Summary
We presenteren hier een protocol over het voorbereiden van primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia uit rattencorticosterces voor time-lapse videobeeldvorming van intracellulaire Ca2+ voor onderzoek naar pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose in het hSOD1G93A-rattenmodel .
Abstract
Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca2+ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.
De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca2+ winkelwerking in hSOD1G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca2+ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca2+ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca2 + kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.
Introduction
Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca2+-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.
ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronenaantast 1. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)2. Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen3. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.
Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte 4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière7. IKG's werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten7. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG's met het stadium en de kenmerken van de ziekte6.
IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten8 en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect - een kenmerk van ALS-pathologie9. Studies naar het hSOD1G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie10) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen11, weefsels 12,13,14 of levende dieren 13. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten11.
Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters15. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS 16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG's aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.
We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca2+ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG's als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG's en Ca2+ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG's in proefdierente injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca2+ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG's op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG's als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.
Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca2+ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca2+ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca2+ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijnen inzake de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en met toestemming van de Ethische Commissie van de Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (goedkeuringsnummer EK-BF-2016/08). Met betrekking tot patiëntenmateriaal (sera voor IgG's) werd het verzameld voor routinematig klinisch onderzoek met toestemming van de geïnformeerde patiënt in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van Helsinki) voor experimenten met mensen. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Klinisch Centrum van Servië (nr. 850/6).
1. Primaire celkweekvoorbereiding
- Isolatie van hersenweefsel
OPMERKING: Isolatie moet worden uitgevoerd op ijs, met behulp van ijskoude oplossingen.- Gebruik pasgeboren pups van 1-3 dagen oud voor primaire neonatale celkweek33.
OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde studie werden Sprague Dawley hSOD1G93A en niet-transgene ratten gebruikt. Voor genotypering werden rattenstaarten gebruikt voor latere DNA-extractie en PCR. - Bestrooi het hoofd van de pup met 70% ethanol en onthoofd het onmiddellijk snel met een schaar.
- Knip de huid open met een schaar met een kleine hoek om de schedel bloot te leggen. Open de schedel door een snede te maken van het foramen magnum naar de banen. Maak vervolgens een loodrechte middellijnsnede. Verwijder de hersenen uit de schedel en plaats deze in een petrischaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Reinig de gereedschappen tussen pups om kruisbesmetting tussen transgene en niet-transgene pups te voorkomen. Isolatie van de cortices van de rest van de hersenen moet worden gedaan onder een stereomicroscoop. - Gebruik de punt van de tang om de verbindingen tussen beide hemisferen te verbreken. Scheid vervolgens de hemisferen met een gebogen tang door voorzichtig een halve bol van het midden naar de zijkant te duwen.
- Verwijder de hersenvliezen door ze voorzichtig te scheuren met een rechte en gebogen tang.
- Verwijder de hippocampus door er met een gebogen tang in te knijpen. Gooi de hippocampus weg of gebruik het voor een ander celkweekpreparaat.
OPMERKING: Verdere stappen moeten worden uitgevoerd onder de laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te garanderen.
- Gebruik pasgeboren pups van 1-3 dagen oud voor primaire neonatale celkweek33.
- Weefselhomogenisatie en dissociatie
- Breng een cortex over in een buis van 15 ml gevuld met 3 ml koude PBS. Pipetteer de ophanging op en neer met een tip van 1 ml en voltooi 10-15 slagen totdat de suspensie homogeen wordt.
OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces. - Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml koude PBS door het op en neer te pipetteren met een punt van 1 ml. Herhaal de centrifugatiestap.
OPMERKING: Alle oplossingen die vanaf dit punt worden gebruikt, moeten worden voorbewarmd tot 37 °C. - Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 2 ml complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica (penicilline en streptomycine). Breng het homogenaat over in een buis van 2 ml.
- Laat het homogenaat door naalden van 21 G en 23 G (elk drie keer) gaan om een suspensie van afzonderlijke cellen te maken.
OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces.
- Breng een cortex over in een buis van 15 ml gevuld met 3 ml koude PBS. Pipetteer de ophanging op en neer met een tip van 1 ml en voltooi 10-15 slagen totdat de suspensie homogeen wordt.
