Уникальные картированные чтения анти-H3K27ac и анти-H3K27me3 были значительно более многочисленными, чем контрольные IgG (см. рис. 7A). Это указывает на то, что специфическое связывание анти-H3K27ac и анти-H3K27me3 увеличивает количество желаемых продуктов. Самая передовая технология анализа одноклеточного эпигенома, Paired-Tag, получает около 2,000 уникальных считываний H3K27ac и 1,500 уникальных чтений H3K27me3 на ядро. Наши результаты показали гораздо большее количество уникальных считываний (в среднем 699 398 сигналов H3K27ac на ячейку и 505 433 сигналов H3K27me3 на ячейку). Результаты также подтвердили вывод о том, что повторные эксперименты с использованием одной и той же многоразовой одиночной ячейки уменьшают потери сигнала и увеличивают плотность сигнала.

Сигналы REpi-seq, показанные на рисунке 7A , были оценены путем сравнения данных REpi-seq с объемными данными ChIP-seq. На рисунке 7B в среднем 91% ± 3,24% сигналов H3K27ac от REpi-seq перекрывались с пиками H3K27ac в объемном ChIP-seq. Этот анализ измеряет уровень «точности» при анализе эпигенома одной клетки18. Точность современных одноклеточных эпигеномных методов для активной гистонной метки H3K4me3 составляет 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18,50% (scChIC-seq; H3K4me3)19 и 60% (ACT-seq; H3K4me3)20. Кроме того, точность REpi-seq для неактивной гистоновой метки H3K27me3 составляла в среднем 52,09% ± 3,71% (рис. 7C), тогда как точность H3K27me3 составляла 47% в одноклеточном ChIC-seq19. В заключение, REpi-seq демонстрирует высокую точность обнаружения H3K27ac и H3K27me3.

Мы также проанализировали «чувствительность»18 REpi-seq, которая измеряет, сколько пиков объемного ChIP-seq было обнаружено с помощью воспроизведенных чтений REpi-seq (рис. 7D, E). Чувствительность REpi-seq составила 55,30% у H3K27ac и 50,94% у H3K27me3. В других методах одноклеточного эпигенома чувствительность составляет 5% в Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% в ACT-seq (H3K4me3)20 и 9,5% в scChIC-seq (H3K27me3)19. Эти результаты показывают, что REpi-seq чувствителен к обнаружению эпигенетических сигналов.

Figure 7
Рисунок 7: Количество сигналов, точность и чувствительность в REpi-seq. Одни и те же эксперименты были повторены 3 раза с одной и той же многоразовой одиночной ячейкой (ячейка K562). (A) Полученные сигналы от одних и тех же восьми одиночных ячеек. Каждая точка представляет собой многоразовую ячейку. Подсчитывались уникальные сигналы от контрольных IgG (черный), анти-H3K27me3 (синий) и анти-H3K27ac (красный) в одних и тех же отдельных клетках. Сигналы против H3K27me3 и анти-H3K27ac были значительно выше, чем контрольные IgG, что указывает на то, что специфическое связывание антител генерирует сигналы более эффективно, чем контрольный IgG. Бар: среднее значение, бар погрешности: стандартное отклонение. (В, В) Точность уникальных считываний REpi-seq H3K27ac (B) и H3K27me3 (C). Точность уникальных считываний, полученных с помощью REpi-seq, была основана на перекрытии с известными пиками ChIP-seq из анализа объемных ячеек K562 (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). В каждой отдельной ячейке были рассчитаны проценты считываний REpi-seq H3K27ac и H3K27me3, подтвержденных пиками ChIP-seq. Результаты выражаются в виде среднего процента 8 отдельных ячеек. (Д, Д) Чувствительность REpi-seq при обнаружении известных пиков H3K27ac (D) и H3K27me3(E). Использовались уникальные чтения REpi-seq. Пики H3K27ac и H3K27me3, идентифицированные с помощью ChIP-seq объемных ячеек K562 в проекте ECODE (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) были распознаны уникальными чтениями REpi-seq. Результаты выражаются в виде среднего процента пиков ChIP-seq, распознаваемых уникальными чтениями REpi-seq. Панели B-E были воспроизведены из Ohnuki et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Буферы, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Антитела и контроль IgG, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Олигонуклеотидная ДНК, используемая в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительное видео S1: Автоматизированный отбор и перенос отдельных клеток в 96-луночную ПЦР-планшет (этап 8.2.4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео S2: Удаление надосадочной жидкости из скважины, содержащей одну ячейку, с помощью робота для обработки жидкостей (этап 8.2.8.1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео S3: Добавление 4% TEMED/минерального масла в скважину, содержащую одну ячейку, с помощью робота для обработки жидкостей (этап 8.2.8.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный код 1: Автоматизированная программа робота для работы с жидкостями, начиная с этапов 8.2.8.1-8.2.8.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описывается пошаговый протокол для недавно зарегистрированного одноклеточного мультиэпигеномного анализа с использованием многоразовых одиночных клеток7. В последующих параграфах мы обсудим критические моменты, подчеркнув потенциальные ограничения в протоколе.

