Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Återanvändbar enda cell för iterativa epigenomiska analyser

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

Detta protokoll beskriver en encellsmetod för iterativa epigenomiska analyser med en återanvändbar enda cell. Den återanvändbara enda cellen möjliggör analyser av flera epigenetiska märken i samma enda cell och statistisk validering av resultaten.

Abstract

Nuvarande encellsepigenomanalyser är utformade för engångsbruk. Cellen kasseras efter en enda användning, vilket förhindrar analys av flera epigenetiska märken i en enda cell och kräver data från andra celler för att skilja signal från experimentellt bakgrundsbrus i en enda cell. Denna artikel beskriver en metod för att återanvända samma enda cell för iterativa epigenomiska analyser.

I denna experimentella metod förankras cellulära proteiner först till en polyakrylamidpolymer istället för att tvärbinda dem till protein och DNA, vilket lindrar strukturell bias. Detta kritiska steg möjliggör upprepade experiment med samma enda cell. Därefter glödgas en slumpmässig primer med en ställningssekvens för närhetsligering till det genomiska DNA, och den genomiska sekvensen tillsätts till primern i förlängning med användning av ett DNA-polymeras. Därefter binds en antikropp mot en epigenetisk markör och kontroll-IgG, var och en märkt med olika DNA-sonder, till respektive mål i samma enda cell.

Närhetsligering induceras mellan den slumpmässiga primern och antikroppen genom att lägga till ett kontakt-DNA med komplementära sekvenser till ställningssekvensen för den slumpmässiga primern och antikropps-DNA-sonden. Detta tillvägagångssätt integrerar antikroppsinformation och närliggande genomsekvenser i en enda DNA-produkt av närhetsligering. Genom att möjliggöra upprepade experiment med samma enda cell möjliggör denna metod en ökning av datatätheten från en sällsynt cell och statistisk analys med endast IgG och antikroppsdata från samma cell. De återanvändbara enskilda cellerna som framställs med denna metod kan lagras i minst några månader och återanvändas senare för att bredda epigenetisk karakterisering och öka datatätheten. Denna metod ger flexibilitet till forskare och deras projekt.

Introduction

Encellsteknik går in i en era av encellsmultiomik, som integrerar individuell encells-omics-teknik1. Nyligen har encellstranskriptomik kombinerats med metoder för att detektera kromatintillgänglighet (scNMT-seq2 och SHARE-seq3) eller histonmodifieringar (Paired-seq4 och Paired-Tag5). På senare tid integrerades encellstranskriptomik och proteomik med kromatintillgänglighet (DOGMA-seq6). Dessa metoder använder transposasbaserad märkning för att detektera kromatintillgänglighet eller histonmodifieringar.

Transposasbaserade metoder klyver genomiskt DNA och lägger till en DNA-streckkod i slutet av det genomiska DNA-fragmentet. Varje klyvt genomiskt fragment kan bara acceptera upp till två DNA-streckkoder (= ett epigenetiskt märke per klyvningsställe), och det genomiska DNA vid klyvningsstället går förlorat. Därför har klyvningsbaserade metoder en avvägning mellan antalet epigenetiska märken som testats och signaltätheten. Detta försvårar analysen av flera epigenetiska märken i samma enda cell. En encells epigenomisk metod som inte klyver det genomiska DNA: t utvecklades för att övervinna denna fråga 7,8.

Förutom den klyvningshärledda frågan som nämns ovan har transposasbaserade metoder andra begränsningar. I encellsepigenomanalys är det viktigt att känna till placeringen av histoner och DNA-associerade proteiner på genomet. I nuvarande tillvägagångssätt uppnås detta genom att använda ofixerade enskilda celler och retention av protein-DNA och protein-proteininteraktioner. Detta genererar emellertid stark bias till tillgängliga kromatinregioner, även vid analys av histonmodifieringar 9. Placeringen av histoner och genomassocierade proteiner på genomet kan bevaras utan tvärbindning av protein-DNA och protein-protein med hjälp av en polyakrylamidställning 7,8. Detta tillvägagångssätt minskar den strukturella bias som observerats i nuvarande tillvägagångssätt som är beroende av protein-DNA och protein-proteininteraktioner.

Transposasbaserade metoder kan bara hämta signaler en gång från en enda cell. Därför är det svårt att avgränsa det fullständiga epigenomet hos en enda cell på grund av signalernas bortfall. Återanvändbara enskilda celler har utvecklats för att övervinna nuvarande begränsningar genom att tillåta iterativ epigenomisk analys i samma enda cell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En schematisk representation av metoden visas i figur 1.

Figure 1
Bild 1: Schematisk representation av protokollarbetsflödet. Steg 7.2-13 förklaras genom schematiska representationer. Varje rad anger ett steg i protokollet. Ett cellulärt protein färgat i grönt är en human nukleosom genererad baserat på en kristallstruktur (PDB: 6M4G). Klicka här för att se en större version av denna figur.

1. Jämvikt av avsaltningskolonner

OBS: Avsaltning av spinnkolonner balanseras enligt beskrivningen i följande steg. De jämviktade avsaltningskolonnerna används i steg 2.1, 3.4 och 4.6.

  1. Ta bort den nedre förslutningen av en avsaltningskolonn (7 kDa cut-off, 0,5 ml hartspärlvolym, se materialtabellen) och lossa locket högst upp på avsaltningskolonnen.
  2. Placera kolonnen i ett 1,5 ml lågbindande protein (ett uppsamlingsrör, se materialtabellen) och centrifugera vid 1 500 × g i 1 min vid rumstemperatur för att avlägsna lagringslösningen i kolonnen.
    OBS: Använd en svängrotorcentrifug för att platta ut toppen av pärlbädden.
  3. Ta bort genomströmningen i 1,5 ml röret och tillsätt 300 μl 150 mM NaCl/100 mM fosfatbuffert, pH 8,0 (se tabell 1), ovanpå hartsbädden.
  4. Centrifugera vid 1 500 × g i 1 min vid rumstemperatur och avlägsna genomströmningen i uppsamlingsröret.
  5. Upprepa steg 1.3-1.4 ytterligare tre gånger.
  6. Kassera bufferten från uppsamlingsröret och placera kolonnen i ett nytt uppsamlingsrör.
  7. Använd den jämviktade avsaltningskolonnen i steg 2.1, 3.4 och 4.4.

2. Buffertutbyte av antikroppar

OBS: Ta bort glycerol, arginin och natriumazid från anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 och anti-Pol II10 (se buffertsammansättningen som visas i tabell 1). Alla följande procedurer utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 1 h

  1. Applicera antikroppslösningen (100 μl, se tabell 2) på en jämviktskolonn som beretts enligt steg 1.
  2. Centrifugera vid 1 500 × g i 2 minuter vid 4 °C och överför genomströmningen från uppsamlingsröret till ett 1,5 ml lågbindande proteinrör.
  3. Mät IgG-koncentrationen med hjälp av absorbans vid 280 nm12 (använd en mikrovolymspektrofotometer).
  4. Överför antikroppslösningen till en ultrafiltreringskassett (molekylvikt cut-off 100 kDa, 0,5 ml, se materialtabellen) och centrifugera vid 12 000 × g i 5 min vid 4 °C.
  5. Mät IgG-koncentrationen med hjälp av absorbansen vid 280 nm.
  6. Upprepa steg 2.4-2.5 tills IgG-koncentrationen når 1 mg/ml.

