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Neuroscience

टोनोटोपिक ग्रेडिएंट्स और माइक्रोसर्किट का मूल्यांकन करने के लिए भ्रूण चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम को टुकड़ा करना

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63476
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

यहां हम एक ब्रेनस्टेम स्लाइस के भीतर टोनोटोपिक गुणों और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों की जांच के लिए चिकन भ्रूण के गैर-कोरोनल श्रवण ब्रेनस्टेम स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन स्लाइसों में धनु, क्षैतिज और क्षैतिज / अनुप्रस्थ अनुभाग शामिल हैं जो एक व्यक्तिगत स्लाइस प्लेन के भीतर बड़े टोनोटोपिक क्षेत्रों को शामिल करते हैं जो पारंपरिक कोरोनल अनुभाग हैं।

Abstract

चिकन भ्रूण श्रवण ब्रेनस्टेम का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकृत पशु मॉडल है, जो अत्यधिक विशिष्ट माइक्रोसर्किटरी और न्यूरोनल टोपोलॉजी से बना है जो टोनोटोपिक (यानी, आवृत्ति) अक्ष के साथ अलग-अलग उन्मुख है। टोनोटोपिक अक्ष रोस्ट्रल-औसत दर्जे का विमान में उच्च आवृत्ति ध्वनियों के अलग-अलग एन्कोडिंग और कॉडो-पार्श्व क्षेत्रों में कम आवृत्ति एन्कोडिंग की अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, भ्रूण के ऊतकों के कोरोनल ब्रेनस्टेम स्लाइस सापेक्ष व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति लैमिना के अध्ययन की अनुमति देते हैं। यद्यपि व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति क्षेत्रों से संबंधित शारीरिक और शारीरिक प्रश्नों की जांच करने के लिए पर्याप्त है, टोनोटोपिक भिन्नता का अध्ययन और बड़े श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों में इसका विकास कुछ हद तक सीमित है। यह प्रोटोकॉल चिकन भ्रूण से ब्रेनस्टेम स्लाइसिंग तकनीकों की रिपोर्ट करता है जिसमें निचले श्रवण ब्रेनस्टेम में आवृत्ति क्षेत्रों के बड़े ग्रेडिएंट शामिल हैं। चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के लिए विभिन्न टुकड़ा करने की क्रिया विधियों का उपयोग एक ब्रेनस्टेम स्लाइस के भीतर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और शारीरिक प्रयोगों की अनुमति देता है, जहां टोनोटोपिक गुणों और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों के बड़े ढाल को कोरोनल वर्गों की तुलना में बेहतर संरक्षित होते हैं। कई टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक श्रवण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किट के विविध शारीरिक, बायोफिजिकल और टोनोटोपिक गुणों की बेहतर जांच की अनुमति देती है।

Introduction

चिकन भ्रूण कोशिका जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी, पैथोलॉजी और विकासात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान सहित कई और विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों में बुनियादी जैविक प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान शोध मॉडल है। चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम की माइक्रोसर्किटरी एक अत्यधिक विशिष्ट सर्किट का एक उत्कृष्ट उदाहरण है जिसे श्रवण आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान के संदर्भ में समझा जा सकता है। उदाहरण के लिए, रूबेल और पार्क (1975) ने पहली बार चिकन न्यूक्लियस मैग्नोसेल्युलरिस (एनएम) और न्यूक्लियस लैमिनारिस (एनएल) के टोनोटोपिक ओरिएंटेशन (यानी, आवृत्ति ढाल) को नाभिक की धुरी पर एक रैखिक कार्य के रूप में वर्णित किया, धनु विमान के संबंध में ~ 30 ° उन्मुख। एनएम और एनएल में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अपनी सबसे अच्छी ध्वनि आवृत्ति को एन्कोड करते हैं- जिसे उनकी विशेषता आवृत्ति (सीएफ) के रूप में जाना जाता है - कॉडो-पार्श्व क्षेत्र में रोस्ट्रल-औसत दर्जे का विमान के साथ। उच्च आवृत्ति-संवेदनशील न्यूरॉन्स रोस्ट्रल-औसत दर्जे का क्षेत्र में होते हैं और कम आवृत्ति-संवेदनशील न्यूरॉन्स कौडो-पार्श्व रूप से स्थित होते हैं। इस प्रकार, टोनोटोपिक गुणों का अध्ययन करने के लिए श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के पारंपरिक विच्छेदन विधियों ने क्रमिक कोरोनल स्लाइस का उपयोग किया है। दरअसल, चिकन भ्रूण के विकास के श्रवण माइक्रोसर्किट को दशकों 1,2,3,4,5,6 के लिए क्रमिक पुच्छल-टू-रोस्ट्रल कोरोनल प्लेन ब्रेनस्टेम स्लाइस के माध्यम से टोनोटोपिक श्रवण कार्यों के सिग्नल प्रोसेसिंग का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है।

हालांकि, एनएम और एनएल का टोनोटोपिक संगठन टोपोलॉजिकल और रूपात्मक रूप से जटिल है। श्रवण तंत्रिका इनपुट इस तरह वितरित किए जाते हैं कि उच्च सीएफ इनपुट एंडबल्ब जैसी संरचनाओं में समाप्त होते हैं जो एक एडेंड्रिटिक एनएम सेल की दैहिक परिधि के कम से कम एक-चौथाई को कवर करते हैं। इसके विपरीत, कम सीएफ इनपुट अंत बल्ब जैसे टर्मिनलों के साथ व्यवस्थित नहीं होते हैं, लेकिन एनएम न्यूरॉन्स के डेंड्राइट्स पर कई बाउटन सिनैप्स के साथ। मध्य सीएफ इनपुट समाप्त होते हैं क्योंकि अंत बल्ब और बाउटन जैसे सिनैप्स दोनों 4,7,8,9,10,11,12 होते हैं। एनएल में, अत्यधिक रूढ़िवादी डेंड्राइटिक ढाल न केवल डेंड्राइटिक लंबाई में बल्कि डेंड्राइटिक चौड़ाई में भी स्पष्ट है। यह अद्वितीय डेंड्राइटिक ढाल टोनोटोपिक अक्ष के अनुरूप है। डेंड्राइट्स क्रमशः उच्च से निम्न सीएफ न्यूरॉन्स से लंबाई में 11 गुना वृद्धि और चौड़ाई में पांच गुना वृद्धि से गुजरते हैं। कोरोनल स्लाइस में इन नाभिक के ऐसे जटिल वितरण को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल धनु, क्षैतिज और क्षैतिज / अनुप्रस्थ विमानों में विच्छेदन दृष्टिकोण का वर्णन करता है। ये टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के उदाहरण प्रदान करती है जो एक व्यक्तिगत स्लाइस विमान में अधिकतम टोनोटोपिक गुणों का प्रदर्शन करती है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थानों के अनुसार किया गया था। ब्रेनस्टेम ऊतक के विच्छेदन और तैयारी के लिए प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉल 5,13 के साथ पालन में हैं।

1. अंडे से निपटने

  1. आईएसीयूसी-अनुमोदित स्थानीय पशु आपूर्तिकर्ता से निषेचित अंडे (गैलस गैलस डोमेस्टिकस) खरीदें।
  2. 14 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में आगमन पर तुरंत अंडे स्टोर करें और 5 दिनों के भीतर सेते हैं।
    नोट: भ्रूण व्यवहार्यता 1 सप्ताह के बाद काफी कम हो जाती है।
  3. 38 ± 1 डिग्री सेल्सियस और ~ 50% आर्द्रता पर इनक्यूबेशन से पहले 70% इथेनॉल के साथ अंडे निष्फल।

2. कृत्रिम सेरेब्रल-स्पाइनल तरल पदार्थ (एसीएसएफ) संरचना और तैयारी

  1. 10x एसीएसएफ स्टॉक समाधान बनाने के लिए 18.2 एमΩcm डीएच2ओ के 1 एल में निम्नलिखित रसायनों को मिलाएं: एनएसीएल (सोडियम क्लोराइड)130 एमएम, एनएएचसीओ 3 (सोडियम बाइकार्बोनेट) 26 एमएम, केसीएल (पोटेशियम क्लोराइड)2.5एमएम, एनएएच 2 पीओ4 (सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट) 1.25 एमएम, डेक्सट्रोज (डी-(+)-ग्लूकोज) 10 एमएम स्टॉक सॉल्यूशन को रेफ्रिजरेटर में रखें।
  2. एमजीसीएल2 (मैग्नीशियम क्लोराइड) 1 एम और सीएसीएल2 (कैल्शियम क्लोराइड) 1 एम समाधान 18.2 एम डीएच2ओ में अलग से तैयार करें और रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
  3. उपयोग करने से तुरंत पहले, 15-20 मिनटके लिए 95% ओ2/5% सीओ 2 के साथ लगातार 10x एसीएसएफ और बुलबुला पतला करें और एमजीसीएल2 और सीएसीएल2 जोड़ें। एसीएसएफ और डीएसीएसएफ (विदारक एसीएसएफ) तैयार करने के लिए, क्रमशः एमजी 2 + 1 एमएम, सीए2 + 3 एमएम और एमजी2 + 3 एमएम, सीए2 + 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें।
  4. एसीएसएफ के लिए बुदबुदाहट दर निर्धारित करें ताकि पीएच 300 और 310 एमओएसएम / एल के बीच ऑस्मोलैलिटी के साथ 7.2-7.4 हो।
    नोट: बुदबुदाते समय एसीएसएफ को बर्फ स्नान में रखा जाना कम समाधान तापमान बनाए रखने के लिए फायदेमंद है, जो विदारक करते समय ऊतक संरचनात्मक अखंडता का समर्थन करेगा।

3. अगारोज (5%) ब्लॉक तैयारी

  1. डीएसीएसएफ के 100 एमएल में 5 ग्राम एगरोज़ मिलाएं। 2-3 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या माइक्रोवेव का उपयोग करें, गांठ को रोकने के लिए हर 30 एस सरगर्मी करें जब तक कि एगरोज पूरी तरह से घुल न जाए और बुदबुदाना शुरू न हो जाए।
  2. 5 मिमी मोटाई तक एक खाली पेट्री डिश में पिघला हुआ एगरोज़ डालें और सेट करने के लिए कमरे के तापमान पर रखें। सेटिंग के बाद, पैराफिल्म का उपयोग करके पेट्री डिश को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एक तेज ब्लेड के साथ क्यूबिकल ब्लॉक में एगरोज़ को काटें और विच्छेदन के समय उनका उपयोग करें।

4. विच्छेदन प्रोटोकॉल और श्रवण ब्रेनस्टेम को अलग करना

  1. 70% एथिल अल्कोहल समाधान स्प्रे का उपयोग करके विच्छेदन क्षेत्र को साफ करें।
  2. वाइब्रेटोम ट्रे पर सहायक या कोण वाले एगरोज़ ब्लॉक को गोंद करें।
  3. वांछित उम्र के अंडे चुनें (वर्तमान प्रोटोकॉल में ई 20 और ई 21)। संभाल और चरण 1 में के रूप में ऊपर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल का पालन अंडे सेते हैं।
  4. अंडे को एक उज्ज्वल प्रकाश (कैंडलिंग) के नीचे रखकर और अंडे के बड़े या गोल पक्ष पर इस स्थान की तलाश करके हवा से भरे स्थान का पता लगाएं।
  5. अंडे को कमरे के तापमान पर अनुकूलित करें, हवा से भरे स्थान पर खोल को क्रैक करें, और झिल्ली थैली को उजागर करें।
  6. चोंच को बेनकाब करने के लिए थैली में एक कोमल चीरा बनाएं।
  7. स्केलपेल के साथ, धीरे-धीरे गर्दन और सिर को अंडे से बाहर खींचें।
  8. तेज कैंची का उपयोग करके सिर को तेजी से काट दें।
  9. विघटन के बाद, विच्छेदन पैड से अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए बर्फ-ठंडा डीएसीएसएफ के साथ सिर को साफ करें।
  10. बर्फ-ठंडा डीएसीएसएफ में सिर को स्थिर रखें और एक रोस्ट्रो-पुच्छल चीरा बनाएं। आंखों के पीछे और बीच चीरा शुरू करें और कटी हुई गर्दन की लंबाई का पालन करें।
    नोट: चीरा बनाते समय युवा भ्रूण को कम दबाव की आवश्यकता हो सकती है।
  11. खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को अलग करें।
  12. पार्श्व दिशा के लिए एक मिडलाइन में आंख के पीछे खोपड़ी काटें। ऐसा दोनों गोलार्द्धों के लिए करें।
    नोट: यह कदम मस्तिष्क के ऊतकों को बरकरार रखते हुए संलग्न मस्तिष्क से खोपड़ी के रोस्ट्रल भाग को अलग करने में मदद करताहै 5.
  13. खोपड़ी के रोस्ट्रल भाग को स्लाइस करें। ब्लेड को आंखों के पीछे रखें और एक त्वरित कटौती करें।
    नोट: संलग्न खोपड़ी को सफाई से काटने के लिए प्रयास की आवश्यकता हो सकती है।
  14. ठंडे डीएसीएसएफ के एक पकवान में सिर विसर्जित करें।
  15. कैंची की एक छोटी जोड़ी का उपयोग करके, ऊतक क्षति के बिना खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग करने की कोशिश करने के लिए खोपड़ी के दुम क्षेत्र में पार्श्व चीरों के लिए मिडलाइन बनाएं।
  16. धीरे-धीरे ब्रेनस्टेम और सेरिबैलम को उजागर करें। पूरी खोपड़ी के पृष्ठीय क्षेत्र को वापस लें, ब्रेनस्टेम को ध्यान से हटा दें, और हल्के स्लेजिंग के साथ एक ठीक पेंटब्रश की मदद से इसे उजागर करें। ऊतक और रक्त वाहिकाओं को जोड़ने से ब्रेनस्टेम को साफ करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। 8कपाल तंत्रिका क्षेत्र पर अतिरिक्त ध्यान दें और दोनों तरफ बरकरार तंत्रिका तंतुओं की एक छोटी लंबाई छोड़ना सुनिश्चित करें।
  17. पेडुनकल्स को काटकर और रक्त वाहिकाओं को सावधानीपूर्वक हटाकर ब्रेनस्टेम को सेरिबैलम से अलग करें। अतिरिक्त रक्त वाहिकाओं के ब्रेनस्टेम को ट्रिम करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पूरी प्रक्रिया बर्फ-ठंडा डीएसीएसएफ में लगातार कार्बोक्सिजन (95% ओ2/5% सीओ2) के साथ बुलबुला किया जाता है।

5. वाइब्रेटोम स्लाइसिंग

नोट: निम्नलिखित चरणों में, ऊतक के पीछे एगरोज़ के एक घनाकार टुकड़े के साथ समर्थित किया जाना चाहिए।

  1. क्षैतिज अक्ष के साथ वाइब्रेटोम ब्लेड रखें और एक टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे पर ब्रेनस्टेम को गोंद करें। कोरोनल स्लाइस के लिए रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष को ऊर्ध्वाधर रखते हुए, रोस्ट्रल पक्ष को गोंद करें।
    1. धनु स्लाइस के लिए पार्श्व-औसत दर्जे का अक्ष ऊर्ध्वाधर रखें।
    2. क्षैतिज स्लाइस के लिए पृष्ठीय-उदर अक्ष ऊर्ध्वाधर रखते हुए, उदर पक्ष को गोंद करें।
  2. तीव्र कोणीय धनु-क्षैतिज विमान को प्राप्त करने के लिए, ब्रेनस्टेम के उदर पक्ष को गोंद करें, उदर-पृष्ठीय अक्ष को अगारोज ब्लॉक की कर्ण सतह पर ऊर्ध्वाधर रखें, जिसे 45 ° कोण पर काटा जाता है। टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे का सामना करने वाले एगरोज़ ब्लॉक की विपरीत सतह को गोंद करें और रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष को ब्लेड किनारे के समानांतर रखें।

6. ब्रेनस्टेम ऊतक के नाजुक या बड़े टुकड़ों को संभालना

  1. चरण 5 के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में, 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश में ~ 40 डिग्री सेल्सियस पर 4% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) एग्रोज़ में पृथक ब्रेनस्टेम को विसर्जित करें।
    1. डूबे हुए ब्रेनस्टेम पर एगरोज़ डालने के बाद, पेट्री डिश को जमने के लिए बर्फ पर रखें। एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके एम्बेडेड ब्रेनस्टेम के साथ क्यूबिकल एगरोज़ ब्लॉक को काटें।
  2. ब्रेनस्टेम के रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष को ऊर्ध्वाधर रखते हुए, अपने रोस्ट्रल पक्ष पर एलएमपी एगरोज़ ब्लॉक को गोंद करें।
    1. एनएम क्षेत्र की कल्पना किए जाने तक कोरोनल स्लाइस लें।
    2. एक तेज ब्लेड के साथ गोंद से एगरोज़ ब्लॉक निकालें। नाभिक को स्पॉट करने के लिए, धीरे-धीरे एक ठीक सुई के साथ एनएम पर डाई (टोलुइडीन ब्लू या नारंगी जी) के 0.5 μL रखें।
    3. धनु या क्षैतिज स्लाइस के लिए टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे पर इस ब्लॉक को फिर से शुरू करें और दाग वाले क्षेत्र के संबंध में नाभिक की पहचान करें।
  3. सर्वोत्तम प्रदर्शन के लिए, 4 - 5 (~ 30 ± 4 मिमी / मिनट), 85-87 हर्ट्ज पर कंपन आवृत्ति, और 4-6 (~ 1 ± 0.2 मिमी) पर टुकड़ा करने की क्रिया आयाम पर कंपन टुकड़ा करने की क्रिया गति सेट करें।
  4. ब्रेनस्टेम सेक्शनिंग के बाद, एसीएसएफ में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए संतुलित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्लाइस चैंबर में 200-300 μm क्रमिक रूप से एकत्र स्लाइस रखें, लगातार 95% ओ2/5% सीओ 2 (पीएच 7.2-7.4, ऑस्मोलरिटी 300-310 एमओएसएम / इन स्थितियों में, स्लाइस 5-6 घंटे तक व्यवहार्य रहते हैं।

7. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी: पैच क्लैंप प्रक्रिया

  1. कार्बोक्सीजनेटेड एसीएसएफ ~ 1.5 ± 0.5 एमएल / मिनट के निरंतर छिड़काव के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में एक ब्रेनस्टेम टुकड़ा स्थानांतरित करें।
  2. टिप व्यास 1-2 μm के एक माइक्रोपिपेट खींचने वाले और 3-6 MΩ की सीमा में प्रतिरोध के साथ पैच पिपेट खींचें।
    1. एक के-ग्लूकोनेट-आधारित आंतरिक समाधान (वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए) के साथ पिपेट भरें।
  3. एक टुकड़े के भीतर विभिन्न टोनोटोपिक क्षेत्रों में न्यूरोनल गुणों का परीक्षण करने के लिए, स्लाइस प्लेन के दोनों छोर पर न्यूरॉन्स का पता लगाएं और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ दृष्टिकोण करें।
  4. एक न्यूरॉन के करीब पहुंचने पर पिपेट टिप पर सकारात्मक हवा के दबाव को बनाए रखें।
  5. सोमा की ओर बढ़ें जब तक कि न्यूरॉन पर इंडेंटेशन की कल्पना न हो जाए। अगले दो चरणों को जल्दी से करें।
  6. सकारात्मक हवा के दबाव को जारी करके एक गीगाओहम (1 जीΩ) सील बनाएं।
  7. वोल्टेज-क्लैंप मोड में एम्पलीफायर सेटिंग रखें और शून्य पीए के रूप में पिपेट ऑफसेट को सही करें। एक सील परीक्षण (100 हर्ट्ज पर 10 एमवी परीक्षण पल्स) चलाएं। न्यूरोनल झिल्ली के एक छोटे पैच को तोड़ने के लिए नकारात्मक वायु-दबाव लागू करें।
  8. श्रवण न्यूरॉन्स के सक्रिय आंतरिक गुणों का परीक्षण करने के लिए, हाइपरपोलराइजिंग और विध्रुवण दैहिक वर्तमान इंजेक्शन लागू करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के उदाहरण पूरक वीडियो एस 1, एस 2 में कल्पना की जा सकती है। इस प्रक्रिया का विवरण वीडियो किंवदंतियों में प्रदान किया गया है।

Representative Results

यहां दिखाए गए सभी ब्रेनस्टेम स्लाइस ब्रेनस्टेम ऊतक (~ 200-300 μm) से प्राप्त किए गए थे और 5x उद्देश्य और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी का उपयोग करके इमेज किए गए थे। कैमरा विदारक माइक्रोस्कोप पर लगाया गया था और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर से जुड़ा हुआ था (सामग्री की तालिका देखें)। इन आंकड़ों (दाएं पैनल) के लिए उपग्रह इनसेट को 60x आवर्धन जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके चित्रित किया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की गई थी कि डिजिटल छवियों को प्राप्त करते समय ब्रेनस्टेम स्लाइस के सभी क्षेत्रों को समान रूप से बढ़ाया गया था। तस्वीरें इष्टतम चमक और फोकस पर ली गईं। ब्रेनस्टेम स्लाइस की डिजिटल छवियों को ओवरलैपिंग क्षेत्र के आधार पर एक प्लानर फैशन में सिला गया था और चमक, कंट्रास्ट और ग्रेस्केल के आगे समायोजन के लिए डेस्कटॉप कंप्यूटर पर आयात किया गया था। चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम के मूल माइक्रोसर्किट की पहचान पिछले काम 1,2,5,13 के अनुसार की गई थी। माइक्रोस्कोप (5x उद्देश्य) के तहत, श्रवण नाभिक को टुकड़े के पृष्ठीय क्षेत्रों के साथ प्रत्येक नाभिक के चारों ओर भारी माइलिनेटेड तंत्रिका तंतुओं से सटे क्षेत्र के रूप में पहचाना गया था।

चित्रा 1 एक ई 21 चिकन भ्रूण से ब्रेनस्टेम ऊतक (200-300 μm) के पारंपरिक कोरोनल वर्गों को दर्शाता है। यहां दिखाए गए चार कोरोनल स्लाइस श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक के सापेक्ष आईएसओ-आवृत्ति क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं, सबसे कम-सीएफ श्रवण क्षेत्र (चित्रा 1 ए, कॉडो-पार्श्व) से उच्चतम-सीएफ श्रवण क्षेत्र (चित्रा 1 डी, रोस्ट्रल-औसत दर्जे का) में प्रगति करते हैं। चित्रा 1 ए-डी में सभी चार कोरोनल स्लाइस के लिए, लेबल किए गए एनएम और एनएल के आवर्धित क्षेत्रों को मध्य स्तंभ में दिखाया गया है और आंकड़ा पैनल (ए और बी, क्रमशः, उपग्रह इनसेट में) की सही दृष्टि पर आवर्धित (60 एक्स उद्देश्य)। चित्रा 1 ए, बी में तीर श्रवण तंत्रिका तंतुओं के इनपुट को दर्शाता है, और तीर टुकड़ा के बाईं ओर एनएम अक्षतंतु के द्विभाजन को दर्शाता है। चित्रा 1 सी एक और एवियन कोक्लियर नाभिक संरचना को दर्शाता है जिसे नाभिक कोणीय (एनए, बाईं ओर तीर और दाईं ओर तीर) के रूप में जाना जाता है। दो सबसे रोस्ट्रल कोरोनल स्लाइस कोरोनल स्लाइस (चित्रा 1 सी, डी, सफेद धराशायी हलकों) के उदर-पार्श्व क्षेत्र के साथ स्थित बेहतर ओलिवरी नाभिक (एसओएन) दिखाते हैं।

चित्रा 2 एक ई 21 चिकन भ्रूण से ब्रेनस्टेम ऊतक (200-300 μm) के धनु वर्गों से पता चलता है। सभी तीन धनु स्लाइस (चित्रा 2 ए-सी) के लिए, लेबल किए गए एनएम और एनएल के आवर्धित क्षेत्रों को मध्य कॉलम में दिखाया गया है और आंकड़ा पैनल (ए और बी, उपग्रह छवियों में क्रमशः ए और बी) की सही दृष्टि पर बढ़ाया गया (60 एक्स उद्देश्य)। एनएम और एनएल की पहचान की गई थी जहां श्रवण तंत्रिका फाइबर (चित्रा 2 ए, मध्य तीर) ने उच्च आवर्धन (चित्रा 2 ए, मध्यम, छोटे, सफेद धराशायी हलकों और तीरहेड्स) पर देखे गए न्यूरॉन्स के क्लस्टर में प्रवेश किया और श्रवण क्षेत्र (चित्रा 2 ए, बाएं, बड़े, सफेद धराशायी सर्कल और तीरहेड) के शुरुआती बिंदु पर प्रकाश डाला। सोन को सबसे पार्श्व टुकड़ा (चित्रा 2 ए, छोटे, सफेद, धराशायी सर्कल) के रोस्ट्रो-पार्श्व क्षेत्र में पहचाना गया था। चित्रा 2 बी विस्तारित टोनोटोपिक क्षेत्रों को दिखाता है जिसमें रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष (सफेद उल्लिखित क्षेत्रों, उपग्रह इनसेट भी देखें) के साथ एनएम और एनएल से अपेक्षाकृत कम और उच्च-सीएफ श्रवण क्षेत्र दोनों होते हैं। चित्रा 2 सी सबसे औसत दर्जे का टुकड़ा और श्रवण क्षेत्र (बाएं और मध्य तीर) के समापन बिंदु में इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल एक्सोनल टफ्ट्स दिखाता है। यहां दिखाए गए स्लाइस का अभिविन्यास स्लाइस के पारंपरिक अभिविन्यास के विपरीत है जैसा कि चित्रा 1 (यानी, कोरोनल) में देखा गया है। यह अभिविन्यास है कि सबसे अच्छा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक एक ग्लास विंदुक के दृष्टिकोण को समायोजित करता है प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन किया गया था।

यह पुष्टि करने के लिए कि टोनोटोपिक अक्ष का एक बड़ा क्षेत्र चित्रा 2 बी में दर्शाया गया था, एनएम न्यूरॉन्स से वर्तमान-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग की गई थी। चित्रा 3 एक कोरोनल स्लाइस (चित्रा 3 ए, बी) और एक धनु टुकड़ा (चित्रा 3 सी, डी, पूरक वीडियो एस 1, एस 2) से दर्ज परिपक्व (ई 21) एनएम न्यूरॉन्स की कार्यात्मक समानताएं और अंतर दिखाता है। दो एनएम न्यूरॉन्स को एक कोरोनल स्लाइस (चित्रा 1 बी में दिखाए गए टुकड़े के समान) के औसत दर्जे का और पार्श्व सिरों से चुना गया था, और दो एनएम न्यूरॉन्स को एक धनु टुकड़े में एनएम के रोस्ट्रल और पुच्छल सिरों से चुना गया था (जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाए गए टुकड़े में)। चित्रा 3 ए, बी दैहिक वर्तमान इंजेक्शन (−100 पीए से +200 पीए, +10 पीए वेतन वृद्धि, 100 एमएस अवधि) के समान इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रिया गुण दिखाता है। इन दो एनएम न्यूरॉन्स का फायरिंग पैटर्न इस स्लाइस प्लेन में सूक्ष्म अंतर प्रदर्शित करता है, जो मध्य-आवृत्ति एनएम न्यूरॉन्स के लिए सापेक्ष आईएसओ-आवृत्ति लैमिना का संकेत देता है। चित्रा 3 सी, डी से पता चलता है कि फायरिंग पैटर्न रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष भर में ठोस अंतर है, एक उच्च आवृत्ति एनएम न्यूरॉन (चित्रा 3 सी) से एक उच्च आवृत्ति एनएम न्यूरॉन (चित्रा 3 डी) के लिए एक अपेक्षाकृत उच्च टोनोटोपिक ढाल का संकेत है। दोनों न्यूरॉन्स ने अपने रूढ़िवादी फायरिंग पैटर्न के साथ प्रस्तुत किया जैसा कि पहले14,15 की सूचना दी गई थी।

चित्रा 4 एक ई 21 चिकन भ्रूण के ब्रेनस्टेम ऊतक (200-300 μm) के क्षैतिज वर्गों से पता चलता है। दोनों क्षैतिज स्लाइस (चित्रा 4 ए, बी) के लिए, लेबल किए गए एनएम और एनएल के आवर्धित क्षेत्रों को मध्य स्तंभ में दिखाया गया है और आंकड़ा पैनल (ए और बी, क्रमशः, उपग्रह इनसेट में) की सही दृष्टि पर बढ़ाया गया (60 एक्स उद्देश्य)। क्षैतिज स्लाइस में, एनएम और एनएल को मिडलाइन की ओर पहचाना गया था और न्यूरॉन्स पार्श्व-औसत दर्जे की धुरी (चित्रा 4 ए, बी, मध्य, सफेद, धराशायी रूपरेखा क्षेत्रों) के साथ फैले हुए थे। आवर्धित छवियां टोनोटोपिक ढाल की बड़ी सीमा दिखाती हैं। कम आवृत्ति न्यूरॉन्स कॉडो-पार्श्व क्षेत्रों में हैं और उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स रोस्ट्रल-औसत दर्जे का क्षेत्रों (चित्रा 4 ए, बी, दाएं, उपग्रहों) में हैं। रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष के साथ मध्य रेखा के माध्यम से चलने वाले फाइबर श्रवण नाभिक के विपरीत कनेक्शन दिखाते हैं, लेकिन इन तंतुओं का संगठन एक साधारण विमान में नहीं है। अनुप्रस्थ खंड से तीव्र कोणीय स्लाइस धनु विमान की ओर इन अक्षीय तंतुओं का पालन कर सकते हैं। एक क्षैतिज विमान से एक तीव्र कोण (45 °) पर 200-300 μM मोटी ब्रेनस्टेम ऊतक के स्लाइस चित्रा 5 में दिखाए गए हैं। श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक को सबसे पार्श्व टुकड़े से शुरू होने वाले एक बड़े विकर्ण प्रसार में देखा जा सकता है और सबसे औसत दर्जे का टुकड़ा (चित्रा 5 ए-सी, लेबल मध्य पैनल, सफेद उल्लिखित क्षेत्र) पर समाप्त होता है। इसके अलावा, एनएम और एनएल क्षेत्रों के कोणीय अभिविन्यास को लगातार विषम स्लाइस (चित्रा 5 ए-सी, लेबल वाले मध्य पैनल, सफेद, धराशायी उल्लिखित क्षेत्र) में भी देखा जा सकता है। आवर्धित छवियां (60x उद्देश्य) श्रवण नाभिक के टोनोटोपिक अक्ष को दिखाती हैं क्योंकि यह रोस्ट्रल-औसत दर्जे का के साथ कॉडो-पार्श्व अक्ष (चित्रा 5 ए-सी, दाएं, उपग्रह इनसेट) के साथ पाठ्यक्रम करता है। चित्रा 5 में स्लाइस का अभिविन्यास चित्रा 2 में समान है। वे छवियों की पारंपरिक प्रस्तुति के विपरीत हैं लेकिन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ब्रेनस्टेम के प्रतिनिधि कोरोनल सीरियल सेक्शन (ए-डी) बाएं: पुच्छल से रोस्ट्रल अक्ष तक स्लाइस, श्रवण नाभिक और एक सफेद धराशायी सर्कल के साथ चिह्नित फाइबर को जोड़ना। मध्य सम्मिलन श्रवण क्षेत्र का एक बड़ा दृश्य है, जहां नाभिक सफेद धराशायी हलकों के भीतर दिखाए जाते हैं ए: एनएम तथा ख: एनएल। तीर श्रवण तंत्रिका अभिवाही फाइबर दिखाते हैं, और तीरहेड ए, बी में एनएम अक्षतंतु द्विभाजन दिखाता है। तीर सी में एनए दिखाता है। पार्श्व सफेद धराशायी सर्कल सी, डी में बेटे को दिखाता है। दाएं: उपग्रह डालने से इन नाभिक को 60x उद्देश्य पर दिखाया गया है: ए: एनएम और बी: एनएल। संक्षिप्त नाम: एनएम = नाभिक मैग्नोसेलुलरिस; एनएल = नाभिक लैमिनारिस; एनए = नाभिक कोणीय; बेटा = बेहतर ओलिवरी नाभिक; एलएफ = अपेक्षाकृत कम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एमएफ = मध्यम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एचएफ = उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स; डी = पृष्ठीय; एल = पार्श्व; वी = उदर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ब्रेनस्टेम के प्रतिनिधि धनु धारावाहिक वर्गों (ए-सी) बाएं: एक सफेद धराशायी सर्कल में लेबल श्रवण नाभिक के साथ पार्श्व से औसत दर्जे का अक्ष तक स्लाइस। मध्य सम्मिलन बड़े दृश्य में एक ही श्रवण नाभिक क्षेत्र को दर्शाता है, जो सफेद धराशायी हलकों के भीतर चिह्नित होता है। (ए) टुकड़ा के केंद्र में सफेद धराशायी सर्कल बेटे पर प्रकाश डाला गया है; श्रवण तंत्रिका तंतुओं और एनए दिखा तीर दिखा तीर। स्लाइस के दाईं ओर की नोक पर एक गहरा काला धब्बा एक इमेजिंग विरूपण साक्ष्य है। सेरिबैलम के क्षेत्रों को बाएं पैनल में स्लाइस ए और बी दोनों में श्रवण क्षेत्र में पृष्ठीय देखा जा सकता है। (बी) एक धनु टुकड़ा जिसका अभिविन्यास कोरोनल विमान (टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान) में बदल दिया गया था। श्रवण क्षेत्र को नीले डाई (काले तीर) के साथ पहचाना गया था और फिर से धनु विमान में कटा हुआ था। (ए-सी) धराशायी सफेद लाइनों के तहत चिह्नित मध्य सम्मिलित एनएम और एनएल क्षेत्र। दाएं: उपग्रह दृश्य से पता चलता है कि ए: एनएम और बी: एनएल 60 एक्स उद्देश्य आवर्धन में मनाया गया है। श्रवण नाभिक में एलएफ और एचएफ टोनोटोपिक ढाल को रोस्ट्रो-पुच्छल अक्ष के साथ दिखाया गया है। (सी) में अंधेरे क्षेत्र की ओर इशारा करते हुए तीर औसत दर्जे का अक्ष के माध्यम से मिडलाइन में चलने वाले भारी माइलिनेटेड एनएम फाइबर दिखाते हैं। फाइबर श्रवण नाभिक के दोनों ओर जुड़ते हैं। संक्षिप्त नाम: एनएम = नाभिक मैग्नोसेलुलरिस; एनएल = नाभिक लैमिनारिस; एनए = नाभिक कोणीय; बेटा = बेहतर ओलिवरी नाभिक; एलएफ = अपेक्षाकृत कम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एचएफ = उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स; डी = पृष्ठीय; वी = उदर; आर = रोस्ट्रल; सी = पुच्छल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: वर्तमान क्लैंप मोड में दैहिक वर्तमान इंजेक्शन (−100 पीए से +200 पीए, +10 पीए वेतन वृद्धि, 100 एमएस अवधि) के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रिया की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग। न्यूरॉन्स को एक ही टुकड़े में रिकॉर्डिंग के लिए चुना गया था लेकिन एनएम के चरम विपरीत क्षेत्रों में। (ए, बी) सूक्ष्म अंतर के साथ सापेक्ष आईएसओ-आवृत्ति गुणों का संकेत देते हुए एक एकल कोरोनल स्लाइस में प्रतिनिधि न्यूरोनल प्रतिक्रियाएं। प्रतिक्रिया गुण एक कोरोनल स्लाइस में एनएम के सबसे औसत दर्जे का (ए) और पार्श्व (बी) क्षेत्रों से दर्ज दो अलग-अलग एमएफ न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी, डी) एक एकल धनु टुकड़े से प्रतिनिधि न्यूरोनल रिकॉर्डिंग। रिकॉर्डिंग अपेक्षाकृत एलएफ एनएम प्रतिक्रिया (सी) और एक एचएफ एनएम प्रतिक्रिया (डी) दिखाती है, जो एक एकल धनु अनुभाग के भीतर टोनोटोपिक ढाल में मूल अंतर को उजागर करती है। संक्षिप्त नाम: एनएम = नाभिक मैग्नोसेलुलरिस; एलएफ = अपेक्षाकृत कम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एमएफ = मध्य आवृत्ति न्यूरॉन्स; एचएफ = उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ब्रेनस्टेम के प्रतिनिधि क्षैतिज धारावाहिक वर्गों। (ए, बी) बाएं: उदर अक्ष के लिए पृष्ठीय के साथ स्लाइस, श्रवण नाभिक सफेद धराशायी हलकों के साथ चिह्नित हैं। 8कपाल तंत्रिका अभिवाही फाइबर तीर के साथ चिह्नित श्रवण नाभिक को जोड़ते हैं। मध्य सम्मिलन श्रवण नाभिक क्षेत्र का एक बड़ा दृश्य है जिसमें सफेद धराशायी लाइनों के तहत चिह्नित श्रवण नाभिक एनएम और एनएल क्षेत्र दिखाए जाते हैं। श्रवण नाभिक का एक स्पष्ट टोपोलॉजिकल आंदोलन ए, बी में देखा जा सकता है। (ए, बी) दाएं: बड़े उपग्रह दृश्य ए: एनएम और बी: एनएल दिखा रहे हैं। राइट इंसर्ट श्रवण नाभिक को 60x उद्देश्य आवर्धन में मनाया जाता है और एलएफ से एचएफ तक घुमावदार टोपोलॉजिकल अक्ष को एक कॉडो-लेटरल से रोस्ट्रल-मेडियल अक्ष के साथ दिखाता है। संक्षिप्त नाम: एनएम = नाभिक मैग्नोसेलुलरिस; एनएल = नाभिक लैमिनारिस; एलएफ = अपेक्षाकृत कम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एचएफ = उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स; एल = पार्श्व; आर = रोस्ट्रल; सी = पुच्छल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
अनुप्रस्थ तीव्र कोणीय (45 °) धारावाहिक वर्गों (ए-सी) बाएं: ब्रेनस्टेम के धारावाहिक वर्गों, सफेद धराशायी सर्कल में चिह्नित श्रवण नाभिक। मध्य सम्मिलन श्रवण क्षेत्र का एक बड़ा दृश्य है। (ए) मध्य डालने इन स्लाइस में एनएम और एनएल न्यूरॉन्स का सबसे बड़ा प्रसार दिखाता है। (बी, सी) मध्य सम्मिलित करें: सफेद धराशायी लाइनों में चिह्नित श्रवण नाभिक (ए-सी) की तुलना में क्रमिक टोपोलॉजिकल परिवर्तन दिखाते हैं। दाएं: उपग्रह डालने श्रवण नाभिक दिखा ए: एनएम और बी: 60 एक्स उद्देश्य आवर्धन में एनएल। एनएम और एनएल में एलएफ से एचएफ क्षेत्रों तक टोनोटोपिक अक्ष पार्श्व से औसत दर्जे का स्लाइस तक कोणीय रूप से घूमता है। संक्षिप्त नाम: एनएम = नाभिक मैग्नोसेलुलरिस; एनएल = नाभिक लैमिनारिस; एलएफ = अपेक्षाकृत कम आवृत्ति न्यूरॉन्स; एचएफ = उच्च आवृत्ति न्यूरॉन्स; वी = उदर; आर = रोस्ट्रल; डी = पृष्ठीय; सी = पुच्छल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 1: हाइपरपोलराइजिंग और दैहिक वर्तमान इंजेक्शन को विध्रुवण करना। वर्तमान क्लैंप मोड में 100 एमएस दैहिक वर्तमान इंजेक्शन के लिए कम आवृत्ति और उच्च आवृत्ति न्यूरॉन से प्रतिक्रिया गुण। न्यूरॉन्स को एक ही धनु ब्रेनस्टेम स्लाइस से चुना गया था। +10 पीए वेतन वृद्धि, 100 एमएस समय अवधि के चरणों में इंजेक्शन -100 से +200 पीए तक होते हैं। एक्शन पोटेंशिअल को पर्याप्त विध्रुवण वर्तमान चरणों के जवाब में देखा जाता है। वीडियो चित्रा 3 सी में दिखाए गए अंतिम निशान से मेल खाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 2: हाइपरपोलराइजिंग और विध्रुवण दैहिक वर्तमान इंजेक्शन। पूरक वीडियो एस 1 के समान, यह वीडियो वर्तमान क्लैंप मोड में कम आवृत्ति और उच्च आवृत्ति न्यूरॉन से 100 एमएस दैहिक वर्तमान इंजेक्शन तक प्रतिक्रिया गुण दिखाता है। न्यूरॉन्स को एक ही धनु ब्रेनस्टेम स्लाइस से चुना गया था। +10 पीए वेतन वृद्धि, 100 एमएस समय अवधि के चरणों में इंजेक्शन -100 से +200 पीए तक होते हैं। एक्शन पोटेंशिअल को पर्याप्त विध्रुवण वर्तमान चरणों के जवाब में देखा जाता है। वीडियो चित्रा 3 डी में दिखाए गए अंतिम निशान से मेल खाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

चिकन भ्रूण ब्रेनस्टेम ऊतक के कोरोनल वर्गों ने दशकों 1,2,5 के लिए सापेक्ष व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति लैमिना के अध्ययन की अनुमति दी है। हालांकि, चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम का टोनोटोपिक (यानी, आवृत्ति) संगठन टोपोलॉजिकल रूप से जटिल है और विशिष्ट शोध प्रश्न के आधार पर अन्य शारीरिक कुल्हाड़ियों में अधिक सुलभ हो सकता है। यद्यपि व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति क्षेत्रों से संबंधित शारीरिक और शारीरिक प्रश्नों की जांच करने के लिए पर्याप्त है, टोनोटोपिक विविधताओं का अध्ययन और बड़े श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों में इसका विकास कोरोनल वर्गों द्वारा कुछ हद तक सीमित है। इस सीमा को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक व्यक्तिगत ब्रेनस्टेम अनुभाग में अधिकतम टोनोटोपिक गुणों और ढाल प्रदर्शित करने वाले श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के अतिरिक्त उदाहरण प्रदान करने के लिए धनु, क्षैतिज और क्षैतिज /

श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों के धनु वर्गों से पता चलता है कि विभिन्न टोनोटोपिक क्षेत्रों को कोरोनल वर्गों (धनु श्रवण क्षेत्र = ~ 300-600 μm, कोरोनल श्रवण क्षेत्र = ~ 200-350 μm) की तुलना में टुकड़े के भीतर एक बड़े क्षेत्र में वितरित किया जाता है। उदाहरण के लिए, एनएम और एनएल क्षेत्रों को धनु वर्गों (जैसे, चित्रा 2 बी) में रोस्ट्रो-पुच्छल अक्ष के साथ एक बड़े क्षेत्र पर कल्पना की गई थी, और इस शारीरिक अक्ष के साथ चलने वाले कार्यात्मक टोनोटोपिक ढाल काफी हद तक एक एकल धनु टुकड़े के भीतर निहित थे। यह आंतरिक न्यूरोनल मतभेदों की वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की गई थी जो रोस्ट्रल-पुच्छल ढाल के साथ भिन्न होती है जैसा कि पहले14,15 (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 सी, डी) की सूचना दी गई थी। भविष्य के प्रयोग जो टोनोटोपिक अक्ष के साथ शारीरिक और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल गुणों को उजागर करते हैं, एक एकल धनु टुकड़ा विमान के भीतर श्रवण गुणों के ज्ञात ढाल की जांच कर सकते हैं। इनमें एमएपी 2 धुंधला और पोटेशियम चैनल अभिव्यक्ति पैटर्न शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं, जो डेंड्राइटिक आर्किटेक्चर और एनएम और एनएल के आंतरिक गुणों के ज्ञात ग्रेडिएंट हैं जो पहले क्रमिक कोरोनल सेक्शन16 में दिखाए गए हैं।

श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों के क्षैतिज वर्गों से पता चलता है कि एनएम और एनएल मध्य रेखा की ओर स्थित हैं। श्रवण अक्षीय तंतुओं का एक हिस्सा क्षैतिज विमान (चित्रा 4) के तिरछे या लंबवत चलता है। इन तंतुओं को धनु विमान के लिए 45 ° एक तीव्र कोणीय टुकड़ा बनाकर पीछा किया जा सकता है। अनुप्रस्थ स्लाइस धनु या क्षैतिज स्लाइस से बड़े थे, और लंबे अक्षीय फाइबर इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल दोनों पक्षों के लिए रोस्ट्रो-पुच्छल अक्ष के माध्यम से पाठ्यक्रम करते थे। एनएम और एनएल दोनों को एक बड़े विकर्ण क्षेत्र (~ 400-700 μm) में देखा जा सकता है जैसे कि पार्श्व-औसत दर्जे का अक्ष के साथ कॉन्ट्रालेटरल कनेक्शन की कल्पना की जा सकती है। अनुप्रस्थ टुकड़ा विमान यह भी दिखाता है कि श्रवण क्षेत्र और परिणामस्वरूप टोनोटोपिक ढाल एक कोणीय मोड़ (चित्रा 5) कैसे बनाते हैं। एक बड़े क्षेत्र में कॉन्ट्रालेटरल कनेक्शन का कोणीय एक्सपोजर इन स्लाइसों को पारंपरिक कोरोनल स्लाइस की तुलना में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना और माइक्रोसर्किटरी अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त बनाता है।

अतिरिक्त फायदे
श्रवण माइक्रोसर्किट के गठन के लिए संकेतों के स्थानिक समन्वय की आवश्यकता होती है जो न्यूरोनल अस्तित्व, सिनैप्टोजेनेसिस, एक्सोनल भेदभाव, डेंड्राइटिक वास्तुकला और परिपक्वता को बढ़ावा देते हैं। इस प्रकार, चिकन भ्रूण श्रवण माइक्रोसर्किट के एक वैकल्पिक ब्रेनस्टेम वर्गों का उपयोग निम्नलिखित शोध विषयों के लिए किया जा सकता है: स्थलाकृतिक रूप से विभिन्न आयामों में न्यूरॉन्स का रूपात्मक संगठन; सभी श्रवण और वेस्टिबुलर नाभिक के कनेक्टोम का आयोजन और मानचित्रण; आईएसओ-आवृत्ति और टोनोटोपिक विमानों में सर्किट घटकों की गतिविधि पैटर्न की पहचान और लक्षण वर्णन; उत्तेजक बनाम निरोधात्मक माइक्रोसर्किट का स्थलाकृतिक संगठन और विशेष न्यूरॉन आबादी (नाभिक) के संबंध; श्रवण नाभिक न्यूरॉन्स का स्थानिक स्थान और इसके भविष्य कहनेवाला सीएफ17; विशिष्ट टोनोटोपिक न्यूरोनल प्रकारों का व्यवस्थित लक्ष्यीकरण; पूर्वज कोशिकाओं को ट्रैक करना और संरक्षित नाभिक में उनका विकास; न्यूरोनल सर्किट के विकास के लिए कोशिकाओं का आनुवंशिक वंश18; प्रजातियों के बीच तुलनात्मक ब्रेनस्टेम शरीर रचना विज्ञान; डिटर के वेस्टिबुलर कॉम्प्लेक्स (डीसी) जैसे वेस्टिबुलर सर्किट की जांच 19; और वेस्टिबुलर नाभिक के बीच सिंक्रनाइज़ेशन और क्रॉस टॉक।

विभिन्न स्लाइस विमानों का उपयोग करके एक बहुआयामी दृष्टिकोण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किट के अज्ञात शारीरिक और बायोफिजिकल गुणों के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है। एक अच्छा उदाहरण प्रमुख श्रवण नाभिक (एनएम, एनए, एनएल और एसओएन) और वेस्टिबुलर नाभिक के बीच संबंध है, जिसमें पार्श्व लेम्निस्कस (एलएलडीपी) के पृष्ठीय नाभिक, अर्धचंद्र नाभिक (एसएलयू) 20 और स्पर्शरेखा नाभिक (टीएन) 3 शामिल हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल और इन टुकड़ा आधारित अध्ययनों की कुछ सीमाएं हैं।

सावधानियां और सीमाएं
प्रयोगों को करने वाली संस्था के आधार पर, नैतिक दिशानिर्देश और चिकन भ्रूण की हैंडलिंग अलग-अलग हो सकती है। जबकि प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थान तेजी से विघटन की अनुमति देते हैं, चिकन भ्रूण इच्छामृत्यु21 के लिए वैकल्पिक तरीके हैं। प्रारंभिक विकासशील चिकन भ्रूण ब्रेनस्टेम ऊतक नरम है, और पुराने भ्रूण की तुलना में नाजुक है। इसमें सतह पर कई कनेक्शन और रक्त वाहिकाएं हैं जिन्हें हटाते समय अतिरिक्त सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। ऊतक को बर्फ-ठंडे डीएसीएसएफ में रखा जाना चाहिए और व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए 95% ओ2/5% सीओ2 के साथ सुगंधित किया जाना चाहिए।

धनु टुकड़ा करने की विधि केवल इप्सिलेटरल टोनोटोपी के लिए उपयोगी है। यह टुकड़ा करने की क्रिया विधि कोरोनल स्लाइस की तुलना में बड़े स्लाइस प्रदान करती है, जिसकी हैंडलिंग अनिश्चित हो सकती है। हालांकि, कोई भी कहीं और विस्तार से वर्णित क्रॉस सुई विधियों का उपयोग करके स्लाइस को ट्रिम कर सकताहै 22. 4% एलएमपी एगारोज़ ब्लॉक एम्बेडेड ब्रेनस्टेम का उपयोग स्लाइस में नाजुक संरचनाओं को बचा सकता है, लेकिन अत्यधिक गर्म एगरोज़ डालने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। ~ 1 मिनट के लिए एक ठंडा वातावरण में एगरोज़-अवरुद्ध ब्रेनस्टेम रखकर इसे जल्दी से सेट करना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस को अधिक व्यवहार्य बनाता है।

अधिक मात्रा में सुपरग्लू का अनुप्रयोग विषाक्त हो सकता है। इसे न्यूनतम रूप से लागू किया जाना चाहिए, और डीएसीएसएफ को बदलकर अधिशेष मात्रा को तुरंत धोया जाना चाहिए। तीव्र कोणीय (45 °) स्लाइस के लिए, एगरोज़ ब्लॉक के कोण को काटना महत्वपूर्ण है; एक तेज ब्लेड के साथ एगरोज़ ब्लॉक को काटते समय सामने के कोण को देखने के लिए एक दर्पण का उपयोग कर सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ब्लेड में एक मोम कोटिंग हो सकती है जिसे शराब से मिटा दिया जाना चाहिए और उपयोग से पहले सुखाया जाना चाहिए। वाइब्रेटोम काटने की गति और आवृत्ति के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है क्योंकि अक्षीय फाइबर टफ्ट्स कॉर्टिकल या मैट्रिक्स ऊतक की तुलना में कठिन होते हैं। एक उच्च आयाम रखने और ठंडा विच्छेदन समाधान का उपयोग ऊतक क्षति को रोक सकता है।

सभी समाधान ताजा तैयार किए जाने चाहिए, और सीए2 + और एमजी2 + को 95% ओ2/5% सीओ 2 को बुदबुदाने के बाद एसीएसएफ में जोड़ा जाना चाहिए। अन्यथा, सीए2+ की वर्षा हो सकती है। वाइब्रेटोम के भीतर धीरे-धीरे स्लाइस को संभालने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि संभव हो तो कुल टुकड़ा करने का समय 15 मिनट से कम रखें। ब्रेनस्टेम स्लाइस पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग किया जा सकता है।

कांच के बने पदार्थ और उपकरणों के लिए डिटर्जेंट या संक्षारक धोने वाले एजेंटों का उपयोग न करें जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले स्लाइस से संपर्क करते हैं। ली गई छवियां अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के तहत 200-300 μM मोटी ऊतक की उपस्थिति का प्रतिनिधित्व करती हैं। दृश्य गुणवत्ता इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में खराब होगी, लेकिन यह सटीक रूप से दर्शाता है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करते समय एक प्रयोगकर्ता क्या देखेगा।

वैकल्पिक शारीरिक अक्ष के साथ माइक्रोसर्किट के प्रारंभिक विकास से संबंधित अध्ययन, चाहे वे पृष्ठीय-उदर, रोस्ट्रल-पुच्छल, या इप्सिलेटरल-कॉन्ट्रालेटरल हों, चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम में सीमित हैं। इसका एक कारण यह है कि ब्रेनस्टेम में ट्रांसक्रिप्शनल कोड और टोनोटोपिक विकास के विनियमन की भूमिका अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। इन विट्रो में गतिविधि का अवलोकन करते समय टॉप-डाउन मॉडुलन और सहज गतिविधि जैसी कार्यात्मक घटनाएं अक्सर खो जाती हैं। हालांकि, विवो अनुसंधान में विशिष्ट और प्रत्यक्ष एकल न्यूरॉन रिकॉर्डिंग द्वारा पूरक है जो केवल इन टुकड़ा स्थितियों में संभव है। विभिन्न झुकावों के साथ ब्रेनस्टेम ऊतक प्राप्त करने का शोधन चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किटरी में टोनोटोपिक ग्रेडिएंट के विकास और जटिलता के बारे में व्यावहारिक जानकारी प्रदान कर सकता है।

Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि शोध किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय हित के बिना आयोजित किया गया था और उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच /एनआईडीसीडी आर 01 डीसी 017167 अनुदान द्वारा समर्थित है। हम पांडुलिपि के पिछले संस्करण पर संपादकीय टिप्पणियां प्रदान करने के लिए क्रिस्टीन मैकलेलन को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe photoshop 2021 Adobe
Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 TMC
Cell sens standard software OLYMPUS
Digidata 1440A MOLECULAR DEVICES
Digital amplifier  multiclamp 700B MOLECULAR DEVICES
DSK line-up linearslicer pro7 TED PELLA, INC
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 OLYMPUS AMERICA INC
Micropipette puller P-97 SUTTER INSTRUMENTS
Microscope BX51W1 OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE software Microsoft Corporation
Ohaus balance model AV212 Ohaus Adventurer
Olympus DPSI0 /DPS80 camera OLYMPUS
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares MOLECULAR DEVICES
pH meter lab 850 benchtop SCHOTT INSTRUMENTS
Sharp stainless blade Dorco/Personna
Vapor pressure osmometer model 5600 WESCOR INC
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF Thermo Scientific
Chemicals- list
Agrose Low melt IB70051 IBI SCIENTIFIC
CaCl2 (Calcium Chloride) ACROS organics
Cynergy instant adhesive CA6001 Resinlab
Dextrose (D-(+)-glucose) VWR Life Science
Ethyl alcohol IBI SCIENTIFIC
KCl (Potassium Chloride) Amresco.Inc
MgCl2 (Magnesium Chloride) Sigma-Aldrich
NaCl (Sodium Chloride) Amresco.Inc
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) Amresco.Inc
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) Amresco.Inc

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 185 टोनोटोपी आवृत्ति अक्ष नाभिक मैग्नोसेलुलरिस (एनएम) नाभिक लैमिनारिस (एनएल) नाभिक कोणीय (एनए) बेहतर ओलिवरी नाभिक (एसओएन) श्रवण ब्रेनस्टेम कोरोनल धनु क्षैतिज ब्रेनस्टेम स्लाइस चिकन भ्रूण
टोनोटोपिक ग्रेडिएंट्स और माइक्रोसर्किट का मूल्यांकन करने के लिए भ्रूण चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम को टुकड़ा करना
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Mohan, S., Roy, A., Ordiway, G.,… More

Mohan, S., Roy, A., Ordiway, G., Sanchez, J. T. Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits. J. Vis. Exp. (185), e63476, doi:10.3791/63476 (2022).

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