Summary
Мы представляем здесь протокол о том, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс для покадровой видеовизуализации внутриклеточного Ca2+ для исследования патофизиологии бокового амиотрофического склероза в модели крыс hSOD1G93A .
Abstract
Этот протокол демонстрирует, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглий из коры крыс Sprague Dawley и как использовать эти клетки с целью изучения патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) в модели hSOD1G93A крыс. Сначала протокол показывает, как изолировать и культивировать астроциты и микроглию из постнатальной коры крыс, а затем как охарактеризовать и проверить эти культуры на чистоту иммуноцитохимией с использованием маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) астроцитов и ионизированного кальций-связывающего адапторного молекулы 1 (Iba1) микроглиального маркера. На следующем этапе описаны методы загрузки красителем (кальций-чувствительный Fluo 4-AM) культивируемых клеток и записи изменений Ca2+ в экспериментах видеовизуализации на живых клетках.
Примеры видеозаписей состоят из: (1) случаев визуализации Ca2+ культивируемых астроцитов, остро подвергшихся воздействию иммуноглобулина G (IgG), выделенного у пациентов с БАС, демонстрируя характерный и специфический ответ по сравнению с ответом на АТФ, как было продемонстрировано в том же эксперименте. Примеры также показывают более выраженное преходящее повышение внутриклеточной концентрации кальция, вызванное ALS IgG в астроцитах hSOD1G93A по сравнению с нетрансгенным контролем; (2) Ca2+ визуализация культивируемых астроцитов во время истощения запасов кальция тапсигаргином (Thg), неконкурентным ингибитором эндоплазматического ретикулума Ca2+ АТФазы, с последующим поступлением кальция в хранилище, вызванным добавлением кальция в регистрирующий раствор, что демонстрирует разницу между работой хранилища Ca2+ в hSOD1G93A и в нетрансгенных астроцитах; (3) Визуализация культивируемой микроглии Ca2+ , показывающая преимущественно отсутствие реакции на ALS IgG, тогда как применение АТФ вызвало изменение Ca2+ . В этой статье также подчеркиваются возможные предостережения и предостережения относительно критической плотности клеток и чистоты культур, выбора правильной концентрации красителя Ca2+ и методов загрузки красителя.
Introduction
Методы культивирования клеток привели к многочисленным достижениям в различных областях клеточной нейрофизиологии в области здравоохранения и болезней. В частности, первичные клеточные культуры, недавно выделенные из нейронной ткани лабораторного животного, позволяют экспериментатору внимательно изучать поведение различных клеток в различных биохимических средах и физиологических установках. Использование различных флуоресцентных физиологических показателей, таких как чувствительные красители Ca2+, в сочетании с покадровой видеомикроскопией обеспечивает лучшее понимание клеточных биофизических и биохимических процессов в режиме реального времени.
БАС является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает верхние и нижние двигательные нейроны1. Заболевание имеет сложный патогенез семейного типа, но преимущественно спорадической формы (90% случаев)2. Хорошо известно, что неклеточные автономные механизмы способствуют патофизиологии БАС, в первую очередь из-за существенной роли глиальных клеток3. БАС также хорошо характеризуется как нейровоспалительное заболевание с участием гуморальных и клеточных факторов воспаления.
Иммуноглобулин G широко используется в качестве молекулярного маркера при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях. Изучение сывороточного уровня этого маркера может свидетельствовать о наличии и стадии нейровоспаления при заболевании 4,5,6, в то время как его наличие в спинномозговой жидкости может свидетельствовать о нарушении гематоэнцефалического барьера7. IgGs также были идентифицированы как отложения в двигательных нейронах спинного мозга пациентов с БАС7. Тем не менее, данный подход показал некоторые несоответствия в соотношении уровня IgGs со стадией и особенностями заболевания6.
IgG, выделенный из сывороток пациентов с БАС (ALS IgG), может индуцировать кальциевый ответ в наивных астроцитах8 и высвобождение глутамата в нейронах, указывая на экситотоксический эффект - отличительный признак патологии БАС9. Однако исследования на крысиной модели hSOD1G93A ALS (содержащей множественные копии человеческой мутации SOD110) показали ряд маркеров окислительного стресса в культивируемых нейроглиальных клетках11, тканях 12,13,14 или живых животных 13. Примечательно, что астроциты, культивируемые из модели крыс с БАС, были более склонны к окислительному стрессу, вызванному перекисью, чем астроглия у нетрансгенных пометников11.
Клетки микроглии в культуре подвергаются воздействию ALS IgG менее очевидным образом. А именно, линия микроглиальных клеток BV-2 показала повышение сигнала от флуоресцентных маркеров окислительного стресса в ответ на применение только 4/11 ALS IgG образцов пациента15. Хорошо известно, что микроглии участвуют во многих нейровоспалительных патологиях, добавляя к окислительному стрессу и поздней фазе прогрессирования в неклеточном автономном механизме БАС16,17. Тем не менее, данные с ALS IgGs показали, что эти клетки могут быть не такими реактивными, как астроциты, на эти гуморальные факторы воспаления БАС. Было проведено несколько исследований с первичными астроцитами из мышиных моделей БАС не только у детенышей, но и у симптоматических животных, либо на головном, либо на спинном мозге 18,19,20,21. Это также верно для первичных культур микроглии, хотя и в меньшей степени, чем астроциты и в основном из областей мозга на эмбриональной стадии 22,23,24.
Мы используем покадровую видеовизуализацию Ca2+ на клетках в культуре в первую очередь как средство для отслеживания внутриклеточных переходных процессов этого иона в качестве физиологического маркера экситотоксичности. Таким образом, путем биофизической характеристики этих переходных процессов (амплитуда, площадь под переходным процессом, время нарастания, частота) исследователь может получить экспериментальные диагностические параметры из различных клеточных моделей нейродегенерации. Таким образом, этот метод дает преимущество количественной физиологической оценки IgGs как биомаркеров заболевания. Существует большое количество литературы о роли IgGs и Ca2+ в индукции БАС. Большинство из этих исследований были выполнены путем индуцирования БАС путем введения пациенту IgGs экспериментальным животным 25,26,27,28,29, которые затем показали внутриклеточное повышение Ca2+ и IgG. В ряде исследований изучалось влияние ALS IgGs на моторный синапс in vitro 30,31,32. В приведенном выше контексте метод, представленный здесь, фокусируется на глиальных клетках как важных игроках в неклеточном автономном механизме БАС и количественно оценивает их потенциальный экситотоксический ответ на IgGs как гуморальные факторы нейровоспаления. Этот подход может иметь более широкое применение при тестировании других гуморальных факторов, таких как целые сыворотки, ликвор или цитокины в различных системах клеточных культур и в клеточных моделях общего воспаления.
В этой статье описывается, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс Sprague Dawley и как в дальнейшем использовать эти клетки для изучения патофизиологии БАС с помощью IgG, полученного из сыворотки пациента. Протоколы подробно описаны для загрузки красителем культивируемых клеток (рисунок 1) и записей изменений Ca2+ в экспериментах с покадровой видеоизображением. Примеры видеозаписей покажут, как глиальные клетки реагируют на ALS IgG по сравнению с АТФ, последний активирует пуринергические мембранные рецепторы. Впервые показан пример того, как астроциты, выделенные из мозга крысы hSOD1G93A ALS , реагируют с более выраженным ответом Ca2+ на ALS IgG по сравнению с нетрансгенным контролем и как связать этот процесс с различиями в работе магазина Ca2+ . Также показан пример визуализации кальция в клетках микроглии, остро оспариваемых ALS IgG, с лишь скромным ответом внутриклеточного кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с директивами ЕС по защите животных в научных целях и с разрешения Этической комиссии биологического факультета Белградского университета (номер одобрения EK-BF-2016/08). Что касается материала пациента (сыворотки для IgGs), то он был собран для планового клинического осмотра с информированного согласия пациента в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкская декларация) для экспериментов с участием людей. Протокол был одобрен Комитетом по этике Клинического центра Сербии (No 850/6).
1. Первичная подготовка клеточной культуры
- Выделение мозговой ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляцию следует проводить на льду, используя ледяные холодные растворы.- Используйте новорожденных щенков в возрасте 1-3 дней для первичной культуры клеток новорожденного33.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования, представленного здесь, были использованы Sprague Dawley hSOD1G93A и нетрансгенные крысы. Для генотипирования крысиные хвосты использовались для последующей экстракции ДНК и ПЦР. - Посыпьте голову щенка 70% этанолом и немедленно быстро обезглавить его ножницами.
- Разрежьте кожу с помощью мелкоугольных ножниц, чтобы обнажить череп. Откройте череп, сделав разрез от большого отверстия в сторону орбит. Далее сделайте перпендикулярный разрез средней линии. Извлеките мозг из черепа и поместите его в чашку Петри, содержащую фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите инструменты между щенками, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между трансгенными и нетрансгенными щенками. Изоляция коры от остальной части мозга должна проводиться под стереомикроскопом. - Используя кончики щипцов, разорвите связи между обоими полушариями. Затем отделите полушария изогнутыми щипцами, осторожно толкая полусферу от центра в сторону.
- Удалите мозговые оболочки, аккуратно разорвав их прямыми и изогнутыми щипцами.
- Удалите гиппокамп, зажав его изогнутыми щипцами. Выбросьте гиппокамп или используйте его для приготовления другой клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшие шаги должны быть выполнены под ламинарной вытяжкой для обеспечения стерильных условий.
- Используйте новорожденных щенков в возрасте 1-3 дней для первичной культуры клеток новорожденного33.
- Гомогенизация и диссоциация тканей
- Переведите одну кору в трубку объемом 15 мл, заполненную 3 мл холодного PBS. Пипетируйте суспензию вверх и вниз наконечником 1 мл, выполняя 10-15 ходов, пока суспензия не станет однородной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы не производить пузырьки в этом процессе. - Центрифуга по 500 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл холодного PBS, пипетируя его вверх и вниз наконечником 1 мл. Повторите этап центрифугирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые с этого момента, должны быть предварительно расплавлены до 37 °C. - Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл полной модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и антибиотиками (пенициллин и стрептомицин). Переложите гомогенат в пробирку объемом 2 мл.
- Пропустите гомогенат через иглы 21 G и 23 G (по три раза каждая), чтобы получить суспензию из одиночных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы не производить пузырьки в этом процессе.
- Переведите одну кору в трубку объемом 15 мл, заполненную 3 мл холодного PBS. Пипетируйте суспензию вверх и вниз наконечником 1 мл, выполняя 10-15 ходов, пока суспензия не станет однородной.
- Вылейте клеточную суспензию, приготовленную из одной коры, в чашку Петри диаметром 60 мм или колбу Т25 (с поверхностью, предварительно обработанной полипептидным покрытием для роста адгезивных клеток), содержащую 3 мл полного DMEM. Слегка встряхните чашку Петри так, чтобы суспензия равномерно распределилась.
- Выращивают клетки в инкубаторе в увлажненной атмосфере 5% CO2/95% воздуха при 37 °C.
- Меняйте среду через 48 ч после выделения и заменяйте среду каждые 3 дня.
- Чтобы способствовать росту астроцитов, когда клетки достигают 70-80% слияния, промывайте их предварительно расплавленным PBS, чтобы удалить слабо прикрепленные глиальные клетки и следы FBS в среде.
- Трипсинизируют нижележащий слой астроцитов путем добавления 1 мл предварительного раствора трипсина (0,25% трипсина, 0,02% ЭДТА в PBS, стерильно-фильтрованный).
- Поместите блюдо в инкубатор при 37 °C на 2-5 мин.
- Проверьте клетки под микроскопом. Когда они начнут отделяться, добавьте 4 мл полного DMEM.
- Соберите клеточную суспензию и переложите ее в трубку объемом 15 мл. Центрифуга по 500 × г в течение 5 мин.
- Выбросьте надосадочный материал и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл полной среды. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Повторно разложите ячейки при плотности 104 клетки/см2 в 5 мл свежего полного DMEM.
- Меняйте среду каждые 3 дня. Чтобы свести к минимуму присутствие других типов глиальных клеток, после того, как астроциты достигнут 50% слияния и перед каждой заменой среды промыть клетки полным DMEM.
- Аспирируйте надосадочную среду пипеткой 1 мл и осторожно распределите ее по слою клеток несколько раз. Убедитесь, что вся поверхность клеточного слоя покрыта на этом этапе промывки.
- Как только клетки достигнут 80% слияния (обычно через 14 дней), повторите трипсинизацию и сбор астроцитов, как описано в шаге 1.6.
- Семя 5 × 103 астроцитов на 7 мм круглом стеклянном покровном листе, покрытом поли-L-лизином (50 мкг/мл). Используют их в экспериментах через 48 ч.
- Чтобы стимулировать микроглию, после шага 1.7 позвольте глиальным клеткам достичь сливающегося слоя34. При появлении микроглиальных клеток поверх слоя астроцитов (через 10-15 дней, распознаваемых по их меньшим, более овальным телам и более коротким отросткам), встряхните чашку Петри на орбитальном шейкере в течение 2 ч при 220 об/мин.
- Диспергирование и посев микроглиальных клеток
- Слегка промыть отсоединившиеся и слабо прикрепленные клетки, аспирируя надосадочную среду наконечником пипетки объемом 1 мл и осторожно распределите ее по слою клеток несколько раз. Обязательно покройте всю поверхность клеточного слоя во время этого этапа промывки, соберите среду с отсоединенными клетками и перенесите ее в трубку объемом 15 мл.
- Центрифуга по 500 × г в течение 5 мин. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл среды.
- Пропустите клеточную суспензию через иглу 21 G для получения одноклеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство опубликованных методов используют трипсин или папаин для диссоциации тканей; тем не менее, иглы 21 Г имеют преимущество в предотвращении переваривания клеток, что позволяет более мягкую диссоциацию. - Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Семена 5 × 103 микроглиальных клеток на 7 мм круглом стеклянном покровном листе, покрытом поли-L-лизином (50 мкг/мл). Используют их в экспериментах через 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно получить чистую микроглиальную культуру путем встряхивания, так как клетки-предшественники олигодендроцитов и астроциты все еще могут присутствовать в переменном количестве в зависимости от опыта экспериментатора. Иммуноцитохимический протокол, используемый для оценки присутствия различных клеточных популяций в глиальных культурах, был описан в другом месте35.
2. Иммуноцитохимия
- Промыть ячейки, покрытые на обшивках в PBS, 2 x 1 мин.
- Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
- Стирка в PBS 3 x 5 мин.
- Инкубировать в блокирующем растворе, содержащем 10% нормальную ослиную сыворотку (NDS)/1% бычий сывороточный альбумин (BSA)/0,1% Triton X-100 в течение 45 мин при RT.
- Добавляют 50 мкл блокирующего раствора на крышку диаметром 10 мм.
- Готовят первичные антитела в 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 в следующих разведении: мышиный анти-GFAP 1:300, козий анти-Iba1 1:500. Инкубируют клетки с первичными антителами в течение ночи при +4 °C.
- Смыть в PBS, 3 x 10 мин.
- Инкубируют со вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором: ослиным антимышевым (возбуждение 488 нм [1:200)) или ослиным антикозелом (возбужденным при 647 нм [1:200)). Инкубируют клетки в течение 2 ч при РТ в темноте.
- Стирка в PBS, 7 x 5 мин.
- Инкубируют клетки с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, 1:4,000) в течение 10 мин при RT.
- Стирка в PBS 5 x 5 мин.
- Установите крышки на предметные стекла микроскопа с помощью монтажного раствора; используйте одну каплю на крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавления антител могут варьироваться в зависимости от производителя. Пользователи должны определить оптимальные разведения для своих экспериментов.
3. Покадровая видеоизображение
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, содержащие флуоресцентный краситель, должны быть защищены от прямого света. Перед началом эксперимента по визуализации убедитесь, что стеклянная крышка не двигается при включении перфузии.
- Приготовление растворов и клеток
- Готовят внеклеточный раствор (ECS) для визуализации: 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCal2, 2 мМ MgCl2, 10 мМ D-глюкозы и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4. Убедитесь, что осмолярность составляет 280-300 мОсм/кг, и приготовьте ECS без Ca2+: 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES и 0,1 мМ EGTA.
- Готовят исследуемые растворы: 100 мкМ АТФ растворено в ECS, 1 мкМ Thg в ECS без Ca2+ и 0,1 мг/мл ALS IgG в ECS8.
- Переложите одну крышку на посуду с ECS, чтобы вымыть весь DMEM. Готовят раствор для загрузки красителя путем разбавления 1 мМ запасного раствора Fluo-4 AM ECS до конечной концентрации 5 мкМ Fluo-4 AM.
- Поместите крышку с ячейками в раствор для загрузки красителя на 30 мин при РТ в темноте. Промывайте ячейки в ECS в течение 20 мин.
- Если ячейки недостаточно загружены (т.е. если базальный уровень флуоресценции слишком низок <5% динамического диапазона камеры со временем экспозиции более 400 мс), увеличьте время загрузки до 45 мин до 1 ч при 37 °C. Альтернативно, смешайте раствор Fluo-4 AM с равным объемом 20% (мас./об.) моющего средства (Pluronic) в DMSO перед разбавлением в ECS, получая конечную концентрацию Pluronic ~0,02%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные примеры этого исследования были выполнены с человеческим IgG, выделенным из сыворотки крови пациентов с БАС, как описано ранее 4,5,11. Каждый эксперимент проводился с образцами IgG одного пациента.
- Видеоизображение
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе система видеоизображения была объединена с ксеноновой короткодуговой лампой, полихроматорной системой и перевернутым эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным водой, глицерином и масляным погружным объективом. Таймлапс-визуализация выполнялась с помощью системы цифровых камер.- Включите компоненты настройки обработки изображений за 15 минут до эксперимента, чтобы система достигла рабочей температуры.
- Поместите крышку в камеру записи с 1 мл рабочего раствора (ECS или ECS без Ca2+).
- Чтобы выбрать правильный протокол визуализации, откройте программное обеспечение для визуализации и на панели Acquisition выберите пары фильтров для Fluo4-AM с длиной волны возбуждения при 480 нм, дихроичным зеркалом на 505 нм и длиной волны излучения на 535 нм.
- Выберите поле зрения, заботясь о том, чтобы на протяжении всего эксперимента было постоянное количество клеток. Отрегулируйте время экспозиции и усиление детектора соответствующим образом, чтобы сигнал не был насыщенным. Выберите псевдоцветной режим для получения. Для получения более подробных инструкций обратитесь к руководству, предоставленному производителем.
- Отрегулируйте частоту дискретизации до 1 Гц (1 кадр в секунду).
- Начните визуализацию с получения базального уровня флуоресценции в течение 3-5 мин для определения исходного уровня (F0). Обеспечьте постоянный поток рабочего решения.
- Остановите поток рабочего решения и переключитесь на тестовое решение на требуемый промежуток времени (см. также временные бары в примерах на рисунке 2 и рисунке 3). Между каждым исследуемым раствором промывайте ячейки постоянным потоком рабочего раствора в течение 3-5 мин.
- Сохраняйте объем раствора в регистрирующей камере на уровне ~1 мл, организуя постоянное всасывание из верхней части раствора (см. Рисунок 2Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для нанесения обработки непосредственно на изображенные ячейки индивидуальная система доставки, изготовленная из стеклянной пипетки (внутренний диаметр 0,8 мм), была расположена на расстоянии ~350 мкм и ~1 мм над ячейками под углом 45° в сочетании с системой обмена раствором, содержащей запорные клапаны и электронный контроллер клапанов (см. Фиг.2E).
4. Анализ данных
- Определите интересующую область (ROI), соответствующую отдельной ячейке.
- Выберите кадр с наибольшей интенсивностью сигнала (т.е. из приложения АТФ) и окружить одну ячейку с помощью приложения Polygonal Tool. Повторите для всех ячеек в приобретенном поле. Выберите пять ROI в фоновом режиме с помощью инструмента «Круг».
- Чтобы измерить среднюю интенсивность сигнала одной ячейки и фона для каждого таймфрейма, выберите все ROI и используйте команду Multi Measure в ROI Manager в ImageJ или любую эквивалентную команду в коммерческом программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
- Экспортируйте средние значения интенсивности сигнала ROI в виде электронной таблицы.
- Усредните пять фоновых ROI и вычтите усредненный фон каждого кадра из средней интенсивности ROI кадра, полученного одновременно.
- Чтобы нормализовать полученные данные к базовому сигналу, используйте уравнение (1):
ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1)
где F — интенсивность сигнала каждого таймфрейма после вычитания фона, а F0 — базовая флуоресценция Fluo-4.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался индивидуальный код. - Для анализа активности кальция определяют несколько параметров4: амплитуда пика кальция (ΔF/F0), интегральное изменение (интеграл времени, поверхность под записью отклика) переходного процесса кальция (ΔF/F0 × с), время до пика от начала стимуляции до максимума переходного процесса кальция (ов), время подъема, прошедшее от начала стимуляции до значения ΔF/F0 которая достигает 50%-80% от максимальной амплитуды (с), половинная ширина-полная ширина переходного процесса при полумаксимальной амплитуде (с), частота откликов, если они повторяются (Гц).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика различных типов глиальных клеток в культуре
Обычно для производства астроцитов для экспериментов требуется 15-21 день, в то время как микроглиальным клеткам требуется 10-15 дней, чтобы вырасти. Иммуноокрашивание проводили для оценки клеточной чистоты культуры. На рисунке 1 показана экспрессия двойной маркировки астроцитарного маркера GFAP и микроглиального маркера Iba1 в соответствующих культурах.
Известно, что кальциевая визуализация выявляет различия в физиологии клеток здоровых и больных астроцитов. Ранее в астроцитах дикого типа мы продемонстрировали, что ALS IgG влияет на клеточный Ca2 + , мобилизуя внутри- и внеклеточные пулы в цитозоль8. Следующий протокол определил, были ли различия между переходными процессами кальция в hSOD1G93A и нетрансгенными культивируемыми астроцитами, остро подвергшимися воздействию образцов ALS IgG от пациентов. Астроциты, нагруженные Fluo4-AM, перфузировали ECS в течение 3 мин для получения стабильного исходного уровня. Далее 100 мкг/мл ALS IgG наносили в ванну на 5 мин. Астроциты промывали ECS, а затем применяли 100 мкМ АТФ в конце каждой записи, чтобы проверить здоровье каждой клетки и наблюдать реакцию кальция на стандартный стимул.
Репрезентативные следы на рисунке 2A,B показывают, что астроциты hSOD1G93A реагируют на ALS IgG с большей амплитудой переходного кальция, большим общим интегрированным изменением и более коротким временем до пика, чем нетрансгенные астроциты. Здесь, однако, следует проявлять осторожность при интерпретации количественных данных, когда используются одноволновые Ca2 + -зонды, такие как Fluo4-AM (см. раздел обсуждения). Кроме того, форма ответа на ALS IgG отличается от ответа на АТФ (обратите внимание на более быстрый переходный процесс с большей амплитудой в следах и синхронностью клеток в псевдоцветных изображениях в ответ на АТФ, рисунок 2A,B).
С целью дальнейшего изучения происхождения различий в реакции кальция на ALS IgG и АТФ между hSOD1G93A и нетрансгенными астроцитами мы использовали фармакологический подход к манипулированию внутренними запасами Ca2+ во время визуализации кальция с использованием 1 мкМ Thg. Thg является неселективным ингибитором эндоплазматического ретикулума Ca2+ ATPase (SERCA), истощение внутриклеточных запасов Ca2+ почти сразу, что отражается в транзиторном кальции, длящемся в течение нескольких минут. Для исключения влияния внешнего Ca2+ на наблюдаемые явления в ходе эксперимента использовали ECS, лишенный Ca2+. После регистрации базального уровня флуоресценции в течение 3 мин, 1 мкМ Тхг наносили в ванну на 2 мин. После истощения кальция, вызванного Thg, астроциты перфузировали с ECS, содержащим Ca2 +, чтобы индуцировать и контролировать пополнение запасов. Репрезентативные следы описанного эксперимента показаны на рисунке 2C,D. Как и ожидалось, астроциты hSOD1G93A имели более высокий уровень Ca2+ в запасах, что было выявлено истощением запасов, что указывает на перегрузку этого иона. Аналогичный механизм был продемонстрирован на культивируемых астроцитах трансгенных мышей SOD1G93A 36.
Кальциевая визуализация клеток микроглии в культуре
Замедленная визуализация микроглии, меченной Fluo-4 AM, выполнялась таким же образом, как описано для астроцитов (рисунок 3B). Микроглиальные клетки перфузировали ECS с 2 мМ Ca2+ в течение 3 мин для получения стабильного исходного уровня, с последующим применением ванны 100 мкг/мл ALS IgG в течение 5 мин, промывкой ECS и стимуляцией 100 мкМ АТФ. Интересно, что в то время как астроциты легко реагируют на ALS IgG, подавляющее большинство микроглиальных клеток не реагируют на ALS IgG (как показано только одной микроглиальной клеткой, реагирующей с переходным кальцием; красный след в примере рисунка 3A). Однако они всегда реагировали на АТФ и аналогично астроцитам (рисунок 3А). Обратите также внимание на случай спонтанного переходного процесса Ca2+ в клеточном следе 2 (рисунок 3A), который не следует принимать за индуцированный ответ.
Рисунок 1: Астроциты и микроглия в первичной культуре. Репрезентативные конфокальные изображения астроцитов (слева) в культуре, меченой с использованием GFAP (красный) и микроглии (справа) в культуре, окрашенной Iba1 (зеленый). Двойная маркировка (GFAP/Iba1) использовалась для обозначения чистоты культуры. DAPI использовался для маркировки ядер (синий). Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; lba1 = ионизированная кальций-связывающая молекула-адаптор 1; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример применения визуализации кальция в исследовании патофизиологии астроцитов. (A) Репрезентативный пример эксперимента по визуализации кальция, в котором астроциты hSOD1G93A были изображены в течение 5 мин для сбора исходной флуоресценции («исходный уровень»), за которым последовало острое применение ALS IgG (0,1 мг / мл) в течение 5 минут («ответ на ALS IgG») и лечение 100 мкм АТФ («реакция на АТФ»). Верхняя панель показывает псевдоцветные изображения (интенсивность флуоресценции имеет цветовую кодировку, где черный соответствует очень низкой интенсивности, в то время как белый отмечает пиксели с наибольшей интенсивностью; отношение интенсивности цвета представлено в цветовой полосе справа в верхней панели B , которая соответствует интенсивности флуоресценции отдельной ячейки в каждом из сегментов эксперимента («базовая линия», «реакция на БАС IgG» и «реакция на АТФ»). Серые пунктирные линии указывают на псевдоцветные изображения определенных временных точек для репрезентативного кальциевого следа (оранжевым цветом). Серая коробочка в середине кальциевого следа отмечает 5-минутное применение ALS IgG. Черная полоса под следами кальция отмечает применение АТФ. (B) То же самое, что и в (A), за исключением нетрансгенных астроцитов (след синего цвета). (C) Репрезентативный кальциевый след (оранжевый) в астроците hSOD1G93A , оспариваемом 1 мкг/мл тапсигаргина (черная полоса под следом) в ECS без кальция, с последующим добавлением 2 мМ Ca2+ ('2 мМ Ca2+', черная полоса под следом). (D) То же самое, что и в (C), за исключением нетрансгенного астроцита (след выделен синим цветом). Шкала амплитуд = 100% ΔF/F0. Временная шкала = 200 с. Шкала стержней = 50 мкм. (E) Схема экспериментальной установки, изображающая индивидуальный режим обмена раствором и размещение пипетки для применения биохимического агента. Сокращения: БАС = боковой амиотрофический склероз; IgG = иммуноглобулин G; Thg = тапсигаргин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример кальциевой визуализации культивируемой микроглии. (A) Слева: Brightfield изображение культивируемой микроглии. Поскольку трудно получить чистую микроглиальную культуру, здесь также присутствуют астроциты (более крупные плоские полигональные клетки, см. пример, указанный наконечником стрелки). В культуре присутствуют как разветвленные (мелкая сома, выступающие отростки), так и амебоидная микроглия (обозначенная зелеными и желтыми коробочками соответственно). Середина: Увеличенные желтые и голубые коробки слева. Красная, синяя и фиолетовая линии обозначают ROI, из которых извлекается средняя интенсивность флуоресценции с течением времени. Справа: следы кальция трех клеток в средней панели. Цвет трассировки соответствует цвету ROI на средней панели. После визуализации исходной флуоресценции кальция («базовая флуоресценция») в течение 200 с клетки подвергались острому применению ALS IgG (0,1 мг / мл) в течение 5 мин («ответ на ALS IgG»), за которым следовал 100 мкМ АТФ («ответ на АТФ»). Серая коробочка в середине кальциевого следа отмечает 5-минутное применение ALS IgG. Черная полоса под следом кальция отмечает применение АТФ. Обратите внимание, что только клетка 1 (красный след), представляющая большое меньшинство клеток, реагировала на ALS IgG, в то время как все клетки реагировали на АТФ. (B) Псевдоцветные изображения представляют интенсивность флуоресценции в каждом из сегментов записей («базовая линия», «реакция на ALS IgG» и «реакция на АТФ»), где оранжевые пунктирные линии указывают на конкретные временные точки в репрезентативных следах кальция (A, правая панель). Зелеными и оранжевыми коробочками отмечены амебоидная микроглия (такая же, как и в А). Отношение интенсивности цвета представлено в цветовой шкале справа. Шкала амплитуд = 100% ΔF/F0. Временная шкала = 100 с. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: БАС = боковой амиотрофический склероз; IgG = иммуноглобулин G; ROI = интересующий регион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлен метод первичного культивирования клеток как быстрый и «бюджетный» инструмент для изучения различных аспектов клеточной (пато)физиологии, таких как БАС в модели hSOD1G93A крыс. Таким образом, метод подходит для исследований на одноклеточном уровне, которые могут быть экстраполированы и дополнительно исследованы на более высоком уровне организации (т. Е. В срезах ткани или у живого животного). Культивирование клеток как техника, однако, имеет несколько предостережений. Наиболее важно сделать изоляцию мозговой ткани и диссоциацию клеток на льду и выполнить эти и последующие этапы выделения и подготовки в кратчайшие сроки. Загрязнение является постоянным препятствием, которое можно преодолеть, используя хорошо стерилизованное оборудование и уделяя особое внимание при выполнении диссоциации тканей в ламинарной вытяжке37. Также важно засеять правильную плотность клеток. Если количество посеянных клеток меньше желаемого числа, это не будет поддерживать рост и размножение клеток в блюде. Однако, если клетки слишком плотные, между ними будет конкуренция за питательные вещества в питательной среде, и, таким образом, большая гибель клеток. Вот почему желательно подсчитать диссоциированные клетки перед посевом, по крайней мере, до того, как будет получен некоторый опыт относительно правильного соотношения исходной ткани и объема диссоциации.
GFAP является широко используемым маркером астроцитов и часто используется для оценки чистоты клеточной культуры38,39. Однако только GFAP недостаточно при изучении реактивности астроцитов. Рекомендуется сочетать его с маркером пролиферации, таким как Ki67 или другими маркерами астроцитов (глютаминсинтетаза, альдолаза-С или альдегиддегидрогеназа-1)18,38. Хотя эти методы, как правило, дают чистые глиальные культуры клеточного типа, необходимо проявлять осторожность при оценке чистоты клеток культуры. Это имеет особое значение для культур клеток микроглии, которые обычно содержат некоторые предшественники олигодендроцитов или астроциты34. Специфические маркеры для клеток микроглии вызывают большой интерес. Наиболее используемым маркером является Iba1, но другие часто используемые маркеры, такие как рецепторы дифференцировки (CD68, CD45) и рецептор фракталкина (CX3CR1), могут быть обнаружены и в других клетках (подробнее см.40). В настоящее время наиболее специфическими маркерами микроглии являются TMEM119 и пуринергический рецептор P2Y1241, хотя недавняя статья вызвала обеспокоенность по поводу специфичности TMEM11942.
Внедрение таймлапсной визуализации живых клеток дает преимущество мониторинга клеточных процессов, таких как передача сигналов Ca2+ , в режиме реального времени. Кроме того, модуляция поведения клеток путем применения различных химических агентов (например, Thg здесь) дает дополнительную информацию для описания путей и сигнальных мессенджеров, активированных в здоровой клетке или модели клеточного заболевания (выделенной и культивируемой здесь у крысы hSOD1G93A ALS). При работе с флуоресцентными красителями, такими как Fluo-4 AM, очень важно найти правильную концентрацию и время инкубации для красителя, чтобы заполнить внутреннюю часть клетки. Если это занимает слишком много времени, поглощение красителя может быть увеличено путем удержания клеток в инкубаторе при 37 ° C. В более тяжелых случаях в загрузочном растворе может использоваться мягкое моющее средство (например, Pluronic F-127). Также не рекомендуется достигать вышесказанного путем повышения концентрации красителя более чем на 10 мкМ. Фактически, при более высоких концентрациях краситель может действовать как буфер Ca2+ и гаснуть амплитуду сигнала Ca2+ .
Стоит также упомянуть, что в дополнение к Fluo-4 и аналогичным одноволновым красителям существуют Ca2+ -чувствительные ратиометрические красители (например, Fura-2), которые излучают при одном измерении и при одной Ca2+ -нечувствительной опорной длине волны. Таким образом, такие измерения нечувствительны к смещению, вызванному неравномерным распределением красителя в ячейке, и к изменениям в оптическом пути. Тем не менее, использование одноволновых красителей, особенно с высокоаффинными показателями, такими как Fluo-4, целесообразно в тех случаях, когда относительные измерения производятся в пределах одного образца или когда следует в первую очередь динамика процесса, а не реальные изменения концентрации Ca2+43. Тем не менее, эти измерения не могут быть использованы для количественных данных с точки зрения концентрации Ca2+, и при интерпретации амплитуд из данных, представленных на рисунке 2, необходима осторожность.
Здесь мы продемонстрировали, как использование этого средства визуализации на живых клетках - астроцитах в культуре - может выявить тонкие внутриклеточные механизмы патофизиологии, такие как пополнение запасов Ca2 + и вход Ca2 + , которые нарушаются в модели ALS, в соответствии с предыдущими результатами на мышиных клетках36. Это может объяснить более высокую чувствительность астроцитов hSOD1G93A к ALS IgG, как предлагается здесь, что может потенцировать прогрессирование патологии. Чтобы сравнить измерения в таких экспериментах, желательно иметь аналогичную плотность клеток в поле зрения и чтобы одни и те же клеточные компартменты были взяты для ROI (например, сома против процессов).
Здесь был показан пример, что клетки микроглии не реагируют на ALS IgG с той же силой, что и астроциты. Это согласуется с выводом о дефицитной генерации пероксида в линии микроглиальных клеток при лечении ALS IgG15. В целом, этот подход указывает на клеточный специфический ответ на IgG, связанный с БАС, также важный факт, реализованный за счет использования чистых клеточных культур микроглии против астроглии. Использование глиальных клеток из моделей невропатофизиологии или полученных из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток пациентов имеет будущее физиологического биомаркирования при тяжелых нервных заболеваниях, таких как БАС. Таким образом, было бы важно понимать тонкую сигнализацию Ca2+ как отпечаток конкретного состояния заболевания или различать различные экситотоксические заболевания. Для этих целей необходимо разработать процедуру машинного обучения и классифицировать записи данных. Кроме того, эти клетки могут быть выращены в культуре и посеяны в микрофлюидное устройство, которое будет использоваться для диагностики или для стратификации нейродегенеративного заболевания пациента с помощью вызова ответа на различные гуморальные факторы нейровоспаления (например, сыворотки, IgG, CSF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Договором Министерства образования, науки и технологического развития Республики Сербия No 451-03-9/2021-14/200178, проектом образовательного и учебного кластера FENS - NENS «Трехсторонний курс по глии в нейровоспалении» и грантом ЕС H2020 MSCA RISE #778405. Мы благодарим Марию Аджич и Мину Перич за предоставление изображений иммуногистохимии и Даниэлу Батавельич за помощь в написании статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