3. Aktivering av antikroppar

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 2,5 h

  1. Lös 1 mg succinimidyl-6-hydrazinonikotinatacetonhydrazon (S-HyNic, se materialtabellen) med 100 μL vattenfri N,N-dimetylformamid (DMF, se materialtabellen).
    OBS: DMF är ett brandfarligt organiskt lösningsmedel och ett potent levertoxin som absorberas genom huden. Använd handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  2. Tillsätt 0,6 μl S-HyNic/DMF till 100 μl antikroppslösning (1 mg/ml i 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfat, pH8,0. Se tabell 2 för använda antikroppar och kontroll IgG.
  3. Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar (skyddar mot ljus).
  4. Applicera 100 μl S-HyNic-reagerad antikropp på toppen av den jämviktade avsaltningskolonnen (se steg 1) och centrifugera vid 1 500 × g i 2 minuter vid 4 °C för att samla upp provet.
  5. Kassera avsaltningskolonnen efter användning.
    OBS: Stabiliteten hos HyNic-grupper på proteiner och andra biomolekyler varierar. Det rekommenderas att konjugera HyNic-modifierade biomolekyler omedelbart.

4. Aktivering av DNA-sond

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 2,5 h

  1. Lös upp en pellet av en aminmodifierad DNA-sond för antikropp eller kontrollera IgG (antikroppssond, tabell 3) med 20 μL 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfatbuffert, pH 8,0.
    OBS: Leta efter en tunn, transparent pellets / film längst ner på röret. Applicera bufferten direkt på pelleten. Om pelleten inte är synlig kan pelleten ha lossnat och fastnat på väggen eller locket. Centrifugera i så fall röret och leta efter en pellets längst ner på röret.
  2. Lös 1 mg succinimidyl-4-formylbensoat (S-4FB, se materialtabellen) med 50 μL vattenfri DMF och tillsätt 10 μL DMF till den upplösta antikroppssonden.
  3. Tillsätt 4 μL S-4FB/DMF beredd i steg 4.2, blanda och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar (skyddar mot ljus).
  4. Applicera 34 μL S-4FB-reagerad antikroppssond på toppen av den jämviktade avsaltningskolonnen (se steg 1).
  5. Applicera 15 μl 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfatbuffert, pH 8,0, på toppen av gelbädden efter att provet har absorberats fullständigt, och centrifugera vid 1 500 × g i 2 minuter vid 4 °C för att samla upp den S-4FB-modifierade antikroppssonden.
  6. Använd genomströmningen för efterföljande konjugering; mäta absorbansen vid 260 nm; och beräkna återvinningsgraden för antikroppssonden.

5. Konjugering av S-HyNic-modifierad antikropp och S-4FB-modifierad antikroppssond

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 2 h

  1. Blanda den S-HyNic-modifierade antikroppen och den S-4FB-modifierade antikroppssonden och pipettera lösningen upp och ner för att blanda.
  2. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur (skyddar mot ljus).
  3. För att släcka reaktionen, tillsätt 478,8 μl lösning för kylning och förvaring (se tabell 1).
  4. Överför antikroppsprobkonjugerad antikroppslösning till en ultrafiltreringskassett (molekylvikt cut-off 100 kDa).
  5. Centrifugera i 5 min vid 12 000 × g, 4 °C.
  6. Kontrollera volymen på lösningen inuti kassetten genom pipettering.
  7. Upprepa steg 5.5–5.6 tills volymen når 100 μl och förvara vid -20 °C.
    OBS: IgG-koncentrationen mäts med sandwich ELISA13,14,15 med hjälp av en IgG-standard.

6. Beredning av kärnmagnetiska pärlor

OBS: I denna metod är en enda cell inbäddad i en dubbelskiktad akrylamidpärla (se figur 2). Kärnan är en magnetisk polyakrylamidpärla. Det yttre skiktet är polyakrylamid ensam. De magnetiska kärnpärlorna genereras i detta avsnitt. Detta avsnitt är inte nödvändigt för experimentet. Tid: 3 h

Figure 2
Figur 2: Struktur av en tvåskiktad polyakrylamidsträng för synlighet och enkel hantering i REpi-seq-experiment. a) Magnetiska nanopartiklar från steg 6.6 efter centrifugering. De magnetiska nanopartiklarna modifieras med monomera akrylamid och integreras i den magnetiska polyakrylamidsträngen som visas i B. (B) Schematisk representation av en återanvändbar enda cell med en magnetisk polyakrylamidpärla. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Blanda 50 μl 1 M natriumbikarbonatbuffert, pH 8,5 och 450 μl 40% akrylamidlösning.
    OBS: Akrylamid är ett neurotoxin. Använd handskar, ett ögonskydd och en labbrock. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  2. Suspendera 1 g NHS-esterfunktionaliserat 30 nm järnoxidpulver (se materialtabellen) i akrylamid/natriumbikarbonatbufferten och inkubera vid 4 °C över natten.
    OBS: Eftersom akrylamidpärlor är transparenta kan det vara svårt att se och manipulera kulornas position. Införandet av en kärnsträng av järnoxid förbättrar synligheten och underlättar manipulation eftersom pärlornas position kan styras med hjälp av en magnet. Men om användarna är bekanta med REpi-seq-experimenten kan användningen av kärnmagnetiska polyakrylamidpärlor hoppas över.
  3. Överför nanopärlsuspensionen till 2 rör (1,5 ml), centrifugera vid 21 300 × g i 1 timme (använd en vinklad rotor) vid 4 °C och avlägsna supernatanten.
  4. Suspendera bottenslammet med 1 ml 40 % akrylamid/bisakrylamid (19:1, se materialtabellen).
    OBS: Bis-akrylamid är ett neurotoxin. Använd handskar och en labbrock. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  5. Centrifugera vid 21 300 × g i 1 timme (använd en vinklad rotor) vid 4 °C.
  6. Centrifugera vid 5 000 × g i 30 minuter (använd en svängrotor utan broms) vid 4 °C.
  7. Ta bort supernatanten med en P1000-pipett med långsam hastighet.
  8. Justera volymen till 400 μL 40 % akrylamid/bis-akrylamid (19:1, se materialtabellen).
  9. Tillsätt 25 μl 10 % ammoniumpersulfatlösning (se tabell 1).
    OBS: Ammoniumpersulfat är ett starkt oxidationsmedel. Luftburet damm som innehåller ammoniumpersulfat kan irritera ögon, näsa, hals, lunga och hud vid kontakt. Använd handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  10. För att generera kärnmagnetiska polyakrylamidpärlor, överför 0,5 μL av den akrylamidmodifierade järnoxidsuspensionen till ett PCR-rör.
  11. Tillsätt 50 μl 4 % N,N,N', N'-tetrametyletylendiamin/mineralolja (TEMED, se tabell 1) och inkubera över natten i rumstemperatur.
    OBS: TEMED är ett brandfarligt lösningsmedel. Arbeta under en huva. Andas inte in. Förvaras åtskilt från öppen låga, heta ytor och antändningskällor. Använd handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.