Одним из критических моментов на протяжении всего протокола (из шагов 7.2-13) является предотвращение загрязнения ДНКазой. Одна клетка имеет только две копии геномной ДНК. Поэтому повреждение геномной ДНК критически снижает сигнальное число. Предотвращение загрязнения ДНКазой имеет важное значение для защиты целостности геномной ДНК.

Проницаемость реагентов через клеточную мембрану/клеточную стенку также имеет решающее значение на протяжении всего протокола. REpi-seq был разработан для анализа эпигенома клеток мыши и человека на уровне отдельных клеток. Ожидается, что оптимальные условия для этого экспериментального метода будут варьироваться в зависимости от проницаемости типов клеток и ядерной мембраны для каждого реагента. Поэтому, когда метод применяется к клеткам, отличным от клеток мыши и человека, таким как растительные клетки, дрожжи и бактерии, условия на каждом этапе нуждаются в оптимизации.

Мы считаем, что критической точкой, характерной для шага 9.5 (отжиг первого случайного праймера), является быстрая скорость охлаждения после денатурации геномной ДНК. Медленное и постепенное охлаждение после денатурации может снизить эффективность отжига случайных праймеров, связывающихся с геномной ДНК. Более того, на этапе 11 (бесконтактное лигирование) критической точкой является буферный состав. Буферы, содержащие полиэтиленгликоль (ПЭГ), широко используются для более быстрых методов лигирования в молекулярной биологии. Низкая концентрация ПЭГ (например, <7,5%) способствует быстрому образованию двухцепочечной ДНК без осаждения ДНК. Однако мы наблюдали, что лигирующий буфер, содержащий ПЭГ, индуцирует усадку одноклеточного гелевого шарика, содержащего одну клетку (многоразовую одноклеточную), что позволяет предположить, что размер ячеек полиакриламидного каркаса уменьшился. Поскольку эта усадка может привести к снижению доступности ДНК-лигазы Т4, мы решили не использовать более быстрый протокол лигирования для REpi-seq.

В REpi-seq результаты могут быть оценены по частоте повторного обнаружения сигналов в тех же отдельных ячейках. Частота повторного обнаружения полезна для мониторинга реакций, включая бесконтактное лигирование с помощью зонда антител и первого случайного праймера. Ранее мы сообщали7 , что 62,03% считываний H3K27ac в одном эксперименте были подтверждены в двух повторных экспериментах, что позволяет предположить, что эффективность перевязки в отдельных экспериментах выше, чем общий процент повторного обнаружения в повторных экспериментах.

Ранее мы также сообщалиоб успешном обнаружении 7 успешного обнаружения связывания РНК-полимеразы II (Pol II) с ДНК в многоразовых одиночных клетках. Связывание Pol II трудно захватить с помощью современных методов одноклеточного эпигенома из-за временного и нестабильного характера этого связывания.

Современные подходы CUT&Tag на основе транспозазы для анализа одноклеточного эпигенома требуют сохранения взаимодействия нуклеосом и ДНК. Специфическое антитело связывается с модификацией гистонов; затем транспозаза, прикрепленная к антителу, расщепляет геномную ДНК и вставляет штрих-код ДНК в место расщепления ДНК. Эта реакция зависит от взаимодействия нуклеосом (гистонов) и ДНК. Поэтому важно, чтобы нуклеосомно-ДНК-взаимодействия и структура клеточных белков и хроматина оставались нетронутыми. Следовательно, подходы CUT&Tag неизбежно смещены в сторону доступных областей структуры хроматина при анализе модификаций гистонов.

Неизбежный уклон в сторону доступных областей хроматина препятствует увеличению количества эпигенетических сигналов при анализе эпигенома одной клетки. Структуры хроматина образованы несколькими типами молекулярных взаимодействий, включая ДНК-нуклеосомные и нуклеосомно-нуклеосомные взаимодействия через нуклеосомо-ассоциированные белки. Следовательно, мы решили не сохранять ДНК-белок и белок-белковые взаимодействия в многоразовых одиночных клетках, сохраняя при этом расположение клеточных белков. Эта особенность достигается с помощью мономерного акриламида и смеси параформальдегида (этап протокола 7), которая модифицирует аминогруппу на клеточных белках, а не сшивает белок с белком или белок с ДНК.

Расположение гистонов и геном-ассоциированных белков сохраняется за счет соединения с полиакриламидным полимером. Нуклеосомы денатурируются при температуре около 71-74 °C21. Следовательно, в многоразовой одиночной ячейке гистоны, вероятно, денатурированы и расслаблены/диссоциированы друг от друга после этапа отжига1-й случайной грунтовки (94 °C). Это может ослабить структуру гетерохроматина и улучшить доступность антител и других молекул к областям гетерохроматина. Этот вывод подтверждается нашими опубликованными результатами7 , показывающими, что смещение, связанное со структурой хроматина, снижается в многоразовых одиночных клетках по сравнению с подходами CUT & Tag9.