- Giet de celsuspensie bereid uit één cortex in een petrischaal met een diameter van 60 mm of een T25-kolf (met het oppervlak voorbehandeld met een polypeptidecoating voor de groei van hechte cellen) met 3 ml volledige DMEM. Schud de petrischaal lichtjes zodat de suspensie gelijkmatig wordt verdeeld.
- Kweek de cellen in de incubator in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2/95% lucht bij 37 °C.
- Vervang het medium 48 uur na isolatie en vervang het medium om de 3 dagen.
- Om de groei van astrocyten te bevorderen, wanneer cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, wast u ze met voorbewarmde PBS om de losjes gehechte gliacellen en sporen van FBS in het medium te verwijderen.
- Trypsinize de onderliggende laag astrocyten door 1 ml voorgewarmde trypsine-oplossing toe te voegen (0,25% trypsine, 0,02% EDTA in PBS, steriel gefilterd).
- Zet het gerecht in de couveuse op 37 °C gedurende 2-5 min.
- Controleer de cellen onder de microscoop. Wanneer ze beginnen los te komen, voeg dan 4 ml volledige DMEM toe.
- Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml volledig medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Vergul de cellen opnieuw met een dichtheid van 104 cellen/cm2 in 5 ml verse complete DMEM.
- Verander het medium om de 3 dagen. Om de aanwezigheid van andere gliaceltypen te minimaliseren, nadat astrocyten 50% confluence hebben bereikt en voorafgaand aan elke mediavervanging, wast u de cellen met volledige DMEM.
- Aspirateer het supernatant medium met een pipet van 1 ml en doseer het meerdere keren voorzichtig op de cellaag. Zorg ervoor dat het hele oppervlak van de cellaag bedekt is tijdens deze wasstap.
- Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal na 14 dagen), herhaalt u de trypsinisatie en de verzameling astrocyten zoals beschreven in stap 1.6.
- Zaad 5 × 103 astrocyten op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur.
- Om microglia te bevorderen, laat je na stap 1.7 de gliacellen een confluentlaagbereiken 34. Wanneer microgliale cellen bovenop de astrocytenlaag verschijnen (na 10-15 dagen, te herkennen aan hun kleinere, meer ovale lichamen en kortere processen), schud de petrischaal op een orbitale shaker gedurende 2 uur bij 220 tpm.
- Dispergeren en zaaien van microgliale cellen
- Was de losgemaakte en losjes bevestigde cellen lichtjes door het supernatantmedium met een pipetpunt van 1 ml aan te zuigen en meerdere keren voorzichtig op de cellaag te doseren. Zorg ervoor dat u het hele oppervlak van de cellaag bedekt tijdens deze wasstap, verzamel het medium met de losgemaakte cellen en breng het over naar een buis van 15 ml.
- Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml medium.
- Laat de celsuspensie door een naald van 21 G gaan om een eencellige suspensie te verkrijgen.
OPMERKING: De meeste gepubliceerde methoden gebruiken trypsine of papaïne om het weefsel te dissociëren; naalden van 21 G hebben echter het voordeel dat ze de overdigestie van cellen voorkomen, waardoor een zachtere dissociatie mogelijk is. - Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaad 5 × 103 microgliale cellen op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur.
OPMERKING: Het is moeilijk om een zuivere microgliale cultuur te verkrijgen door te schudden, omdat de oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten nog steeds in een variabel aantal aanwezig kunnen zijn, afhankelijk van de ervaring van de experimentator. Het immunocytochemische protocol dat wordt gebruikt om de aanwezigheid van verschillende celpopulaties in gliaculturen te schatten, is elders beschreven35.
2. Immunocytochemie
- Spoel de cellen verguld op coverslips in PBS, 2 x 1 min.
- Bevestig de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Wassen in PBS 3 x 5 min.
- Incubeer in een blokkerende oplossing met 10% normaal ezelserum (NDS)/1% runderserumalbumine (BSA)/0,1% Triton X-100 gedurende 45 minuten bij RT.
- Voeg 50 μL van een blokkerende oplossing per afdeksel met een diameter van 10 mm toe.
- Bereid primaire antilichamen in 1% NDS / 1% BSA / 0,1% TritonX-100 in de volgende verdunningen: muis anti-GFAP 1: 300, geiten anti-Iba1 1:500. Incubeer de cellen met primaire antilichamen 's nachts bij +4 °C.
- Afspoelen in PBS, 3 x 10 min.
- Incubeer met de secundaire antilichamen geconjugeerd met een fluorofoor: ezel anti-muis (excitatie 488 nm [1:200)) of ezel anti-geit (geëxciteerd bij 647 nm [1:200)). Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij RT in het donker.
- Wassen in PBS, 7 x 5 min.
- Incubeer de cellen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:4.000) gedurende 10 minuten bij RT.
- Wassen in PBS 5 x 5 min.
- Monteer de coverslips op microscoopglaasjes met behulp van een montageoplossing; gebruik er één druppel van per coverslip.
OPMERKING: Antilichaamverdunningen kunnen variëren afhankelijk van de producent. Gebruikers moeten optimale verdunningen voor hun experimenten bepalen.
3. Time-lapse videobeelden
OPMERKING: Oplossingen die de fluorescerende kleurstof bevatten, moeten worden beschermd tegen direct licht. Voordat u met het beeldvormingsexperiment begint, moet u ervoor zorgen dat de glazen afdekplaat niet beweegt bij het inschakelen van de perfusie.
- Bereiding van oplossingen en cellen
- Bereid extracellulaire oplossing (ECS) voor beeldvorming: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose en 10 mM HEPES. Stel de pH in op 7,4. Zorg ervoor dat de osmolariteit 280-300 mOsm/kg is en bereid ECS voor zonder Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES en 0,1 mM EGTA.
- Bereid de testoplossingen: 100 μM ATP opgelost in ECS, 1 μM Thg in ECS zonder Ca2+ en 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.
- Breng een coverslip over op een schaal met ECS om de volledige DMEM uit te wassen. Bereid de kleurstofbelastingsoplossing door 1 mM stamoplossing van Fluo-4 AM met ECS te verdunnen tot de eindconcentratie van 5 μM Fluo-4 AM.
- Plaats de coverslip met cellen in de kleurstoflaadoplossing gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Was de cellen in ECS gedurende 20 min.
- Als cellen niet voldoende worden geladen (d.w.z. als het basale fluorescentieniveau te laag is <5% van het dynamische bereik van de camera met een belichtingstijd van meer dan 400 ms), verhoog dan de laadtijd tot maximaal 45 minuten tot 1 uur bij 37 °C. U kunt ook de Fluo-4 AM stockoplossing mengen met een gelijk volume van 20% (w/v) wasmiddel (Pluronic) in DMSO voordat u verdunt in ECS, waardoor de uiteindelijke pluronische concentratie ~0,02% wordt.
OPMERKING: De experimentele voorbeelden van deze studie werden uitgevoerd met menselijk IgG geïsoleerd uit bloedsera van ALS-patiënten zoals eerder beschreven 4,5,11. Elk experiment werd uitgevoerd met IgG-monsters van een enkele patiënt.
- Videobeelden
OPMERKING: In dit protocol werd het Video Imaging System gecombineerd met een xenon korte booglamp, een polychromatorsysteem en een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met water, glycerine en olie-onderdompelingsobject. Timelapse-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een digitaal camerasysteem.- Schakel de componenten van de beeldinstallatie 15 minuten voor het experiment in om het systeem de werktemperatuur te laten bereiken.
- Plaats de afdeksel in de opnamekamer met 1 ml werkoplossing (ECS of ECS zonder Ca2+).
- Om het juiste beeldvormingsprotocol te kiezen, opent u de beeldvormingssoftware en kiest u in het deelvenster Acquisitie de filterparen voor Fluo4-AM met een excitatiegolflengte bij 480 nm, een dichroïsche spiegel bij 505 nm en een emissiegolflengte bij 535 nm.
- Kies het gezichtsveld en zorg ervoor dat u gedurende het hele experiment een consistent aantal cellen hebt. Pas de belichtingstijd en detectorversterking op de juiste manier aan, zodat het signaal niet verzadigd is. Kies de pseudokleurmodus voor acquisitie. Raadpleeg voor meer gedetailleerde instructies de handleiding van de fabrikant.
- Pas de bemonsteringsfrequentie aan op 1 Hz (1 frame per seconde).
- Start de beeldvorming door het basale fluorescentieniveau gedurende 3-5 minuten te verkrijgen voor de basislijnbepaling (F0). Zorg voor een constante doorstroming van de werkoplossing.
- Stop de stroom van de werkoplossing en schakel over naar de testoplossing voor de gewenste tijdsduur (zie ook de tijdbalken in voorbeelden van figuur 2 en figuur 3). Was de cellen tussen elke testoplossing met een constante stroom van de werkoplossing gedurende 3-5 minuten.
- Houd het oplossingsvolume in de opnamekamer op ~1 ml door een constante zuigkracht van de bovenkant van de oplossing te regelen (zie figuur 2E).
OPMERKING: Om de behandeling rechtstreeks op de afgebeelde cellen toe te passen, werd een aangepast toedieningssysteem gemaakt van een glazen pipet (0,8 mm binnendiameter) op ~ 350 μm afstand en ~ 1 mm boven de cellen geplaatst, onder een hoek van 45 ° in combinatie met het oplossingsuitwisselingssysteem met knijpkleppen en een elektronische klepregelaar (zie figuur 2E).
4. Data-analyse
- Definieer een interessante regio (ROI) die overeenkomt met de afzonderlijke cel.
- Kies het frame met de hoogste signaalintensiteit (d.w.z. van de toepassing van ATP) en omcirkel één cel met behulp van de toepassing Polygonal Tool. Herhaal dit voor alle cellen in het verkregen veld. Kies vijf ROI's op de achtergrond met behulp van het gereedschap Cirkel.
- Als u de gemiddelde signaalintensiteit van een enkele cel en de achtergrond voor elk tijdsbestek wilt meten, selecteert u alle ROIs en gebruikt u de opdracht Multi Measure in ROI Manager in ImageJ of een gelijkwaardige opdracht in commerciële software (zie de tabel met materialen).
- Exporteer de gemiddelde signaalintensiteitswaarden van de ROI's als spreadsheet.
- Gemiddeld vijf achtergrond-ROI's en trek de gemiddelde achtergrond van elk frame af van de gemiddelde ROI-intensiteit van het frame dat tegelijkertijd is verkregen.
- Om de verkregen gegevens te normaliseren naar het basislijnsignaal, gebruikt u vergelijking (1):
ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1)
waarbij F de signaalintensiteit is van elk tijdsbestek na achtergrondaftrek en F0 de basislijnfluorescentie Fluo-4 is.
OPMERKING: In dit onderzoek is een op maat gemaakte code gebruikt. - Om de calciumactiviteit te analyseren, bepaalt u verschillende parameters4: de amplitude van de calciumpiek (ΔF/F0), de geïntegreerde verandering (tijdintegraal, oppervlak onder de responsregistratie) van de calciumtransiënt (ΔF/F0 × s), tijd-tot-piek-verstreken tijd vanaf het begin van de stimulatie tot het maximum van calciumtransiënt(en), stijgende tijd verstreken vanaf het begin van de stimulatie tot de waarde van ΔF/F0 die 50%-80% van de maximale amplitude (s), halve breedte-volledige breedte van een transiënt bij half-maximale amplitude (s), frequentie van reacties als ze repetitief zijn (Hz).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering van verschillende gliaceltypen in cultuur
Het duurt meestal 15-21 dagen om astrocyten te produceren voor experimenten, terwijl microgliale cellen 10-15 dagen nodig hebben om te groeien. Immunostaining werd uitgevoerd om de celzuiverheid van de kweek te beoordelen. Figuur 1 toont de expressie van dubbele labeling van de astrocytische marker GFAP en de microgliale marker Iba1 in respectievelijke culturen.
Van calciumbeeldvorming is bekend dat het de verschillen in celfysiologie van gezonde en zieke astrocyten onthult. Eerder toonden we in wilde astrocyten aan dat ALS IgG cellulaire Ca2+ beïnvloedt door intra- en extracellulaire pools in het cytosol8 te mobiliseren. Het volgende protocol bepaalde of er verschillen waren tussen de calciumtransiënten in hSOD1G93A en niet-transgene gekweekte astrocyten die acuut werden blootgesteld aan ALS IgG-monsters van patiënten. Astrocyten geladen met Fluo4-AM werden gedurende 3 minuten doordrenkt met ECS om een stabiele uitgangswaarde te verkrijgen. Vervolgens werd 100 μg/ml ALS IgG gedurende 5 minuten in het bad aangebracht. Astrocyten werden gewassen met ECS en vervolgens werd 100 μM ATP toegepast aan het einde van elke opname om de gezondheid van elke cel te testen en de calciumrespons op een standaard stimulus te observeren.
Representatieve sporen in figuur 2A,B laten zien dat hSOD1G93A astrocyten reageren op ALS IgG met een grotere amplitude van de calciumtransiënt, een grotere algehele geïntegreerde verandering en een kortere time-to-peak dan niet-transgene astrocyten. Hier moet men echter voorzichtig zijn bij het interpreteren van kwantitatieve gegevens wanneer ca2+-probes met één golflengte zoals Fluo4-AM worden gebruikt (zie het discussiegedeelte). Bovendien is de vorm van de respons op ALS IgG te onderscheiden van de respons op ATP (let op een snellere transiënt met een grotere amplitude in de sporen en celsynchronisatie in pseudokleurbeelden als reactie op ATP, figuur 2A,B).
Met het doel om de oorsprong van de verschillen in de calciumrespons op ALS IgG en ATP tussen hSOD1G93A en niet-transgene astrocyten verder te bestuderen, gebruikten we een farmacologische benadering om interne Ca2+ winkels tijdens calciumbeeldvorming te manipuleren met behulp van 1 μM Thg. Thg is een niet-selectieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPase (SERCA), het uitputten van de intracellulaire Ca2+ slaat vrijwel onmiddellijk op, wat tot uiting komt in een calciumtransiënt die gedurende enkele minuten duurt. Om het effect van externe Ca2+ in de waargenomen verschijnselen uit te sluiten, werd ecs met Ca2+ gebruikt tijdens het experiment. Na het registreren van het basale niveau van de fluorescentie gedurende 3 minuten, werd 1 μM Thg gedurende 2 minuten in het bad aangebracht. Na Thg-geïnduceerde calciumdepletie werden de astrocyten doordrenkt met ECS met Ca2+ om het bijvullen van de voorraden te induceren en te controleren. Representatieve sporen van het beschreven experiment zijn weergegeven in figuur 2C,D. Zoals verwacht hadden hSOD1G93A astrocyten een hoger niveau van Ca2+ in de winkels, zoals blijkt uit uitputting van de winkel, wat wijst op een overbelasting van dit ion. Een soortgelijk mechanisme is aangetoond in gekweekte astrocyten van SOD1G93A transgene muizen36.
Calcium beeldvorming van microgliale cellen in cultuur
Timelapse beeldvorming van microglia gelabeld met Fluo-4 AM werd uitgevoerd op dezelfde manier als beschreven voor astrocyten (figuur 3B). Microgliale cellen werden doordrenkt met ECS met 2 mM Ca2+ gedurende 3 minuten om een stabiele uitgangswaarde te verkrijgen, gevolgd door badtoepassing van 100 μg/ml ALS IgG gedurende 5 min, wassen met ECS en stimulatie met 100 μM ATP. Interessant is dat terwijl astrocyten gemakkelijk reageren op ALS IgG, een overgrote meerderheid van de microgliale cellen niet reageerde op ALS IgG (zoals geïllustreerd door slechts één microgliale cel die reageert met een calciumtransiënt; rood spoor in het voorbeeld van figuur 3A). Ze reageerden echter altijd op ATP en op een vergelijkbare manier als astrocyten (figuur 3A). Let ook op een geval van een spontane Ca2+ transiënt in het celspoor 2 (Figuur 3A) dat niet mag worden verward met een geïnduceerde respons.
Figuur 1: Astrocyten en microglia in een primaire cultuur. Representatieve confocale afbeeldingen van astrocyten (links) in cultuur gelabeld met behulp van GFAP (rood) en microglia (rechts) in een cultuur gekleurd met Iba1 (groen). Dubbele etikettering (GFAP/Iba1) werd gebruikt om de zuiverheid van de cultuur aan te geven. DAPI werd gebruikt om kernen (blauw) te labelen. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: GFAP = glial fibrillary acidic protein; lba1 = geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een voorbeeld van calciumbeeldvormingstoepassing in een studie naar astrocytenpathofysiologie. (A) Een representatief voorbeeld van een calciumbeeldvormingsexperiment waarbij hSOD1G93A-astrocyten gedurende 5 minuten werden afgebeeld om baseline fluorescentie ('baseline'baseline') te verzamelen, gevolgd door een acute toepassing van ALS IgG (0,1 mg/ml) gedurende 5 minuten ('respons op ALS IgG'), en een behandeling met 100 μM ATP ('respons op ATP'). Het bovenste paneel toont pseudokleurafbeeldingen (intensiteit van fluorescentie is kleurgecodeerd, waarbij zwart overeenkomt met een zeer lage intensiteit, terwijl wit pixels met de hoogste intensiteit markeert; kleurintensiteitsrelatie wordt weergegeven in een kleurenbalk rechts in het bovenste paneel van B die overeenkomt met de fluorescentie-intensiteit van een individuele cel in elk van de segmenten van het experiment ('baseline', 'reactie op ALS IgG', en 'reactie op ATP'). De grijze stippellijnen wijzen naar de pseudokleurafbeeldingen van specifieke tijdspunten voor het representatieve calciumspoor (in oranje). Het grijze vak in het midden van het calciumspoor markeert de 5 minuten durende toepassing van ALS IgG. Zwarte balk onder het calciumspoor markeert de toepassing van ATP. (B) Hetzelfde als in (A) behalve voor niet-transgene astrocyten (spoor in blauw). (C) Een representatief calciumspoor (oranje) in hSOD1G93A astrocyt uitgedaagd met 1 μg/ml thapsigargin (zwarte staaf onder het spoor) in ECS zonder calcium, gevolgd door de toevoeging van 2 mM Ca2+ ('2 mM Ca2+', zwarte staaf onder het spoor). (D) Hetzelfde als in (C) behalve voor de niet-transgene astrocyten (spoor is in blauw). Amplitudeschaal = 100% ΔF/F0. Tijdschaal = 200 s. Schaalstaven = 50 μm. (E) Schema van de experimentele opstelling met de op maat gemaakte modus van oplossingsuitwisseling en de plaatsing van de pipet voor toepassing van biochemische agentia. Afkortingen: ALS = amyotrofische laterale sclerose; IgG = immunoglobuline G; Thg = thapsigargin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een voorbeeld van calciumbeeldvorming van gekweekte microglia. (A) Links: Brightfield-afbeelding van gekweekte microglia. Omdat het moeilijk is om een zuivere microgliale cultuur te verkrijgen, zijn hier ook astrocyten aanwezig (grotere platte veelhoekige cellen, zie voorbeeld aangegeven door pijlpunt). Zowel vertakt (kleine soma, prominente processen) als amoeboïde microglia (aangegeven met respectievelijk groene en gele vakjes) zijn aanwezig in de cultuur. Midden: Vergrote gele en cyaan vakken van links. Rode, blauwe en violette lijnen markeren de ROI's waaruit de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd wordt geëxtraheerd. Rechts: Calciumsporen van drie cellen in het middenpaneel. De kleur van het spoor komt overeen met de kleur van de ROIs in het middelste paneel. Na beeldvorming van de baseline calciumfluorescentie ('baseline fluorescentie') gedurende 200 s, werden cellen blootgesteld aan een acute toepassing van ALS IgG (0,1 mg/ml) gedurende 5 min ('respons op ALS IgG'), gevolgd door 100 μM ATP ('respons op ATP'). Het grijze vak in het midden van het calciumspoor markeert de 5 minuten durende toepassing van ALS IgG. De zwarte balk onder het calciumspoor markeert de toepassing van ATP. Merk op dat alleen cel 1 (rood spoor) die een grote minderheid van cellen vertegenwoordigt, reageerde op ALS IgG, terwijl alle cellen reageerden op ATP. (B) Pseudocolor-beelden vertegenwoordigen de fluorescentie-intensiteit in elk van de segmenten van de opnames ('baseline', 'respons op ALS IgG' en 'respons op ATP') waarbij oranje stippellijnen wijzen naar de specifieke tijdspunten in de representatieve calciumsporen (A, rechterpaneel). Groene en oranje vakjes markeren amoeboïde microglia (hetzelfde als in A). De relatie kleurintensiteit wordt weergegeven in een kleurenbalk aan de rechterkant. Amplitudeschaal = 100% ΔF/F0. Tijdschaal = 100 s. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: ALS = amyotrofische laterale sclerose; IgG = immunoglobuline G; ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert de methode van primaire celkweek als een snelle en "on the budget" tool voor het bestuderen van verschillende aspecten van cel (patho)fysiologie zoals ALS in het rat hSOD1G93A model. De techniek is dus geschikt voor studies op het niveau van één cel die kunnen worden geëxtrapoleerd en verder kunnen worden onderzocht op een hoger organisatieniveau (d.w.z. in weefselplakken of bij een levend dier). Celkweek als techniek heeft echter een paar kanttekeningen. Het is het meest cruciaal om de isolatie van hersenweefsel en de dissociatie van cellen op ijs te doen en deze en daaropvolgende stadia van isolatie en voorbereiding in de kortst mogelijke tijd uit te voeren. Besmetting is een altijd aanwezige hindernis die kan worden overwonnen door goed gesteriliseerde apparatuur te gebruiken en bijzondere zorg te besteden aan het uitvoeren van weefseldissociatie in de laminaire kap37. Het is ook van cruciaal belang om de juiste dichtheid van cellen te zaaien. Als het aantal gezaaide cellen minder is dan het gewenste aantal, zal dit de celgroei en vermeerdering in het gerecht niet ondersteunen. Als cellen echter te dicht zijn, zal er concurrentie tussen hen zijn voor de voedingsstoffen in het groeimedium en dus meer celdood. Daarom is het raadzaam om de gedissocieerde cellen te tellen voor het zaaien, althans voordat enige ervaring wordt opgedaan met de juiste relatie van het startweefsel en het dissociatievolume.
GFAP is een veelgebruikte astrocytenmarker en wordt vaak gebruikt om de zuiverheid van celkweek te beoordelen38,39. Alleen GFAP is echter niet voldoende bij het bestuderen van astrocytenreactiviteit. Het wordt geadviseerd om het te combineren met een proliferatiemarker zoals Ki67 of andere astrocytenmarkers (glutaminesynthetase, aldolase-C of aldehydedehydrogenase-1)18,38. Hoewel deze technieken de neiging hebben om zuivere gliacelachtige culturen op te leveren, moet voorzichtigheid worden betracht bij het beoordelen van de zuiverheid van cultuurcellen. Dit is met name van belang voor microgliale celculturen die meestal enkele oligodendrocytenprecursoren of astrocyten bevatten34. Specifieke markers voor microgliale cellen trekken veel belangstelling. De meest gebruikte marker is Iba1, maar andere vaak gebruikte markers, zoals differentiatiereceptoren (CD68, CD45) en fractalkinereceptor (CX3CR1), kunnen ook in andere cellen worden gedetecteerd (voor meer details, zie40). Momenteel zijn de meest specifieke markers voor microglia TMEM119 en de purinerge receptor P2Y1241, hoewel een recent artikel bezorgdheid heeft geuit over TMEM119-specificiteit42.
Introductie van timelapse live-cell imaging biedt het voordeel van het monitoren van cellulaire processen, zoals Ca2+ signalering, in real time. Bovendien geeft de modulatie van celgedrag door het toepassen van verschillende chemische agentia (bijv. Thg hier) meer informatie voor de beschrijving van de routes en signaalboodschappen die worden geactiveerd in een gezonde cel of een cellulair ziektemodel (geïsoleerd en hier gekweekt van de hSOD1G93A ALS-rat). Bij het werken met celmembraandoorlatende fluorescerende kleurstoffen zoals Fluo-4 AM, is het van cruciaal belang om de juiste concentratie en incubatietijd te vinden voor de kleurstof om het binnenste van de cel te vullen. Als het te lang duurt, kan de opname van kleurstoffen worden verhoogd door de cellen in een incubator op 37 °C te houden. In ernstigere gevallen kan een mild reinigingsmiddel (bijv. Pluronic F-127) in de laadoplossing worden gebruikt. Het wordt ook niet geadviseerd om het bovenstaande te bereiken door de concentratie van de kleurstof boven 10 μM te verhogen. In feite kan de kleurstof bij hogere concentraties fungeren als een Ca2+ buffer en de Ca2+ signaalamplitude dempen.
Het is ook vermeldenswaard dat er naast Fluo-4 en soortgelijke kleurstoffen met één golflengte, Ca2+ -gevoelige ratiometrische kleurstoffen (bijv. Fura-2) bestaan die uitzenden bij één meting en bij één Ca2+ -ongevoelige referentiegolflengte. Dergelijke metingen zijn dus ongevoelig voor de vertekening veroorzaakt door ongelijke kleurstofverdeling in de cel en voor veranderingen in het optische pad. Niettemin is het gebruik van kleurstoffen met één golflengte, vooral met indicatoren met hoge affiniteit zoals Fluo-4, raadzaam in gevallen waarin relatieve metingen binnen hetzelfde monster worden gedaan, of waar men voornamelijk de dynamiek van het proces volgt en niet echte Ca2 + concentratieveranderingen43. Niettemin kunnen deze metingen niet worden gebruikt voor kwantitatieve gegevens in termen van Ca2+ concentratie, en voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van amplitudes uit de gegevens zoals weergegeven in figuur 2.
We hebben hier aangetoond hoe het gebruik van deze beeldvormingsfaciliteit op levende cellen - astrocyten in cultuur - subtiele intracellulaire mechanismen van pathofysiologie kan onthullen, zoals de aanvulling van Ca2 + -winkels en opgeslagen Ca2 + -invoer, die verstoord zijn in het ALS-model, in overeenstemming met eerdere resultaten op muizencellen36. Dit zou dan een hogere gevoeligheid van hSOD1G93A astrocyten voor ALS IgG kunnen verklaren, zoals hier gesuggereerd, die de progressie van de pathologie kan versterken. Om metingen in dergelijke experimenten te vergelijken, is het raadzaam om een vergelijkbare celdichtheid in het gezichtsveld te hebben en dat dezelfde celcompartimenten worden genomen voor ROI's (bijvoorbeeld soma versus processen).
Hier werd een voorbeeld getoond dat microgliale cellen niet met dezelfde kracht reageerden op ALS IgG als astrocyten. Dit is in lijn met de bevinding van de schaarse generatie peroxide in de microgliale cellijn bij ALS IgG-behandeling15. Al met al wijst deze benadering op een celspecifieke respons op IgG gerelateerd aan ALS, ook een belangrijk feit gerealiseerd door het gebruik van zuivere celculturen van microglia versus astroglia. Het gebruik van de gliacellen uit de modellen van neuropathofysiologie of afgeleid van induceerbare pluripotente stamcellen van patiënten heeft de toekomst van fysiologische biomarking bij ernstige neurale ziekten zoals ALS. Het zou dus essentieel zijn om fijne Ca2+ signalering te begrijpen als de vingerafdruk van de specifieke toestand van de ziekte of om onderscheid te maken tussen verschillende excitotoxische ziekten. Voor deze doeleinden moet een machine learning-procedure worden ontwikkeld en gegevensregistraties worden gecategoriseerd. Bovendien kunnen deze cellen in cultuur worden gekweekt en in een microfluïdisch apparaat worden gezaaid om te worden gebruikt voor diagnose of voor patiëntstratificatie van neurodegeneratieve ziekten door middel van het oproepen van een reactie op verschillende humorale factoren van neuro-inflammatie (bijv. Sera, IgG, CSF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologische Ontwikkeling, contract nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, het FENS - NENS Education and Training Cluster-project "Trilaterale cursus over glia in neuro-inflammatie" en de EC H2020 MSCA RISE-subsidie # 778405. We bedanken Marija Adžić en Mina Perić voor het leveren van de immunohistochemische beelden en Danijela Bataveljić voor hulp bij het schrijven van papier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