7. Ändra aminogruppen av cellulära proteiner med monomerakramid

REpi-seq utformades för att analysera epigenomet hos mus- och humana celler på encellsnivå. Varje steg måste optimeras när denna metod används på celler av andra arter än mus eller människa.

  1. Skörda cellerna
    OBS: Tid: 30 min
    1. Mät cellkoncentrationen och livskraften med hjälp av en cellräknare (se materialtabellen).
      OBS: Cellernas livskraft i detta steg påverkar hur många celler som är levande celler i dataanalysen.
    2. Justera cellkoncentrationen till 1 × 105 celler/ml med odlingsmedium (*) innehållande 10 % fetalt bovint serum.
      OBS: *Odlingsmedium är ett optimalt odlingsmedium för cellerna av intresse.
    3. Överför 1 ml av cellsuspensionen till ett 1,5 ml rör.
    4. Centrifugera cellsuspensionen vid 240 × g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten.
    5. Tillsätt 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), blanda cellerna genom försiktig pipettering och centrifugera cellsuspensionen vid 240 × g i 5 min vid 4 °C.
    6. Ta bort supernatanten.
      OBS: Alla ovanstående steg bör utföras i en laminär flödesren huva för att förhindra kontaminering.
  2. Modifiering av aminogruppen av cellulära proteiner med monomer akrylamid
    OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 1,5 h
    1. Tillsätt 1 ml aminogruppmodifieringslösning (se tabell 1) till cellpelleten och suspendera cellpelleten genom försiktig pipettering.
    2. Inkubera röret på is i 1 timme och centrifugera cellsuspensionen vid 240 × g i 5 minuter vid 4 °C.
    3. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen med 100 ml 4 % akrylamid/1 mM EDTA/PBS innehållande ett interkalatorfärgämne för DNA (se tabell 1, 1 cell/μl).

8. Beredning av återanvändbara enskilda celler

  1. Beredning av återanvändbara enskilda celler (manuell version)
    OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 9 h/96 celler
    1. Blanda 1 ml cellsuspension (1 cell/μl) och 199 ml 1 mM EDTA/PBS innehållande ett interkalatorfärgämne för DNA (se tabell 1).
    2. Överför 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn med 96-brunnsplattor med platt botten (totalt 10 plattor, se materialtabellen).
    3. Sätt locket på 96-brunnsplattan och skanna de 10 plattorna med ett skanningsmikroskop (se materialtabellen) för att identifiera brunnar som innehåller en enda cell.
    4. Överför innehållet i brunnen som innehåller en enda cell till ett PCR-rör.
      1. Luta plattan (mot operatören) och vänta några minuter tills den enda cellen har sjunkit till brunnens nedre kant.
      2. Placera pipettspetsen i det nedre hörnet och överför den enskilda cellen och bufferten (aspirera 210 μl/brunn = 200 μl buffert + 10 μl luft) till ett PCR-rör.
        OBS: Var noga med att använda en P200 låg retention spets.
      3. Kontrollera brunnen med hjälp av ett fluorescensmikroskop för att bekräfta överföringen.
      4. Om en enda cell fortfarande finns i brunnen, tillsätt 200 μL/brunn med 1 mM EDTA/PBS innehållande ett interkalatorfärgämne för DNA.
      5. Upprepa sedan överföringen.
    5. Centrifugera PCR-röret vid 240 × g i 5 minuter vid 4 °C med en svängrotor utan broms.
      OBS: Bromsning orsakar ett virvlande flöde av vatten i röret, vilket stör utfällningen av den enda cellen. Vid centrifugering med en svängande rotor utan broms sjunker den enda cellen alltid till botten av röret. Men om en vinklad rotor används, fäster den enda cellen på PCR-rörets sidovägg och kan gå förlorad.
    6. Avlägsna 195 μl av supernatanten med en mycket långsam pipetteringshastighet.
    7. Tillsätt 195 μl/tub akrylamid/bisakrylamid/APS-lösning (se tabell 1).
    8. Centrifugera PCR-röret vid 240 × g i 5 minuter vid 4 °C med en svängrotor utan broms.
    9. Avlägsna 195 μl av supernatanten med mycket långsam pipetteringshastighet.
    10. Överför de nedre 3 μl-värdena till PCR-röret som innehåller 4 % TEMED/mineralolja och en magnetisk polyakrylamidpärla (genererad i steg 6).
      OBS: Var noga med att använda en P10 låg retention spets. Fördela cellen nära den magnetiska polyakrylamidpärlan. I mineraloljan fäster vätskan som innehåller den enda cellen på ytan av den magnetiska polyakrylamidpärlan genom ytspänning.
    11. Inkubera över natten vid rumstemperatur.
      OBS: Denna process genererar en tvålagers akrylamidgelpärla. Kärnan är en magnetisk gelpärla. Det yttre skiktet är polyakrylamidgel innehållande en enda cell. Den enda cellen är inbäddad i gelens yttre skikt. Säker stopppunkt: Efter tvättning av de återanvändbara enskilda cellerna med 50% glycerol / 1 mM EDTA / 0,05% Tween 20 / 0,5% BSA / TBS-buffert kan de återanvändbara enskilda cellerna förvaras vid -20 ° C i upp till 6 månader.
  2. Beredning av återanvändbara enskilda celler (semiautomatiserad version)
    OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 3 h/96 celler
    1. Blanda 1 ml cellsuspension (1 cell/μl) och 199 ml 1 mM EDTA/PBS innehållande ett interkalatorfärgämne för DNA (se tabell 1).
    2. Överför 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en 4 nL nanobrunnsplatta (se figur 3 och materialtabellen) och placera 4 nL nanowellplattan på en automatiserad encellsplockningsrobot (se materialtabellen).
    3. Placera en 96-brunns PCR-platta som destinationsplatta på den automatiserade encellsplockroboten. Se till att varje brunn innehåller 200 μL/brunn akrylamid/bisakrylamid/APS-lösning (se tabell 1).
    4. Överför en enda cell från en 4 nL nanobrunn till en brunn på 96-brunns PCR-plattan (se kompletterande video S1).
    5. Sätt ett lock ovanpå PCR-plattan med 96 brunnar och centrifugera 96-brunnsplattan vid 240 × g i 5 minuter vid 4 °C med en svängrotor utan broms.
    6. Placera PCR-plattan med 96 brunnar på däcket på en automatisk vätskehanteringsrobot (se materialtabellen, figur 4 och tilläggskod 1).
    7. Dra och släpp tilläggskod 1 till programvarufönstret (se materialförteckningen) för vätskehanteringsroboten.
    8. Kör programmet på den automatiska vätskehanteringsroboten (se kompletterande video S2 och kompletterande video S3).
      1. Avlägsna 195 μl av supernatanten med en mycket långsam pipetteringshastighet.
      2. Tillsätt 50 μL 4% TEMED/mineralolja.
        Anmärkning: Steg 8.2.8.1-8.2.8.2 kan utföras med manuell pipettering.
    9. Inkubera över natten vid rumstemperatur (figur 5). Säker stopppunkt: Efter tvättning av de återanvändbara enskilda cellerna med 50% glycerol / 1 mM EDTA / 0,05% Tween 20 / 0,5% BSA / TBS-buffert, förvara de återanvändbara enskilda cellerna vid -20 ° C i upp till 6 månader.