Связь гистона H3 с полиакриламидом сохраняется по крайней мере после 3 циклов тепловой денатурации, поскольку расположение гистонов в многоразовой одиночной ячейке сохраняется в течение повторных экспериментов7. Эта функция позволяет повторять один и тот же эксперимент с использованием одной и той же ячейки. Повторные эксперименты способствуют увеличению количества сигналов от одной ячейки по сравнению с подходами CUT&Tag.

Проверяемость является фундаментальным принципом в науке. Однако проверка экспериментальных результатов одной клетки невозможна в подходах CUT&Tag, поскольку повторные эксперименты с одними и теми же клетками невозможны. Геномная ДНК расщепляется транспозазой и получает штрих-код ДНК для одной эпигенетической метки. Расщепленная геномная ДНК высвобождается из своего первоначального местоположения. Таким образом, подход CUT&Tag находится в невыгодном положении для анализа нескольких эпигенетических меток в одной и той же клетке. Эта особенность методов CUT&Tag лежит в основе компромисса между снижением плотности сигнала и увеличением количества эпигенетических меток на одну клетку.

Чтобы избежать этой проблемы, мы скопировали геномную ДНК, а не разрезали геном, а затем пометили скопированную геномную ДНК зондом ДНК антител. REpi-seq позволяет анализировать одни и те же одиночные ячейки и увеличивает плотность сигнала. Он также предоставляет средства для верифицируемости экспериментальных результатов, мультиплексирования эпигеномного анализа и решения проблемы компромисса в подходах CUT & Tag. Хотя этот метод преодолевает ограничения эпигеномного анализа на основе транспозазы, он еще не способен анализировать большое количество клеток на уровне одной клетки. Необходимо дальнейшее развитие.

В заключение, REpi-seq копирует геномную ДНК, а не разрезает геном, а затем помечает скопированную геномную ДНК зондом ДНК антител. REpi-seq все еще находится в зачаточном состоянии и нуждается в увеличении пропускной способности клеток. Тем не менее, REpi-seq имеет сильные стороны, которые преодолевают ограничения современных методов эпигенома одной клетки: 1) увеличение плотности сигнала за счет уменьшения выпадения сигналов за счет повторных экспериментов в одних и тех же отдельных клетках; 2) снижение структурного смещения за счет уменьшения труднодоступных участков на основе структуры хроматина; 3) обеспечение верифицируемости экспериментальных результатов повторными экспериментами в одной и той же отдельной ячейке, 4) идентификация сигнала на основе вероятности повторного обнаружения одного и того же сигнала в каждой отдельной ячейке; 5) анализ нескольких эпигенетических меток в одной и той же отдельной клетке без конкуренции между эпигенетическими метками. Эти достижения позволяют анализировать эпигенетические механизмы в одной клетке, что является важным приложением и неосуществимо с другими одноклеточными эпигеномными методами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Доктора Онуки и Тосато являются соавторами патента под названием «Способы получения многоразовой одиночной клетки и методы анализа эпигенома, транскриптома и генома одной клетки» (EP3619307 и US20200102604). Заявка на патент была подана частично на основании предварительных результатов, связанных с технологией, описанной в настоящей рукописи. Изобретение или изобретения, описанные и заявленные в этой патентной заявке, были сделаны, когда изобретатели были штатными сотрудниками правительства США. Таким образом, в соответствии с 45 Сводом федеральных правил, часть 7, все права, титулы и интересы в отношении этой заявки на патент были или должны быть переданы по закону правительству США. Правительство США передает часть получаемых им роялти своим сотрудникам-изобретателям в соответствии с 15 Кодексом США § 3710c.

Acknowledgments

Мы благодарим докторов Дэвида Санчеса-Мартина и Кристофера Б. Бака за комментарии на этапе концептуализации проекта. Мы также благодарим Genomics Core, Центр исследований рака, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения за помощь в предварительных экспериментах и Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH за советы по вычислительному анализу. Мы благодарим г-жу Анну Ворд за помощь в оптимизации ДНК-полимераз, используемых в методе. В этой работе использовались вычислительные ресурсы кластера NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Этот проект поддерживается Очной программой Центра исследований рака, Национальным институтом рака, Национальными институтами здравоохранения, премией директора NCI за инновации (#397172) и федеральными средствами Национального института рака по контракту No HHSN261200800001E. Мы благодарим докторов Тома Мистели, Кэрол Тиле, Дугласа Р. Лоуи и всех сотрудников Лаборатории клеточной онкологии за продуктивные комментарии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Опровержение выпуск 180
Многоразовая одиночная клетка для итеративного эпигеномного анализа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter