Summary
ここでは、hSOD1G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。
Abstract
このプロトコルは、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、星状細胞、およびミクログリアの初代培養物を調製する方法と、ラットhSOD1G93A モデルにおける筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学を研究する目的でこれらの細胞を使用する方法を示しています。まず、生後ラット皮質から星状細胞とミクログリアを単離して培養する方法を示し、次に、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)マーカーとイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)ミクログリアマーカーを使用した免疫細胞化学によって、これらの培養物の純度を特徴付けて試験する方法を示します。次の段階では、培養細胞の色素ローディング(カルシウム感受性Fluo 4-AM)の方法と、生細胞のビデオイメージング実験におけるCa2+ 変化の記録について説明します。
ビデオ録画の例は、(1)ALS患者から単離された免疫グロブリンG(IgG)に急性曝露された培養アストロサイトのCa2+イメージングの症例で構成され、同じ実験で実証されたATPに対する応答と比較して特徴的かつ特異的な応答を示します。実施例はまた、非トランスジェニック対照と比較して、hSOD1G93A星状細胞におけるALS IgGによって誘発される細胞内カルシウム濃度のより顕著な一過性上昇を示しています。(2)小胞体Ca2+ ATPaseの非競合阻害剤であるタプシガルギン(Thg)によるカルシウム貯蔵の枯渇中の培養アストロサイトのCa2+イメージング、続いて記録溶液中のカルシウムの添加によって誘発される貯蔵操作によるカルシウム侵入、これはhSOD1G93Aと非トランスジェニック星状細胞におけるCa2+貯蔵操作の違いを実証する。(3)培養ミクログリアのCa2+イメージングは、主にALS IgGに対する応答の欠如を示し、一方、ATP適用はCa2+変化を誘発した。この論文はまた、重要な細胞密度と培養物の純度、Ca2+色素の正しい濃度の選択、および色素ローディング技術に関して考えられる警告と注意を強調しています。
Introduction
細胞培養技術は、健康と病気における細胞神経生理学の多様な分野で多くの進歩をもたらしました。特に、実験動物の神経組織から新たに単離された初代細胞培養により、実験者はさまざまな生化学的培地や生理学的設定での多様な細胞の挙動を綿密に研究することができます。Ca2+感受性色素などのさまざまな蛍光生理学的指標をタイムラプスビデオ顕微鏡と組み合わせて使用 すると、細胞の生物物理学的および生化学的プロセスをリアルタイムでよりよく理解できます。
ALSは、上位および下部の運動ニューロンに影響を与える壊滅的な神経変性疾患です1。この病気は家族型の複雑な病因を持っていますが、ほとんどが散発的な型です(症例の90%)2。非細胞自律機構がALS病態生理に寄与することはよく知られており、主にグリア細胞の本質的な役割に起因しています3。ALSはまた、炎症の体液性および細胞性因子の関与を伴う神経炎症性疾患としてよく特徴付けられる。
免疫グロブリンGは、ALSやその他の神経変性疾患の分子マーカーとして広く使用されています。このマーカーの血清レベルを研究することは、疾患における神経炎症の存在および病期を示すことができる4,5,6が、脳脊髄液中のその存在は、血液脳関門7の破れを示すことができる。IgGは、ALS患者の脊髄運動ニューロンにおける沈着物としても同定された7。それにもかかわらず、このアプローチは、IgGのレベルと疾患の病期および特徴との相関においていくつかの矛盾を示しています6。
ALS患者の血清から単離されたIgG(ALS IgG)は、ナイーブアストロサイト8でカルシウム応答を誘導し、ニューロンでグルタミン酸放出を誘発する可能性があり、ALS病理9の特徴である興奮毒性効果を示しています。しかし、hSOD1G93A ALSラットモデル(ヒトSOD1変異10の複数のコピーを含む)に関する研究は、培養神経膠細胞11、組織12、13、14、または生きた動物13において酸化ストレスの多くのマーカーを示した。ALSラットモデルから培養されたアストロサイトは、非トランスジェニック同腹仔からのアストログリアよりも過酸化物によって誘発される酸化ストレスを受けやすいことは注目に値します11。
培養中のミクログリア細胞は、あまり明白ではない方法でALS IgGの影響を受けます。すなわち、BV-2ミクログリア細胞株は、わずか4/11 ALS IgG患者試料の適用に応答して酸化ストレスの蛍光マーカーからのシグナルの上昇を示した15。ミクログリアは多くの神経炎症病理に関与し、ALS16,17の非細胞自律メカニズムにおける酸化ストレスおよび後期進行期を追加することはよく知られている。それにもかかわらず、ALS IgGのデータは、これらの細胞がALS炎症のこれらの体液性因子に対して星状細胞ほど反応性がない可能性があることを示しました。ALSマウスモデルの初代星状細胞を用いて、仔だけでなく、脳または脊髄上の症候性動物においても、いくつかの研究が行われている18,19,20,21。これはミクログリア初代培養にも当てはまりますが、星状細胞ほどではなく、主に胚期の脳領域からのものです22,23,24。
培養中の細胞上のCa2+のタイムラプスビデオイメージングは、主に興奮毒性の生理学的マーカーとしてこのイオンの細胞内過渡性を追跡する手段として使用しています。したがって、これらの過渡現象(振幅、過渡下面積、立ち上がり時間、周波数)の生物物理学的特性評価により、研究者は神経変性の多様な細胞モデルから実験的診断パラメータを得ることができます。したがって、この技術は、疾患バイオマーカーとしてのIgGの定量的生理学的評価の利点を提供します。ALSの誘導におけるIgGとCa2+の役割に関する文献は数多くあります。これらの研究のほとんどは、患者のIgGを実験動物に注射することによってALSを誘導することによって行われ25、26、27、28、29、その後、細胞内Ca2+上昇およびIgG沈着を示した。一連の研究では、in vitroでの運動シナプスに対するALS IgGの効果を調査しました30,31,32。上記の文脈において、ここで提示された技術は、ALSの非細胞自律メカニズムにおける重要なプレーヤーとしてのグリア細胞に焦点を当て、神経炎症の体液性因子としてのIgGに対する潜在的な興奮毒性応答を定量化します。このアプローチは、さまざまな細胞培養システムや一般的な炎症の細胞モデルで、血清全体、CSF、サイトカインなどの他の体液性因子の試験に幅広い用途がある可能性があります。
この論文では、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、アストロサイト、ミクログリアの初代培養物を調製する方法と、これらの細胞をさらに使用して、患者の血清由来IgGによるALS病態生理学を研究する方法について説明します。培養細胞の色素ローディング(図1)とタイムラプスビデオイメージング実験におけるCa2+変化の記録に関するプロトコルが詳しく説明されています。ビデオ録画の例は、グリア細胞がATPと比較してALS IgGにどのように反応するかを示し、後者はプリン作動性膜受容体を活性化します。hSOD1G93A ALSラット脳から単離された星状細胞が、非トランスジェニック対照と比較してALS IgGに対するより顕著なCa2+応答とどのように反応するか、およびこのプロセスをCa2+保存操作の違いに関連付ける方法の例が初めて示されています。また、ALS IgGに急性挑戦されたミクログリア細胞におけるカルシウムイメージングの例も示されており、細胞内カルシウムの反応はわずかです。
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Protocol
すべての実験は、科学的目的のための動物の保護に関するEU指令に従い、ベオグラード大学生物学部の倫理委員会(承認番号EK-BF-2016/08)の許可を得て実施されました。患者材料(IgGの血清)については、ヒトを対象とした実験については、世界医師会倫理綱領(ヘルシンキ宣言)に従って、患者の同意を得た日常的な臨床検査のために収集されました。プロトコルは、セルビア臨床センターの倫理委員会によって承認されました(No.850/6)。
1. 初代細胞培養の準備
- 脳組織の分離
注意: 分離は、氷冷溶液を使用して、氷上で実行する必要があります。- 初代新生児細胞培養には、生後1〜3日の新生児の子犬を使用します33。
注:ここで提示された研究では、Sprague Dawley hSOD1G93A および非トランスジェニックラットが使用されました。ジェノタイピングのために、ラットテールを後のDNA抽出およびPCRに使用した。 - 子犬の頭に70%エタノールを振りかけ、ハサミを使ってすぐに断頭します。
- 頭蓋骨を露出させるために小さな角度のはさみを使用して皮膚を切り開きます。 大孔 から軌道に向かって切り込みを入れて頭蓋骨を開きます。次に、垂直な正中線カットを行います。頭蓋骨から脳を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むペトリ皿に入れます。
注意: トランスジェニック子犬と非トランスジェニック子犬の間の相互汚染を防ぐために、子犬の間のツールを清掃してください。脳の残りの部分からの皮質の分離は、実体顕微鏡下で行われるべきです。 - 鉗子の先端を使用して、両方の半球間の接続を引き裂きます。次に、半球を中央から横にそっと押して、湾曲した鉗子で半球を分離します。
- 髄膜をまっすぐで湾曲した鉗子で慎重に引き裂いて取り除きます。
- 湾曲した鉗子で海馬をつまんで取り外します。海馬を廃棄するか、別の細胞培養準備に使用します。
注意: 無菌状態を確保するために、層流フードの下でさらに手順を実行する必要があります。
- 初代新生児細胞培養には、生後1〜3日の新生児の子犬を使用します33。
- 組織の均質化と解離
- 1つの皮質を3 mLの冷たいPBSで満たされた15 mLのチューブに移します。1 mLのチップで懸濁液を上下にピペットし、懸濁液が均一になるまで10〜15ストロークを完了します。
注意: このプロセスで気泡が発生しないように十分に注意してください。 - 500 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、1 mLのチップで上下にピペッティングして、ペレットを3 mLの冷たいPBSに再懸濁します。遠心分離ステップを繰り返します。
注意: この時点から使用されるすべての溶液は、37°Cに予熱する必要があります。 - 上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質(ペニシリンとストレプトマイシン)を添加した2 mLの完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にペレットを再懸濁します。.ホモジネートを2 mLチューブに移します。
- ホモジネートを21 Gおよび23 Gの針(各3回)に通して、単一細胞の懸濁液を作ります。
注意: このプロセスで気泡が発生しないように十分に注意してください。
- 1つの皮質を3 mLの冷たいPBSで満たされた15 mLのチューブに移します。1 mLのチップで懸濁液を上下にピペットし、懸濁液が均一になるまで10〜15ストロークを完了します。
- 1つの皮質から調製した細胞懸濁液を、直径60 mmのペトリ皿または3 mLの完全なDMEMを含むT25フラスコ(接着細胞の増殖のために表面をポリペプチドコーティングで前処理)に注ぎます。懸濁液が均一に分布するようにペトリ皿を軽く振る。
- インキュベーター内の細胞を37°Cで5%CO2/95%空気の加湿雰囲気中で増殖させる。
- 分離後48時間で培地を交換し、3日ごとに培地を交換します。
- アストロサイトの成長を促進するために、細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、予熱したPBSで洗浄して、培地中の緩く付着したグリア細胞と微量のFBSを取り除きます。
- 予熱したトリプシン溶液1 mL(0.25%トリプシン、PBS中の0.02%EDTA、滅菌ろ過)を加えて、星状細胞の下層をトリプシン処理します。
- 皿を37°Cのインキュベーターに2〜5分間入れます。
- 顕微鏡下で細胞を確認します。剥離を開始したら、4 mLの完全DMEMを追加します。
- 細胞懸濁液を回収し、15 mLチューブに移します。500 × g で5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 5 mLの新鮮な完全DMEM中で104 細胞/cm2 の密度で細胞を再プレートします。
- 3日ごとに培地を交換してください。他のグリア細胞型の存在を最小限に抑えるために、星状細胞が50%コンフルエントに達した後、各培地交換の前に、完全なDMEMで細胞を洗浄します。
- 上清培地を1 mLピペットで吸引し、細胞の層に数回静かに分注します。この洗浄ステップでは、細胞層の表面全体が覆われていることを確認してください。
- 細胞が80%のコンフルエントに達したら(通常は14日後)、ステップ1.6に記載されているように、トリプシン処理とアストロサイトの収集を繰り返します。
- アストロサイトの5 × 103 を、ポリ-L-リジン(50 μg/mL)でコーティングした7 mmの円形ガラスカバースリップ上にシードします。48時間後の実験でそれらを使用してください。
- ミクログリアを促進するために、ステップ1.7の後、グリア細胞がコンフルエント層34に到達するのを許容する。ミクログリア細胞が星状細胞層の上に現れたら(10〜15日後、より小さく、より楕円形の体とより短いプロセスによって認識されます)、220rpmで2時間オービタルシェーカーでペトリ皿を振ってください。
- ミクログリア細胞の分散と播種
- 上清培地を1 mLのピペットチップで吸引して、剥離して緩く付着した細胞を軽く洗浄し、細胞の層に数回静かに分注します。この洗浄ステップでは、必ず細胞層の表面全体を覆い、剥離した細胞を含む培地を回収し、15 mLチューブに移してください。
- 500 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1 mLの培地に再懸濁します。
- 細胞懸濁液を21 Gの針に通して、単一細胞懸濁液を得る。
注:ほとんどの公開された方法は、トリプシンまたはパパインを使用して組織を解離します。ただし、21 Gの針には、細胞の過剰消化を防ぎ、より穏やかな解離を可能にするという利点があります。 - 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。ポリ-L-リジン(50 μg/mL)でコーティングされた7 mmの円形ガラスカバーガラスに5 ×10 3 ミクログリア細胞を播種します。48時間後の実験でそれらを使用してください。
注:オリゴデンドロサイトの前駆細胞とアストロサイトは、実験者の経験に応じて可変数で存在する可能性があるため、振とうによって純粋なミクログリア培養物を得ることは困難です。グリア培養物における異なる細胞集団の存在を推定するために使用される免疫細胞化学的プロトコルは、他の場所に記載されている35。
2. 免疫細胞化学
- カバーガラスにメッキした細胞をPBSで2 x 1分すすぎます。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒドに室温(RT)で20分間固定します。
- PBSで3 x 5分洗ってください。
- 10%正常ロバ血清(NDS)/1%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.1%Triton X-100を含むブロッキング溶液中でRTで45分間インキュベートします。
- 直径10 mmのカバーガラスあたり50 μLのブロッキング溶液を追加します。
- 一次抗体を1%NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100で、マウス抗GFAP 1:300、ヤギ抗IBA1 1:500の希釈液で調製します。細胞を一次抗体とともに+4°Cで一晩インキュベートします。
- PBSですすぎ、3 x 10分。
- 蛍光色素を結合させた二次抗体(ロバ抗マウス(励起488 nm [1:200))またはロバ抗ヤギ(647 nm [1:200)で励起))でインキュベートします。暗所でRTで2時間細胞をインキュベートします。
- PBSで7 x 5分洗ってください。
- 細胞を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:4,000)でRTで10分間インキュベートします。
- PBSで5 x 5分洗浄します。
- 取り付けソリューションを使用して顕微鏡スライドにカバーガラスを取り付けます。カバーガラスごとに1滴を使用してください。
注:抗体希釈は生産者によって異なる場合があります。ユーザーは、実験に最適な希釈を決定する必要があります。
3.タイムラプスビデオイメージング
注意: 蛍光色素を含む溶液は、直射日光から保護する必要があります。イメージング実験を開始する前に、灌流をオンにするときにガラスカバーガラスが動かないことを確認してください。
- 溶液と細胞の調製
- イメージング用の細胞外溶液(ECS)を調製します:140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCal 2、2 mM MgCl2、10 mM D-グルコース、および10 mM HEPES。pHを7.4に調整します。浸透圧が280〜300 mOsm / kgであることを確認し、Ca 2+を含まないECSを調製します:140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl2、10 mM D-グルコース、10 mM HEPES、および0.1 mM EGTA。
- 試験溶液を調製します:ECSに溶解した100 μM ATP、Ca2+を含まないECS中の1 μM Thg、およびECS8に0.1 mg/mLのALS IgG。
- 1枚のカバーガラスをECSで皿に移し、DMEM全体を洗い流します。Fluo-4 AMの1 mMストック溶液をECSで最終濃度5 μM Fluo-4 AMに希釈して、色素ローディング溶液を調製します。
- 細胞の入ったカバーガラスを色素ローディング溶液に30分間、暗所のRTで30分間入れます。細胞をECSで20分間洗浄します。
- 細胞に十分な負荷がかかっていない場合(すなわち、蛍光の基礎レベルがカメラのダイナミックレンジの<5%と低く、露光時間が400ミリ秒を超える場合)、装填時間を37°Cで最大45分から1時間に増やします。 または、ECSで希釈する前に、Fluo-4 AMストック溶液をDMSO中の等量の20%(w/v)界面活性剤(プルロニック)と混合して、最終的なプルロニック濃度を~0.02%にします。
注:この研究の実験例は、前述のようにALS患者の血清から単離されたヒトIgGを用いて実施された4,5,11。各実験は、単一の患者のIgGサンプルを用いて実施した。
- ビデオイメージング
注:このプロトコルでは、ビデオイメージングシステムは、キセノンショートアークランプ、ポリクロメーターシステム、および水、グリセリン、および油浸対物レンズを備えた倒立落射蛍光顕微鏡と組み合わされました。タイムラプス撮影は、デジタルカメラシステムを用いて行った。- 実験の15分前にイメージングセットアップのコンポーネントをオンにして、システムが動作温度に到達できるようにします。
- カバーガラスを1 mLの作業溶液(ECSまたはCa 2+を含まないECS)と一緒に記録チャンバーに入れます。
- 正しいイメージングプロトコルを選択するには、イメージングソフトウェアを開き、取得パネルで、励起波長が480 nm、ダイクロイックミラーが505 nm、発光波長が535 nmのFluo4-AMのフィルターペアを選択します。
- 実験全体を通して一貫した数の細胞を持つように注意して視野を選択してください。露光時間と検出器のゲインは、信号が飽和しないように適切に調整してください。取得する 擬似カラー モードを選択します。詳細な手順については、製造元が提供するマニュアルを参照してください。
- サンプリングレートを1 Hz(1フレーム/秒)に調整します。
- ベースライン決定のための蛍光の基礎レベルを3〜5分間取得することによりイメージングを開始する(F0)。作業溶液の一定の流れを確保してください。
- 作業溶液の流れを停止し、目的の時間だけテスト溶液に切り替えます(図 2 および 図3の例のタイムバーも参照してください)。各試験溶液の間で、作業溶液の一定の流れで3〜5分間細胞を洗浄する。
- 溶液の上部から一定の吸引を配置して、記録チャンバー内の溶液容量を~1 mLに保ちます ( 図2Eを参照)。
注:画像化された細胞に直接処理を適用するために、ガラスピペット(内径0.8 mm)で作られたカスタマイズされた送達システムを、ピンチバルブと電子バルブコントローラーを含む溶液交換システムと組み合わせて、45°の角度で~350 μm、細胞の上に~1 mm配置しました( 図2Eを参照)。
4.データ分析
- 個々のセルに対応する関心領域 (ROI) を定義します。
- (つまり、ATPのアプリケーションから)信号強度が最も高いフレームを選択し、アプリケーション Polygonal Toolを使用して1つのセルを囲みます。取得したフィールド内のすべてのセルに対して繰り返します。 円ツールを使用してバックグラウンドで5つのROIを選択します。
- 各時間枠の単一セルとバックグラウンドの平均信号強度を測定するには、すべてのROIを選択し、ImageJのROIマネージャーのマルチメジャーコマンドを使用するか、商用ソフトウェアの同等のコマンドを使用します(材料の表を参照)。
- ROIの平均信号強度値をスプレッドシートとしてエクスポートします。
- 5つのバックグラウンドROIを平均し、同時に取得したフレームの平均ROI強度から各フレームの平均バックグラウンドを減算します。
- 取得したデータをベースライン信号に正規化するには、式 (1) を使用します。
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
ここで、Fはバックグラウンド減算後の各時間枠のシグナル強度であり、F0 はベースラインFluo-4蛍光である。
注:この研究ではカスタムメイドのコードを使用しました。 - カルシウム活性を分析するには、いくつかのパラメータ4を決定します:カルシウムピークの振幅(ΔF / F 0)、カルシウム過渡現象の積分変化(時間積分、応答記録下の表面)(ΔF / F 0 × s)、刺激の開始からカルシウム過渡の最大値までのピーク経過時間(s)、刺激の開始からΔF / F 0の値までの経過時間-時間 これは、最大振幅(s)の50%〜80%、半値最大振幅(s)での過渡現象の半値幅-全幅、反復の場合は応答の周波数(Hz)に達します。
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Representative Results
培養中の異なるグリア細胞タイプの特性評価
実験用の星状細胞を作製するのに通常15〜21日かかりますが、ミクログリア細胞は成長するのに10〜15日かかります。培養物の細胞純度を評価するために免疫染色を行った。 図1 は、それぞれの培養における星状細胞マーカーGFAPおよびミクログリアマーカーIba1の二重標識の発現を示す。
カルシウムイメージングは、健康な星状細胞と病気の星状細胞の細胞生理機能の違いを明らかにすることが知られています。以前、野生型アストロサイトでは、ALS IgGが細胞内外のプールをサイトゾル8に動員することにより、細胞Ca2+に影響を与えることを実証しました。以下のプロトコルは、hSOD1G93Aのカルシウム過渡現象と、患者からのALS IgGサンプルに急性曝露された非トランスジェニック培養アストロサイトとの間に違いがあるかどうかを決定しました。Fluo4-AMを負荷したアストロサイトをECSで3分間灌流し、安定したベースラインを得ました。次に、100 μg/mLのALS IgGを浴中で5分間塗布した。アストロサイトをECSで洗浄し、各記録の最後に100 μM ATPを適用して、各細胞の健康状態をテストし、標準刺激に対するカルシウム応答を観察しました。
図2A,Bの代表的な痕跡は、hSOD1G93A星状細胞がALS IgGに応答し、非トランスジェニック星状細胞よりもカルシウム過渡の振幅が大きく、全体的な統合変化が大きく、ピークまでの時間が短いことを示しています。ただし、ここでは、Fluo4-AMなどの単一波長Ca2+プローブを使用する場合、定量データの解釈には注意が必要です(説明のセクションを参照)。さらに、ALS IgGに対する応答の形態は、ATPに対する応答と区別可能である(ATPに応答した擬似カラー画像におけるトレースおよび細胞同期性の振幅が大きい、より速い過渡性に注目する、図2A、B)。
hSOD1G93Aと非トランスジェニックアストロサイトとの間のALS IgGおよびATPに対するカルシウム応答の違いの起源をさらに研究することを目的として、1 μM Thgを使用してカルシウムイメージング中に内部Ca2+貯蔵を操作する薬理学的アプローチを使用しました。 Thgは、小胞体Ca2+ ATPアーゼ(SERCA)の非選択的阻害剤であり、 細胞内Ca2+貯蔵をほぼ即座に枯渇させ、これは数分にわたって持続するカルシウム一過性に反映される。観察された現象における外部Ca2+の影響を排除するために、Ca2+を奪われたECSを実験中に使用した。蛍光の基礎レベルを3分間記録した後、1μM Thgを浴中に2分間適用した。Thg誘発性カルシウム枯渇に続いて、アストロサイトをCa2+を含むECSで灌流し、貯蔵庫の補充を誘導およびモニターした。記載された実験の代表的な痕跡を図2C、Dに示す。予想通り、hSOD1G93A星状細胞は、貯蔵庫の枯渇によって明らかにされたように、貯蔵庫内のCa2+のレベルが高く、このイオンの過負荷を示しています。同様のメカニズムが、SOD1G93Aトランスジェニックマウス36由来の培養星状細胞において実証されている。
培養中のミクログリア細胞のカルシウムイメージング
Fluo-4 AMで標識されたミクログリアのタイムラプスイメージングは、アストロサイトについて説明したのと同じ方法で行った(図3B)。ミクログリア細胞に2 mMCa2+のECSを3分間灌流して安定したベースラインを得た後、100 μg/mLのALS IgGを5分間浴中塗布し、ECSで洗浄し、100 μM ATPで刺激しました。興味深いことに、アストロサイトはALS IgGに容易に反応するが、ミクログリア細胞の大部分はALS IgGに反応しなかった(カルシウム一過性に反応するミクログリア細胞は1つだけである;図3Aの例では赤色の痕跡)。しかし、それらは常にATPに反応し、星状細胞と同様の方法で反応しました(図3A)。細胞トレース2(図3A)における一過性の自発的なCa2+の場合も誘導応答と間違えてはならないことに留意されたい。
図1:初代培養におけるアストロサイトとミクログリア。 GFAP(赤)を用いて標識した培養液中のアストロサイト(左)とIba1(緑)で染色した培養液中のミクログリア(右)の代表的な共焦点画像。二重標識(GFAP/Iba1)は、培養純度を示すために使用されました。DAPIは核(青色)の標識に使用されました。スケールバー= 50μm。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;lba1 =イオン化カルシウム結合アダプター分子1;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アストロサイトの病態生理学の研究におけるカルシウムイメージングアプリケーションの例 。 (A)hSOD1G93A アストロサイトを5分間イメージングしてベースライン蛍光を収集し(「ベースライン」)、その後ALS IgG(0.1 mg / mL)を5分間急性適用し(「ALS IgGに対する応答」)、および100 μM ATPによる治療(「ATPに対する応答」)を行ったカルシウムイメージング実験の代表例。上部のパネルは擬似カラー画像を示しています(蛍光の強度は色分けされており、黒は非常に低い強度に対応し、白は最も高い強度のピクセルを示します;色と強度の関係は、実験の各セグメントの個々の細胞の蛍光強度に対応する B の上部パネルの右側のカラーバーで表されます(「ベースライン」、 'ALS IgGに対する反応'、および'ATPに対する反応')。灰色の破線は、代表的なカルシウムトレース(オレンジ色)の特定の時点の擬似カラー画像を指しています。カルシウムトレースの中央にある灰色のボックスは、ALS IgGの5分間の適用を示しています。カルシウムトレースの下の黒いバーはATPの適用を示します。(B)非トランスジェニック星状細胞(青色のトレース)を除いて(A)と同じ。(C)hSOD1G93A 星状細胞の代表的なカルシウムトレース(オレンジ色)をカルシウムを含まないECSで1 μg/mLのタプシガルギン(トレースの下の黒いバー)で挑戦し、続いて2 mM Ca 2+( 「2 mM Ca2+」、トレースの下の黒いバー)を添加しました。(D)非トランスジェニックアストロサイト(微量は青色)以外は(C)と同様。振幅スケール = 100% ΔF/F0タイムスケール= 200秒。スケールバー = 50 μm。 (E)溶液交換のカスタムメイドモードと生化学物質塗布のためのピペットの配置を示す実験セットアップのスキーム。略語:ALS =筋萎縮性側索硬化症;IgG =免疫グロブリンG;Thg = タプシガーギン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:培養ミクログリアのカルシウムイメージングの一例 。 (A) 左:培養ミクログリアの明視野画像。純粋なミクログリア培養物を得ることは困難であるため、ここにもアストロサイトが存在する(より大きな扁平多角形細胞、矢印で示す例を参照)。枝分かれした(小さな体細胞、顕著な突起)とアメーバ状のミクログリア(それぞれ緑と黄色のボックスで示されている)の両方が培養物に存在します。 中央:左から黄色とシアンのボックスを拡大。赤、青、紫の線は、経時的な平均蛍光強度が抽出されるROIを示します。 右:中央パネルの3つの細胞のカルシウムトレース。トレースの色は、中央のパネルのROIの色に対応しています。ベースラインのカルシウム蛍光(「ベースライン蛍光」)を200秒間イメージングした後、細胞をALS IgG(0.1 mg/mL)の急性適用に5分間曝露し(「ALS IgGに対する応答」)、続いて100 μM ATP(「ATPに対する応答」)を曝露しました。カルシウムトレースの中央にある灰色のボックスは、ALS IgGの5分間の適用を示しています。カルシウムトレースの下の黒いバーは、ATPの適用を示しています。なお、大少数の細胞を表す細胞1(赤色のトレース)のみがALS IgGに応答し、一方、全ての細胞がATPに応答した。(B)擬似カラー画像は、記録の各セグメント(「ベースライン」、「ALS IgGに対する応答」、および「ATPに対する応答」)の蛍光強度を表し、オレンジ色の破線は代表的なカルシウムトレースの特定の時点を指しています(A、右パネル)。緑とオレンジのボックスはアメーバミクログリアを示します( Aと同じ)。色と強度の関係は、右側のカラーバーで表されます。振幅スケール = 100% ΔF/F0タイムスケール= 100秒。スケールバー= 50μm。略語:ALS =筋萎縮性側索硬化症;IgG =免疫グロブリンG;ROI = 関心領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文では、ラットhSOD1G93A モデルにおけるALSなどの細胞(病態)生理学のさまざまな側面を研究するための迅速で「予算内」のツールとして初代細胞培養の方法を紹介します。したがって、この技術は、より高い組織レベル(すなわち、組織スライスまたは生きた動物)で外挿し、さらに調査することができる単一細胞レベルでの研究に適しています。ただし、技術としての細胞培養にはいくつかの注意点があります。氷上で脳組織の分離と細胞の解離を行い、これらの段階とその後の分離と準備を可能な限り短い時間で実行することが最も重要です。汚染は常に存在するハードルであり、十分に滅菌された機器を使用し、層流フード37内で組織解離を行う際に特に注意を払うことによって克服することができる。細胞の正しい密度を播種することも重要です。播種された細胞の数が所望の数より少ない場合、これは皿内での細胞増殖および増殖を支持しないであろう。しかし、細胞が密度が高すぎると、増殖培地中の栄養素をめぐって細胞間で競争が起こり、したがって細胞死が増加します。これが、少なくとも出発組織と解離量の正しい関係に関してある程度の経験が得られる前に、播種前に解離細胞を数えることが賢明である理由です。
GFAPは広く使用されているアストロサイトマーカーであり、細胞培養の純度を評価するためによく使用されます38,39。しかし、アストロサイトの反応性を研究する場合、GFAPだけでは不十分です。Ki67や他の星状細胞マーカー(グルタミン合成酵素、アルドラーゼ-C、アルデヒドデヒドロゲナーゼ-1)などの増殖マーカーと組み合わせることをお勧めします18,38。これらの技術は純粋なグリア細胞タイプの培養をもたらす傾向がありますが、培養細胞の純度を評価する際には注意が必要です。これは、通常、いくつかの希突起膠細胞前駆体または星状細胞を含むミクログリア細胞培養にとって特に重要である34。ミクログリア細胞の特異的マーカーは多くの関心を集めています。最も使用されるマーカーはIba1ですが、分化受容体(CD68、CD45)やフラクタルカイン受容体(CX3CR1)などの他の頻繁に使用されるマーカーも他の細胞で検出できます(詳細については、40を参照されたい)。現在、ミクログリアの最も特異的なマーカーはTMEM119とプリン作動性受容体P2Y1241ですが、最近の論文ではTMEM119の特異性に関する懸念が提起されています42。
タイムラプスライブセルイメージングの導入は、Ca2+シグナル伝達などの細胞プロセスをリアルタイムでモニタリングできるという利点を提供します。さらに、異なる化学物質(例えば、ここではThg)を適用することによる細胞挙動の調節は、健康な細胞または細胞疾患モデル(hSOD1G93A ALSラットから単離および培養されたここ)において活性化される経路およびシグナル伝達物質の記述のためのさらなる情報を与える。Fluo-4 AMなどの細胞膜透過性蛍光色素を扱う場合、色素が細胞の内部を満たすための正しい濃度とインキュベーション時間を見つけることが重要です。時間がかかりすぎる場合は、細胞をインキュベーター内で37°Cに保つことで色素の取り込みを増強できます。 より重篤な場合には、中性洗剤(例えば、プルロニックF-127)をローディング溶液に使用することができる。また、染料の濃度を10μM以上に上げることによって上記を達成することはお勧めしません。実際、より高い濃度では、色素はCa2+バッファーとして作用し、Ca2+シグナル振幅を減衰させる可能性があります。
また、Fluo-4および同様の単一波長色素に加えて、1回の測定および1回のCa2+非感受性基準波長で発光するCa2+感受性レシオメトリック色素(Fura-2など)が存在することにも言及する価値があります。したがって、このような測定は、細胞内の不均一な色素分布によって引き起こされるバイアスや光路の変化の影響を受けません。それにもかかわらず、特にFluo-4などの高親和性インジケーターで単一波長色素を使用することは、同じサンプル内で相対的な測定が行われる場合、または実際のCa2+濃度変化ではなく、主にプロセスのダイナミクスに従う場合に推奨されます43。しかし、これらの測定値はCa2+濃度の定量データには使えず、図2のようにデータから振幅を解釈する際には注意が必要です。
本研究では、このイメージング施設を生細胞(培養中のアストロサイト)に用いることで、マウス細胞36のこれまでの結果に従って、ALSモデルで乱されているCa2+貯蔵の補充やストア操作のCa2+侵入などの病態生理の微妙な細胞内メカニズムを明らかにすることができることを実証しました。これは、ここで示唆されているように、ALS IgGに対するhSOD1G93A星状細胞のより高い感受性を説明することができ、それは病理学の進行を増強する可能性がある。このような実験で測定値を比較するには、視野内の細胞密度が類似していること、およびROI(例えば、ソーマ対プロセス)のために同じ細胞コンパートメントが取られることが賢明である。
ミクログリア細胞がアストロサイトと同じ勢いでALS IgGに反応しなかった例がここで示されました。これは、ALS IgG処理時のミクログリア細胞株における過酸化物の希少な生成の発見と一致している15。全体として、このアプローチは、ALSに関連するIgGに対する細胞特異的応答を示しており、ミクログリア対アストログリアの純粋な細胞培養の使用を通じて実現される重要な事実でもあります。神経病態生理学のモデルからのグリア細胞または患者の誘導多能性幹細胞に由来するグリア細胞を使用することは、ALSなどの重篤な神経疾患における生理学的バイオマーキングの未来を持っています。したがって、微細なCa2+ シグナル伝達を疾患の特定の状態の指紋として理解するか、異なる興奮毒性疾患を区別することが不可欠です。これらの目的のために、機械学習手順を開発し、データ記録を分類する必要があります。さらに、これらの細胞は培養中で増殖させ、神経炎症の多様な体液性因子(例えば、血清、IgG、CSF)に対する応答を誘発することによって、神経変性疾患の診断または患者の層別化に使用されるマイクロ流体デバイスに播種することができる。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この作業は、セルビア共和国教育科学技術開発省契約番号451-03-9 / 2021-14 / 200178、FENS-NES教育訓練クラスタープロジェクト「神経炎症におけるグリアに関する三国間コース」、およびEC H2020 MSCA RISE助成金#778405によってサポートされました。免疫組織化学画像を提供してくれたMarija AdžićとMina Perić、論文執筆を手伝ってくれたDanijela Bataveljićに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
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