Figure 3
Figur 3: Automatisk encellsplockning och överföring till en PCR-platta med 96 brunnar i steg 8.2 . (A) Översikt över ett enda cellplockningssystem. En enda cellplockningsrobot är i en laminär flödesren huva för att undvika kontaminering. (B) En platta med 24 brunnar med 4 nL nanobrunnar inuti brunnen. (C) Cellfördelning i en brunn från plattan med 24 brunnar. Gröna prickar är celler som identifieras som en enda cell i varje 4 nL nanobrunn. Magenta prickar är celler som identifieras som dubbletter eller multipletter av celler. (D) Brightfield-bild av brunnen i 24-brunnsplattan. En grön fyrkant är en 4 nL nanobrunn som innehåller en enda cell. En magenta kvadrat är en 4 nL nanowell som innehåller flera celler. (E) Förstorat fält av cirka 4 nL nanobrunnar. Ljusa prickar är enskilda celler i 4 nL nanobrunnar. Det enda cellplockningssystemet identifierar nanobrunnar som innehåller en enda cell genom att förvärva ljusfälts- och fluorescensbilder av celler med DAPI-färgning. Identifierade enskilda celler överförs från 4 nL nanobrunnen till en brunn på en 96-brunns PCR-platta. Skalstänger = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Förkortning = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Generering av återanvändbara enskilda celler med hjälp av en vätskehanteringsrobot . (A) Ett däck på vätskehanteringsroboten. Däcket har 11 slitsar för pipettspetsställ (P300-spets: Spår 1-3, P20-spets: Spår 5-6), 2 ml djupbrunnsplatta med 96 brunnar (spår 4), två PCR-plattor med 96 brunnar som innehåller en enda cell per brunn (spår 7 och 10) och två platta 96-brunnsplattor med platt botten för flytande avfall (spår 8 och 11). (B) Däcket efter placering av labware. (C) Schematisk representation av robotpipettering i steg 8.8.1. Programmet tar bort supernatanten utan att aspirera en enda cell från botten av 96-brunns PCR-plattan. d) Återanvändbara enskilda celler som genererats med hjälp av tilläggskod 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

9. Slumpmässig primerglödgning och förlängning

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Asterisker (*) vid följande steg indikerar att en magnetisk separator kan användas för att styra positionen för polyakrylamidpärlor som innehåller en återanvändbar enda cell i röret. Användningen av magnetseparatorn är dock inte nödvändig. Genom att långsamt röra sig nerför pipettspetsen längs rörets vägg trycks pärlorna upp för tvätt eller buffertbyte. Tid: 9 h

  1. Avlägsna mineraloljan genom pipettering(*) och tvätta (*) 5 gånger med 200 μL 1x TP Mg(-)-buffert (späd 10x TP Mg(-)-bufferten till 1x buffert med ultrarent vatten, se tabell 1).
  2. Ta bort supernatanten (*) och tillsätt 15 μl glödgningsbuffert (se tabell 1).
  3. Inkubera i 1 h på is.
    OBS: Syftet med denna inkubation är att permeabilisera plasma och kärnmembran och leverera den slumpmässiga primern till cellkärnan.
  4. Placera PCR-rören på en termisk cykler och värm vid 94 °C i 3 minuter.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är ca 20 μl, inklusive polyakrylamidpärlans volym. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.
  5. Överför rören till ett iskylt metallblock och inkubera i 2 minuter.
  6. Tillsätt 4 μLMgSO4/NaCl/dNTP-blandning (se tabell 1) och blanda med en virvelblandare på medelhastighet.
  7. Tillsätt 1 μL Bst-polymeras, stort fragment (se materialförteckningen) och blanda med hjälp av en virvelblandare med medelhastighet.
  8. Inkubera i 4 timmar i en skakapparat (600 varv/min vid 4 °C).
    OBS: Syftet med denna inkubation är att leverera Bst-polymeraset till cellkärnan.
  9. Placera PCR-röret på en termisk cykler och kör ett av följande program.
    1. Kör ett 4-timmarsprogram: 10 °C i 30 min, 20 °C i 30 minuter och 25 °C i 180 min.
    2. Alternativt kan du köra ett program över natten: 4 ° C i 4 timmar, 10 ° C i 2 timmar, 20 ° C i 2 timmar, 25 ° C i 4 timmar och håll vid 4 ° C.
      OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är ca 25 μl, inklusive polyakrylamidpärlans volym. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C. Säker stopppunkt: Stoppa experimentet här i upp till 1 dag genom att lagra de återanvändbara enskilda cellerna vid 4 °C.

10. Bindning av antikroppar

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 1,5 h

  1. Tillsätt 1,625 μL NaCl/EDTA/BSA-lösning (se tabell 1) och blanda genom virvling på låg hastighet.
    OBS: Detta steg syftar till att 1) underlätta kelering av Mg2+ med EDTA, 2) stabilisera bindningen av denförlängda 1: a slumpmässiga primern med 300 mM NaCl och 3) blockera ospecifik bindning av antikroppar med bovint serumalbumin (BSA) i den efterföljande reaktionen.
  2. Inkubera i 1 timme på is och tillsätt 0,1 μg/ml vardera av antikroppen och kontrollera IgG konjugerat med antikroppssond (beredd i steg 5).
  3. Inkubera över natten på is med försiktig skakning på en shaker.

11. Närhetsligering av antikroppssond och proximalt förlängd slumpmässig primer

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Asterisker (*) i följande steg indikerar var en magnetisk separator kan användas för att styra positionen för polyakrylamidpärlor som innehåller en återanvändbar enda cell i röret. Användningen av magnetseparatorn är dock inte nödvändig. Genom att långsamt röra sig nerför pipettspetsen längs rörets vägg kan pärlorna skjutas upp för tvätt eller buffertbyte. Tid: 6 h

  1. Tvätta (*) två gånger med 200 μL 1x TPM-T-buffert (20 min inkubation i varje tvätt) på is. Späd 10x TPM-T-buffert (Tris-HCl / kaliumklorid / magnesiumsulfat / Triton X-100) till 1x med ultrarent vatten).
  2. Ta bort (*) supernatanten och tvätta (*) en gång med 1x T4 DNA-ligasbuffert (se materialtabellen).
  3. Ta bort (*) supernatanten och tillsätt 19 μl ligeringsadapterlösning (se tabell 1).
  4. Inkubera i 1 timme vid 25 °C.
  5. Tillsätt 1 μL T4 DNA-ligas (se materialtabellen) och blanda röret på en virvelblandare med medelhastighet.
  6. Placera röret på en termisk cykler och kör följande program: närhetsligeringsprogram, 4 timmar vid 16 °C och 30 min vid 25 °C.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är ca 25 μl, inklusive polyakrylamidpärlans volym. Temperaturen på det termiska cykellocket är rumstemperatur.
  7. Tvätta (*) två gånger kort med 200 μl 1x Bst Mg(-) EDTA(+)-buffert (se tabell 1; förbered 1x buffert från 10x lagerbuffert) och förvara cellen vid 4 °C över natten. Säker stopppunkt: Stoppa experimentet här i upp till 1 dag genom att lagra de återanvändbara enskilda cellerna vid 4 °C.

12. Full förlängning av den 1: a slumpmässiga primern

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 4,5 h

  1. Tvätta två gånger med 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-)-buffert (se tabell 1, förbered 1x buffert från 10x lagerbuffert), ta bort supernatanten och tillsätt 20 μL Bst/dNTPs/MgSO4-blandning (se tabell 1).
  2. Blanda med en virvelblandare på medelhastighet och inkubera i 4 timmar i orbitalskakning (vid 6 °C och 500 varv/min).
  3. Placera röret på en termisk cykler och kör följande program: fullförlängningsprogram: 10 °C i 1 h, 20 °C i 1 h, 30 °C i 1 h, 40 °C i 1 h, 50 °C i 1 h, 65 °C i 1 h, 94 °C i 10 minuter och håll i 4 °C.
    OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan stoppas här i upp till 1 dag genom att lagra de återanvändbara enskilda cellerna vid 4 ° C.

13. Förstärkning av flera förskjutningar

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 2,5 h (steg 13.1-13.2) + 15 min (steg 13.3-13.4) + 1 dag (steg 13.5-13.10)

  1. Tillsätt 0,4 μl 100 μM 2:a slumpmässiga primern (se tabell 3) och blanda med en virvelblandare på medelhastighet.
  2. Inkubera i 2 timmar vid 6 °C och 500 rpm i orbitalskakning och placera röret på en termisk cykler och värm vid 94 °C i 3 minuter.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är cirka 25,4 μl, inklusive volymen av polyakrylamidpärlan. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.
  3. Placera rören i ett iskylt metallblock och tillsätt 1 μl/rör Bst DNA-polymeras.
  4. Vortex med låg hastighet, placera rören på en termisk cykler och kör följande program:
    4 °C i 4 timmar, 10 °C i 30 minuter, 20 °C i 30 minuter, 30 °C i 30 minuter, 40 °C i 30 minuter, 50 °C i 30 minuter, 65 °C i 60 minuter, 94 °C i 3 minuter och håll i 4 °C.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är ca 26,4 μl, inklusive volymen av polyakrylamidpärlan. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C. Säker stopppunkt: Stoppa experimentet här i upp till 1 dag genom att lagra de återanvändbara enskilda cellerna vid 4 °C.
  5. Samla upp supernatanten (ca 20 μl) och överför den till ett PCR-rör.
  6. Förvara den uppsamlade supernatanten vid -80 °C.
  7. Tillsätt 20 μl/rör med 0,05 % Tween 20/0,1x TE-buffert till ett PCR-rör som innehåller den återanvändbara encellen (se tabell 1) och inkubera den återanvändbara enskilda cellen vid 4 °C över natten. Säker stopppunkt: Stoppa experimentet här i några dagar genom att förlänga inkubationstiden.
  8. Samla upp supernatanten och kombinera supernatanten med det prov som samlats in i steg 13.5.
  9. Upprepa steg 13.7–13.8 en gång till. Blötlägg den återanvändbara enskilda cellen i 50% glycerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS-buffert och inkubera den i 30 minuter på en orbitalskakare (4 °C, 600 rpm). Förvara den återanvändbara enskilda cellen vid -20 °C till nästa experiment.
  10. Tillsätt 40 μl Exo-mastermix (se tabell 1) och placera röret på en termisk cykler och kör följande program: i) 95 °C i 5 minuter, ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C i 30 s, v) upprepa steg ii–iv 19 gånger, vi) 72 °C i 5 minuter, vii) håller 4 °C.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är ca 45 μl, inklusive polyakrylamidpärlans volym. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C. Säker stopppunkt: Experimentet kan stoppas här i minst några dagar genom att förvara provet vid -80 °C.

14. Fenolkloroformrening och utfällning av polyetylenglykol

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 1,5 h

  1. Överför produkten till ett 0,5 ml DNA-lågbindande rör och tillsätt 100 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol.
    OBS: Fenol: Kloroform: Isoamylalkohol orsakar irritation och eventuellt brännskador genom kontakt. Använd handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Använd endast med tillräcklig ventilation eller använd lämplig andningsskydd. Följ de institutionella säkerhetsriktlinjerna. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  2. Skaka i 30 s för hand och centrifugera vid 12 000 × g i 10 minuter vid 4 °C.
  3. Samla upp vattenfasen (80 μl) i ett 0,5 ml lågbindande DNA-rör och tillsätt 40,84 μl/rör linjär akrylamid/MgCl2-blandning (se tabell 1).
  4. Tillsätt 47,06 μl/rör med 50 % (w/v) PEG8000 (RNase-free) och blanda genom pipettering.
  5. Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur och centrifugera vid 240 × g i 10 minuter vid rumstemperatur.
  6. Ta bort supernatanten och tillsätt 400 μl/rör 80 % etanol (EtOH).
  7. Tvätta med 80% EtOH, ta bort supernatanten med en sugmotor och lufttorka pelleten.
  8. Suspendera pelleten med 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 buffert, och förvara lösningen vid -80 °C.
    OBS: Mät DNA-koncentrationen med ett dubbelsträngat DNA-specifikt interkalatorfärgämne (se materialtabellen). Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i minst en vecka.

15. Transkription in vitro

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase- och RNas-kontaminering. Tid: 5 h

  1. Tina DNA från produkter som härrör från enstaka celler (från steg 14) och bereda ett blandat bibliotek med produkter som härrör från enstaka celler genom att blanda 2 μl/cell av DNA-produkterna (total volym 20 μl).
  2. Tillsätt 26 μl mastermix för in vitro-transkription (se materialtabellen och tillverkarens protokoll) och blanda genom pipettering.
  3. Placera PCR-röret på en termisk cykler och inkubera i 4 timmar vid 37 °C.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är 46 μl. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.
  4. Tillsätt 5 μL 10x DNas I-buffert (se materialtabellen) och tillsätt 4 μL DNas I (RNase-fri, 4 U, se materialtabellen).
  5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37 °C och överför provet till ett 0,5 ml rör.
  6. Tillsätt 300 μl/rör Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform (se materialförteckningen) och blanda genom försiktig virvling.
    OBS: Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform kan leda till allvarliga kemiska brännskador genom kontakt. Använd handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Använd endast med tillräcklig ventilation eller använd lämplig andningsskydd. Följ institutionens säkerhetsriktlinjer. Kassera den använda labware enligt institutionens riktlinjer.
  7. Inkubera i 5 minuter vid R.T. i en shaker och förvara sedan proverna vid -80 °C i upp till 3 dagar.
    OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i upp till 3 dagar.

16. RNA-rening

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase- och RNas-kontaminering. Tid: 2 h

  1. Tillsätt 80 μl/rör kloroform till provet från steg 15.7 och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder.
  2. Inkubera i rumstemperatur i 2–15 minuter och centrifugera provet vid 12 000 × g i 15 minuter vid 4 °C.
  3. Samla upp och överför provets vattenfas (~200 μl) till ett nytt 1,5 ml rör.
  4. Tillsätt 600 μl/rör Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform och överför provet till ett 1,5 ml rör.
  5. Tillsätt 180 μl/tub kloroform och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder.
  6. Centrifugera provet vid 12 000 × g i 10 min vid 4 °C.
  7. Samla upp och överför provets vattenfas (~450 μl) till ett 1,5 ml rör.
  8. Tillsätt 60 μl/rör linjär akrylamid (5 μg/μl) och tillsätt 400 μl/rör 100 % isopropanol till vattenfasen.
  9. Inkubera röret vid rumstemperatur i 10 minuter och centrifugera det vid 12 000 × g i 10 minuter vid 4 °C.
  10. Ta försiktigt bort supernatanten.
  11. Tvätta RNA-pelleten 3 gånger med 200 μL 75% etanol (EtOH/RNase-fritt vatten), avlägsna supernatanten och lufttorka RNA-pelleten.
    OBS: Låt inte RNA torka helt eftersom pelleten kan förlora löslighet.
  12. Återsuspendera RNA-pelleten i 20 μl RNasfritt vatten innehållande en RNAse-hämmare (1 μl/20 μl) och lös upp pelleten genom pipettering.
  13. Mät absorbansen vid 260 nm.

17. Omvänd transkription

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 1 h

  1. Tillsätt 7 μl/rör med omvänd transkriptionsprimer + dNTP-blandning (se tabell 1 och tabell 3) och placera rören på en termisk cykler.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är 27 μl. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.
  2. Värm vid 65 °C i 5 min och lägg rören på is i minst 1 min.
  3. Tillsätt 14 μl/rör av omvänt transkriptasmastermix (se tabell 1) och blanda genom pipettering.
  4. Placera rören på en termisk cykler och inkubera dem vid 55 °C i 10 minuter och därefter vid 80 °C i 10 minuter.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är 60 μl. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.

18. Andra strängsyntesen

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 2,5 h

  1. Tillsätt 40 μl/rör ultrarent vatten och dela upp 100 μl-lösningen i två 0,2 ml PCR-rör (50 μl/rör).
  2. Tillsätt 60 μl/rör av blandningen av andra strängssyntesen (se tabell 1) och placera rören på en termisk cykler och kör följande program: i) 95 °C i 5 minuter, ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C i 30 s, iv) 72 °C i 30 s, v) upprepa steg ii–iv 20 gånger och vi) håll i 4 °C.
    OBS: Rörstorleken är 0,2 ml. Lösningens volym är 110 μl. Temperaturen på värmecykellocket är 105 °C.
  3. Tillsätt 4,4 μl/rör med 0,5 M EDTA (slutliga 20 mM) och förvara vid -80 °C över natten.
    OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i upp till några dagar.
  4. Rena DNA genom fenolkloroformrening och utfällning av polyetylenglykol (beskrivs i steg 14).
    OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i minst en vecka.

19. Restriktionsenzymuppslutning och storleksval

OBS: Följande procedur utförs under en ren huva för att undvika DNase-kontaminering. Tid: 3 h (steg 19.1-19.7)

  1. Mät DNA-koncentrationen i det renade DNA:t (från steg 18.4) genom att mäta absorbansen vid 260 nm.
  2. Överför 6 μg DNA till ett PCR-rör, tillsätt 30 μL 10x rötningsbuffert och justera volymen till 294 μL med ultrarent vatten.
  3. Tillsätt 6 μl BciVI-restriktionsenzym och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
  4. Utför EtOH-utfällning med linjär polyakrylamid.
    1. Tillsätt 60 μl/rör med 3 M natriumacetat (pH 5.2) och tillsätt sedan 40 μl/rör linjär akrylamid (5 mg/ml, se materialtabellen).
    2. Tillsätt 400 μl/rör EtOH och inkubera över natten vid -20 °C.
      OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i en dag.
    3. Centrifugera 12 000 × g i 10 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten.
    4. Tvätta pelleten två gånger med 80% EtOH och torka pelleten.
    5. Lös upp pelleten med 20 μL 1xTE-buffert och tillsätt 4 μL/tub färsk 6x gelladdningsbuffert.
  5. Fyll provet i en 5% agarosgel/0,5x TAE-buffert och utför elektrofores (50 V i 40 min).
  6. Skär och samla upp gelen över 50 bp (se figur 6) och extrahera DNA med hjälp av ett gelextraktionskit.
    OBS: Säker stopppunkt: Experimentet kan säkert stoppas här i minst en vecka.
  7. Konstruera sekvenseringsbiblioteket med hjälp av ett DNA-biblioteksberedningssats (se materialtabellen)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

K562 enstaka celler genererades med hjälp av protokollet som beskrivs i steg 8 (se figur 5). Enstaka celler var inbäddade i det yttre skiktet av polyakrylamidpärlan. Cell-DNA färgades och visualiserades med hjälp av ett interkalatorfärgämne för DNA-färgning.

Figure 5
Figur 5: Genererade återanvändbara enskilda celler. Cellerna färgas med ett interkalatorfärgämne för DNA (grön fluorescens). Vita pilar indikerar enskilda celler inbäddade i det yttre lagret av polyakrylamidpärlor. Den återanvändbara enda cellen placeras i en 96-brunns plattbottenplatta. Bilderna togs med ett skanningsmikroskop, BZ-X710. Skalstång = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Resultaten som visas i figur 6 stödde genereringen av de önskade DNA-produkterna. DNA-produkter från steg 19.7 spjälkades av BciVI-restriktionsenzymet i fragment av 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp och >49 bp. Dessa resultat stödde slutsatsen att de flesta produkter innehåller antikroppssond-härledda sekvenser och 2:a slumpmässiga primer-härledda sekvenser. DNA-produkterna ligerades därefter med Illumina-adaptern med hjälp av ett TruSeq Nano-kit och sekvenserades med hjälp av en Illumina NovaSeq6000-sekvenserare.

Figure 6
Figur 6: DNA-produkter före och efter BciVI-restriktionsenzymets digestion . (A) BciVI-uppslutning genererade de förväntade fragmenten på 19–20 bp, fragmenten med 31–32 bp och de önskade produkterna (>49 bp) innehållande antikroppsstreckkod, ligerad sekvens, genomiskt DNA och cellstreckkod. B) Slutprodukternas storleksfördelning i slutet av steg 19.7. Konstruerat DNA-bibliotek analyserades med kapillärelektrofores. Den ljusrosa linjen indikerar önskade produkter som innehåller sekvenseringsadaptrar, antikroppsstreckkod och cellstreckkod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Sekvenseringsresultaten indikerade att de produkter som genererades genom att följa steg 7-19 innehåller antikroppssonden, ligerad sekvens, genomsekvens och cellstreckkod. Unika mappade avläsningar från anti-H3K27ac och anti-H3K27me3 var signifikant fler än från kontroll-IgG (se figur 7A). Detta indikerar att den specifika bindningen av anti-H3K27ac och anti-H3K27me3 ökar antalet önskade produkter. Den mest avancerade tekniken för encellsepigenomanalys, Paired-Tag, förvärvar cirka 2 000 unika läsningar av H3K27ac och 1 500 unika läsningar av H3K27me3 per kärna. Våra resultat visade ett mycket högre antal unika läsningar (genomsnitt 699,398 H3K27ac signaler / cell och 505,433 H3K27me3 signaler / cell). Resultaten stödde också slutsatsen att upprepade experiment med samma återanvändbara enda cell minskar signalförlusten och ökar signaltätheten.

REpi-seq-signalerna som visas i figur 7A utvärderades genom att jämföra REpi-seq-data med ChIP-seq-data i bulk. I figur 7B överlappade i genomsnitt 91% ± 3,24% av H3K27ac-signalerna från REpi-seq med H3K27ac-toppar i bulk ChIP-seq. Denna analys mäter nivån av "precision" i encellsepigenomanalys18. Precisionen hos nuvarande encelliga epigenomiska metoder för det aktiva histonmärket H3K4me3 är 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19 och 60 % (ACT-seq; H3K4me3)20. Dessutom var precisionen för REpi-seq för det inaktiva histonmärket H3K27me3 i genomsnitt 52,09 % ± 3,71 % (figur 7C), medan precisionen för H3K27me3 var 47 % i encells ChIC-seq19. Sammanfattningsvis visar REpi-seq hög precision vid detektering av H3K27ac och H3K27me3.

Vi analyserade också "känsligheten"18 för REpi-seq, som mäter hur många toppar av bulk ChIP-seq som detekterades av REpi-seq-reproducerade läsningar (figur 7D, E). Känsligheten för REpi-seq var 55,30% i H3K27ac och 50,94% i H3K27me3. I andra encellsepigenommetoder är känsligheten 5% i Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% i ACT-seq (H3K4me3)20 och 9,5% i scChIC-seq (H3K27me3)19. Dessa resultat indikerar att REpi-seq är känslig för att detektera epigenetiska signaler.

Figure 7
Figur 7: Signalnummer, precision och känslighet i REpi-seq. Samma experiment upprepades 3 gånger med samma återanvändbara enda cell (en K562-cell). (A) Förvärvade signaler från samma åtta enskilda celler. Varje punkt representerar en återanvändbar enda cell. Unika signaler från kontroll IgG (svart), anti-H3K27me3 (blå) och anti-H3K27ac (röd) i samma enskilda celler räknades. Anti-H3K27me3- och anti-H3K27ac-signalerna var signifikant högre än kontroll-IgG, vilket indikerar att specifik bindning av antikroppar genererar signaler mer effektivt än kontroll-IgG. Bar: medelvärde, felfält: standardavvikelse. (B, C) Precision av REpi-seq H3K27ac (B) och H3K27me3 (C) unika läsningar. Precisionen hos unika avläsningar härledda från REpi-seq baserades på överlappning med kända ChIP-seq-toppar från K562 bulkcellsanalys (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). Procentandelarna av REpi-seq H3K27ac och H3K27me3 läsningar bekräftade av ChIP-seq toppar beräknades i varje enskild cell. Resultaten uttrycks som den genomsnittliga procentandelen av 8 enskilda celler. (D, E) Känslighet för REpi-seq vid detektering av H3K27ac (D) och H3K27me3 (E) kända toppar. Unika läsningar av REpi-seq användes. H3K27ac- och H3K27me3-toppar identifierade med ChIP-seq av K562-bulkceller i ECODE-projektet (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) erkändes av REpi-seq unika läsningar. Resultaten uttrycks som den genomsnittliga procentuella ChIP-seq-toppar som känns igen av REpi-seq unika läsningar. Panelerna B-E reproducerades från Ohnuki et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Buffertar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Antikroppar och IgG-kontroll som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Oligonukleotid-DNA som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande video S1: Automatiserad encellsplockning och överföring till en 96-brunns PCR-platta (steg 8.2.4). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S2: Avlägsnande av supernatant från en brunn som innehåller en enda cell med hjälp av en vätskehanteringsrobot (steg 8.2.8.1). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S3: Tillsätt 4% TEMED/mineralolja till en brunn som innehåller en enda cell med hjälp av en vätskehanteringsrobot (steg 8.2.8.2). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Tilläggskod 1: Automatiserat program för vätskehanteringsroboten från steg 8.2.8.1-8.2.8.2. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den här artikeln beskriver steg-för-steg-protokollet för den nyligen rapporterade encellsmultiepigenomiska analysen med återanvändbara enskilda celler7. I de följande styckena diskuterar vi kritiska punkter och betonar potentiella begränsningar i protokollet.

En av de kritiska punkterna i hela protokollet (från steg 7.2-13) är att undvika DNase-kontaminering. En enda cell har bara två kopior av genomiskt DNA. Därför minskar skadligt genomiskt DNA kritiskt signalnumret. Att undvika kontaminering med DNas är viktigt för att skydda integriteten hos genomiskt DNA.

Reagensernas permeabilitet över cellmembranet/cellväggen är också kritisk genom hela protokollet. REpi-seq utformades för att analysera epigenomet hos mus- och humana celler på encellsnivå. De optimala förhållandena för denna experimentella metod förväntas variera beroende på permeabiliteten hos celltyper och kärnmembran för varje reagens. Därför, när metoden tillämpas på andra celler än mus- och mänskliga celler, såsom växtceller, jäst och bakterier, behöver förhållandena vid varje steg optimeras.

Vi tror att en kritisk punkt som är specifik för steg 9.5 (glödgning av den första slumpmässiga primern) är den snabba kylningshastigheten efter denaturering av det genomiska DNA. Långsam och gradvis kylning efter denaturering kan minska glödgningseffektiviteten hos de slumpmässiga primrar som binder till det genomiska DNA. Dessutom, i steg 11 (närhetsligering), är en kritisk punkt buffertkompositionen. Buffertar som innehåller polyetylenglykol (PEG) används ofta för snabbare ligeringsmetoder i molekylärbiologiska applikationer. En låg koncentration av PEG (t.ex. <7,5%) främjar snabb bildning av dubbelsträngat DNA utan DNA-utfällning. Vi observerade dock att ligeringsbufferten innehållande PEG inducerar krympning av den encelliga gelsträngen som innehåller den enda cellen (återanvändbar enda cell), vilket tyder på att maskstorleken på polyakrylamidställningen hade krympt. Eftersom denna krympning kan orsaka minskad tillgänglighet av T4 DNA-ligas, bestämde vi oss för att inte använda det snabbare ligeringsprotokollet för REpi-seq.

I REpi-seq kan resultaten utvärderas genom återdetekteringsfrekvensen av signaler i samma enskilda celler. Redetektionsfrekvensen är användbar för att övervaka reaktioner, inklusive närhetsligering med antikroppssonden och den första slumpmässiga primern. Vi rapporterade tidigare7 att 62.03% av H3K27ac-läsningar i ett experiment bekräftades i två replikatexperiment, vilket tyder på att effektiviteten av närhetsligering i enskilda experiment är högre än den totala återdetekteringsprocenten i upprepade experiment.

Vi har också tidigare rapporterat7 framgångsrik detektion av RNA-polymeras II (Pol II) bindning till DNA i återanvändbara enskilda celler. Pol II-bindning är svår att fånga med de nuvarande encelliga epigenommetoderna på grund av bindningens tidsmässiga och instabila natur.

Nuvarande transposasbaserade CUT&Tag-metoder för encellsepigenomanalys kräver bevarande av nukleosom-DNA-interaktion. En specifik antikropp binder till en histonmodifiering; sedan klyver transposas fäst vid antikroppen det genomiska DNA: t och sätter in en DNA-streckkod på DNA-klyvningsstället. Denna reaktion beror på nukleosom (histon)-DNA-interaktion. Därför är det viktigt att nukleosom-DNA-interaktioner och strukturen hos cellulära proteiner och kromatin förblir intakta. Därför är CUT&Tag-tillvägagångssätt oundvikligen partiska till tillgängliga regioner av kromatinstruktur vid analys av histonmodifieringar.

Den oundvikliga bias mot de tillgängliga kromatinregionerna hindrar ökningen av antalet epigenetiska signaler i encellsepigenomanalys. Kromatinstrukturer bildas av flera typer av molekylära interaktioner, inklusive DNA-nukleosom- och nukleosom-nukleosominteraktioner genom nukleosomassocierade proteiner. Därför valde vi att inte bevara DNA-protein och protein-proteininteraktioner i de återanvändbara enskilda cellerna samtidigt som placeringen av cellulära proteiner bevarades. Denna egenskap uppnås med användning av monomer akrylamid och en paraformaldehydblandning (protokollsteg 7), som modifierar aminogruppen på cellulära proteiner snarare än tvärbindning av protein till protein eller protein till DNA.

Placeringen av histoner och genomassocierade proteiner bibehålls genom anslutningen till polyakrylamidpolymeren. Nukleosomer denatureras runt 71-74 °C21. Därför är histoner i den återanvändbara encellen sannolikt denaturerade och avslappnade / dissocierade från varandra efter glödgningssteget i den 1:a slumpmässiga primern (94 ° C). Detta kan slappna av heterokromatinstrukturen och förbättra tillgängligheten av antikroppar och andra molekyler till heterokromatinregioner. Denna slutsats stöds av våra rapporterade resultat7 som visar att bias associerad med kromatinstruktur reduceras i återanvändbara enskilda celler jämfört med CUT&Tag-metoder9.

Anslutningen av histon H3 till polyakrylamid upprätthålls efter minst 3 omgångar värmedenaturering eftersom placeringen av histoner i den återanvändbara enda cellen bevaras under upprepade experiment7. Denna funktion möjliggör upprepning av samma experiment med samma enda cell. Upprepade experiment bidrar till att öka antalet signaler från en enda cell jämfört med CUT&Tag-metoder.

Verifierbarhet är en grundläggande princip inom vetenskapen. Att verifiera experimentella resultat för en enda cell är dock inte möjligt i CUT&Tag-metoder, eftersom upprepade experiment med samma celler inte är möjliga. Det genomiska DNA:t klyvs genom transposas och tar emot DNA-streckkoden för ett epigenetiskt märke. Det klyvda genomiska DNA:t frigörs från sin ursprungliga plats. Därför har CUT&Tag-metoden en nackdel för analys av flera epigenetiska märken i samma enda cell. Denna funktion av CUT&Tag-metoder ligger till grund för avvägningen av minskad signaltäthet med ett ökat antal epigenetiska märken per enskild cell.

För att undvika detta problem kopierade vi genomiskt DNA snarare än att klippa genomet och märkte sedan det kopierade genomiska DNA med en antikropps-DNA-sond. REpi-seq möjliggör analys av samma enskilda celler och ökar signaltätheten. Det ger också ett sätt att verifiera experimentella resultat, multiplexera epigenomisk analys och lösa avvägningsproblemet i CUT&Tag-metoder. Även om metoden övervinner begränsningarna för transposasbaserad epigenomisk analys, kan den ännu inte analysera ett stort antal celler på en enda cellnivå. Ytterligare utveckling behövs.

Sammanfattningsvis kopierar REpi-seq genomiskt DNA snarare än att klippa genomet och märker sedan det kopierade genomiska DNA: t med en antikropps-DNA-sond. REpi-seq är fortfarande i sin linda och behöver öka genomströmningen av celler. REpi-seq har dock styrkor, vilket övervinner begränsningarna i nuvarande encelliga epigenommetoder: 1) öka signaltätheten genom att minska bortfall av signaler genom upprepade experiment i samma enskilda celler; 2) minska strukturell bias genom att minska otillgängliga regioner baserat på kromatinstruktur; 3) tillhandahålla verifierbarhet av experimentella resultat genom upprepade experiment i samma enda cell, 4) signalidentifiering baserad på återdetekteringssannolikheten för samma signal i varje enskild cell; 5) analysera flera epigenetiska märken i samma enda cell utan konkurrens mellan epigenetiska märken. Dessa framsteg gör det möjligt att analysera epigenetiska mekanismer i en enda cell, vilket är en viktig tillämpning och inte genomförbar med de andra encelliga epigenomiska metoderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Ohnuki och Tosato är meduppfinnare på ett patent med titeln "Metoder för att förbereda en återanvändbar enda cell och metoder för att analysera epigenomet, transkriptomet och genomet hos en enda cell" (EP3619307 och US20200102604). Patentansökan lämnades in delvis baserat på preliminära resultat relaterade till den teknik som beskrivs i det aktuella manuskriptet. Uppfinningen eller uppfinningarna som beskrivs och hävdas i denna patentansökan gjordes medan uppfinnarna var heltidsanställda hos den amerikanska regeringen. Därför, enligt 45 Code of Federal Regulations Part 7, har alla rättigheter, titel och intresse för denna patentansökan tilldelats eller bör enligt lag tilldelas den amerikanska regeringen. Den amerikanska regeringen förmedlar en del av de royalties som den erhåller till sina anställda uppfinnare enligt 15 U.S. Code § 3710c.

Acknowledgments

Vi tackar Drs. David Sanchez-Martin och Christopher B. Buck för kommentarer under konceptualiseringsstadiet av projektet. Vi tackar också Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health för hjälp i preliminära experiment och Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH för råd i beräkningsanalys. Vi tackar Anna Word för att hon hjälpt till med optimering av DNA-polymeraser som används i metoden. Detta arbete utnyttjade beräkningsresurserna i NIHHPC Biowulf-klustret (http://hpc.nih.gov). Detta projekt stöds av det intramurala programmet för Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (# 397172) och federala medel från National Cancer Institute under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Vi tackar Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy och alla medlemmar i Laboratory of Cellular Oncology för produktiva kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Indragning utgåva 180
Återanvändbar enda cell för iterativa epigenomiska analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter